Controle biológico de isolados de Sclerotinia sclerotiorum por Trichoderma spp. e Ulocladium atrum e patogenicidade ao feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
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(2) Girlene Soares de Figueirˆ edo. ´ CONTROLE BIOLOGICO DE ISOLADOS DE SCLEROTINIA SCLEROTIORUM POR TRICHODERMA SPP. E ULOCLADIUM ATRUM E PATOGENICIDADE AO FEIJOEIRO (PHASEOLUS VULGARIS L.) Disserta¸c˜ao apresentada ao Programa de P´os-gradua¸c˜ao em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco como requisito parcial para obten¸c˜ao do grau de Mestre em Biologia de Fungos.. Orientadora:. Profa. Dra. Neiva Tinti de Oliveira Co-orientadora:. Profa. Dra. Angela Coimbra dos Santos. Recife 2005.
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(4) ˆ GIRLENE SOARES DE FIGUEIREDO. Disserta¸c˜ao de Mestrado sob o t´ıtulo Controle biol´ ogico de isolados de Sclerotinia sclerotiorum por Trichoderma spp. e Ulocladium atrum e patogenicidade ao feijoeiro (Phaseolus vulgares L.), defendida e aprovada em 24 de fevereiro de 2005, em Recife, Pernambuco, pela banca examinadora constitu´ıda pelos doutores:.
(5) DEDICO Aos meus pais, Jos´e Norberto Soares e Raimunda Soares, que em todos os momentos de minha vida acreditaram na minha vit´oria. A minha filha Isabela Soares de Figueirˆedo, minha maior vit´oria e fonte inspiradora.. OFEREC ¸O A L´ıvio Carvalho de Figueirˆedo, meu esposo, pelo apoio constante e carinho..
(6) ´ melhor tentar e falhar, que se preocupar e ver a vida passar. “E ´ melhor tentar, ainda que em v˜ao, que sentar-se fazendo nada at´e o final. E Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver”. Martin Luther King.
(7) AGRADECIMENTOS A minha orientadora, Neiva Tinti de Oliveira pelo apoio incondicional `a realiza¸c˜ao deste trabalho. ˆ A Angela Coimbra dos Santos, co-orientadora, por todas as sugest˜oes valiosas. Ao Dr. Antonio F´elix da Costa, diretor de Pesquisa do IPA por toda ajuda concedida. A Iranise B. B. Torres, que me guiou nos meus primeiros passos na Micologia. A todos os professores da P´os-Gradua¸c˜ao em Biologia de Fungos pelos conhecimentos transmitidos. Aos colegas de Mestrado: Adry, Bruno Severo, Bruno Walter, Franci, Felipe, Ida, Luciana, Marcos e Mary pelos momentos de descontra¸c˜ao e amizade. Ao Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco pela disponibilidade de suas instala¸c˜oes. A CAPES pelo apoio financeiro no decorrer desta obra. Aos professores do Departamento: Laura Mesquita, Oliane Magalh˜aes, Sidney Turiassu e S´ılvia Barros pelos conselhos dados e amizade. Aos in´ umeros colegas que se somaram a minha lista durante a realiza¸c˜ao desta pesquisa, em especial: Auristela, Aurelice, Nicola, Lili, Eliane e tantos outros. A todos os que, direta ou indiretamente, contribu´ıram de alguma maneira com esta pesquisa: Obrigada!.
(8) RESUMO Dentre as doen¸cas que afetam a cultura do feij˜ao, o mofo branco causado por Sclerotinia sclerotiorum ´e uma das mais importantes, principalmente em sistemas de cultivo que adotam a agricultura irrigada. Quatro isolados de Sclerotinia sclerotiorum, sendo trˆes provenientes de plantas cultivadas com sintomas do mofo branco (Ss11-feij˜ao; Ss17-alface e Ss5-soja) e um de solo (806), foram avaliados quanto a patogenicidade a plantas de feij˜ao, variedade IPA-10. Todos os isolados testados revelaram-se patogˆenicos e apenas o isolado Ss5 foi estatisticamente inferior aos demais. Tamb´em foi avaliado o controle biol´ogico in vitro pelo m´etodo de pareamento em placas de Petri utilizandose oito isolados de Trichoderma e um de Ulocladium atrum, al´em do controle qu´ımico in vitro, por meio do crescimento micelial dos isolados de S. sclerotiorum em meio BDA, acrescido dos fungicidas Cercobin (Tiofanato met´ılico), Rovral (Iprodione) e Derosal (Carbendazim) em quatro concentra¸c˜oes distintas do ingrediente ativo (1, 10, 50 e 100 ppm). Com exce¸c˜ao de U. atrum, todos os isolados de Trichoderma revelaram potencial antagˆonico contra S. sclerotiorum, destacando-se T. harzianum (3601) como o de melhor desempenho. Quanto ao controle qu´ımico, Cercobin (Tiofanato met´ılico) foi o mais eficiente inibindo de forma satisfat´oria o crescimento micelial do pat´ogeno, sendo este fungicida e o isolado 3601 selecionados para a compara¸c˜ao entre os controles qu´ımico e biol´ogico in vivo de S. sclerotiorum em plantas de feij˜ao, variedade IPA-10, em casa-de-vegeta¸c˜ao. O antagonista foi aplicado ao solo veiculado em arroz autoclavado, numa concentra¸c˜ao de 2 g/Kg de solo em diferentes per´ıodos (antes do pat´ogeno, juntamente com o pat´ogeno e ap´os o pat´ogeno), enquanto o fungicida foi aplicado de acordo com as recomenda¸c˜oes do fabricante. Houve diferen¸ca estat´ıstica entre os tratamentos, sendo a aplica¸c˜ao do fungicida e do antagonista realizadas antes do pat´ogeno os mais eficientes, reduzindo o percentual de patogenicidade em 32,94% e 37,04%, respectivamente..
(9) ABSTRACT Several diseases affect the bean crop, and the white mold caused by Sclerotinia sclerotiorum is one of the most important, mainly at cultural systems that adopt the irrigated agriculture. Four isolates of Sclerotinia sclerotiorum, being three proceeded from cultivated plants with the white mold symptoms (Ss11-bean; Ss17-lettuce e Ss5-soy) and one from soil (806), were evaluated on the pathogenicity to bean plants, variety IPA10. All tested isolates showed to be pathogenic, and only the Ss5 isolate was statistically inferior to the others. Moreover, the in vitro biological control was evaluated by means of pairing in Petri dishes method using eight Trichoderma and one Ulocladium atrum isolates, besides the in vitro chemical control, analysed by means of mycelial growth of S. sclerotiorum isolates in PDA medium added to the fungicides Cercobin (Thiophanate methyl), Rovral (Iprodiona) and Derosal (Carbendazim) at four different concentrations of the active ingredient (1, 10, 50 and 100 ppm). Except for U. atrum, all isolates of Trichoderma showed antagonist potential against all S. sclerotiorum, showing up the isolate 3601 as the one of best performance. In the chemical control, Cercobin (Thiophanate methyl) was the most efficient, inhibiting in a satisfactory way the mycelial growth of the pathogen. This fungicide and the isolate 3601 were selected for the comparison between the in vivo chemical and biological control of S. sclerotiorum in bean plants, variety IPA-10 in greenhouse. The antagonist was applied on the soil, using substrat rice, at a concentration of 2 g/Kg of soil at different times (before the pathogen; together with the pathogen and after the pathogen), and the fungicide was applied as indicated on the product label. The results presented statistical differences among the treatments, being the treatments with the fungicide and with the antagonist applied before the pathogen, the most efficient ones, reducing the percentage of pathogenicity in 32,94% and 37,04%, respectively..
