5.1. Efeito da HDL total sobre a dimensão do infarto e a preservação da função sistólica do ventrículo esquerdo
A infusão de HDL (200 µg de proteína/mL), durante os primeiros minutos da reperfusão, reduziu o tamanho do infarto em 24% comparado ao grupo controle (p<0,01). Além disso, a maior dose de HDL gerou maior benefício em relação as concentrações de 100 e 50 µg, -19% (p<0,05) e -30% (p<0,001) respetivamente. Como um controle negativo, utilizamos a LDL na concentração de 200 µg de proteína/mL e comparamos com os demais grupos. A HDL 200 µg diminuiu em 26% as dimensões do infarto comparado ao grupo LDL (p<0,01). Não foram observadas diferenças entre os demais grupos (Figura 14A).
Corroborando com resultados do tamanho de infarto, a HDL 200 µg recuperou fortemente a função sistólica do VE em 30 min (+36%; p<0,001), 60 min (+33%; p<0,001) e 90 min (+30%; p<0,01) de reperfusão comparado ao grupo controle. A HDL 200 µg melhorou o desempenho ventricular esquerdo comparado a todos os demais grupos durante a reperfusão: (i) HDL 100 µg, 30 min (+33%; p<0,01) e 60 min (+25%; p<0,05); (ii) HDL 50 µg, 30 min (+50%; p<0,0001), 60 min (+41%; p<0,001) e 90 min (+38%; p<0,001); e (iii) LDL 200 µg, (+36%; p<0,001), 60 min (+33%; p<0,01) e 90 min (+34%; p<0,01) (Figura 14B).
A infusão de partículas de HDL na concentração de 200 µg de proteína/mL, durante os minutos iniciais da reperfusão coronariana, diminuiu o tamanho de infarto e melhorou o índice de contratilidade do VE.
Figura 14: Efeito da HDL total sobre a dimensão do infarto e a preservação da função
sistólica do ventrículo esquerdo. (A) Tamanho de infarto, ANOVA: p=0,0002.; (B) Índice de contratilidade do VE durante reperfusão (dP/dt max) ANOVA: p<0,05. p<0,05 significante.
5.2. Associação do tamanho de infarto com o fluxo e resistência coronariana durante a infusão de HDL total
Nós evidenciamos que a infusão de HDL 200 µg aumentou acentuadamente o fluxo coronariano em 7 min de reperfusão em relação ao grupo controle (+40%;
p<0,0001), a HDL 100 µg (+40%; p<0,0001), a HDL 50 µg (+33%; p<0,0001) e o grupo LDL (+45%; p<0,0001). Todos os outros grupos obtiveram fluxo similares ao controle (Figura 15A).
Inversamente aos dados de fluxo, nós observamos que a HDL 200 µg diminuiu potentemente a resistência coronariana em comparação ao controle (- 119%; p<0,0001), a HDL 100 µg (-92%; p<0,01), a HDL 50 µg (-70%; p<0,05) e a LDL (-120%; p<0,01). Com os demais grupos não foram observadas diferenças significantes (Figura 15B).
Figura 15: Fluxo e resistência coronariana durante a infusão de HDL total. A= Fluxo
ANOVA= p<0,0001. B= Resistência, ANOVA= p<0,0001. p<0,05 significante.
Em paralelo, utilizando a análise de correlação de Spearman, nós encontramos uma forte associação inversa entre o fluxo coronário em 7 min e o
tamanho de infarto (r=-0,616; p=0,0002; n=32) (Figura 16A) Nós também mostramos uma associação positiva entre a resistência coronariana em 7 min e o tamanho de infarto (r=0,581; p=0,0005; n=32) (Figura 16B).
Esses dois parâmetros hemodinâmicos, aferidores da dilatação dos vasos, parecem implicar diretamente no tamanho de infarto.
Figura 16: Associação do tamanho de infarto com o fluxo e resistência coronariana durante
a infusão de HDL total. p<0,05 significante.
