UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
VITOR WILSON DE MOURA VIRGINIO
HDL 3B E 3C REDUZEM A LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO E PRESERVAM A FUNÇÃO SISTÓLICA DO VENTRÍCULO ESQUERDO APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO POR MECANISMO MEDIADO PELO ÓXIDO NÍTRICO
HDL 3B AND 3C REDUCE ISCHEMIA AND REPERFUSION INJURY AND PRESERVE THE SYSTOLIC FUNCTION OF THE LEFT VENTRICLE AFTER MYOCARDIAL INFARCTION BY A MECHANISM DEPENDENT ON NITRIC OXIDE
CAMPINAS 2019
VITOR WILSON DE MOURA VIRGINIO
HDL 3B E 3C REDUZEM A LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO E PRESERVAM A FUNÇÃO SISTÓLICA DO VENTRÍCULO ESQUERDO APÓS INFARTO DO MIOCÁRDIO POR MECANISMO MEDIADO PELO ÓXIDO NÍTRICO
HDL 3B AND 3C REDUCE ISCHEMIA AND REPERFUSION INJURY AND PRESERVE THE SYSTOLIC FUNCTION OF THE LEFT VENTRICLE AFTER MYOCARDIAL INFARCTION BY A MECHANISM DEPENDENT ON NITRIC OXIDE
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, na área de Clínica Médica.
Thesis submitted to the Faculty of Medical Sciences of the State University of Campinas as part of the application required to obtain a PhD in science.
ORIENTADOR: ANDREI CARVALHO SPOSITO
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO VITOR WILSON DE MOURA VIRGINIO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO.
CAMPINAS 2019
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Virginio, Vitor Wilson de Moura,
V819h VirHDL 3B e 3C reduzem a lesão de isquemia e reperfusão e preservam a função sistólica do ventrículo esquerdo após infarto do miocárdio por mecanismo mediado pelo óxido nítrico / Vitor Wilson de Moura Virginio. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
VirOrientador: Andrei Carvalho Sposito.
VirTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Vir1. Lipoproteínas HDL. 2. Infarto do miocárdio. 3. Cardioproteção. 4.
Isquemia miocárdica. 5. Reperfusão miocárdica. 6. Óxido nítrico. 7. Respiração mitocondrial. I. Sposito, Andrei Carvalho, 1967-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: HDL 3B and 3C reduce ischemia and reperfusion injury and preserve the systolic function of the left ventricle after myocardial infarction by a mechanism dependent on nitric oxide
Palavras-chave em inglês: Lipoproteins, HDL Myocardial infarction Cardioprotection Myocardial ischemia Myocardial reperfusion Nitric oxide Mitochondrial respiration
Área de concentração: Clínica Médica Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:
Andrei Carvalho Sposito [Orientador] Licio Augusto Velloso
Fabiana Hanna Rached Marisa Passarelli
Rodrigo Bueno de Oliveira Data de defesa: 11-09-2019
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-9192-904X - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3736528026155836
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
VITOR WILSON DE MOURA VIRGINIO
ORIENTADOR: PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO
MEMBROS:
1. PROF. DR. ANDREI CARVALHO SPOSITO
2. PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO
3. PROFª. DRª. FABIANA HANNA RACHED
4. PROFª. DRª. MARISA PASSARELLI
5. PROF. DR. RODRIGO BUENO DE OLIVEIRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedicatória
Aos meus pais (Walkiria e José Vitor) minhas maiores inspirações, aos meus irmãos (João Vitor e Evelyn), ao senhor Deus todo poderoso e a todos os meus familiares e amigos.
AGRADECIMENTOS
Meu agradecimento e respeito...
Ao meu mestre Prof. Dr. Andrei Carvalho Sposito pela riquíssima orientação, não só na pesquisa, mas na vida. Já se passaram 8 anos onde a amizade e a inspiração científica só aumentaram.
Aos meus amigos de laboratório Isabella Bonilha e Helison do Carmo pela riquíssima amizade, suporte emocional e fundamental contribuição na finalização dessa tese de Doutorado. Ao Zeca, Michelle, Alexandre Soares, Camila, Luiz Sérgio pela amizade, discussões cientificas e muita aprendizagem.
A Eliene Dupret, nossa funcionária do Centro de Pesquisa Clínica, uma pessoa bondosa, rara e sempre disposta a ajudar. E também a todos os amigos do Centro de Pesquisa Clínica.
Ao Prof. Dr. Orlando Petrucci Jr. e Prof Dr. Aníbal Vercesi pela essencial colaboração na tese.
A minha família, meus pais Walkiria e José Vitor, meus irmãos João Vitor e Evelyn, e meu cunhado Rafael, por todo o suporte emocional e incentivo.
Aos meus amigos irmãos primos de alma Henricão Mendes, Lincoln Sales, Larissa Richter, William Garcia, Diego Garcia, Luiz Américo, Iago Faria, Rodrigo Rosa, Bob Fagundes, Ana Mateucci, Juninho Ramos, Bananeira, Stéfani Prestes, Gustavo Fagotti e demais amigos, por todo o suporte e diversão proporcionada ao longo da tese e da vida.
A minha grande amiga Andressa Reginato, uma pessoa fascinante que me ensinou a acreditar em mim mesmo, nunca perder as esperanças e encarar a vida de uma forma mais leve e feliz, tenho muito a agradecer e aprender com você.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização dessa tese de doutorado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pelo apoio financeiro concedido no início do projeto de Doutorado (Nº do Processo: 1501479).
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Bolsa de Doutorado, Nº do Processo: 2014/26136-9), pelo apoio e suporte financeiro no projeto de doutorado.
“Ando devagar / Porque já tive pressa / E levo esse sorriso / Porque já chorei demais / Hoje me sinto mais forte / Mais feliz, quem sabe / Só levo a certeza / De que muito pouco sei / Ou nada sei.... É preciso amor / Pra poder pulsar / É preciso paz pra poder sorrir / É preciso a chuva para florir / Penso que cumprir a vida / Seja simplesmente / Compreender a marcha / E ir tocando em frente / Como um velho boiadeiro / Levando a boiada / Eu vou tocando os dias / Pela longa estrada, eu vou.... Cada um de nós compõe a sua história / Cada ser em si / Carrega o dom de ser capaz / E ser feliz”
Resumo
A pandemia de doenças isquêmicas do coração, principalmente, manifesta na forma de infarto do miocárdio (IM) está associado a elevada taxa de mortalidade e morbidade na população mundial. Durante o IM, mesmo com rápida intervenção para a restauração do fluxo coronariano, cerca da metade da dimensão da lesão remanescente é decorrente da lesão de isquemia e reperfusão (I/R). Diversas estratégias terapêuticas vêm sendo estudadas, a fim de, reduzir os danos causados pela lesão de I/R, mas até o momento nenhuma terapia efetiva foi demonstrada. Baseado nos efeitos cardioprotetores das partículas de lipoproteína de alta densidade (High-density lipoprotein - HDL) tais como, atividade anti-inflamatória, antioxidante, antiapoptótica, além de sua importante regulação na homeostase vascular, tornam a HDL um potencial candidato na atenuação da lesão I/R. No entanto, as partículas de HDL podem ser divididas em cinco subclasses: 2B e 2A (maiores e ricas em lípides), 3A, 3B e 3C (menores e ricas em proteínas). Ainda não está claro, qual subclasse de HDL traria maiores benefícios no cenário de I/R. O objetivo desse estudo foi avaliar qual subclasse de HDL poderia resultar em maior proteção após o IM, em relação a redução do tamanho de infarto, melhora da função sistólica do ventrículo esquerdo (VE) e do fluxo coronariano. Da mesma maneira, buscou-se avaliar qual o papel da síntese de óxido nítrico (NO), bem como, explorar as vias celulares diretamente envolvidas na proteção desencadeada pela HDL/NO e proteção mitocondrial. A presente hipótese foi verificada com amostras de HDL total e de subclasses, isoladas de 15 voluntários saudáveis (26 ± 5 anos de idade). A HDL foi testada em modelo de I/R em corações isolados de ratos Wistar inseridos no sistema de Langendorff. Os corações foram submetidos a 35 minutos de isquemia regional e 90 minutos de reperfusão. As HDL foram infundidas nos minutos iniciais da reperfusão. A mesma abordagem foi testada in vitro separadamente em células endoteliais e cardiomiócitos no cenário de hipóxia-reoxigenação. A biossíntese de NO foi avaliada em ex vivo e in vitro por quimioluminescência, e as vias de cardioproteção foram evidenciadas por immunoblotting. A respiração mitocondrial foi caracterizada através da taxa de consumo de oxigênio. Nossos resultados demonstraram que a HDL total foi capaz de diminuir -24% (p<0,01) o tamanho de infarto e melhorar a função sistólica durante a reperfusão. Nós evidenciamos que as menores HDL, as subclasses 3C e 3B, foram mais eficientes em reduzir o tamanho de infarto (-30%, p<0,001; -25%, p<0,01, respectivamente) e aumentar a viabilidade de cardiomiócitos em três vezes (p=0,023) no cenário de hipóxia-reoxigenação. As HDL 3C e 3B também melhoraram a função sistólica do VE durante a reperfusão e reduziram a resistência coronariana comparado ao controle e as outras subclasses. Além disso, nós demonstramos que o NO tem um papel fundamental na cardioproteção após a isquemia e que a HDL 3C e 3B foram os fenótipos de HDL mais
eficazes em estimular o aumento da biodisponibilidade de NO no efluente coronariano (240%, p<0,0001 e 204%, p<0,0001), no meio extracelular de células endoteliais coronarianas humanas (330%, p<0,0001) e cardiomiócitos (390%, p<0,0001) comparado ao controle. Em células endoteliais, esse acréscimo de NO pelas subclasses 3C e 3B foram via receptores S1P1 e S1P3, confirmado pela ativação da eNOS. Ainda, em tecido miocárdico submetido a I/R e em cardiomiócitos no cenário de hipóxia-reoxigenação, o pool de HDL 3B e 3C ativou a via cardioprotetora Akt/GSK3β envolvida na proteção mitocondrial (109%, p=0,038 e 90%, p<0,0001) em comparação ao controle. Por fim, nós demonstramos que o pool de HDL 3B e 3C leva a um aumento da respiração mitocondrial no estado 3 (60%, p<0,01), na respiração máxima (55%, p<0,001) e que a síntese de NO é necessária para tal benefício. Nosso estudo concluiu que os fenótipos de HDL 3C e 3B foram capazes de atenuar a lesão de I/R, através da redução do tamanho de infarto e melhora da função hemodinâmica. Parte desses benefícios foram decorrentes da: (i) capacidade de estimular a biodisponibilidade de NO no efluente coronariano, em células endoteliais e em cardiomiócitos; (ii) pela ativação da via de cardioproteção Akt/GSK3β; (iii) e pelo aumento da função da respiração mitocondrial.
