Na Tabela 3 são apresentados os resultados das contagens microbiológicas. A contagem da cultura lática manteve-se constante nas amostras T1 e T5, controle e com extrato de jabuticaba, respectivamente. As amostras T2 (ácido ascórbico) e T4 (cisteína) apresentaram um pequeno aumento da contagem na metade do período de estocagem seguido de uma queda. Já a amostra T3, contendo glicose oxidase, apresentou um declínio durante a estocagem. Na comparação das diferentes amostras para um mesmo tempo de estocagem, a amostra T3 foi a única que apresentou diferença em relação as demais. Ela apresentou uma redução nas contagens a partir do 7° dia de estocagem.
Na contagem dos Lactobacillus acidophilus (Tabela 3), com exceção da amostra T3 (glicose oxidase), todas as amostras apresentaram contagem acima de 6 log UFC·g-1 durante os 28 dias de estocagem. A amostra acrescida de extrato da casca de jabuticaba (T5) apresentou melhor estabilidade da contagem de Lactobacillus acidophilus, com redução de apenas 1 ciclo logarítmico, passando de 8,26 log UFC·g-1 no tempo inicial, para 7,15 log UFC·g-1 ao final dos 28 dias de estocagem (p<0,05). Para o Bifidobacterium lactis, as amostras apresentaram pequeno aumento da contagem no início do período de observação, acompanhadas de um decréscimo nas contagens seguintes, porém todas as amostras apresentaram contagem de 6 ciclos logarítmicos, ou bem próximo, durante todo período de estocagem. Estudo realizado por Cruz et al. (2012a) onde foi aplicado glicose oxidase em iogurte, verificou-se contagens de Lactobacillus
acidophilus e Bifidobacterium lactis acima de 8 ciclos logarítmicos. As aplicações
de ácido ascórbico e cisteína também se mostraram eficientes, assim como nos estudos realizados por Dave e Shah (1997a, b), mantendo a contagem dos probióticos estáveis ao longo dos 28 dias de estocagem.
Na avaliação do pH das amostras (Tabela 4), não foi possível uma diferenciação estatística (p>0,05) entre os tratamentos. Observou-se um decréscimo no pH o que pode indicar uma possível pós-acidificação do produto.
50
Tabela 3 – Médias e desvios padrão das contagens de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis dos tratamentos T1, T2, T3, T4 e T5 do Petit Suisse probiótico durante a estocagem a 4±1°C. Tratamento Tempo (dias) Streptococcus thermophilus (log UFC·g-1) Lactobacillus acidophilus (log UFC·g-1) Bifidobacterium lactis (log UFC·g-1) T1 0 8,02±0,03 aA 8,26±0,05 aA 6,11±0,07 aBC 1 8,22±0,06 aA 8,25±0,00 cA 6,28±0,06 aAB 7 8,36±0,12 aA 8,27±0,02 bA 6,39±0,10 abA 14 8,32±0,02 aA 8,36±0,02 aA 6,45±0,05 aA 21 8,25±0,01 aA 8,20±0,03 aA 5,87±0,12 aC 28 8,15±0,05 aA 6,00±0,00 bB 6,00±0,01 bC T2 0 8,02±0,03 aBC 8,26±0,05 aB 6,11±0,07 aAB 1 8,13±0,00 aBC 8,21±0,05 cBC 6,19±0,06 aA 7 8,51±0,01 aA 8,52±0,01 aA 6,28±0,00 abA 14 8,28±0,01 aAB 8,28±0,02 abB 6,24±0,05 aA 21 8,26±0,21 aAB 8,05±0,08 abC 5,87±0,04 aB 28 7,80±0,10 bC 6,00±0,00 bD 6,03±0,11 bAB T3 0 8,02±0,03 aA 8,26±0,05 aB 6,11±0,07 aABC 1 8,34±0,01 aA 8,45±0,01 abA 6,04±0,06 aABC 7 6,39±0,55 bB 6,48±0,00 cC 6,21±0,13 abAB 14 6,48±0,02 bB 6,59±0,14 cC 5,95±0,07 bBC 21 6,59±0,16 bB 5,00 ± 0,00 dD 5,85±0,00 aC 28 5,00±0,00 cC 4,00±0,00 cE 6,31±0,11 aA T4 0 8,02±0,03 aBC 8,26±0,05 aB 6,11±0,07 aBC 1 8,34±0,09 aAB 8,50±0,03 aA 6,25±0,03 aAB 7 8,46±0,01 aA 8,49±0,00 aA 6,41±0,05 aA 14 8,14±0,04 aABC 8,18±0,03 bB 6,48±0,05 aA 21 8,25±0,07 aABC 8,01±0,04 bC 5,45±0,21 bD 28 7,92±0,14 abC 6,00±0,00 bD 5,98±0,19 bC T5 0 8,02±0,03 aA 8,26±0,05 aAB 6,11±0,07 aBC 1 8,20±0,04 aA 8,31±0,02 bcAB 6,26±0,00 aAB 7 8,38±0,04 aA 8,41±0,02 abA 6,14±0,13 bBC 14 8,12±0,01 aA 8,16±0,03 bB 6,47±0,10 aA 21 8,06±0,03 aA 7,79±0,06 cC 5,93±0,04 aC 28 8,04±0,01 abA 7,15±0,21 aD 6,16±0,06 abBC
Onde: T1: controle, T2: ácido ascórbico, T3: glicose oxidase, T4: cisteína, T5: extrato de jabuticaba. a, b, c
Para cada coluna, médias com letras minúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos para um mesmo tempo de estocagem.