(10) ´ SUMARIO. Lista de Figuras Lista de Tabelas 1 Introdu¸c˜ ao. p. 12. 2 Revis˜ ao de Literatura. p. 14. 2.1. A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 14. 2.2. O Pat´ogeno e a Doen¸ca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 15. 2.3. Controle qu´ımico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 16. 2.4. Controle Biol´ogico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 19. 3 Material e M´ etodos. p. 25. 3.1. Isolados de Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 25. 3.2. Isolados de antagonistas utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 26. 3.3. Teste. de. patogenicidade dos isolados de Sclerotinia sclerotiorum. em plantas de feij˜ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 27. 3.3.1. Preparo do in´oculo e inocula¸c˜ao das plantas de feij˜ao . . . . . .. p. 27. 3.3.2. Avalia¸c˜ao da patogenicidade dos isolados de Sclerotinia sclerotiorum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3.4. p. 27. Controle biol´ogico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum com isolados de Trichoderma e Ulocladium atrum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 28. 3.4.1. Determina¸c˜ao da taxa de crescimento micelial dos isolados . . .. p. 28. 3.4.2. Pareamento entre isolados de Sclerotinia sclerotiorum e antagonistas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 28.
(11) 3.5. Controle qu´ımico in vitro. de Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . .. 3.6. Compara¸c˜ao entre controle biol´ogico e qu´ımico em plantas de feij˜ao in vivo p. 30. 4 Resultados e Discuss˜ ao 4.1. p. 32. Patogenicidade dos isolados de Sclerotinia sclerotiorum `a plantas de feij˜ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4.2. p. 30. Potencial antagˆonico de isolados de Trichoderma e Ulocladium contra Sclerotinia. atrum. sclerotiorum in vitro . . . . . . . . . . . . . . . .. 4.3. Controle qu´ımico in vitro. 4.4. Compara¸c˜ao entre os controles qu´ımico e biol´ogico in vivo. p. 32. de isolados de Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . .. p. 35 p. 39 p. 41. 5 Conclus˜ oes. p. 43. Referˆ encias. p. 44.
(12) LISTA DE FIGURAS 1. Esquema ilustrando o teste de pareamento entre antagonista e pat´ogeno.. 2. Vagens de feij˜ao, (A) de uma planta testemunha e infectada com isolados de Sclerotinia sclerotiorum: (B) Ss5 e (C) Ss11. . . . . . . . . . . . . .. 3. p. 29. p. 32. Plantas de feij˜ao variedade IPA-10 (A) com sintomas do mofo branco causados pelo isolado Ss11 de Sclerotinia sclerotiorum e (B) testemunha. p. 33. 4. Crescimento em cultivo pareado entre os isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Trichoderma spp. e Ulocladium atrum. . . . . . . . . . . . . . .. 5. p. 35. Pareamentos entre os isolados de Trichoderma spp. e Sclerotinia sclerotiorum (A) T. harzianum (3601xSs11); (B)T. aureoviride (4915xSs17) e (C)T. aureoviride (4916x806). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. p. 36. Pareamento entre isolados de Trichoderma e Sclerotinia sclerotiorum: (A)T. aureoviride (4913x806); (B) T. viride(2820xSs11) e (C) T. aureoviride (914xSs5). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 7. Entrela¸camento de hifas de (A)Sclerotinia sclerotiorum por (B)Trichoderma harzianum (3601).. 8. p. 37. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 38. Crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum (Ss11) em meio BDA + fungicidas em diferentes concentra¸c˜oes do ingrediente ativo: (a) Cercobin (tiofanato met´ılico); (b) Rovral (iprodione) e (c) Derosal (carbendazim).. 9. N´ıveis. de. p. 40. incidˆencia do mofo branco, causado por Sclerotinia. sclerotiorum nos diferentes tratamentos. M´edias seguidas da mesma letra n˜ao diferem entre si a 0.10 de probabilidade. Foi aplicado um modelo de binomial multivariado segundo a metodologia GEE. . . . . . . . . . . .. p. 41.
(13) LISTA DE TABELAS 1. Isolados de Sclerotinia sclerotiorum utilizados.. . . . . . .. p. 26. 2. Rela¸c˜ao dos isolados antagonistas utilizados no controle biol´ogico. . . .. p. 26. 3. Classes de antagonismo para Trichoderma e Ulocladium atrum com Sclerotinia sclerotiorum, adaptado de (BELL; WELLS; MARKHAM, 1982).. 4. .. p. 29. Esquema de tratamento e tempo de aplica¸c˜ao do antagonista e fungicida selecionado para compara¸c˜ao entre controle qu´ımico e biol´ogico de Sclerotinia sclerotiorum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5. Percentual de patogenicidade apresentado pelos isolados de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feij˜ao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. p. 31. p. 33. Compara¸c˜ao entre os tratamentos utilizados e suas respectivas correspondentes estat´ısticas para os percentuais de patogenicidade de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feij˜ao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 7. Classes de antagonismo para os isolados de Trichoderma contra Sclerotinia sclerotiorum, ap´os 144 horas de pareamento. . . . . . . . . . . . .. 8. p. 34. p. 36. Efeito de fungicidas no crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, ap´os 144 horas em meio BDA, em diferentes concentra¸c˜oes do ingrediente ativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. p. 40.