Palavras-chave: lipoproteína de alta densidade; infarto do miocárdio; cardioproteção; lesão de isquemia e reperfusão; óxido nítrico; respiração mitocondrial.
Abstract
The pandemic of ischemic heart disease mainly manifested in the form of myocardial infarction (MI) is associated with a high mortality and morbidity rate in the world population. During MI, even with rapid intervention to restore coronary flow, about half the size of the remaining lesion is due to ischemia and reperfusion (I/R) injury. Several therapeutic strategies have been studied to reduce the damage caused by I/R injury, however, no effective therapy has been demonstrated. Based on the cardioprotective effects of high-density lipoprotein (HDL) particles such as anti-inflammatory, antioxidant, antiapoptotic activity, as well as its important regulation on vascular homeostasis, make HDL a potential candidate for attenuation I/R injury. HDL particles can be divided into five subclasses: 2B and 2A (larger and rich in lipids), 3A, 3B and 3C (smaller and rich in proteins). However, it is not clear until now which HDL subclass would yield the most benefits in the I/R injury. The aim of this study was to evaluate which HDL subclass could result in greater protection after MI, in relation to infarct size, left ventricular (LV) systolic function, and coronary flow. Similarly, we sought to evaluate the role of nitric oxide (NO) synthesis, as well as to explore the cell pathways directly involved in the protection triggered by HDL/NO and mitochondrial protection. The present hypothesis was verified with total and subclass HDL samples isolated from 15 healthy volunteers (26 ± 5 years old). HDL was tested in an I/R model in hearts isolated from Wistar rats perfused in the Langendorff system. The hearts were submitted to 35 minutes of ischemia and 90 minutes of regional myocardial reperfusion. The HDL was infused at very first minutes of reperfusion. The same approach was tested in vitro separately on endothelial and cardiomyocytes cells in the hypoxia-reoxygenation scenario. NO biosynthesis was evaluated ex vivo and in vitro by chemiluminescence, and cardioprotection pathways were evidenced by immunoblotting. Mitochondrial respiration was characterized by the rate of oxygen uptake Our results demonstrated that total HDL was able to decrease -24% (p<0.01) infarct size and improve systolic function during reperfusion. We found that the smallest HDL, subclasses 3C and 3B, were more efficient in reducing infarct size (-30%, p<0.001; -25%, p<0.01, respectively) and increasing viability of cardiomyocytes (three times; p=0.023) in the hypoxia-reoxygenation scenario. HDL 3C and 3B also improved LV systolic function during reperfusion and reduced coronary resistance compared to control and other subclasses. In addition, we have shown that NO plays a key role in cardioprotection after ischemia and that the HDL 3C and 3B were the most effective phenotypes in stimulating increased NO bioavailability in coronary effluent (240%, p<0.0001 and 204%, p<0.0001), in the extracellular environment of human coronary endothelial cells (330%, p<0.0001) and cardiomyocytes (390%, p<0.0001). In endothelial cells, this NO increase by subclasses 3C and 3B were via S1P1 and S1P3 receptors in order of magnitude,
confirmed by eNOS activation. Also, in myocardial tissue submitted to I/R and cardiomyocytes in the hypoxia-reoxygenation scenario, the HDL 3B and 3C pool activated the Akt/GSK3β cardioprotective pathway involved in mitochondrial protection (109%, p=0.038 and 90%, p<0.0001). Finally, we demonstrate that the HDL 3B and 3C pool increase the mitochondrial respiratory function at state 3 (60%, p<0.01), maximal respiration (55%, p<0.001) and that NO synthesis is required for such a benefit. Our study concluded that HDL 3C and 3B phenotypes were able to attenuate I/R injury by reducing infarct size and improving hemodynamic function. Part of these benefits were due to: (i) the ability to stimulate NO bioavailability in coronary effluent, endothelial cells and cardiomyocytes; (ii) activation of the Akt/GSK3β cardioprotection pathway responsible for the reduction of cell death; (iii) and finally, by increased mitochondrial respiration function.
Keywords: high-density lipoprotein; myocardial infarction; cardioprotection; ischemia and reperfusion injury; nitric oxide; mitochondrial respiration.