A, B, C, D, E
Para cada coluna, médias com letras maiúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) numa mesma amostra para os diferentes tempos de estocagem.
51
Em relação à proteólise das amostras (Tabela 4), todas apresentaram aumento da absorbância, o que pode significar elevação do conteúdo de aminoácidos livres. Os tratamentos T1 (sem antioxidantes) e T5 (com extrato de jabuticaba) apresentaram os maiores índices de proteólise, passando de 0,682 de absorbância no início da estocagem para 1,136 e 1,132 (p<0,05), respectivamente, aos 28 dias. Mas, ao se comparar cada amostra em cada período isoladamente, verificou-se que não houve diferença significativa entre as amostras, ou seja, os antioxidantes utilizados não influenciaram na atividade proteolítica das culturas empregadas. A pós-acidificação e aumento da proteólise podem ser atribuídos à remoção do oxigênio promovida pelos antioxidantes, o que cria condições favoráveis para o desenvolvimento de bifidobactérias, resultando em uma atividade metabólica maior (CRUZ et al., 2012a).
Ainda na Tabela 4, são apresentados também os valores de atividade antioxidante obtidos pelos métodos DPPH e FRAP. Embora tais métodos apresentem pequenas diferenças entre si, quando comparados os seus resultados, é possível verificar que todas as amostras apresentaram diminuição da atividade antioxidante com o tempo para ambos os métodos. Além disso, ao se comparar os tratamentos, verificou-se que as amostras T4 e T5, contendo cisteína e extrato de casca de jabuticaba, respectivamente, apresentaram os maiores valores de atividade antioxidante para ambos os métodos, passando de 273µmol TE·g-1 no tempo zero para 566µmol TE·g-1 (p<0,05), no dia 1 e, seguido de um decréscimo ao final dos 28 dias, passando a 470 e 486µmol TE·g-1 (p<0,05), pelo método FRAP, respectivamente. Este comportamento indica que a adição de cisteína e de extrato de jabuticaba apresentaram não apenas maior atividade antioxidante como maior estabilidade ao longo do tempo de estocagem. Porém, a amostra sem antioxidante (T1) e amostra contendo ácido ascórbico apresentaram menores valores e queda mais acentuada para ambos os métodos, passando de 273µmol TE·g-1 no tempo inicial para 116 e 143µmol TE·g-1 (p<0,05), respectivamente, aos 28 dias de estocagem pelo método FRAP.
52
Tabela 4 – Médias e desvios padrão para os valores de pH, proteólise e atividade antioxidante para os tratamentos T1, T2, T3, T4 e T5 do Petit Suisse probiótico durante a estocagem a 4±1°C.