(14) 12. 1. ˜ INTRODUC ¸ AO. O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) ´e uma leguminosa de grande importˆancia s´ocioeconˆomica para a maioria das regi˜oes brasileiras. A ´area ocupada pelo cultivo anualmente no Brasil est´a em torno de 5,8 milh˜oes de hectares, se forem consideradas as trˆes ´epocas de plantio: ´aguas, seca e inverno com irriga¸c˜ao (EMBRAPA, 2003a). O Brasil ´e o segundo maior produtor mundial de gr˜aos de plantas do gˆenero Phaseolus e o primeiro na esp´ecie P. vulgaris. A importˆancia dessa produ¸c˜ao deve-se ao fato de que o feij˜ao, al´em de constituir um dos alimentos b´asicos da popula¸c˜ao brasileira ´e um dos principais produtos fornecedores de prote´ına na dieta alimentar das classes sociais menos favorecidas. O feij˜ao tem uma grande adapta¸c˜ao edafoclim´atica, o que permite seu cultivo, durante todo o ano, em quase todos os estados da federa¸c˜ao, possibilitando constante oferta do produto no mercado (EMBRAPA, 2003b). V´arias doen¸cas afetam o feijoeiro no Brasil, algumas das quais causadoras de grandes preju´ızos, como a antracnose, a mancha angular, a fusariose e o mofo branco causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Este u ´ltimo, tem um c´ırculo de hospedeiro que abrange pelo menos 408 esp´ecies e 278 gˆeneros de plantas (BOLLAND; HALL, 1994), sendo comumente associado a perdas significativas de rendimento em lavouras comerciais de feij˜ao irrigadas sob pivˆo central na regi˜ao Centro-Oeste do pa´ıs (CHARCHAR; ANJOS; OSSIPI, 1999). No Estado de Goi´ as, as perdas atingem 50% e em soja h´a relatos de 18,7%. de perdas (CARDOSO et al., 1994). No Estado de Pernambuco foi relatada a incidˆencia do mofo branco, na regi˜ao Agreste Meridional do Estado em pequenas planta¸c˜oes comerciais. O controle desse pat´ogeno por meio de pr´aticas convencionais, como a aplica¸c˜ao de fungicidas qu´ımicos, ´e a forma mais utilizada. Entretanto em alguns casos ´e impratic´avel e muito dispendiosa financeiramente (CUNDOM et al., 2000), al´em de causar impactos ecol´ogicos por seus res´ıduos t´oxicos (ROCHA; OLIVEIRA, 1998). O controle qu´ımico ao ´ , contr´ario de outras formas de controle, apresenta efeito imediato e espetacular (GOES. 1999), no entanto, os principais problemas advindos deste tipo de controle s˜ao a crescente.
(15) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 13. preocupa¸c˜ao com o meio ambiente e surgimento de linhagens resistentes aos fungicidas qu´ımicos (AZEVEDO, 2001). Devido `a ampla utiliza¸c˜ao dessa forma de controle, s˜ao in´ umeros os produtos existentes no mercado e muitos outros s˜ao lan¸cados a cada ano. O biocontrole atualmente ocupa um lugar importante dentre as pr´aticas de manejo das doen¸cas de plantas causadas por pat´ogenos f´ ungicos. Os agentes de biocontrole podem atuar por meio de v´arios mecanismos de a¸c˜ao como: antibiose, hiperparasitismo, ´ de primordial importˆancia conhecer competˆencia e hipovirulˆencia (MICHEREFF, 2000). E cada um destes mecanismos de a¸c˜ao em detalhes, e esta informa¸c˜ao pode ser obtida por meio de testes in vitro ou ainda em estudos sistem´aticos em casa de vegeta¸c˜ao (in vivo) antes de serem testados efetivamente no campo. O uso de biocontroladores como esp´ecies do gˆenero Trichoderma pode diminuir ou ainda eliminar a necessidade de tratamentos com antif´ ungicos qu´ımicos (BIOCONTROL, 2004), o que gera um interesse despertado em resposta `a crescente preocupa¸c˜ao da sociedade acerca do uso de fungicidas qu´ımicos. Este trabalho teve por objetivo verificar a eficiˆencia de esp´ecies de Trichoderma e Ulocladium atrum como agentes de biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum e a patogenicidade deste organismo a plantas de feij˜ao (Phaseolus vulgaris)..
(16) 14. 2. ˜ DE LITERATURA REVISAO. 2.1. A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris). O feij˜ao ´e uma dicotiledˆonea arbustiva amplamente cultivada em todo o mundo. Segundo Pompeu et al. (1997) o gˆenero Phaseolus compreende aproximadamente 55 esp´ecies, das quais apenas cinco s˜ao cultivadas: o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris), o feij˜ao de lima (P. lunatus), o feij˜ao ayocote (P. coccineus), o trepari (P. acutifolus) e o P. polyanthus. No Brasil, o cultivo dessa leguminosa ´e bastante difundido, sendo reconhecida como cultura de subsistˆencia em pequenas propriedades (YOKOYAMA; BANNO; KUTHCOUSKI, 1996). Para Carnide et al. (2003) o feij˜ao apresenta uma grande variabilidade que vai desde o h´abito de crescimento at´e o tamanho das folhas, flores e vagens, tipo de vagem, tamanho e cor das sementes, permitindo estas caracter´ısticas separar as esp´ecies selvagens das cultivadas. Considerando-se todos os gˆeneros e esp´ecies de feij˜ao englobados nas estat´ısticas da ´ FAO (Organiza¸c˜ao das Na¸c˜oes Unidas para Agricultura e Alimenta¸c˜ao), a Asia foi o maior continente produtor, participando com 48,6% da produ¸c˜ao mundial, vindo a seguir ´ as Am´ericas do Norte/Central (19,7%), a Am´erica do Sul (16,3%), a Africa (11,8%), a Europa (3,4%) e a Oceania (0,2%) (FAO, 1999). Analisando-se somente a esp´ecie Phaseolus vulgaris (feij˜ao comum), o Brasil ´e o maior produtor mundial, seguido pelo M´exico. Entretanto, essa produ¸c˜ao ´e insuficiente para abastecer o mercado interno, havendo necessidade da importa¸c˜ao do produto (EMBRAPA, 2003a). Segundo estat´ısticas do IBGE (2002), no ano 2000 o Brasil importou cerca de 90 mil toneladas sendo, a maior parte de feij˜ao preto proveniente da Argentina e do Chile. Eventualmente, o Brasil tamb´em importa feij˜ao do M´exico, da Bol´ıvia e dos Estados Unidos..
(17) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 15. A ´area plantada no Brasil diminuiu gradativamente, de 5.317,1 mil hectares em 1985 para 4.302,2 mil hectares em 2000, o que representou uma diminui¸c˜ao de 19,1%. Em contrapartida a an´alise dos dados de produ¸c˜ao, referentes a este mesmo per´ıodo, j´a indicou um aumento de 17,9%, pois em 1985, foram produzidas 2.548,4 toneladas, enquanto em 2000, 3.005,6 mil toneladas (YOKOYAMA, 2002). Segundo estat´ısticas do IBGE (2002) a principal regi˜ao produtora de gr˜aos ´e a Sul, que no ano de 2002 produziu 963.637 toneladas, enquanto a regi˜ao Nordeste ´e a segunda maior produtora com produ¸c˜ao de 866.962 toneladas de gr˜aos no mesmo per´ıodo, sendo os estados da Bahia, Cear´a e Pernambuco os principais produtores desta regi˜ao.. 2.2. O Pat´ ogeno e a Doen¸ca. Sclerotinia sclerotiorum ´e um fungo habitante do solo que causa a doen¸ca conhecida por mofo branco. Segundo Cundom et al. (2000) esta doen¸ca provoca danos consider´aveis em diversas culturas, afetando o produto comercial, conseq¨ uentemente, diminuindo sua rentabilidade. O pat´ogeno afeta uma ampla gama de hospedeiros, cerca de 408 esp´ecies vegetais, incluindo culturas importantes como: tomate (Lycopersicon sculentum Mill.), batata (Solanum tuberosum L.), alface (Lactuca sativa L.), feij˜ao (Phaseolus vulgaris L.) e muitas outras (BOLLAND; HALL, 1994). Vieira, Pinto e Paula J´ unior (2003) consideram o feij˜ao a principal cultura afetada por esta enfermidade no Brasil, principalmente o chamado “feij˜ao de inverno”, que ´e plantado no per´ıodo de entressafra, e correspondem `as planta¸c˜oes irrigadas. De acordo com Nasser e Sutton (1993) o significante decl´ınio na produ¸c˜ao de feij˜ao desde os anos 80 no Brasil, tem sido causado por S. sclerotiorum, especialmente no cerrado brasileiro, compreendendo o Distrito Federal e o Estado de Minas Gerais, neste u ´ltimo cerca de 35% dessa leguminosa ´e produzido sob sistema de irriga¸ca˜o (VIEIRA; PINTO; ´ PAULA JUNIOR , 2003) a condi¸c˜ao de alta umidade, aliada as temperaturas amenas nestes. plantios, favorece o desenvolvimento do mofo branco, que vem gerando perdas constantes na produ¸c˜ao de gr˜aos. A doen¸ca desenvolve-se numa faixa de temperatura entre 5-30◦ C, principalmente ao redor dos 25◦ C, no entanto, a umidade ´e o fator clim´atico mais importante para o desenvolvimento do mofo branco (CARRASCO, 1997)..