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCA1: transportadores ABC (ATP-binding cassette) do tipo A1 ABCG1: transportadores ABC (ATP-binding cassette) do tipo G1 ADP: adenosina difosfato
Akt (PKB): serina / treonina quinase (proteína quinase B) ApoA-I: apolipoproteína A-I
BH4: tetrahidrobiopterina
BIOPS: solução de relaxamento e preservação
BSA: bovine serum albumin (soro de albumina bovina) CaM: complexo cálcio / calmodulina
CAT: carboxiatractilosídeo Cav-1: caveolina-1
CE: colesterol esterificado
CETP: proteína de transferência de colesterol esterificado CIR: condicionamento isquêmico remoto
CKMB: creatina quinase isoforma MB DAC: doença arterial coronariana DAE: descendente anterior esquerda DCV: doenças cardiovasculares
dP/dt max: máxima frequência de mudança da pressão do ventrículo esquerdo eNOS: óxido nítrico sintase endotelial
ERO: espécies reativas de oxigênio FAD: flavina adenina dinucleotídeo
FCCP: carbonil cianeto 4-trifluorometo xifenil hidrazona FMN: flavina mononucleotídeo
GC: guanilato ciclase
GMPc: guanosina monofosfato cíclico GPCR: receptores acoplados à proteína G GSK3β: glicogênio sintase quinase 3 beta GTP: guanosina trifosfato
H9C2: célula mioblástica cardíaca
HDL: high-density lipoprotein (lipoproteína de alta densidade) HUVEC: células endoteliais da veia umbilical humana
I/R: isquemia e reperfusão
ICP: intervenção coronariana percutânea IM: infarto do miocárdio
LCAT: enzima lecitina aciltransferase
LDL: low-density lipoprotein (lipoproteína de baixa densidade) L-NAME: NG-nitro-L-arginine methyl ester
MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno
MPTP: poro de transição de permeabilidade mitocondrial NF-κB: fator nuclear kappa B
NO: óxido nítrico
OCR: oxygen consumption rate (taxa de consumo de oxigênio) ODQ: [1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one
PAF-AH: acetil-hidrolase do fator ativador de plaquetas PBS: tampão fosfato salino
PCI: pré-condicionamento isquêmico PI3K: fosfatidilinositol 3-quinase PKG: proteína quinase G
PKG-I: proteína quinase G tipo I
PLTP: proteína de transferência de fosfolípides PON: paraoxonase
PON-1: paraoxonase tipo 1
POPC: 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina PosCI: pós-condicionamento isquêmico
RISK: quinases de salvamento de lesão por reperfusão S1P: esfingosina-1-fosfato
S1P1: receptor de esfingosina-1-fosfato tipo 1 S1P3: receptor de esfingosina-1-fosfato tipo 3 SAA: soro amiloide A
SAFE: survival activating factor enhancement SBF: soro fetal bovino
SRB1: scavenger receptor class B type 1 (receptor scavenger classe B tipo 1) TG: triglicérides
TNFα: fator de necrose tumoral alfa TTC: cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio
VASP: fosfoproteína estimulada por vasodilatação VE: ventrículo esquerdo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 17
1.1. Epidemiologia e definição de infarto do miocárdio ... 17
1.2. Intervenções após o IM e lesão de isquemia e reperfusão ... 18
1.3. Estratégias de redução da lesão de I/R miocárdica ... 21
1.4. Lipoproteína de alta densidade (High-density lipoprotein, HDL) como um candidato terapêutico na lesão de I/R ... 23
1.4.1. Biossíntese da HDL ... 24
1.4.2. Composição e funções das subclasses de HDL ... 25
1.4.3. HDL-S1P e vias de proteção pós IM ... 28
1.4.4. HDL-ApoA-I e vias de proteção pós IM ... 31
1.4.5. Evidências atuais da relação HDL-C e doença coronariana ... 33
2. HIPÓTESE ... 34
3. OBJETIVOS: Primários e Secundários ... 35
4. MÉTODOS ... 36
4.1. Sujeitos e isolamento de HDL ... 36
4.2. Avaliação da lesão de I/R miocárdica regional em modelo ex vivo de coração isolado de ratos Wistar: Grupos experimentais ... 37
4.3. Síntese de NO em células endoteliais coronarianas e inibição dos receptores de S1P: Efeito das subclasses de HDL ... 42
4.4. Avaliação da hipóxia e reoxigenação em cardiomiócitos estimulados com pool de HDL 3B e 3C sobre a produção de NO e viabilidade celular ... 43
4.5. Quantificação de NO em efluente coronariano e meio de cultura celular Teste de tolerância à glicose ... 44
4.6. Técnica de Immunoblotting (Western Blotting) ... 45
4.7. Respiração mitocondrial no cenário de I/R miocárdica ... 45
4.8. Análises estatísticas ... 47
5. RESULTADOS ... 48
5.1. Efeito da HDL total sobre a dimensão do infarto e a preservação da função sistólica do ventrículo esquerdo ... 48
5.2. Associação do tamanho de infarto com o fluxo e resistência coronariana durante a infusão de HDL total ... 49
5.3. Efeito da reperfusão coronariana com subclasses de HDL sobre o tamanho de infarto e função sistólica do ventrículo esquerdo ... 52
5.4. Fluxo e resistência coronariana com a infusão de subclasses de HDL ... 54 5.5. Associação entre a síntese de óxido nítrico induzido pelas subclasses de HDL e
tamanho de infarto ... 55
5.6. Efeito das subclasses de HDL na via da produção de NO em células endoteliais coronarianas humanas: Resultado do bloqueio dos receptores de S1P ... 57
5.7. Inibição de óxido nítrico com e sem vasodilatação e infusão de HDL 3B e 3C durante a reperfusão miocárdica ... 60
5.8. Bloqueio da via de vasodilatação específica do NO e infusão de HDL 3B e 3C durante a reperfusão em ex vivo ... 61
5.9. Identificação das vias de sinalização cardioprotetoras na lesão de I/R miocárdica após 7 min de reperfusão com pool de HDL 3B e 3C ... 62
5.10. Efeito do pool de HDL 3B e 3C sobre a síntese de NO e viabilidade celular em cardiomiócitos (H9C2) no cenário de hipóxia e reoxigenação ... 63
5.11.O pool de HDL 3B e 3C afeta taxas de consumo de oxigênio mitocondrial e desacoplamento de uma maneira dependente de NO em tecido cardíaco após lesão de I/R .. ... 65
6 DISCUSSÃO ... 67
7 CONCLUSÃO ... 71
8 LIMITAÇÕES E PESPECTIVAS ... 73
9 REFERÊNCIAS ... 74
1. INTRODUÇÃO
1.1. Epidemiologia e definição de infarto do miocárdio
Segundo a Organização Mundial de Saúde, as doenças isquêmicas do coração estão no topo da lista de causas de mortes em todo o mundo. Em 2016, nove milhões de pessoas foram a óbito em decorrências de infarto do miocárdio (IM), representando 16% da mortalidade global (Figura 1) (1). No Brasil em 2011, foram registradas 385 mil mortes por doenças cardiovasculares (DCV), dentre as quais, 120 mil foram por IM (2). Além disso, em 2010 foi estimado que o tratamento mundial das DCV resultaram em um custo de U$863 bilhões de dólares e que até 2030 os custos vão ultrapassar U$1 trilhão (1).
Figura 1: As 10 principais causas de morte globais em 2016, adaptado de (1).
Nos últimos anos, o avanço na medicina e os esforços nas campanhas de prevenção das DCV reduziram consideravelmente a mortalidade por doença coronariana nos países desenvolvidos. No entanto, a prevalência de DCV e seus principais fatores de risco como a hipertensão, a obesidade e o diabetes, tornaram-se uma crescente pandemia global. As DCV e suas comorbidades estão associados principalmente com a transição da produção agrícola para industrial, urbanização, atividade física e as desigualdades sociais e econômicas (3).
O IM representa a principal causa de óbito e incapacidade entre as DCV. A aterosclerose é uma doença crônica causada principalmente pelo acumulo de
colesterol na parede dos vasos susceptíveis, como as artérias coronárias que irrigam o musculo cardíaco. Essa doença transita por períodos estáveis e instáveis. No cenário de instabilidade ocorre prevalência de inflamação ativa na parede vascular e pode gerar o IM. O IM é definido como morte das células cardíacas em decorrência da oclusão/isquemia prolongada do vaso. Nesse contexto, a privação de oxigênio e nutrientes é gerada principalmente pela estenose vascular parcial ou total em decorrência da: (i) Ruptura/erosão de placas ateroscleróticas com formação de trombos; (ii) Placas ateroscleróticas fixas; (iii) Vaso espasmos; (iv) Disfunções microvasculares; ou (v) Dissecções. A formação de placa aterosclerótica é progressiva e assintomática, em alguns casos o IM pode ser indetectável, mas em compensação pode gerar eventos intensos como disfunções hemodinâmicas graves ou morte súbita. O IM pode representar a primeira manifestação de doença arterial coronariana (DAC) ou pode ocorrer repetidas vezes em pacientes com doença estabelecida. Clinicamente o IM pode ser identificado pela história do paciente, e através de alterações no eletrocardiograma e/ou marcadores bioquímicos de lesão do musculo cardíaco, como troponina e a creatina quinase isoforma MB (CKMB) (4, 5).
1.2. Intervenções após o IM e lesão de isquemia e reperfusão
Estratégias clínicas para proteger o miocárdio isquêmico têm sido amplamente exploradas. Após o IM, a intervenção coronariana percutânea primária (ICP), a cirurgia de revascularização e a trombólise são os principais avanços na atenuação da necrose miocárdica e na redução da mortalidade. Todas essas intervenções buscam a retomada da irrigação do tecido cardíaco. Baseado em estudos experimentais e observações clínicas, a restauração do fluxo sanguíneo, após uma isquemia miocárdica prolongada, pode reduzir até 50% do tamanho do infarto, no entanto, metade do infarto remanescente é devido a lesão de isquemia e reperfusão (I/R) (Figura 2) (6-8). Um estudo demostrou que após a cirurgia de revascularização do miocárdio a lesão de reperfusão se associou com 25% da mortalidade. O tempo curto de sobrevida também revelou a letalidade dessa complicação (9). A investigação de agentes que possam reduzir esses danos durante a reperfusão miocárdica podem ser determinantes na melhora da qualidade
de vida e na redução da mortalidade após o IM, mas até o momento nenhuma terapia efetiva foi demonstrada ou reproduzida em estudos clínicos.