5.3. Efeito da reperfusão coronariana com subclasses de HDL sobre o tamanho de infarto e função sistólica do ventrículo esquerdo
Nós fracionamos as partículas de HDL total e obtivemos cinco subclasses distintas de HDL. Cada subclasse de HDL, na concentração de 200 µg de proteína/mL, foi testada separadamente nos primeiros 7 minutos da reperfusão coronariana. Nós demonstramos que as partículas menores e mais densas de HDL, as subclasses 3C e 3B, reduziram substancialmente o tamanho de infarto comparado ao controle, -29% (p<0,001) e -25% (p<0,01), respetivamente. As outras subclasses de HDL não foram eficientes em reduzir a dimensão do infarto e apresentaram similaridades com o grupo controle (Figura 17A).
A subclasse 3C melhorou o índice de contratilidade do VE em 30 min (+34%; p<0,001), 60 min (+20%; p<0,05) e 90 min (+21%; p<0,05) da reperfusão comparado ao controle. O HDL 3B também foi capaz de otimizar a função sistólica do VE apenas em 30 min da reperfusão (+23%; p<0,01) em relação ao grupo controle. Nós não observamos diferenças entre as outras subclasses de HDL (2B, 2A e 3A) e o grupo controle (Figura 17B).
As HDL 3C e 3B, em ordens de magnitude, diminuíram acentuadamente o tamanho de infarto e melhoraram o desempenho sistólico do VE.
Figura 17: Efeito da reperfusão coronariana com subclasses de HDL sobre o tamanho de
infarto e função sistólica do ventrículo esquerdo. A= Tamanho de infarto, Controle (n=6) e Subfrações (n=5-7); (B) Índice de contratilidade do VE (dP/dt max) durante reperfusão com subfrações, ANOVA (p<0,0001). O dado hemodinâmico dP/dt max foi ajustado pelo estado basal do coração antes da isquemia. p<0,05 significante.
5.4. Fluxo e resistência coronariana com a infusão de subclasses de HDL De todas as subclasses, a HDL 3C aumentou significantemente o fluxo coronariano em 7 min de reperfusão comparado ao controle (+23%; p<0,05) (Figura 18A). Em relação a resistência coronariana, aferida pela pressão da aorta dividida pelo fluxo coronariano, nós mostramos que a HDL 3C e 3B diminuíram eficientemente a resistência do vaso comparado ao grupo controle, -88% (p<0,05) e -77% (p<0,05), respectivamente. Novamente não encontramos diferenças significantes com as demais subclasses de HDL (Figura 18B).
As menores partículas de HDL geraram maior fluxo nas artérias coronárias, nos minutos iniciais da reperfusão, referente aos outros subtipos de HDL e o grupo controle.
Figura 18: Fluxo e resistência coronariana com a infusão de subclasses de HDL. A= fluxo
coronariana ANOVA= p<0,05; B= Resistência coronariana, ANOVA= p<0,05. p<0,05 significante.
5.5. Associação entre a síntese de óxido nítrico induzido pelas subclasses de HDL e tamanho de infarto
Para verificar se o aumento do fluxo e a diminuição da resistência coronariana estão envolvidos com o aumento da produção de NO estimulada pelas menores partículas de HDL, nós evidenciamos que em 1 min de reperfusão, a
biodisponibilidade de NO do efluente coronariano aumentou 220% (p<0,0001) com a infusão de HDL 3C e 131% (p<0,05) com a HDL 3B em relação ao grupo controle. Além disso, em 5 min de reperfusão a HDL 3B e 3C aumentaram 240% (p<0,0001) e 204% (p<0,0001) a concentração de NO comparado ao controle. Nós não observamos aumento na síntese de NO com as outras subclasses de HDL (Figura 19A).
Paralelamente, nós encontramos uma forte associação inversa entre a concentração de NO no efluente coronariano em 5 min de reperfusão e o tamanho de infarto (r2=-0,617; p=0,0004; n=30) (Figura 19B). Nós também demonstramos
uma correlação negativa entre a biodisponibilidade de NO em 1 min de reperfusão e o tamanho de infarto (r2=-0,433; p=0,019; n=29) (Figura 19C).
Novamente nossas evidências apontam que a vasodilatação mediada pelo NO estão associados de forma direta com o tamanho de IM.