(18) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 16. Segundo Bianchini, Maringoni e Carneiro (1997) o pat´ogeno pode afetar as partes a´ereas da planta, provocando les˜oes inicialmente pequenas e aquosas que posteriormente aumentam em tamanho, tomando todo o ´org˜ao afetado. Com o desenvolvimento da doen¸ca as partes afetadas perdem a cor, tornando-se inicialmente amareladas, depois marrons, produzindo uma podrid˜ao mole nos tecidos. Em est´agios avan¸cados ocorre a coloniza¸c˜ao dos tecidos vegetais por mic´elio branco e abundante, culminando com a morte da planta e o surgimento dos escler´ocios, protuberˆancias inicialmente brancas, que posteriormente se tornam r´ıgidos e enegrecidos. S. sclerotiorum pode sobreviver durante anos no solo ou em restos de cultura. Para Phillips (1990) o fungo permanece ativo por mais ou menos trˆes anos, e uma forma de dissemina¸c˜ao ´e o transporte de restos de plantas ou solo infectados com escler´ocios para ´areas sem o hist´orico da doen¸ca. Epidemias de mofo branco, em culturas de feij˜ao ou soja ocorrem geralmente ap´os a flora¸c˜ao (ABAWI; GROGAN, 1979). Os escler´ocios podem germinar para produzir o mic´elio ou ainda em condi¸c˜oes prop´ıcias formar apot´ecios. Cada apot´ecio produz milh˜oes de ascosporos, estes s˜ao liberados e dispersados pelo ar at´e as plantas pr´oximas. Segundo Vieira, Pinto e Paula J´ unior (2003) essa ´e a principal forma de infec¸c˜ao prim´aria. De acordo com Tu (1989) outras formas de infec¸c˜ao prim´aria s˜ao: folhas em contato com solo contaminado com ascosporos, folhas em contato com escler´ocios expostos na superf´ıcie do solo ou infec¸c˜oes associadas a inj´ urias. Segundo o mesmo autor, a infec¸c˜ao secund´aria ocorre do contato entre plantas infectadas e sadias. Bianchini, Maringoni e Carneiro (1997) afirmam que a rota¸c˜ao de culturas com gram´ıneas pode ajudar a reduzir o in´oculo inicial e recomendam o plantio de sementes sadias, al´em de a¸c˜oes que aumentem a aera¸c˜ao da lavoura, de modo a facilitar a circula¸c˜ao do ar e a penetra¸c˜ao dos raios solares, como medidas de controle importantes para diminuir a incidˆencia da doen¸ca.. 2.3. Controle qu´ımico. Os pesticidas ocupam posi¸c˜ao singular dentre as substˆancias qu´ımicas, pois s˜ao adicionados intencionalmente ao ambiente para erradicar ou controlar algumas formas de vida indesej´aveis para a agricultura. Para Dores e Freire (1999) muitos s˜ao os argumentos usados em favor do uso de pesti-.
(19) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 17. cidas, como por exemplo, aumento na produtividade agr´ıcola e agropecu´aria, diminui¸c˜ao nas perdas de alimentos, armazenamento e erradica¸c˜ao de vetores de doen¸cas entre outros. Entretanto muitas s˜ao as conseq¨ uˆencias indesej´aveis que advˆem do uso de pesticidas, quer como contamina¸c˜ao ambiental, que em u ´ltima instˆancia atinge a popula¸c˜ao em geral, quer em sa´ ude ocupacional. Ware (1980) relata que devido ao fato de n˜ao serem completamente seletivos, os fungicidas qu´ımicos tamb´em afetam esp´ecies n˜ao-alvo que est˜ao presentes no ambiente. Assim que s˜ao aplicados na lavoura, seja por via a´erea ou misturados ao solo ou ainda `as sementes, parte desses defensivos atingir´a seu objetivo, enquanto que o restante poder´a atingir organismos n˜ao-alvo, como por exemplo, vida selvagem, insetos predadores, microrganismos do solo e organismos aqu´aticos, podendo causar v´arios efeitos adversos como redu¸c˜ao do n´ umero de esp´ecies, altera¸c˜ao na produ¸c˜ao, altera¸c˜ao comportamental, susceptibilidade a doen¸cas e manifesta¸c˜oes biol´ogicas, dentre outros. Ayotte et al. (1995) afirmam que mecanismos f´ısicos e biol´ogicos possibilitam a distribui¸c˜ao dos res´ıduos de defensivos qu´ımicos nos ecossistemas pelo ar, ´agua e migra¸c˜ao dos organismos. Exemplo disso ´e a detec¸c˜ao de res´ıduos qu´ımicos organoclorados encon´ trados no Artico. Embora esses produtos tenham sido usados em maior parte em regi˜oes pr´oximas ao Equador, praticamente todos os organoclorados detectados em latitudes mais baixas foram tamb´em detectados no ambiente ´artico, ainda que em pequenas propor¸c˜oes. Pimentel e Levitan (1991) em revis˜ao sobre a quantidade de pesticidas que ´e aplicada e a que efetivamente atinge o organismo alvo a controlar, mencionam que nos Estados Unidos freq¨ uentemente, menos de 0,1% do produto aplicado atinge seus objetivos. Segundo Spadotto et al. (1996) o Brasil ´e o quinto maior consumidor de agrot´oxicos no mundo. O consumo aparente de agrot´oxicos no pa´ıs foi de 151,8 mil toneladas de produtos formulados (comerciais) em 1989. Expresso em quantidade de ingrediente ativo, tal consumo passou de 16 mil toneladas em 1964 (RUEGG et al., 1987), para 60,2 mil toneladas em 1991 (GARCIA; ALMEIDA, 1991). A ´area ocupada com lavouras agr´ıcolas no Brasil cresceu 76,0% entre 1960 e 1991 (IBGE, 1993). Enquanto isso o aumento no consumo de agrot´oxicos foi de 276,2% no mesmo per´ıodo (SPADOTTO; GOMES; RODRIGUES, 1998). O consumo desses produtos difere nas v´arias regi˜oes do pa´ıs, em fun¸c˜ao da diversidade de atividades agr´ıcolas intensivas e tradicionais. Na regi˜ao Norte esse consumo ´e muito pequeno em compara¸c˜ao com as demais regi˜oes. Na regi˜ao Nordeste o uso est´a princi-.