Figura 2: Ilustração do benefício da reperfusão oportuna e lesão de isquemia e reperfusão
miocárdica, adaptado de (7).
O mecanismo da lesão de I/R incluem dois estágios em cardiomiócitos: (i) Durante a hipóxia gerada pela oclusão do vaso, as células alteram seu metabolismo para a respiração anaeróbica. Nesse estágio ocorre produção de lactato e queda do pH intracelular. Essa mudança no metabolismo gera um desbalanço iônico que resulta na sobrecarga de Na+ que induz o acumulo de cálcio intracelular. As condições ácidas inibem a abertura dos poros de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP) e a contratação dos cardiomiócitos; (ii) No momento da reperfusão, a cadeia de transporte de elétrons é reativada e ocorre produção demasiada de espécies reativas de oxigênio (ERO). Outras fontes de ERO incluem a xantina oxidase produzida a partir de células endoteliais e NADPH oxidase de neutrófilos. As ERO estão diretamente ligadas aos danos gerados na lesão de reperfusão. Esses radicais livres induzem a abertura do MPTP, provocam disfunção no reticulo sarcoplasmático e promovem a quimiotaxia de neutrófilos (inflamação).
Esses fatores intensificam a sobrecarga de cálcio, a desnaturação de enzimas, a perda da integridade na membrana celular e dano oxidativo diretamente ao DNA. A restauração abrupta do pH fisiológico durante a reperfusão reata a contração dos cardiomiócitos e nesse estágio de disfunção celular intensifica a apoptose e a morte das células (Figura 3) (7, 10).
Figure 3: Esquema do mecanismo intracelular da lesão de I/R miocárdica. O mecanismo dessa lesão envolve dois estágios: (i) Isquemia, devido à falta de oxigênio as células mudam seu metabolismo para respiração anaeróbica, ocorre queda do pH intracelular e consequente desbalanço iônico, aumento de cálcio intracelular e alterações no MPTP. (ii) Reperfusão, a rápida retomada do pH intracelular, induz a geração de espécies reativas de oxigênio, a abertura do MPTP, danos na parede celular e em consequência apoptose e morte celular. MPTP= poros de transição de permeabilidade mitocondrial, SR= retículo sarcoplasmático. Adaptado de (10).
A intensidade da lesão de I/R que sobrevém ao IM representa um importante determinante não apenas de morte celular de cardiomiócitos, mas também pode gerar apoptose e disfunção das células endoteliais no leito das coronárias (11).
Diferentemente das células miocárdicas, as células endoteliais são mais resistentes à isquemia, sendo capazes de manter suas funções mesmo após 4 a 6 horas de isquemia. Entretanto, as células endoteliais são extremamente mais sensíveis ao processo de reperfusão, reduzindo bruscamente sua produção de óxido nítrico (NO) mesmo após curto período de reperfusão (2 minutos) (12, 13).
1.3. Estratégias de redução da lesão de I/R miocárdica
Centenas de estudos clínicos e experimentais investigam estratégias que atenuem a lesão de I/R. As principais abordagens podem ser classificadas pela modalidade de proteção, tempo de aplicação, alvo celular ou intracelular. Os métodos mais estudados incluem a administração fármacos (antes, durante ou após a isquemia), a aplicação de curtos períodos de I/R (condicionamento isquêmico) ou de medidas físicas (hipotermia, estimulação elétrica, entre outros) (14).
As estratégias baseadas no condicionamento isquêmico abrangem o pré-condicionamento isquêmico (PCI, antes ou durante a isquemia), pós -condicionamento isquêmico (PosCI, início da reperfusão) e -condicionamento isquêmico remoto (CIR, curtos atrasos do fluxo na reperfusão). Estudos mostraram que o PCI diminuiu o desacoplamento da eNOS, a formação de ERO, aumentou a ativação das vias da proteína quinase G (PKG), da via Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) e da via Survivor Activating Factor Enhancement (SAFE) em cardiomiócitos. O CIR também manteve a preservação da PKG, atuou na função mitocondrial e na ativação das vias RISK e SAFE (8, 14). O PosCI protege a o miocárdio principalmente por retardar a normalização do pH intracelular e fornece o efeito protetor principalmente por sua capacidade de retardar a normalização do pH. Essa função reduz os danos oxidativos e preservam as vias de sinalização NO-cGMP-PKG e o desbalanço iônico e a sobrecarga de cálcio (15).
As estratégias cardioprotetoras podem ser categorizadas por seus alvos finais, o primeiro grupo inclui alvos moleculares envolvidos principalmente na morte por necrose celular que abrangem proteases, bombas iônicas, ERO, vias de contração e o MPTP. Essa primeira estratégia se baseia na utilização de moléculas farmacológicas e geralmente não resultam em ensaios clínicos. Com exceção da Ciclosporina A, que tem como alvo o MPTP, esse fármaco resultou em experimentos pré-clínicos inconsistentes e falhou em ensaios clínicos. A lesão de I/R pode resultar
em diferentes tipos de morte celular como apoptose, piroptose, autofagia e necroptose. Identificar o mecanismo desses diferentes tipos de morte celular podem gerar novas vias de proteção na lesão de I/R. O segundo grupo de alvos são vias de sinalização cardioprotetoras, como a cascata de vasodilatação do NO/cGMP/PKG, via RISK e SAFE, metabolismo dos cardiomiócitos e preservação da morfologia mitocondrial. A inflamação é outro alvo adicional que se intensifica após a isquemia (Figura 4) (14, 16, 17).
Vários agentes farmacológicos foram testados na lesão de I/R, as estratégicas mais relevantes e suas vias de proteção estão evidenciadas na Figura 5. As principais vias de proteção ativadas por esses agentes se basearam na ativação de receptores acoplados à proteína G (GPCR) e subsequente ativação de PI3K/Akt que leva produção de NO pelo aumento da atividade da eNOS. Esse episódio favorece a ativação da via da guanilato ciclase (GC) e da PKG. Os substratos da PKG incluem a proteína reguladora do reticulo sarcoplasmático (Fosfolamban) que promove a redução de cálcio citosol e inibe a abertura do MPTP. A ativação da Akt também é capaz de ativar o sítio de inibição GSK3β (Proteína pró-apoptótica) inibindo a abertura do MPTP. Essas duas vias de proteção resultam na redução de apoptose e consequente morte celular (Figura 5) (15). Uma forma eficaz de avaliar a atividade aumentada da PKG na cardioproteção é através da verificação da fosforilação da fosfoproteína estimulada por vasodilatação (VASP) na serina S239, estudo mostram sua forte associação com a atividade da PKG (18).
Figura 4: Estratégias terapeutícas mais promissoras e suas vias cardioprotetoras na lesão
de I/R. GPCR= ativação de certos receptores acoplados à proteína G; ANP= peptídeo natriurético atrial; cGMP= monofosfato de guanilato cíclico; GTP= trifosfato de guanosina; IPre= pré-condicionamento isquêmico; IPost= pós-condicionamento isquêmico; NO= óxido nítrico; GC= guanilato ciclase; PKG= proteína quinase G; RIC= condicionamento isquêmico remoto; MPTP= poro de transição da permeabilidade mitocondrial., adaptado de (15).
A utilização individual desses alvos na aplicação clínica gerou sucessos de graus variados em pacientes. A hipótese atual é que a junção de múltiplos alvos em uma única terapia poderia potencializar a cardioproteção, uma vez que o IM é multifatorial, e decorre da morte de cardiomiócitos por diferentes mecanismos, além de afetar outros tipos de celulares presentes no miocárdio, como fibroblastos, células endoteliais, células do musculares liso, plaquetas e células imunes (14).
1.4. Lipoproteína de alta densidade (High-density lipoprotein, HDL) como um candidato terapêutico na lesão de I/R
Devido as suas multifunções cardioprotetoras em diferentes tipos celulares, vários estudos têm indicado que as partículas da lipoproteína de alta densidade (HDL) são as candidatas ideais para reduzir os danos causados pela lesão de I/R e aumentar as vias de proteção miocárdica. Em células endoteliais, a HDL diminui a
expressão de moléculas de adesão, aumenta síntese de prostanóides, de óxido nítrico (NO) e intensifica a neoangiogênese. Em cardiomiócitos, a HDL reduz a apoptose, citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), e é capaz de aumentar as vias de sobrevivência celular e a captação de glicose, potencializando a função cardiovascular. Ainda, em leucócitos, a HDL diminui a quimiotaxia e a síntese de enzimas proteolíticas (19, 20).
