Dos nove isolados antagonistas analisados quanto ao potencial de biocontrole a S. sclerotiorum, apenas trˆes revelaram a¸c˜ao satisfat´oria T. harzianum (3601), T. aureoviride (4915 e 4916), pertencendo `a classe 1 de antagonismo, adaptado de Bell, Wells e Markham (1982). Os demais isolados de Trichoderma apresentaram potencial antagˆonico mediano, pertencendo `a classe 2 de antagonismo. O isolado 3180 (U. atrum) n˜ao demonstrou a¸c˜ao antagˆonica `a S. sclerotiorum (Figura 4 e Tabela 7). Li, Huang e Acharya (2003) relataram a existˆencia do potencial antagˆonico de U. atrum contra S. sclerotiorum, embora n˜ao demonstrando caracter´ısticas de micoparasitismo. Neste estudo o ´unico isolado de U. atrum testado n˜ao revelou potencial antagˆonico frente ao pat´ogeno, tal fato pode ser atribu´ıdo provavelmente `a condi¸c˜ao de preserva¸c˜ao do isolado, j´a que este foi obtido da cole¸c˜ao de culturas Micoteca URM. Segundo alguns pesquisadores (SMITH; ONIONS, 1994) a preserva¸c˜ao de microrganismos pode alterar ou inativar caracter´ısticas fisiol´ogicas importantes como a patogenicidade, esporula¸c˜ao ou libera¸c˜ao de enzimas e outros compostos metab´olicos.
Figura 4. Crescimento em cultivo pareado entre os isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Trichoderma spp. e Ulocladium atrum.
Os isolados 3601, 4915 e 4916, pertencentes `a classe 1 de antagonismo apresentaram diferen¸cas quanto ao tempo necess´ario para crescer sobre o pat´ogeno, sendo o isolado
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3601 (T. harzianum) o que apresentou melhor desempenho (Figura 5). Dennis e Webster (1971) afirmam que esta caracter´ıstica ´e muito vantajosa para os antagonistas na disputa por ´area colonizada, pois vencendo a competi¸c˜ao por espa¸co e nutrientes o antagonista est´a exercendo uma das formas de biocontrole.
Tabela 7. Classes de antagonismo para os isolados de Trichoderma contra Sclerotinia sclerotiorum, ap´os 144 horas de pareamento.
Isolado Classe de antagonismo
3601 (T. harzianum) 1 2820 (T. viride) 2 2745 (T. viride) 2 3180 (T. viride) 3 4912 (U. atrum) 2 4913 (T. aureoviride) 2 4914 (T. aureoviride) 2 4915 (T. aureoviride) 1 4916 (T. aureoviride) 1
Figura 5. Pareamentos entre os isolados de Trichoderma spp. e Sclerotinia sclerotiorum (A) T. harzianum (3601xSs11); (B)T. aureoviride (4915xSs17) e (C)T. aureoviride (4916x806).
Al´em do crescimento micelial tamb´em foi observado o grau de esporula¸c˜ao dos isolados antagonistas. Nesse sentido, a produ¸c˜ao de esporos dos isolados 3601, 4914, 4915, 4916 e 3180 n˜ao foi afetada durante o pareamento com o pat´ogeno. J´a os isolados 4912 e 4913, apresentaram uma esporula¸c˜ao levemente diminu´ıda, enquanto os isolados 2745 e 2820 praticamente n˜ao esporularam. Batista (2002) ressalta que o processo de produ¸c˜ao de esporos possivelmente seria uma caracter´ıstica favor´avel aos antagonistas, pois ´e altamente
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desej´avel que estes produzam novos in´oculos na presen¸ca do pat´ogeno, inibindo assim a a¸c˜ao destes, devido a maior densidade do in´oculo antagonista.
A inibi¸c˜ao do crescimento micelial de S. sclerotiorum ocorreu em maior intensi- dade com os isolados 2745 (T. viride), 2820 (T.viride), 4912 (T. aureoviride), 4913 (T. aureoviride) e 4914 (T. aureoviride), que colonizaram 2/3 da placa sem no entanto crescer sobre o fitopat´ogeno (Figura 6). Esta inibi¸c˜ao deve-se provavelmente `a capacidade de produ¸c˜ao de substˆancias antibi´oticas por estes antagonistas, que podem interferir no desenvolvimento do pat´ogeno (CHET; BAKER, 1981; BLAKEMAN; FOKKEMA, 1982; PA- PAVIZAS, 1985). De fato, Campbell (1989) afirma que entre os efeitos provocados por
substˆancias antibi´oticas liberadas por antagonistas, podem ser observadas a redu¸c˜ao ou paralisa¸c˜ao do crescimento micelial e esporula¸c˜ao, redu¸c˜ao na germina¸c˜ao de esporos, al´em de distor¸c˜oes na hifa e end´olise.