Tratamento Tempo (dias) pH* Proteólise (absorbância a 340nm) Atividade Antioxidante – FRAP (µmol TE·g-1)
Atividade Antioxidante – DPPH (µmol TE·g-1) T1 0 4,91 ± 0,01 0,68 ± 0,02 aE 273 ± 28 aA 220 ± 2 aA 1 4,65 ± 0,01 0,84 ± 0,02 abD 194 ± 11 cB 200 ± 0 cAB 7 4,64 ± 0,25 0,88 ± 0,01 aCD 183 ± 10 bB 162 ± 19 cAB 14 4,42 ± 0,03 0,92 ± 0,02 bcC 169 ± 2 bBC 141 ± 41 cBC 21 4,51 ± 0,08 1,03 ± 0,02 abB 150 ± 31 bBC 135 ± 52 cBC 28 4,47 ± 0,04 1,14 ± 0,01 aA 116 ± 16 cC 81 ± 1 cC T2 0 4,91 ± 0,01 0,68 ± 0,02 aE 273 ± 28 aA 220 ± 2 aA 1 4,76 ± 0,01 0,86 ± 0,01 aD 199 ± 2 cB 199 ± 3 cAB 7 4,69 ± 0,05 0,92 ± 0,00 aC 151 ± 12 bBC 175 ± 3 cABC 14 4,63 ± 0,01 0,96 ± 0,02 bC 137 ± 19 bC 134 ± 3 cBC 21 4,55 ± 0,04 1,01 ± 0,01 bB 128 ± 11 bC 124 ± 4 cC 28 4,49 ± 0,00 1,12 ± 0,04 aA 143 ± 28 cBC 118 ± 4 cC T3 0 4,91 ± 0,01 0,68 ± 0,02 aE 273 ± 28 aA 220 ± 2 aAB 1 4,90 ± 0,01 0,81 ± 0,01 bC 261 ± 6 bA 234 ± 5 cA 7 4,77 ± 0,07 0,82 ± 0,00 bC 158 ± 3 bB 175 ± 3 cABC 14 4,74 ± 0,01 0,91 ± 0,00 cB 179 ± 25 bB 158 ± 3 cBCD 21 4,73 ± 0,01 1,07 ± 0,00 aA 161 ± 7 bB 149 ± 4 cCD 28 4,63 ± 0,01 1,10 ± 0,01 abA 283 ± 46 bA 100 ± 2 cD T4 0 4,91 ± 0,01 0,68 ± 0,02 aE 273 ± 28 aD 220 ± 2 aC 1 4,88 ± 0,01 0,82 ± 0,01 abD 566 ± 2 aA 494 ± 4 bA 7 4,72 ± 0,03 0,88 ± 0,01 aC 529 ± 5 aAB 482 ± 3 bAB 14 4,59 ± 0,01 0,93 ± 0,02 bcB 506 ± 4 aBC 454 ± 2 bAB 21 4,60 ± 0,00 1,01 ± 0,00 bA 450 ± 17 aC 432 ± 3 bAB 28 4,52 ± 0,01 1,06 ± 0,03 bA 470 ± 15 aC 423 ± 68 bB T5 0 4,91 ± 0,01 0,68 ± 0,02 aE 273 ± 28 aD 220 ± 2 aD 1 4,68 ± 0,01 0,86 ± 0,00 abD 566 ± 7 aA 682 ± 1 aA 7 4,51 ± 0,15 0,92 ± 0,001 aC 552 ± 15 aAB 675 ± 2 aA 14 4,55 ± 0,00 1,02 ± 0,00 aB 544 ± 16 aAB 616 ± 71 aAB 21 4,53 ± 0,01 1,03 ± 0,02 abB 496 ± 7 aBC 594 ± 4 aB 28 4,44 ± 0,01 1,13 ± 0,01 aA 486 ± 11 aC 489 ± 1 aC
Onde: T1: controle, T2: ácido ascórbico, T3: glicose oxidase, T4: cisteína, T5: extrato de jabuticaba. *Não foi aplicado o teste de comparação de médias por que o F de interação não foi significativo. a, b, c
Para cada coluna, médias com letras minúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos para um mesmo tempo de estocagem.
A, B, C, D, E
Para cada coluna, médias com letras maiúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) numa mesma amostra para os diferentes tempos de estocagem.
53
Embora estes métodos de análise de atividade antioxidante possuam ampla aplicação pela comunidade científica (KAITHWAS; SINGH; BHATIA, 2014; VIEIRA et al., 2013; GÜLÇIN, 2012; REYNERTSON et al., 2008; EINBOND et al., 2004; KORDALI et al., 2005), devido tratar-se de uma análise in vitro, faz-se necessária uma análise mais detalhada do comportamento de inibição do estresse oxidativo
in vivo conforme alguns trabalhos já publicados na literatura (LIU et al., 2014a,
2014b; PATRO et al., 2014). Por outro lado, os valores de atividade antioxidante para o extrato de jabuticaba puro foram de 1956 e 1922µmol TE·g-1 para FRAP e DPPH, respectivamente. Tais valores foram bem superiores àqueles obtidos para as amostras de Petit Suisse adicionadas de extrato de jabuticaba. Isso provavelmente deve-se a parcial oxidação dos compostos antioxidantes como resultado do estresse oxidativo com o oxigênio incorporado ao produto bem como devido ao possível consumo desses compostos antioxidantes presentes no extrato por parte das bactérias probióticas. O extrato de jabuticaba puro utilizado neste estudo apresentou teor de fenólicos totais de 110mg GAE∙g-1
de peso seco e 25mg de cianidina 3-glicosídeo∙g-1
de peso seco, respectivamente. Tais compostos têm sido reportados na literatura como os principais compostos antioxidantes presentes na casca da jabuticaba (REYNERTSON et al., 2006, 2008; SANTOS; VEGGI; MEIRELES, 2010; SANTOS; MEIRELES, 2011; RUFINO et al., 2010).