A HDL é uma nanopartícula endógena que está envolvida no transporte e metabolismo do colesterol, fosfolípides e triglicérides, além da crucial manutenção da homeostase vascular mantendo importante ação na vasodilatação. As partículas de HDL são transportadoras de centenas de ligantes, incluindo proteínas, vitaminas, hormônios, fosfolípides funcionais e microRNAs para vários órgãos e tecidos. A eficácia do sistema HDL depende de características bioquímicas e biofísicas da partícula, mas igualmente da expressão de receptores celulares e da transferência de moléculas mensageiras ao seu alvo. Não é por menos que a HDL é genericamente denominada “colesterol bom", além de remover o excesso de colesterol celular e evitar a formação de placas ateroscleróticas, ela também possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, que protegem o sistema cardiovascular (21, 22).
A HDL como uma nanopartícula endógena possui características únicas, até o momento não foram produzidas nanopartículas artificias com o diâmetro de 8-12 nanômetros (nm) e tamanha efetividade. A sua meia vida de 12-24 horas e a alta tolerabilidade plasmática (até 8 g de proteína por infusão) são potenciais alvos terapêuticos. Atualmente vários tipos de ApoA-I recombinante e peptídeos miméticos de ApoA-I foram desenvolvidos para o preparo de HDL reconstituída com qualidades semelhantes as HDLs endógenas (21). No entanto, ainda são necessários estudos que evidenciem o fenótipo e a composição ideal de HDL para cada tipo de doença.
1.4.1. Biossíntese da HDL
O processo de síntese e remodelamento da HDL geram partículas que variam em tamanho, densidade, carga da superfície e composição. A ApoA-I e a apolipoproteína A-II são responsáveis por aproximadamente 90% do conteúdo proteico da HDL, no entanto foram descritos mais de 100 tipos diferentes de proteínas associadas à HDL (23).
A ApoA-I livre ou pobre em lípides são a base estrutural para a formação da HDL. Esses precursores são sintetizados no fígado e no intestino, mas também podem ser formados a partir de subprodutos originados de lipoproteína ricas em triglicérides (TG) (VLDL e quilomícrons), ou através do processo de conversão entre as classes de HDL 2 e 3. A HDL nascente é instável e rapidamente capta colesterol e fosfolípides das membranas celulares via transportadores ATP-binding cassette do tipo A1 (ABCA1) e G1 (ABCG1) e também via receptores scavenger do tipo B1 (SR-B1). O colesterol adquirido é esterificado pela enzima lecitina aciltransferase (LCAT) formando um núcleo lipídico composto exclusivamente por colesterol esterificado (CE) e uma pequena quantidade de TG. Esse processo resulta na formação da HDL3, caracterizada como uma partícula densa, esférica, pequena e pobre em lípides. O processo prolongado de esterificação pela LCAT acarreta no desenvolvimento da HDL2, uma partícula maior em tamanho, mais leve e rica em lípides (22).
As classes de HDL 2 e 3 sofrem constantemente remodelamento intravascular. Por intermédio da proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP), a HDL transfere CE e recebe TG das lipoproteínas que contém apolipoproteína B (VLDL, IDL e LDL). A HDL também pode ser modificada pela proteína de transferência de fosfolípides (PLTP). Por fim, as HDLs ricas em triglicérides são hidrolisadas pela lipase hepática e as ricas em fosfolípides fornecem substrato para a lipase endotelial e a fosfolipase do tipo A2 (22).
1.4.2. Composição e funções das subclasses de HDL
A técnica de ultracentrifugação permitiu a identificação de cinco subclasses distintas de HDL: (i) as HDL 2B e 2A, grandes e leves; (ii) e as HDL 3A, 3B e 3C, partículas menores e densas. As subclasses de HDL 2B, 2A e 3A são quantitativamente predominantes em indivíduos normolipidêmicos (22, 24).
As HDL3 possuem um grande volume proteico em relação a HDL2 (Tabela 2) (25). A ApoA-I estão presentes em grandes quantidades nas HDL3, porém as apolipoproteínas M, J, L-I, F e as enzimas paraoxonase 1 e 3 (PON1 e 3), PLTP e a PAF-AH foram identificadas quase que exclusivas nas subclasses 3C. Foi demonstrado em vários estudos que as enzimas PON1 e PAF-AH possuem alta atividade antioxidante, a PON1 é preferencialmente abundante nas HDL 3C (22, 26).
As atividades das enzimas associadas ao HDL (LCAT, PON1, PAF-AH) são igualmente elevadas em HDL3C. Por outro lado, as apolipoproteínas E, I, II e C-III foram predominantemente encontradas nas HDL2 (22).
Em relação aos lípides, a concentração de colesterol, triglicérides e ácidos graxos totais diminui progressivamente da HDL2B para 3C. Entretanto a proporção de fosfolípides se mantém igual levando em conta o tamanho da partícula, principalmente com os subtipos fosfatidilcolina, fosfatidietanolamina, fosfatidilinositol, esfingomielina e lisofosfatidilcolina. Também foi observado que a concentração de pequenos lípides bioativos da família dos esfingolípides, a esfingosina-1-fosfato (S1P) estão presentes 2-3 vezes mais nas partículas de HDL3. Um estudo recente demonstrou que as subclasses 3B e 3C contém concentrações similares de S1P cerca de 3 vezes mais comparado com a HDL2B e 2A (Tabela 1) (22, 25).
Tabela 1: Composição química e conteúdo de S1P das subclasses de HDL HDL 2B HDL 2A HDL 3A HDL 3B HDL 3C Proteína total (massa, %) 36,8 ± 4,8 36,8 ± 2,8 47,5 ± 4,4 53,6 ± 4,2 60,7 ± 1,8 Fosfolípides (massa, %) 29,4 ± 3,9 (43,7) 29,2 ± 5,2 (46,1) 25,9 ± 6,3 (46,7) 22,4 ± 4,7 (46,1) 18,2 ± 2,3 (44,6) Colesterol livre (massa, %) 5,7 ± 1,5 (8,4) 3,7 ± 0,8 (5,9) 2,9 ± 0,8 (5,1) 2,2 ± 0,4 (4,5) 1,8 ± 0,1 (4,4) Colesterol esterificado (massa, %) 25,6 ± 0,8 (38,0) 23,8 ± 0,2 (37,4) 21,9 ± 0,8 (39,6) 20,2 ± 1,8 (41,3) 17,2 ± 1,8 (42,0) Triglicérides (massa, %) 6,7 ± 1,8 (10,0) 6,7 ± 2,8 (10,6) 4,7 ± 1,6 (8,6) 4,0 ± 1,4 (8,2) 3,7 ± 1,3 (9.0) ApoA-I (massa, %) 30,4 ± 4,1 28,1 ± 4,6 35,1 ± 1,8 40,0 ± 3,2 45,0 ± 2,6 S1P (mmol/mol HDL) 19,3 ± 9,6 14,4 ± 3,2 35,9 ± 3,5 65,1 ± 16.4 62,8 ± 16,8 Composição química e concentração de S1P nas subclasses de HDL, adaptado (25).
Foi demonstrado em vários estudos que as HDL3 são responsáveis pela maioria dos efeitos cardioprotetores da HDL, principalmente no efluxo de colesterol,
na atividade antioxidante, anti-inflamatória, antitrombótica, antiapoptótica e na vasodilatação (Tabela 2) (25, 27). No entanto estudos demonstram que as HDL2 são mais eficientes em realizar efluxo de colesterol devido aos seus ligantes mais eficientes e a conformação da ApoA-I que facilita o efluxo de colesterol (63).