Figura 19: Associação entre a síntese de óxido nítrico induzido pelas subclasses de HDL e
tamanho de infarto. A= Concentração de NO no efluente coronariano com 1 e 5 minutos de reperfusão, Controle (n=5) e Subfrações (n=5-6), ANOVA= p<0,0001; B e C= correlações. p<0,05 significante.
5.6. Efeito das subclasses de HDL na via da produção de NO em células endoteliais coronarianas humanas: Resultado do bloqueio dos receptores de S1P
Nós buscamos observar o potencial das subclasses de HDL em estimular a síntese de NO separadamente em células endoteliais in vitro. Nossos resultados demostraram que o pool de HDL 3B e 3C aumentou 330% (p<0,0001) e o pool das
HDL maiores (2B, 2A e 3A) 85% a síntese de NO em células coronarianas humanas em relação ao grupo basal. Além disso, a HDL 3B e 3C foi 245% (p<0,0001) mais efetiva em aumentar a produção de NO comparado com o pool de partículas maiores de HDL.
Para verificar a influência do conteúdo de S1P nas subclasses de HDL 3B e 3C, nós utilizamos bloqueadores dos dois principais receptores de S1P envolvidos na via do NO, o receptor S1P1 e S1P3. Nós demonstramos que a inibição do receptor S1P1 reduziu em -220% (p<0,0001) e do receptor S1P3 em -230% (p<0,001) a eficiência da HDL 3B e 3C em estimular a síntese de NO. A utilização conjunta dos antagonistas dos receptores S1P1 e S1P3 diminuiu -220% (p<0,001) a ação das subclasses 3B e 3C em induzir a produção de NO. Ainda, mesmo com o bloqueio do receptor de S1P1, S1P3 ou ambos, o pool de HDL 3B e 3C foi capaz de induzir em 110% (p<0,0001), -100% (p<0,001) e -110% (p<0,001) a síntese de NO nas células endoteliais coronarianas, respectivamente. A concentração de NO somente com L-NAME e com os antagonistas de S1P foram semelhantes ao basal (Figura 20A).
A forte ação da HDL 3B e 3C sobre a produção de NO endotelial foi confirmada por immunoblotting através da constatação da ativação da eNOS pela fosforilação na serina 1177. As subclasses 3B e 3C aumentaram 90% (p<0,001) a ativação da eNOS comparado ao grupo basal. O bloqueio do receptor S1P1 reduziu potentemente a ativação da eNOS pela HDL 3B e 3C (-135%; p<0,0001). A ação conjunta dos antagonistas de S1P1 e S1P3 também foram capazes de atenuar o efeito das subclasses 3B e 3C. Em contraste, o bloqueio do receptor S1P3 não reduziu significantemente a ativação da eNOS pelas HDLs menores (Figura 20B).
O pool das menores HDLs, as subclasses 3B e 3C, foram mais eficazes em estimular o aumento da biodisponibilidade de NO por células endoteliais coronarianas humanas no meio extracelular. O bloqueio de ambos os receptores S1P1 e S1P3 reduziram em 67% o efeito das partículas de HDL 3B e 3C em induzir a síntese de NO. No entanto, em relação a via de ativação do NO, o bloqueio do receptor S1P1 atenuou potentemente a ativação da eNOS comparado com a inibição do receptor S1P3.
Figura 20: Efeito das subclasses de HDL na via da produção de NO em células endoteliais
coronarianas humanas: Resultado do bloqueio dos receptores de S1P. A= Produção de NO em células endoteliais: Basal (n=6), L-NAME (n=4), pool 2B, 2A e 3A (n=6), pool 3B e 3C (n=6), W146+pool 3B e 3C (n=6), Ty52156+ pool 3B e 3C (n=6), W+Ty+pool 3B e 3C (n=6), W+Ty (n=4), ANOVA p<0,0001); (B) Western Blotting eNOS: Basal (n=5), pool 3B e 3C (n=5), W146+ pool 3B e 3C (n=5), Ty52156+ pool 3B e 3C (n=5), ANOVA p<0,0001. p<0,05 significante.