(20) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 18. palmente concentrado nas ´areas de agricultura irrigada, que utiliza grandes quantidades de agrot´oxicos. No Centro-oeste o consumo aumentou nas d´ecadas de 70 e 80, devido a ocupa¸c˜ao dos Cerrados. Mas os grandes consumidores encontram-se nas regi˜oes Sudeste e Sul, particularmente nos estados de S˜ao Paulo, Paran´a e Rio Grande do Sul (SPADOTTO; GOMES; RODRIGUES, 1998).. O grupo mais importante de pesticidas utilizados para o controle de doen¸cas de plantas ´e o dos fungicidas, segundo Michereff (2000), para o qual algumas das caracter´ısticas de um bom fungicida s˜ao: alta fungitoxidade (deve ser t´oxico ao pat´ogeno em pequenas concentra¸c˜oes), alta especificidade, grande tenacidade (ser resistente a intemp´eries, como chuvas, ventos, radia¸c˜ao solar,etc.), n˜ao fitot´oxico (deve ser t´oxico apenas ao fungo e n˜ao `a planta), n˜ao deve ser t´oxico ao homem e animais e apresentar compatibilidade (ser compat´ıvel com outros fungicidas, inseticidas ou herbicidas para maior economicidade nas aplica¸c˜oes). Cabrera et al. (1998) em estudos para detec¸c˜ao dos n´ıveis residuais de benomil, fungicida amplamente usado no controle de diversas doen¸cas de etiologia f´ ungica em sucos processados e subprodutos de abacaxi (Smooth cayenne), constataram n˜ao haver res´ıduos do fungicida em n´ıveis detect´aveis pelo m´etodo empregado, entretanto, ressaltam que o mesmo n˜ao ocorre quando das aplica¸c˜oes do produto em quantidades maiores que a recomendada, fato esse que ocorre freq¨ uentemente. Myers (1985) afirma que o uso de fungicidas via ´agua de irriga¸c˜ao (fungiga¸c˜ao), pode resultar no controle eficiente de doen¸cas por proporcionar excelente uniformidade de distribui¸c˜ao. Tu (1989) relata que as aplica¸c˜oes com fungicidas em feijoeiro, por avi˜ao, n˜ao fornecem um bom controle do mofo branco devido `as gotas muito espa¸cadas e o volume de ´agua insuficiente para promover uma boa cobertura. Foster (1985) obteve bom controle do mofo branco em feijoeiro por fungiga¸c˜ao mesmo com a doen¸ca em n´ıveis elevados, decorrente da alta freq¨ uˆencia de chuvas. Matheron e Matejka (1989) avaliaram, por meio de testes in vitro como pouco significativa a a¸c˜ao de seis fungicidas, dentre eles o iprodione e o vinclozolin, no controle qu´ımico de S. sclerotiorum em alface. O efeito do tetratiocarbonato de s´odio no crescimento e viabilidade de Sclerotinia spp., mostrou-se eficiente no controle desse pat´ogeno (MATHERON; MATEJKA, 1993). Oliveira et al. (1995) avaliaram para efeito comparativo a fungiga¸c˜ao e aplica¸c˜ao convencional de fungicidas para o controle de S. sclerotiorum em feijoeiro e observaram que todos os seis fungicidas testados, isolados ou em associa¸c˜ao (entre fungicidas) foram.
(21) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 19. eficientes no controle do mofo branco. Mueller, Hartman e Pedersen (1999) por meio de testes in vitro observaram redu¸c˜ao bastante significativa (98%) no desenvolvimento de escler´ocios e apot´ecios de S. sclerotiorum em sementes de soja em contato com os fungicidas fludioxonil e captan + pentacloronitrobenzeno + tiabendazol. Mueller, Derksen e Ozkan (2002) testaram a efic´acia dos fungicidas benomil, tiofanato met´ılico e vinclozolin no controle de S. sclerotiorum em soja e observaram uma redu¸c˜ao maior que 50% com benomil e tiofanato met´ılico quando aplicados por sistemas de aspers˜ao. Mantec´on (2003) revelou a eficiˆencia dos fungicidas Folicur (tebuconazol), Bravistin (carbendazim) e Frowcide (fluazinan) quando aplicados no in´ıcio da flora¸c˜ao.. 2.4. Controle Biol´ ogico. Durante os u ´ltimos 25 anos poucas ´areas da fitopatologia tem atra´ıdo tanto interesse quanto o uso de microrganismos para o controle de fitopat´ogenos (BIOCONTROL, 2004). O grande interesse despertado para o controle biol´ogico de pat´ogenos de plantas ´e uma resposta, em grande parte, `a crescente preocupa¸c˜ao da sociedade acerca do uso de pesticidas qu´ımicos. Os governos de muitos pa´ıses est˜ao cada dia mais conscientes dos efeitos que esses pesticidas causam ao meio ambiente, assim como aos agricultores e consumidores desses produtos. Chain (1995) relatou que mais de 70 pesticidas, incluindo fumigantes do solo, foram detectados em ´aguas do subsolo, em 38 estados americanos, e uma pesquisa publicada pela Agˆencia de Estudos de Prote¸c˜ao Ambiental norte americana, indica que 3000 - 6000 casos de cˆancer s˜ao induzidos anualmente por res´ıduos de pesticidas em alimentos, enquanto outros 50-100 casos, pela exposi¸c˜ao a estes durante sua aplica¸c˜ao. Segundo Alves (1998) a incorpora¸c˜ao do controle biol´ogico como parte de um programa de controle integrado reduz os riscos legais ambientais e p´ ublicos, advindos do uso de produtos qu´ımicos. O controle biol´ogico, por outro lado, pode representar uma alternativa mais econˆomica ao uso de alguns fungicidas, entretanto, demora mais tempo e requer conhecimentos espec´ıficos acerca da biologia do pat´ogeno e de seus antagonistas. A desvantagem do controle biol´ogico, ´e que algumas vezes a falta de um resultado imediato, em rela¸c˜ao ao controle qu´ımico, ´e confundida com ineficiˆencia do biocontrolador..