Tabela 2: Funções ateroprotetoras das classes de HDL Funções Ateroprotetoras Classes de HDL Características Conteúdo Responsável Efluxo de colesterol HDL 3 Potente efluxo em macrófagos; Potente efluxo
via ABCA1; Potente ativação da LCAT
Diferentes conformações da ApoA-I; Conteúdo
lipídico reduzido
HDL 2 Potente efluxo via ABCG1 e SR-B1
Elevação do conteúdo de FL; Conformação da
ApoA-I
Antioxidante HDL 3
Potente proteção contra oxidação da LDL; Potente inativação de LOOH e outros FL oxidados Depleção de SM e enriquecimento de ApoA-I e enzimas hidrolíticas Anti-inflamatória HDL 3 Inibição da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais Diferentes conformações da ApoA-I e composição de FL Capacidade imunomoduladora em neutrófilos Proteínas relacionadas com fator H Citoprotetora HDL 3
Potente proteção das células endoteliais contra a apoptose induzida por LDL
oxidada Enriquecimento em ApoA-I e S1P Vasodilatação HDL 3 Produção de NO em células endoteliais; Potente vasodilatação em anéis de aortas de coelho Conteúdo de S1P e ApoA1 HDL 2 Induz a diminuição da produção de tromboxano A2 (vasoconstritor) Antitrombótica HDL 2 Inibição da agregação
plaquetária
Enriquecimento de ApoE
HDL 3 Potente atividade anticoagulante
Enriquecimento de TFPI e S1P
HDL 3: menores e densas; HDL 2: maiores e leves; ABCA1: ATP-binding cassete
transporter A1; LCAT: lecitina colesterol aciltransferase; ApoA-I: apolipoproteína A-I; FL: fosfolípides; ABCG1: ATP-binding cassete transporter G1; SR-B1: receptor scavenger do tipo B1; LDL: lipoproteína de baixa densidade; SM: esfingomielina; LOOH: hidroperóxido lipídico; S1P: esfingosina-1-fosfato; TFPI: inibidor da via do fator tecidual. Tabela adaptada de (25, 27).
1.4.3. HDL-S1P e vias de proteção pós IM
A S1P é um mediador lipídico envolvido no controle de muitas funções fisiológicas no sistema imune e no sistema vascular, o qual circula no plasma em baixas concentrações (~1 µM) é primariamente carreado pela HDL (~65%; ApoM+HDL), especificamente mais abundante nas subclasses com maior conteúdo de ApoM, ou pela albumina (~35%). Suas funções celulares ocorrem através de interações intracelulares diretas ou através de cinco diferentes receptores de membrana acoplados à proteína G (S1P1-5), que desencadeiam algumas cascatas de sinalização celular. O receptor S1P1 e S1P3, em particular, são importantes ativadores de cardioproteção tanto no endotélio quanto em cardiomiócitos (28, 29).
Por tudo isto, tanto albumina quanto HDL agem como aceptores da S1P exportada da célula, que pode ser proveniente de vários tipos celulares com potencial de geração de S1P (30). Em particular, as principais fontes plasmáticas de S1P são eritrócitos, plaquetas, células mononucleares e células endoteliais. Interessantemente, as células endoteliais vasculares liberam S1P em resposta a estímulos danosos, como estresse de cisalhamento (31), com a função de promover sobrevivência celular.
Em paralelo, a S1P é responsável por 60% do efeito vasodilatador da HDL, o conteúdo de S1P ativa enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). A indução de NO pela S1P acontece diretamente em dois receptores em células endoteliais o S1P1 e S1P3 (32, 33). Esses dois receptores ativam a eNOS pela via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) / proteína quinase B (Akt) ou proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) (46). Essas evidências nos mostram que S1P sinaliza uma rápida resposta celular e demonstra ser o principal ativador de NO endotelial. Foi demostrado que 50% da vasodilatação induzida pela HDL foi perdida
em camundongos knockout para S1P3 (30) e um recente estudo mostrou que em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) a ativação da eNOS ocorre similarmente em ambos os receptores S1P1 e S1P3 (47).
Figura 5: Potenciais interações celulares cardioprotetoras HDL-S1P durante IM. A apoptose de macrófagos é um evento crítico inicial na progressão da aterosclerose. O HDL/S1P inibe a apoptose de macrófagos através de JAK (janus quinase) 2 / STAT3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3) e expressão de survivina. Nos cardiomiócitos, o HDL/S1P se liga à via do ERK (quinase regulada por sinal extracelular) desencadeada por S1P2 para induzir STAT3 mitocondrial a diminuir a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial (MPTP) e subsequente apoptose induzida por mitocôndrias. Da mesma forma, HDL/S1P ativa a via Akt (serina / treonina quinase) / NO e desativa GSK3β via receptores S1P1 e S1P3, que culmina na cardioproteção contra a lesão de I/R. O HDL/S1P também pode promover a fosforilação da Cx43 (conexina 43) através da PKC (proteína quinase C),
que também desempenha um papel cardioprotetor central na diminuição da morte celular. Outra via protetora alternativa contra a I/R é a via SAFE, que envolve TNF (fator de necrose tumoral) e STAT3. O HDL/S1P pode ativar a via SAFE via S1PR/JAK/STAT3 ou através de uma ligação com TNF liberado por cardiomiócitos após pré-condicionamento e pós-condicionamento isquêmico, o que desencadeia a cascata TNFR2 (receptor TNF 2) / TRAF2 (fator 2 associado ao receptor TNF) / SK1 / S1P. Nas células endoteliais, o HDL/S1P induz a síntese de NO através da eNOS via S1P1 e S1P3 / Akt ou Erk. O HDL também induz a expressão de COX-2 (ciclo-oxigenase 2) em células endoteliais de veia umbilical humana, contribuindo para sua ação cardioprotetora, através da PKC e Sphk2. Além disso, o S1P ligado ao HDL atenua a resposta inflamatória em células endoteliais vasculares via NF-κB. ETC= cadeia transportadora de elétrons; I/R= isquemia e reperfusão; MAPK= proteína quinase ativada por mitogênico; pAkt= serina / treonina quinase fosforilada; PI3K= fosfatidilinositol-4,5-bifosfato 3-cinase; SK1= esfingosina quinase 1; e Sphk1= esfingosina quinase 1, adaptado de (29).
No ambiente de lesão de I/R a HDL-S1P pode inibir a apoptose em macrófagos via JAK/STAT3 e aumento da expressão de survivina. Nos cardiomiócitos a HDL-S1P ativa a STAT3 mitocondrial pela via S1P2/Erk e inibe a abertura do MPTP e a apoptose. Ainda, a HDL-S1P através do receptor S1P1 pode ativar a Akt e promover cardioproteção através da inativação da GSK3β pela fosforilação na serina 9, a inativação dessa proteína resulta na inibição da apoptose via MPTP. A Akt também pode ativar a eNOS e subsequentemente a ativação de NO intracelular e promover cardioproteção contra lesão de I/R. A HDL-S1P também pode promover a fosforilação da Cx43 através da PKC, que também desempenha um papel cardioprotetor central na atenuação da morte celular. Outra via de proteção alternativa contra a lesão de reperfusão é a o aumento da via SAFE. Em células endoteliais, o HDL-S1P também foi capaz de induzir a ativação cardioprotetora da eNOS para liberar NO via receptores S1P1 ou S1P3. Curiosamente, o HDL também induz a expressão de COX-2 em células endoteliais para a proteção através da PKC e Sphk2. Além disso, o S1P ligado ao HDL reduz a resposta inflamatória nas células endoteliais, via S1P1 e β-arrestina1 (Figura 5) (29).
O NO é um gás de meia vida curta (~10s) e em células endoteliais é produzido a partir do substrato L-arginina pela enzima eNOS. Os cofatores e coenzimas como oxigênio molecular, tetrahidrobiopterina (BH4), flavina
mononucleotídeo (FMN), flavina adenina dinucleotídeo (FAD), NADPH e ferro heme, são essenciais para a formação do NO (34, 35).
A eNOS é uma enzima formada por um homodímero, cada unidade composta por um domínio terminal oxidase, um domínio de afinidade para o complexo cálcio/calmodulina (CaM) e um domínio terminal redutase (36). Nas cavéolas, é necessário que a eNOS permaneça acoplada na caveolina-1 (Cav-1) para ser ativada. O NO produzido em células endoteliais é disseminado para as células do musculo liso, onde ativa guanilato ciclase (GCs), que converte guanosina trifosfato (GTP) em guanosina monofosfato cíclico (GMPc), induz a redução de cálcio intracelular e gera relaxamento do músculo liso (vasodilatação) (37).
O NO exalado na lesão de I/R pode agir como um potente agente antioxidante por diminuir espécies reativas de oxigênio e aumentar a restauração de enzimas antioxidantes como a glutationa, a catalase e a superóxido dismutase. Além disso, foi demostrado que doadores de NO age diretamente na inflamação, diminuindo o TNF-alfa substancial, NF-kb, a AP1 e consequentemente a apoptose (38).