5.7. Inibição de óxido nítrico com e sem vasodilatação e infusão de HDL 3B e 3C durante a reperfusão miocárdica
Para verificar a importância do NO sobre o tamanho de infarto, nós inibimos a síntese de NO com L-NAME (100 µM) durante todo o experimento e utilizamos um pool das subfrações mais eficientes em diminuir a lesão de isquemia e reperfusão miocárdica, a HDL 3B e 3C. A inibição da síntese de NO pela L-NAME aboliu o efeito da HDL 3B e 3C em reduzir o tamanho do infarto. A dimensão do infarto com L- NAME ou L-NAME com o pool de HDL 3B e 3C foram semelhantes ao controle. Em contraste, a reperfusão somente com o pool de HDL 3B e 3C diminuiu acentuadamente o tamanho do infarto comparado ao controle (-35%; p<0,0001), ao grupo L-NAME (-28%; p<0,05) e ao grupo L-NAME com pool 3B e 3C (-27%; p<0,05) (Figura 21B).
Para conferir se a perda da proteção da HDL 3B e 3C na lesão reperfusão foi em decorrência da falta de vasodilatação, nós utilizamos Hidralazina (100 µM), um fármaco vasodilatador independente da ação de NO, para manter o fluxo coronariano. Nós observamos que mesmo mantendo o fluxo coronariano basal, não houve benefício da HDL na lesão de I/R. A adição de Hidralazina em todos os ensaios foram semelhantes ao grupo controle (Figura 21A).
Esses experimentos demostraram que a vasodilatação sem a ação do NO não é responsável pela cardioproteção conferida pelas subclasses de HDL 3B e 3C.
Figura 21: Inibição de óxido nítrico com e sem vasodilatação e infusão de HDL 3B e 3C
durante a reperfusão miocárdica. A= fluxo coronariano mantido com Hidralazina + L-NAME. B= Tamaho de infarto com Hidralazina + L-NAME, ANOVA= p<0,0001. p<0,05 significante. 5.8. Bloqueio da via de vasodilatação especifica do NO e infusão de HDL 3B
e 3C durante a reperfusão em ex vivo
Nós também investigamos se o bloqueio da via de vasodilatação do NO no tecido cardíaco está diretamente envolvido ao tamanho final de infarto. Nós utilizamos um inibidor da guanilato ciclase, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1- one (ODQ, 10 µM), nos corações isolados e verificamos se o efeito protetor da HDL
3B e 3C se mantinha. Nossos resultados mostraram que a inibição da via de ação do NO na vasodilatação eliminou a proteção miocárdica pela HDL (Figura 22).
Figura 22: Bloqueio da via de vasodilatação especifica do NO e infusão de HDL 3B e 3C
durante a reperfusão em ex vivo. ANOVA: p=0,0002. p<0,05 significante.
5.9. Identificação das vias de sinalização cardioprotetoras na lesão de I/R miocárdica após 7 min de reperfusão com pool de HDL 3B e 3C
Para verificar qual via de sinalização foi responsável por tal cardioproteção observada pela redução do tamanho do infarto, nós investigamos duas vias distintas, a via da Akt/GSK3β que age na inibição de abertura do MPTP e a via da PKG que age diretamente no potencial de membrana mitocondrial, ambas as vias reduzem morte celular por apoptose. Nós evidenciamos que em 7 min de reperfusão a HDL 3B aumentou 82% (p=0,038) a ativação da Akt no tecido miocárdico isquêmico comparado ao controle (Figura 23A), ainda nós observamos que a fosforilação do sitio de inativação da GSK3β aumentou 109% (p=0,026) comparado ao grupo controle (Figura 23B). Curiosamente nós não observamos diferenças na ativação da PKG-I através da fosforilação VASP (Figura 23C).
Figura 23: Identificação das vias de sinalização cardioprotetoras na lesão de I/R miocárdica
após 7 min de reperfusão com pool de HDL 3B e 3C. A= via Akt; B= via GSK3β; C= via PKG-I. p<0,05 significante.