Figura 6. Pareamento entre isolados de Trichoderma e Sclerotinia sclerotiorum: (A)T. aureoviride (4913x806); (B) T. viride(2820xSs11) e (C) T. aureovi- ride (914xSs5).
Tamb´em foram observadas altera¸c˜oes morfol´ogicas relevantes no pat´ogeno, tais como: o tempo de forma¸c˜ao dos escler´ocios, que foi maior em alguns pareamentos (3601xSs11, 4915xSs11 e 2820xSs17); a quantidade reduzida de escler´ocios produzidos que ocorreu nos pareamentos 2745 x Ss5 e 4913 x Ss17 ou ainda, a n˜ao produ¸c˜ao destas estruturas de resistˆencia caracter´ıstica de S. sclerotiorum (3601 x Ss17, 4912 x Ss5 e 4914 x Ss5). Resultados semelhantes foram relatados por Cassiolato, Baker e Mello (1997), Gracia- Garza, Reeleder e Paulitz (1997) em estudos sobre a a¸c˜ao de esp´ecies de Trichoderma na forma¸c˜ao de escler´ocios de S. sclerotiorum, verificando que T. hamatum, T. harzianum, T.viride e T. aureoviride provocaram uma redu¸c˜ao do n´umero de escler´ocios formados.
As observa¸c˜oes microsc´opicas dos pareamentos ocorridos entre os antagonistas e o fitopat´ogeno, demonstraram altera¸c˜oes morfol´ogicas dos mesmos, tais como: crescimento
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paralelo das hifas do antagonista e do pat´ogeno; forma¸c˜ao de an´eis de hifas no antagonista; enrolamento das hifas do pat´ogeno pelo antagonista; fragmenta¸c˜ao de hifas; mic´elio sem conte´udo protoplasm´atico e penetra¸c˜ao de hifas de S. sclerotiorum por todos os isolados de Trichoderma analisados nesse estudo (Figura 7).
Figura 7. Entrela¸camento de hifas de (A)Sclerotinia sclerotiorum por (B)Trichoderma harzianum (3601).
Elad (2000) relata que existem etapas sucessivas que envolvem o micoparasitismo de fungos pat´ogenos por esp´ecies de Trichoderma, tais como: crescimento quimiotr´ofico (onde exsudatos do pat´ogeno atraem o antagonista); reconhecimento entre o fitopat´ogeno e o antagonista; ades˜ao das hifas do pat´ogeno pelo antagonista e por fim a degrada¸c˜ao, onde o antagonista utiliza-se de enzimas como proteases e quitinases para degradar e penetrar na parede celular do pat´ogeno. De acordo com Brunner, Peterbauer e Mach (2003) a enzima 73-KDA N-acetyl-β-D-glucosaminidase est´a relacionada aos genes envolvidos na indu¸c˜ao da quitinase, sendo esta enzima a de maior relevˆancia para o biocontrole pois est´a relacionada com a degrada¸c˜ao da parede das c´elulas f´ungicas.
Durante a an´alise microsc´opica dos pareamentos observou-se a grande quantidade de hifas sem conte´udo protoplasm´atico, sugerindo micoparasitismo necrotr´ofico. Cook e Baker (1983), Trutmann e Keane (1990) afirmam que em muitos casos de antagonismo, as esp´ecies T. harzianum e T. koningii podem ser classificadas como parasitas necrotr´oficos,
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pois matam seu hospedeiro, utilizando os nutrientes extravasados da hifa morta.
Os isolados antagonistas apresentaram a forma¸c˜ao de an´eis de hifas, quando em pare- amento com o pat´ogeno. Elad, Sadowski e Chet (1987) estudando o controle biol´ogico de Rhizoctonia solani por esp´ecies de Trichoderma observaram que estas forma¸c˜oes sempre ocorriam durante o pareamento, por esse motivo relacionaram esta estrutura ao parasi- tismo. Entretanto Rocha (1997) observou que mesmo na ausˆencia do mic´elio hospedeiro houve a forma¸c˜ao de an´eis de hifas, sugerindo que estas estruturas n˜ao teriam rela¸c˜ao direta com o micoparasitismo.