Na Tabela 5 são apresentadas as concentrações dos principais ácidos orgânicos comumente produzidos pelas bactérias probióticas ao longo dos dias de estocagem refrigerada. A concentração de ácido lático aumentou em todos os tratamentos, mas o aumento foi maior no tratamento controle (T1), com um aumento de 59% da concentração no final do período em relação ao início da estocagem. O ácido acético aumentou nas amostras T2 e T5, ácido ascórbico e extrato de casca de jabuticaba, respectivamente, com aumentos de 37 e 26% cada, sendo que a amostra T5 foi a que apresentou maior concentração do ácido em relação às demais, com 6,34mg·g-1 no tempo inicial e 7,97mg·g-1 (p<0,05) ao final do período. Já o ácido cítrico diminuiu nos tratamentos T2, T3 e T4, ácido ascórbico, glicose oxidase e cloreto de cisteína, respectivamente, mas se manteve
54
constante nos demais. A amostra T5 também apresentou maior concentração do ácido cítrico no período, passando de 2,25mg·g-1 no tempo de 1 dia, para 2,79mg·g-1 (p<0,05) em 28 dias. A elevada produção de ácidos pela amostra T5 também está relacionada com a atividade antioxidante do extrato de jabuticaba, o que pode acelerar a atividade metabólica da cultura devido às condições favoráveis (CRUZ et al., 2012a). De acordo com Rodrigues et al. (2011), a cultura de Bifidobacterium lactis possui uma atividade metabólica maior que a de
Lactobacillus acidophilus, sendo heterofermentativa, assim podendo-se atribuir a
maior produção de ácidos às bifidobactérias. Segundo Izco, Tormo e Jiménez- Flores (2002), o ácido acético presente nos queijos é resultado da lipólise da gordura do leite, o ácido cítrico é proveniente do metabolismo bioquímico normal dos bovinos e o ácido lático é produto do desenvolvimento microbiano de bactérias lácticas.
Tabela 5 – Médias e desvios padrão da composição de ácidos orgânicos dos tratamentos T1, T2, T3, T4 e T5 do Petit Suisse probiótico durante a estocagem a 4±1°C.
Tratamento Tempo (dias) Ácido lático (mg·g-1) Ácido acético (mg·g-1) Ácido cítrico (mg·g-1) T1 1 7,58 ± 0,01 abC 1,92 ± 0,04 bA 1,72 ± 0,01 bA 14 8,95 ± 0,20 aB 2,22 ± 0,02 bA 1,71 ± 0,01 cA 28 12,04 ± 0,08 aA 2,06 ± 0,02 bcA 2,07 ± 0,09 bA T2 1 5,92 ± 0,04 dB 1,79 ± 0,02 bB 1,93 ± 0,00 bA 14 7,81 ± 0,09 bA 2,28 ± 0,01 bA 1,80 ± 0,00 cA 28 8,01 ± 0,01 bA 2,45 ± 0,12 bA 1,75 ± 0,01 bA T3 1 8,12 ± 0,02 aAB 1,92 ± 0,03 bA 3,29 ± 0,04 aA 14 8,66 ± 0,73 abA 1,88 ± 0,00 bA 3,22 ± 0,74 aA 28 7,78 ± 0,14 bB 1,92 ± 0,00 cA 1,71 ± 0,00 bB T4 1 7,15 ± 0,01 bcB 2,14 ± 0,01 bA 2,30 ± 0,02 bA 14 8,21 ± 0,27 abA 2,33 ± 0,02 bA 2,11 ± 0,36 bcAB 28 8,05 ± 0,10 bA 2,24 ± 0,01 bcA 1,64 ± 0,00 bB T5 1 6,69 ± 0,36 cdB 6,34 ± 0,52 aC 2,25 ± 0,17 bA 14 8,24 ± 0,54 abA 7,22 ± 0,14 aB 2,54 ± 0,05 abA 28 7,98 ± 0,27 bA 7,97 ± 0,27 aA 2,79 ± 0,09 aA
Onde: T1: controle, T2: ácido ascórbico, T3: glicose oxidase, T4: cisteína, T5: extrato de jabuticaba. a, b, c, d
Para cada coluna, médias com letras minúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos para um mesmo tempo de estocagem.