(22) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 20. Palti e Rotem (1985) consideram esp´ecies de fungos pertencentes ao gˆenero Trichoderma as mais empregadas comercialmente para o biocontrole de doen¸cas de plantas cultivadas economicamente importantes. De fato, muitos estudos tˆem sido feitos relatando a eficiˆencia desses organismos (PAPAVIZAS, 1985; CHET, 1987, 1990; DUBOS, 1987; WELLS, 1988; GULLIANO, 1991; ELAD, 1996). Melo (1991) afirma que o fungo Trichoderma pode ser utilizado para controle biol´ogico, visto que, dentre v´arios atributos, apresenta as seguintes vantagens: a) r´apido crescimento; b) poucos requisitos nutricionais; c) produz esporos e clamidosporos; d) produz enzimas l´ıticas que digerem a parede celular de fitopat´ogenos; e) produz antibi´oticos vol´ateis e n˜ao vol´ateis; f) manifesta resistˆencia aos fungicidas com facilidade; g) apresenta ciclo parassexual conhecido em algumas esp´ecies, facilitando os estudos de gen´etica cl´assica; h) ´e facilmente mut´avel diante de radia¸c˜oes ionizantes e n˜ao-ionizantes e mutagˆenicos qu´ımicos; i) apresenta con´ıdios uninucleados em muitas esp´ecies, o que facilita a obten¸c˜ao de mutantes est´aveis. Michereff (1991) relatou que o crescimento r´apido associado `a libera¸c˜ao de metab´olitos t´oxicos no substrato permite a predominˆancia da popula¸c˜ao antagonista no ambiente, podendo exercer, isolada ou conjuntamente, duas atividades importantes no biocontrole que s˜ao a competi¸c˜ao e a antibiose. Segundo Esposito e Silva (1998), esp´ecies do gˆenero Trichoderma s˜ao amplamente utilizadas devido a seus m´ ultiplos usos na agricultura, quer como fungicida biol´ogico, estimulador do crescimento em plantas ou ainda biorremediador, j´a que degrada alguns grupos de pesticidas qu´ımicos de alta persistˆencia no ambiente. Esp´ecies de Trichoderma desenvolveram mecanismos para atacar e parasitar outros fungos e assim, aproveitar uma fonte nutricional adicional. Harman e Bj¨orkman (1998) relatam v´arios mecanismos demonstrados por Trichoderma em sua atua¸c˜ao como biocontroladores, que s˜ao: micoparasitismo; antibiose; competi¸c˜ao por nutrientes e espa¸co; desativa¸c˜ao das enzimas do pat´ogeno; tolerˆancia a estresses por parte da planta; solubiliza¸c˜ao e absor¸c˜ao de nutrientes inorgˆanicos e resistˆencia induzida. Para Michereff (2000) destes mecanismos os quatro primeiros tˆem a¸c˜ao direta do biocontrole sobre o pat´ogeno e os demais s˜ao indiretos, j´a que sua a¸c˜ao ´e induzir ou impulsionar mecanismos de defesa fisiol´ogicos e bioqu´ımicos da planta. Segundo Lorito (1998) o micoparasitismo ´e um processo complexo que inclui uma s´erie de eventos sucessivos que s˜ao: crescimento quimiotr´ofico; reconhecimento entre o biocontrolador e o pat´ogeno; ades˜ao (ap´os o reconhecimento o biocontrolador envolve e adere-se.
(23) 21. Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... `as hifas do pat´ogeno) e degrada¸c˜ao parcial ou total da parede celular do pat´ogeno por meio de enzimas micol´ıticas secretadas pelo biocontrolador. Cherif e Berihamou (1990) e Manocha e Balasubramanian (1994) afirmam que esp´ecies de Trichoderma secretam enzimas como: glucanases, quitinases, lipases e proteases que degradam a parede celular e Papavizas (1985) relata que estes organismos produzem antibi´oticos como a gliotoxina, a viridina e a tricodermina, que s˜ao t´oxicos a v´arios outros fungos. Esp´ecies de Trichoderma podem incrementar a taxa de crescimento e desenvolvimento das plantas, em especial seu sistema radicular, tornando-as mais resistentes a condi¸c˜oes ¨ adversas (HARMAN; BJORKMAN , 1998). O mesmo autor relata em suas pesquisas que. ra´ızes de plantas colonizadas por uma linhagem de Trichoderma, conhecida por T22, requerem 40% menos fertilizantes nitrogenados com rela¸ca˜o `as ra´ızes n˜ao colonizadas. Algumas esp´ecies de Trichoderma tˆem sido relatadas como estimuladoras do crescimento de esp´ecies vegetais, tais como:. pepino (Cucumis sativus L.), berinjela. (Solanum melogena L.), ervilha (Pisum sativum L.), pimenta (Capsicum frutescens L.), fumo (Nicotiana tabacum L.),. tomate (Lycopersicum esculentum L.),. algod˜ao. (Gossypium spp.) e feij˜ao (Phaseolus vulgaris L.) e plantas ornamentais (INBAR; CHET, 1995; WINDHAM; ELAD; BAKER, 1986). A utiliza¸c˜ao de Trichoderma no controle da antracnose do maracujazeiro, que tem por agente etiol´ogico Colletotrichum gloeosporioides, foi estudada por Rocha (1997) e Rocha e Oliveira (1998), avaliando o biocontrole por Trichoderma in vitro e in vivo. Para o biocontrole em frutos obtiveram resultados pouco satisfat´orios. Esses resultados foram obtidos com base na an´alise do diˆametro das ´areas necrosadas, enquanto utilizandose frutos inoculados com linhagens de Trichoderma e Colletotrichum, as testemunhas receberam apenas o fitopat´ogeno (Colletotrichum gloeosporioides). Houve diferen¸ca da a¸c˜ao biocontroladora entre isolados do antagonista, o que j´a havia sido observado por Wells e Bell (1979), e por Bell, Wells e Markham (1982). Cardoso, Silva e Marques (1997) selecionaram alguns isolados de Trichoderma, com o objetivo de suprimirem enfermidades causadas por Fusarium solani em podrid˜oes de raiz de plˆantulas de feijoeiro, em condi¸c˜oes controladas, em casa de vegeta¸c˜ao. Os mesmos verificaram que um isolado de Trichoderma foi capaz de reduzir os sintomas provocados pelo pat´ogeno, resultados que corroboram os de Cardoso e Faleiro (1991). Reis et al. (1995) com o objetivo de selecionarem isolados de Trichoderma spp. para o controle de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, observaram que de 41 isolados de Trichoderma, aplicados na forma de p´o biol´ogico, em covas de semeadura em casa de.