1.4.4. HDL-ApoA-I e vias de proteção pós IM
ApoA-I é o conteúdo principal das partículas de HDL, ela desempenha papeis importantes na homeostase vascular principalmente no efluxo de colesterol e na síntese do NO (39, 40). A ativação da eNOS via ApoA-I é totalmente dependente de sua ligação ao SRB1 e é necessário que a ApoA-I se acople ao 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) para induzir a ativação da eNOS via SR-BI e o efluxo de colesterol. A ativação da PI3K pela interação entre HDL e SR-B1-PDZK1 pode também ativar a eNOS via Erk (MAPK) (41).
Figura 6: Efeito da HDL-ApoA-I em cardiomiócitos no ambiente de IM. O HDL/ApoA-I se liga
ao SRB1, desencadeando a fosforilação da Erk, que promove a ativação do STAT3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3) em sua serina 727 (pSTAT3). Paralelamente, o eixo HDL/ApoA-I/SRB1 ativa a via PI3K / Akt, que concorda na estimulação da HKII (hexoquinase II) e inibição da GSK (inosina / guanosina quinase) 3β, inibindo finalmente a abertura do MPTP. Além disso, o HDL / ApoA-I se liga ao receptor ABCA1 (transportador de cassetes de ligação a ATP A1), levando a um aumento do conteúdo intracelular de cálcio, o que estimulou positivamente a CAMKK (proteína quinase ativada por cálcio/calmodulina) com efeitos positivos sobre a AMPK (AMP- proteína quinase ativada), adaptado de (29).
Em a cardiomiócitos a interação HDL-ApoA-I/SRB1 leva a ativação da STAT3 na S727 via Erk (MAPK). A ativação da STAT3 decorre de sua translocação mitocondrial para ligação ao GRIM19 que modula positivamente a atividade do complexo-I e inibe a abertura dos poros mitocondriais. Em paralelo a ligação entre HDL-ApoA-I com o receptor SRB1 inibe a GSK3β na serina 9 via ativação PI3K/Akt inibindo a abertura do MPTP. Além disso a ligação HDL-ApoA-I ao ABCA1 leva a um aumento intracelular de cálcio (29).
1.4.5. Evidências atuais da relação HDL-C e doença coronariana: Disfuncionalidade da HDL
As dosagens de HDL colesterol (HDL-C), amplamente utilizada na prática clínica, refletem apenas o conteúdo de colesterol da HDL. Essa dosagem representa não mais que 20% da massa total da partícula e dependendo do tamanho pode variar em até 10 vezes. A quantidade plasmática de HDL-C é na verdade uma estimativa entre partículas grandes e pequenas. O número exato de partículas de HDL circulante pode ser quantificado por equipamentos que não fazem parte da rotina de análises clínicas, como ressonância magnética e análise de mobilidade iônica (23).
Apesar das grandes evidências dos benefícios cardioprotetores da HDL expostos por centenas de estudos, as meta-análises e grandes estudos de coortes atuais demonstraram que o HDL-C acima de 40 mg/dL não estão associados com a diminuição de risco cardiovascular, pelo contrário, em alguns casos foram associados com o aumento do risco de doença coronariana. Curiosamente também foi comprovado que aumentar a concentração de HDL-C do próprio doente não traz benefício cardiovascular. Este fato foi demonstrado em análises de estudos que abordaram diversas estratégias para elevar a concentração de HDL-C, como fármacos inibidores da CETP e mutações de genes envolvidos na regulação da síntese de HDL (42). A maior explicação para esses achados pode ser esclarecida pela disfuncionalidade das partículas de HDL no ambiente fisiopatológico (43). As dosagens de HDL-C sem levar em consideração a sua composição total, o seu tamanho, o número exato de partículas e principalmente a qualidade de suas principais funções cardioprotetoras não reflete adequadamente o potencial antiaterogênico ou pró-aterogênico da HDL (23, 42).
Em pacientes com doenças crônicas cuja fisiopatogenia são determinadas pelo aumento da atividade inflamatória sistêmica, tais como síndrome metabólica, diabetes e DAC, a HDL, perde em graus variados, seu potencial antiaterogênico (44). Na DAC crônica por exemplo, a HDL é submetida a incessante enriquecimento e hidrólise dos triglicérides desencadeando assim catabolismo e redução no conteúdo de Apo-A1 e redução do seu diâmetro e do transporte reverso de colesterol (45). Na SCA, a composição protéica da HDL se modifica ainda mais intensamente. O estresse oxidativo/inflamatório da fase aguda leva à retenção na
HDL de proteínas pró-inflamatórias como o soro amiloide A (SAA) e a ceruloplasmina (46), e à redução de proteínas anti-inflamatórias e antioxidantes como a paraoxonase 1 (PON-1) (47).
Uma vez que a terapia com a HDL do doente crônico e agudo não geram benefício. As evidências a cima sugerem que enfatizar o fenótipo ideal de HDL saudável para servir como apoio tecnológico na formação de nanopartículas artificias de HDL podem conferir grande benefício na redução de doença coronariana e IM. A HDL é capaz de carregar diversos ligantes e agir em múltiplas vias cardioprotetoras.
2. HIPOTESES
Baseado em estudos prévios que demonstraram claramente uma maior eficiência de partículas de HDL menores em diversas funções antiaterogênicas comparado com as HDL maiores, nossa hipótese é que as menores partículas de HDL podem potencializar a proteção em múltiplas vias durante a reperfusão miocárdica e reduzir consideravelmente os danos gerados na lesão de I/R.
3. OBJETIVOS
Primário: O objetivo desse estudo foi verificar qual subclasse de HDL é mais eficiente em atenuar a lesão de I/R miocárdica em relação a redução do tamanho de infarto e a melhora dos dados hemodinâmicos como a função sistólica do VE e o fluxo coronariano.
Secundários:
1. Qual o papel da síntese de NO como mediadora da proteção promovida pela HDL.
a. Avaliar o papel do efeito vasodilatador coronariano nesta proteção. b. Explorar as vias celulares diretas possivelmente envolvidas na
proteção desencadeada pela HDL/NO: (i) A ativação da Akt/GSK3β e a (ii) via do NO/PKG em ex vivo e in vitro (vias de proteção mitocondrial). 2. Verificar se o potencial efeito da atenuação da lesão miocárdica é mediado
4. MÉTODOS
4.1. Sujeitos e isolamento de HDL
As partículas de HDL foram isoladas por gradiente de ultracentrifugação a partir do soro obtido do sangue venoso periférico de 15 voluntários saudáveis do sexo masculino (26 ± 5; 19 - 32 anos de idade). Foram critérios de exclusão, doença manifesta, tabagismo, uso de medicamentos, obesidade (IMC ≥ 30kg/m2), histórico
familiar de dislipidemia e DCV. O Protocolo de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa FCM/UNICAMP (CAAE Nº 38309314.7.0000.5404). Para os objetivos secundários foram utilizados um pool de soro sanguíneo obtidos sempre dos mesmos quatro voluntários para obtenção das subclasses de HDL.
A HDL total foi isolada a partir de 4 mL de soro sanguíneo ajustado para a densidade de 1,21 g/mL com brometo de potássio (KBr) (0,325 g/mL de plasma) seguidas por soluções de KBr adicionadas com auxílio de uma mini bomba peristáltica: (i) 3 mL de solução salina (1,063 g/mL), (ii) 3 mL de solução salina (1,019 g/mL) e (iii) 2,5 mL de solução salina (1,006 g/mL). O gradiente formado foi ultracentrifugado a 40.000 rpm por 24 horas a 4ºC em rotor SW-41 Ti (Beckman L8-70M, Beckman Coulter Inc.). Após a ultracentrifugação as frações de lipoproteínas na sequência VLDL, IDL, LDL e HDL foram extraídas nos volumes 1 mL, 2 mL, 3,7 mL e 2 mL (48). As partículas de LDL também foram isoladas para utilização nos experimentos de coração isolado como um controle interno.
As subfrações de HDL foram isoladas a partir de 3 mL de soro ajustado para 1,21 g/mL com KBr seguindo a seguinte ordem de gradientes de densidade: (i) 2 mL de solução salina (1,24 g/mL), (ii) 3 mL de soro (1,21 g/mL), (iii) 2 mL de solução salina (1,063 g/mL), (iv) 2,5 mL de solução salina (1,019 g/mL) e (v) 2,5 mL de solução salina (1,006 g/mL). O gradiente formado foi ultracentrifugado a 40.000 rpm por 48 horas a 4ºC. Após a ultracentrifugação as frações de lipoproteínas não HDL foram descartadas (aproximadamente 5 mL) e as subfrações da HDL foram extraídas na sequência 2B (1 mL), 2A (800 µL), 3A (800 µL), 3B (800 µL) e 3C (800 µL) (24).