A, B, C
Para cada coluna, médias com letras maiúsculas sobrescritas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) numa mesma amostra para os diferentes tempos de estocagem.
55
A composição dos principais ácidos graxos livres das amostras é apresentada na Tabela 6. A concentração de ácidos graxos livres pode interferir nas características sensoriais e nutricionais do produto. Nesta análise, verificou-se a predominância de ácidos graxos saturados principalmente o ácido palmítico (C16:0), variando de 30,31 a 38,74g·100g-1 de lipídios (p<0,05) entre as amostras, seguido do ácido esteárico (C18:0) entre 11,11 e 16,53g·100g-1 de lipídios (p<0,05) e do ácido mirístico (C14:0), variando de 10,09 a 12,91g·100g-1 de lipídios (p<0,05). Em segundo lugar, encontraram-se os ácidos graxos monoinsaturados, representado principalmente pelo ácido oléico (C18:1 cis), variando entre 24,11 a 29,56g·100g-1 de lipídios (p<0,05) entre as amostras. Em terceiro, ficaram os ácidos graxos poli-insaturados, principalmente o ácido linoléico (C18:2), entre 2,29 e 5,15g·100g-1 de lipídios (p<0,05).
Em relação ao ácido graxo trans, a amostra T1, controle, apresentou a maior concentração de ácido oléico (18:1 trans) no início da estocagem (2,94g·100g-1 de lipídios, p<0,05). Sua concentração diminuiu aos 28 dias (2,73g·100g-1 de lipídios, p<0,05), mas ainda assim foi encontrado em maior proporção nessa amostra. Já a amostra T5, adicionada do extrato de jabuticaba, foi a que apresentou menor quantidade, passando de 2,29g·100g-1 de lipídios no tempo inicial, para 1,76g·100g-1 de lipídios (p<0,05) aos 28 dias. Segundo Florence et al. (2012), o leite bovino contém cerca de 2% do total de lipídios do leite bovino é de ácidos graxos trans, podendo chegar a 4 a 10% dependendo da dieta do animal. Assim, a presença do extrato de jabuticaba tornou o produto mais saudável, ou seja, com menor concentração de ácidos graxos trans.
Em relação ao ácido linoléico conjugado (CLA), componente com atividade biológica, verificou-se que a adição dos antioxidantes não afetou sua produção, pois a amostra com ausência destes (T1) foi a que apresentou maior quantidade de CLA, 0,72g·100g-1 de lipídios nos tempos 1 e 28 dias de estocagem. Nos tratamentos T2 e T3, ácido ascórbico e glicose oxidase, respectivamente, a concentração do CLA aumentou, passando de 0,21 para 0,24g·100g-1 (p<0,05) de lipídios em T2 e de 0,14 para 0,67g·100g-1 (p<0,05) em T3 entre os tempos 1 e 28 dias de estocagem. Já nos tratamentos T4 e T5, cisteína e extrato de jabuticaba,
56
respectivamente, o valor diminuiu passando de 0,16 para 0,11g·100g-1 (p<0,05) de lipídios em T4 e de 0,42 para 0,23g·100g-1 (p<0,05) em T5 entre os tempos 1 e 28 dias de estocagem. A presença de CLA na dieta tem sido reportada como inibidor de fatores anticarcinogênicos e antiteratogênicos em estudos em animais, bem como a imunomodulação e redução de gordura corporal (BASSAGANYA-RIERA; HONTECILLAS; WANNEMUEHLER, 2002; BENJAMIN; SPENER, 2009). Segundo Oh et al. (2003), as bifidobactérias podem produzir CLA, porém, a adição dos antioxidantes não afetou positivamente na produção de CLA.
De acordo com Rodrigues et al. (2011), algumas enzimas microbianas são as principais responsáveis pela produção de CLA: a enzima ácido linoléico isomerase pode converter o ácido linoléico a CLA. A aplicação de bactérias probióticas capazes de sintetizar CLA livre em produtos lácteos pode trazer benefícios adicionais à saúde. Porém, estudos adicionais são necessários para avaliar se a quantidade de CLA presente em todos os tratamentos representam quantidade suficiente para promover benefícios à saúde. Segundo Ritzenthaler et al. (2001), é necessária uma dose diária de 620 e de 441mg de CLA para homens e mulheres, respectivamente, para que se obtenha algum efeito protetivo contra o câncer.