(24) 22. Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... vegeta¸c˜ao, 15 foram capazes de reduzir em mais de 20% a severidade da doen¸ca. Esses resultados. assemelham-se. aos. obtidos. para. o. controle. de. F.. oxysporum. f. sp. melonis e F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici com T. harzianum (SIVAN et al., 1985); F. oxysporum f. sp. melonis, F. oxysporum f. sp. vasinfectum e F. roseum. com um isolado de T. harzianum (SIVAN; CHET, 1986); F. oxysporum f. sp. dianthi com isolados de T. harzianum e T. viride (LUNDBERG; UNESTAN, 1980) e F. oxysporum f. sp. lycopersici com isolados de Trichoderma spp. (SILVA, 1992). Grigoletti J´ unior et al. (2000) em suas pesquisas, avaliaram o antagonismo de Trichoderma a Cylindrocladium spathulatum, agente causal da pinta-preta da erva-mate. Os resultados obtidos foram promissores, revelando em teste de laborat´orio, pelo m´etodo de pareamento de culturas, que todos os isolados utilizados apresentaram um elevado potencial de antagonismo. Moreira et al. (2002) utilizaram o controle biol´ogico por Trichoderma em Monilinia fructicola, agente causal da podrid˜ao parda do pˆessego, na regi˜ao da Lapa, no Estado do Paran´a. Na avalia¸c˜ao in vitro, da atividade antagˆonica dos isolados de Trichoderma, os mesmos autores avaliaram a atividade antagˆonica por dois mecanismos: o hiperparasitismo e o antagonismo, revelando que no teste de pareamento de colˆonias (hiperparasitismo), a maioria dos isolados apresentou um potencial de antagonismo satisfat´orio. Observando-se os resultados de detec¸c˜ao de antibiose, verificaram um percentual acima de 60% de inibi¸c˜ao de M. fructicola. Sobre mecanismos de antagonismo, Bettiol (1995) cita como caracter´ıstica importante para um antagonista, atuar por mais de um mecanismo, como ocorreu nos resultados obtidos por Moreira et al. (2002). May. e. Kimati. (1999). estudaram. o. controle. biol´ogico. de. Phytophthora. parasitica em mudas de citros, no Estado de S˜ao Paulo. Foram feitas duas avalia¸c˜oes para verificar a atividade antagˆonica dos isolados de Trichoderma in vitro, uma quanto ao hiperparasitismo e outra para verificar a produ¸c˜ao de substˆancias antagˆonicas que inibissem ou prejudicassem o desenvolvimento do pat´ogeno. Ficando evidenciada a eficiˆencia do Trichoderma em reduzir o crescimento do pat´ogeno. Jackisch e Menezes (1999) estudaram o efeito de Trichoderma spp. no controle de Pythium aphanidermatum. em fumo e observaram que todas as esp´ecies de. Trichoderma estudadas exerceram efeito inibit´orio sobre o crescimento de P. aphanidermatum, n˜ao havendo diferen¸ca significativa entre a eficiˆencia dos antagonistas. Observa¸c˜oes feitas quanto `as caracter´ısticas culturais nos pareamentos em placas, mostraram a ocorrˆencia de sobreposi¸c˜ao da colˆonia de Pythium, esporula¸c˜ao sobre Pythium e.
(25) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 23. forma¸c˜ao de um halo de separa¸c˜ao. Patricio, Kimati e Barros (2001) selecionaram isolados de Trichoderma spp. antagˆonicos a P. aphanidermatum em pepino, em casa-de-vegeta¸c˜ao, verificando o controle do tombamento em plˆantulas de pepino, com a aplica¸c˜ao de seis isolados de Trichoderma spp. e do fungicida metalaxyl + mancozeb, com rela¸c˜ao `a testemunha. Fajola e Alasoadura (1975) verificaram que os melhores resultados de biocontrole para P. aphanidermatum por T. harzianum foram obtidos quando os con´ıdios de T. harzianum foram aplicados 7 a 14 dias antes da inocula¸c˜ao dos zo´osporos de P. aphanidermatum e numa concentra¸c˜ao de 5 x 104 a 5 x 106 con´ıdios/kg de solo, tanto em solo natural quanto esterilizado. Devaki, Shankara Bhat e Majunath (1992) consideraram T. harzianum ineficiente para reduzir P. aphanidermatum em fumo, em solo natural. Noronha et al. (1996) selecionaram isolados de Trichoderma spp. para o controle de Rhizoctonia solani em feijoeiro no Estado de Pernambuco, testando alguns candidatos antagonistas pertencentes ao gˆenero Trichoderma em laborat´orio (tratamento de sementes) e em campo. Sob diferentes densidades de in´oculo de R. solani, T. harzianum apresentou os melhores n´ıveis de controle da doen¸ca, superando o fungicida Quintozene quando aplicado `as sementes. Em condi¸c˜oes de campo n˜ao houve controle efetivo de R. solani pelo tratamento do solo com o isolado de T. harzianum ou com Quintozene. Silveira et al. (1994) objetivando selecionar isolados de Trichoderma spp. com o potencial de biocontrole sobre isolados de Sclerotium rolfsii, no Estado de Pernambuco, observaram que isolados de Trichoderma spp. testados mostraram capacidade vari´avel de inibir o crescimento micelial e produ¸c˜ao de escler´ocios de S. rolfsii, sendo T. harzianum, o que apresentou maior potencialidade. Lobo J´ unior e Abreu (2000) estudaram a inibi¸c˜ao do crescimento micelial de S. sclerotiorum por metab´olitos vol´ateis produzidos por alguns antagonistas, incluindo esp´ecies de Trichoderma, em diferentes temperaturas e pH’s, e observaram que todos os isolados foram capazes de inibir o crescimento micelial do pat´ogeno demonstrando, assim, a produ¸c˜ao de metab´olitos vol´ateis com efeito inibit´orio ao crescimento micelial de S. sclerotiorum. A intera¸c˜ao entre os isolados e a temperatura foi altamente significativa quanto a eficiˆencia de cada isolado em trˆes temperaturas (10, 20 e 30◦ C ). Illipronti J´ unior e Machado (1998) verificaram que o controle desse pat´ogeno em culturas de feij˜ao e soja, no Estado de Minas Gerais, foi efetuado com destaque por fungos do gˆenero Trichoderma, `a exce¸c˜ao de T. hamatum em soja. Perceberam tamb´em, diferen¸cas significativas entre percentuais de controle do pat´ogeno realizado por isolados de T. koningii..
(26) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 24. Esses dados obtidos confirmam observa¸c˜oes feitas por Weildling (1934), de que ocorrem diferen¸cas entre grupos e esp´ecies de Trichoderma quanto a sua a¸c˜ao, seja por agressividade ou efeito de seu princ´ıpio letal ao pat´ogeno. Cassiolato, Baker e Melo (1996) estudaram o parasitismo de S. sclerotiorum e S. minor por mutantes resistentes ao Benomyl de T. harzianum, em aipo, no Estado de S˜ao Paulo, com o objetivo de selecionar de forma r´apida, linhagens eficientes de Trichoderma spp. no controle desses pat´ogenos e detectaram diferen¸cas estat´ısticas significativas quanto ao comportamento antagˆonico de mutantes contra S. minor e S. sclerotiorum, resultando em interferˆencia no crescimento micelial dos pat´ogenos e diminui¸c˜ao das les˜oes ocorridas na cultura, devido o antagonismo eficiente de alguns mutantes de Trichoderma..