5.10. Efeito do pool de HDL 3B e 3C sobre a síntese de NO e viabilidade celular em cardiomiócitos (H9C2) no cenário de hipóxia e reoxigenação
Nós evidenciamos o efeito das subclasses de HDL 3B e 3C sobre a produção de NO e a proteção contra a hipóxia e reoxigenação isoladamente em
cardiomiócitos. Claramente, nós demonstramos que as partículas menores de HDL também foram capazes de estimular fortemente a síntese de NO avaliado ao final de 10 min de reoxigenação em cardiomiócitos comparado ao grupo basal (+390%; p<0,0001) (Figura 24A).
Simultaneamente, o estimulo celular com HDL 3B e 3C nos 10 primeiros minutos da reoxigenação, diminuiu em 3 vezes o número de células não viáveis ao final de 18h de reoxigenação comparado ao grupo basal (5,2 ± 1,2 vs. 15,4 ± 4,0 nº de células não viáveis; p=0,023) (Figura 24B).
Figura 24: Efeito do pool de HDL 3B e 3C sobre síntese de NO e viabilidade celular em
cardiomiócitos (H9C2) no cenário de hipóxia e reoxigenação: A= a síntese de NO (n=4); B= viabilidade celular (n=3); C= ativação GSK3β (n=3); D= ativação eNOS (n=3). p<0,05 significante.
Corroborando com as vias de sinalização observadas em corações isolados durante os minutos inicias da reperfusão com as subfrações 3B e 3C. Nós também encontramos uma fosforilação aumentada no sítio de inativação (Ser9) da GSK3β em 90% (p<0,0001) com o tratamento de pool de HDL 3B e 3C comparado ao grupo controle (Figura 24C). Além disso, nós observamos a HDL 3B e 3C aumentou em 96% (p=0,033) a ativação da eNOS (Figura 24D), esse último resultado confirmou o aumento da biodisponibilidade de NO em cardiomiócitos
5.11. O pool de HDL 3B e 3C afeta taxas de consumo de oxigênio mitocondrial e desacoplamento de uma maneira dependente de NO em tecido cardíaco após lesão de I/R
Para avaliar se a redução do infarto pelas subclasses de HDL 3B e 3C está ligada a preservação da função mitocondrial no cenário de lesão de I/R, nós mensuramos o taxa de consumo de oxigênio na área de risco do tecido miocárdico na presença de substratos do complexo-I da cadeia respiratória depois da permeabilização do tecido com saponina. Nossos resultados demonstraram que a HDL 3B3C não afetou a taxa respiratória basal (estado 2). Por sua vez, HDL 3B3C induziu 2,4 vezes (p<0,01) o aumento na taxa respiratória fosforilativa (estado 3), o qual é dependente da síntese de NO e da via de vasodilatação ligada ao NO, uma vez que o efeito se perde nos grupos tratados com L-NAME e ODQ, respectivamente. Ainda, a respiração desacoplada, medida depois da adição de FCCP, foi 2,2 vezes (p<0,001) maior no grupo tratado com HDL 3B e 3C, em relação ao grupo controle e mesmo em relação ao grupo tratado com as subclasses de HDL maiores (2B, 2A e 3A). Novamente, o efeito é atenuado nos grupos tratados com L- NAME e ODQ, sugerindo que a ação da HDL 3B e 3C depende da síntese de NO e da via de vasodilatação dependente da GC sensível ao NO. Por outro lado, a taxa de consumo de oxigênio na presença de CAT (estado 4) foi similar entre os grupos,
indicando que a respiração mitocondrial não-fosforilativa associada ao proton leak não foi afetada pela HDL, embora também haja uma tendência não-significativa de aumento (Figura 25. Juntos, estes resultados sugerem que HDL 3B 3C leva a um aumento na função da respiração mitocondrial dependente do complexo-I e que a síntese de NO é necessária para essa função.
Figura 25: Efeito do pool de HDL 3B e 3C nas taxas de consumo de oxigênio mitocondrial e
desacoplamento de uma maneira dependente de NO em tecido cardíaco após lesão de I/R. ANOVA= p<0,05. p<0,05 significante.