A HDL total e subfrações foram exaustivamente dialisadas em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) a 4ºC para a retirada do KBr. Em seguida foi quantificado a proteína de cada amostra pelo método de ácido bicinconínico (Pierce BCA Protein
Assay Kit,Thermofisher). A HDL total e subfrações foram estocadas a 4ºC e utilizadas por no máximo 5 dias.
É importante destacar que o HDL isolada dessa forma é potencialmente livre de outras proteínas plasmáticas como albuminas e globulinas, e representam baixas concentrações de produtos de oxidações proteicas e lipídicas (22).
4.2. Avaliação da lesão de I/R miocárdica regional em modelo ex vivo de coração isolado de ratos Wistar
Para avaliar o efeito da cardioproteção da HDL total e subclasses na lesão de I/R nosso grupo utilizou ratos Wistar adultos (n=118, 300-400g). Para testar nossas hipóteses, nós divididos os animais em 20 grupos e subgrupos (descritos nos próximos tópicos). Os animais foram provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da UNICAMP (CEUA 4418-1/2016 e 4664-1/2017) e foram mantidos com 12:12h em um ciclo claro-escuro, temperatura constante (23 ± 2ºC), circulação de ar e condições de acesso livre a água e comida.
Antes do procedimento os animais foram anestesiados intraperitoneal com tiopental sódico (80 mg/Kg), seguido de heparina sódica (3.000 UI/Kg). Após a anestesia, os animais foram submetidos a uma toracotomia bilateral para exposição e isolamento do coração. O coração foi rapidamente excisado e a aorta foi perfundida com solução de Krebs-Henseleit por meio de uma bomba peristáltica de rolete (Masterflex) com fluxo aproximado de 10 mL/min no sistema de Langendorff (Radnoti). Após alguns minutos, a perfusão do coração foi realizada com pressão constante com média de 70 mmHg. Em seguida, o átrio direito foi removido para permitir o escoamento do fluxo coronário. A solução de Krebs-Henseleit foi composta de NaCl 118,5 mM/L, NaHCO3 25 mM/L, KCl 4,7 mM/L, MgSO4 1,2 mM/L, KH2PO4
1,2 mM/L, Glicose 11,0 mM/L e CaCl2 1,4 mM/L e equilibrada por uma mistura
carbogênica (5% CO2 e 95% O2) ligada ao equipamento para manter o pH em ~7,4 a
37°C durante todo o experimento. No ventrículo esquerdo foi inserido um cateter com um balão de látex através da válvula mitral para manter uma pressão diastólica entre 5-10 mmHg durante todo o experimento. Também foi inserido um termômetro na artéria pulmonar para o registro da temperatura e um medidor de fluxo (Transonic) foi mantido na linha de perfusão da aorta para a mensuração do fluxo coronário, adaptado de (49, 50).
4.2.1. Infusão de HDL total e subclasses durante os primeiros minutos da reperfusão em modelo de I/R: Avaliação do tamanho de infarto, dados hemodinâmicos e immunoblotting
O protocolo para avaliar a lesão de I/R regional foi seguido por: (i) 20 minutos de estabilização; (ii) 35 minutos de isquemia regional, com uma transiente oclusão da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) através de um fio de sutura; (iii) 90 minutos de reperfusão, (Figura 7), adaptado de (51).
Figura 7: Esquema do protocolo de I/R em modelo de coração isolado ex vivo inserido no
sistema de Langendorff.
A HDL total (50, 100 e 200 µg de proteína/mL de PBS), ou as subclasses de HDL (200 µg de proteína/mL de PBS), ou LDL (200 µg de proteína/mL de PBS) ou apenas tampão PBS (Controle) foram infundidas separadamente em experimentos individuais com uma bomba de infusão automática nos primeiros 7 minutos da reperfusão, adaptado de (51) (Figura 8A e 8B). As amostras de lipoproteínas e o tampão PBS foram aquecidos a 37ºC antes da infusão nos corações. A solução que irrigou o coração (efluente coronariano) foi coletado antes da isquemia (Basal) e no 1º e 5º minuto da reperfusão com as lipoproteínas ou com PBS após a isquemia. Em seguida, as amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em ultrafreezer -80ºC para dosagens de NO.
Figura 8: A= Esquema dos grupos experimentais para testar o efeito da HDL total em
diferentes concentrações, ou da LDL (controle interno) ou do grupo controle na lesão de I/R. B= Esquema dos grupos experimentais para testar o efeito das subclasses de HDL.
Os dados hemodinâmicos como a máxima frequência de mudança da pressão do ventrículo esquerdo (dP/dt max) (mmHg/s), o fluxo (mL/min) e a resistência coronariana (mmHg/mL/min) foram monitoradas e mensurados durante todo o experimento utilizando o software LabChart (ADInstruments, New South Wales, Australia) através dos sensores de fluxo e pressão acoplados no equipamento de Langendorff. Todos os dados hemodinâmicos foram representados em porcentagem (%) de recuperação, levando em consideração o estado basal de cada coração antes da isquemia aferido ao final do período de 20 minutos de estabilização.
No final da reperfusão de 90 minutos, a artéria coronária DAE foi novamente ocluída para a infusão de azul de Evans (0,25%) para demarcar a área do coração que não sofreu isquemia. Em seguida, cortes seriados do coração foram realizados e adicionados em solução contendo 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC) para demarcar a
área de risco. O infarto foi calculado em porcentagem de necrose celular normalizado pela área de risco utilizando planimetria computadorizada (Digimizer, MedCalc Software, Ostend, Belgium) (Figura 9).
Figura 9: Modelo de quantificação do tamanho de infarto em cortes de corações isolados.
A= área não isquêmica; B= área de risco; C= área de infarto.
Os extratos de proteínas foram obtidos de corações de ratos submetidos a 35 minutos de isquemia regional e apenas 7 minutos de reperfusão com pool de HDL 3B e 3C obtidas de 4 voluntários saudáveis ou tampão PBS (Controle) (Figura 10). Esse protocolo foi realizado apenas para a técnica de Western Blotting com o objetivo de observar a ativação das proteínas ao final de 7 minutos de reperfusão com HDL. Após os 7 min, a artéria coronária DAE foi novamente ocluída para a infusão de azul de Evans para a separação da área isquêmica e não isquêmica, em seguida o ventrículo direito foi removido. A área de risco dos corações (parte isquêmica) foi rapidamente congelada em nitrogênio líquido e estocados em -80ºC. O tecido cardíaco foi macerado em nitrogênio líquido e as proteínas foram extraídas com tampão de lise RIPA suplementado com inibidores de protease e fosfatases, o extrato proteico foi estocado em -80ºC.
4.2.2. Bloqueio da síntese de NO durante lesão a de I/R estimulado com pool de HDL 3B e 3C: Efeito da inibição do NO com e sem vasodilatação pela Hidralazina
Para avaliar a importância do NO na lesão de I/R miocárdica, os corações receberam uma dose do inibidor de NO L-NG-Nitroarginine methyl ester (L-NAME, 100 µM) durante todo o experimento na ausência ou presença de um pool de HDL 3B e 3C. Nós também utilizamos Hidralazina (100 µM) com o intuído de manter o fluxo coronariano por via independente de NO na presença de L-NAME e verificar se a vasodilatação é o principal efeito cardioprotetor pelo NO induzido pela HDL. Nós também avaliamos ambos, L-NAME e a Hidralazina, sozinho nos experimentos de I/R para verificar se os fármacos interferem no aumento ou redução do infarto (Figura 10).
Figura 11: Esquema dos grupos experimentais para testar a implicação da inibição do NO
(L-NAME) com e sem vasodilatação independente do NO (Hidralazina) e o efeito da HDL 3B e 3C nesse cenário.
4.2.3. Bloqueio da síntese da via de vasodilatação exclusiva do NO e efeito do pool de HDL 3B e 3C na lesão de I/R
Para verificar se a via de vasodilatação exclusiva do NO e ativadora da PKG no tecido miocárdico é importante para a redução do tamanho do infarto pela HDL 3C e 3B, nós utilizamos um inibidor permanente da guanilato ciclase,