(27) 25. ´ MATERIAL E METODOS. 3. Esta pesquisa foi desenvolvida no Laborat´orio de Fungos Fitopatogˆenicos e casa-devegeta¸c˜ao do Curso de P´os-Gradua¸c˜ao em Biologia de Fungos da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.. 3.1. Isolados de Sclerotinia sclerotiorum. Foram utilizados quatro isolados de S. sclerotiorum (Tabela 1), um deles proveniente da Micoteca URM do Departamento de Micologia da UFPE sob o registro 806 e trˆes de plantas com sintomas do mofo branco de diferentes localidades, sendo um obtido de soja do Estado do Rio Grande do Sul (Ss5 , fornecido pela EMBRAPA-Arroz e feij˜ao), um de alface do Distrito Federal (Ss17, fornecido pela EMBRAPA-Arroz e feij˜ao) e um de feij˜ao da Regi˜ao do Agreste Meridional do Estado de Pernambuco (Ss11). O isolamento de S. sclerotiorum de feij˜ao, procedeu-se segundo o m´etodo descrito por Menezes e Silva (1997) onde plantas de feij˜ao com sintomas da doen¸ca foram coletadas e partes retiradas destas foram desinfestadas superficialmente com hipoclorito de s´odio (3%) por dois a cinco minutos e, posteriormente, lavadas em ´agua destilada. Com o aux´ılio de um estilete flambado foram retirados pequenos fragmentos das margens da les˜ao e plaqueados em meio BDA (batata-dextrose-´agar) + cloranfenicol, distribuindoos de forma eq¨ uidistante na superf´ıcie do meio de cultura. As placas foram incubadas `a temperatura ambiente (28±1◦ C)e ap´os o crescimento do fungo, as estruturas foram transferidas para placa de Petri ou tubo de ensaio contendo meio BDA, dependendo da pureza da cultura. O isolado depois de purificado foi encaminhado `a Micoteca URM para identifica¸c˜ao da esp´ecie..
(28) 26. Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... Tabela 1. Isolados de Sclerotinia sclerotiorum utilizados.. 3.2. Isolado. Local de Origem. Substrato. Ano. 806 (Micoteca URM). Estados Unidos. –. 1957. Ss5 (EMBRAPA-Arroz e Feij˜ao). Rio Grande do Sul. Soja. 1998. Ss11 (Micoteca URM). Pernambuco. Feij˜ao. 2004. Ss17 (EMBRAPA-Arroz e Feij˜ao). Distrito Federal. Alface. 1998. Isolados de antagonistas utilizados. Foram utilizados nove isolados de antagonistas para o controle biol´ogico de S. sclerotiorum, dos quais oito eram esp´ecies do gˆenero Trichoderma e apenas uma esp´ecie de Ulocladium atrum. Trˆes isolados de Trichoderma (3601, T. harzianum; 2820 e 2745 T. viride) e o u ´nico isolado de U. atrum (3180) foram fornecidos pela Micoteca URM do Departamento de Micologia da UFPE,enquanto os cinco isolados antagonistas restantes foram obtidos a partir de solo da rizosfera de feij˜ao coletado de planta¸c˜oes com sintomas da doen¸ca no munic´ıpio de S˜ao Jo˜ao, Pernambuco. Esses isolados foram identificados como T. aureoviride e depositados na Micoteca URM (Tabela 2). Tabela 2. Rela¸c˜ao dos isolados antagonistas utilizados no controle biol´ogico. Esp´ ecie. Isolado. Local de Origem. Substrato. T. viride. 2745 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera cana-de-a¸cu ´car. T. viride. 2820 (Micoteca URM). Alagoas. cana-de-a¸cu ´car. T. harzianum. 3601 (Micoteca URM). Paran´a. Solo. T. aureoviride. 4912 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera de feij˜ao. T. aureoviride. 4913 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera de feij˜ao. T. aureoviride. 4914 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera de feij˜ao. T. aureoviride. 4915 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera de feij˜ao. T. aureoviride. 4916 (Micoteca URM). Pernambuco. Rizosfera de feij˜ao. U. atrum. 3180 (Micoteca URM). Pernambuco. Gr˜ao de cevada. Para isolamento de esp´ecies antagonistas do solo da rizosfera de feij˜ao, utilizou-se o m´etodo descrito por Clark (1965) modificado com o seguinte procedimento: por¸c˜oes do solo pr´oximo `as ra´ızes foram coletadas, acondicionadas em sacos de papel, peneiradas e feitas suspens˜oes sucessivas em ´agua destilada autoclavada at´e obten¸c˜ao de uma suspens˜ao de 1/10.000. A seguir 1 mL desta suspens˜ao foi retirada e semeada em placas de Petri.
(29) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 27. contendo meio BDA acrescido de Cloranfenicol, numa concentra¸c˜ao de 50 mg/L. As placas foram incubadas `a temperatura ambiente ± 28◦ C por 72 horas, ap´os esse per´ıodo de incuba¸c˜ao foi feita a purifica¸c˜ao dos isolados e estes mantidos em tubos de ensaio contendo. meio BDA. Os isolados purificados foram identificados por taxonomistas da Micoteca URM do Departamento de Micologia da UFPE.. 3.3. 3.3.1. Teste de patogenicidade dos isolados de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feij˜ ao Preparo do in´ oculo e inocula¸c˜ ao das plantas de feij˜ ao. Foram preparados dois tipos de in´oculos do pat´ogeno a partir de culturas de S. sclerotiorum com dez dias de crescimento a ± 28◦ C. O primeiro tipo consistiu de. escler´ocios germinados e o segundo tipo foi uma suspens˜ao preparada de mic´elio-´agar triturado com ´agua destilada esterilizada. Plantas de feij˜ao da variedade IPA-10 foram cultivadas em vasos pl´asticos com capacidade para 3 Kg de solo esterilizado com brometo de metila e 15 dias ap´os o plantio, procedeu-se a inocula¸c˜ao. Os escler´ocios germinados foram depositados no solo numa profundidade de trˆes cent´ımetros e a dois cent´ımetros pr´oximos do caule (trˆes escler´ocios por planta). A suspens˜ao de in´oculo (mic´elio triturado + ´agua destilada) tamb´em foi aplicada ao solo pr´oximo `as ra´ızes a uma profundidade de cinco cent´ımetros, recebendo cada planta 20 mL do in´oculo. As plantas testemunhas receberam ´agua destilada esterilizada sem in´oculo de S. sclerotiorum. Todas as plantas. foram mantidas em casa de vegeta¸c˜ao e o delineamento experimental foi inteiramente casualizado com dez repeti¸c˜oes para cada tratamento.. 3.3.2. Avalia¸c˜ ao da patogenicidade dos isolados de Sclerotinia sclerotiorum.. A avalia¸c˜ao dos sintomas foi realizada aos 10, 15, 20 e 25 dias ap´os a inocula¸c˜ao dos isolados do pat´ogeno e consistiu na observa¸c˜ao de sintomas t´ıpicos da doen¸ca, quantificando as folhas, pec´ıolos e ramos infectados, obtendo assim os percentuais de patogenicidade de acordo com o m´etodo descrito por Hall e Phillips (1996). Os dados obtidos foram submetidos `a testes estat´ısticos para compara¸c˜ao entre os isolados. Aplicou-se um modelo de binomial multivariado segundo a metodologia GEE (PRENTICE; ZHAO, 1991) com a estrutura de correla¸c˜ao permut´avel, para explicar de maneira conjunta o percentual de folhas, pec´ıolos e ramos infectados..
(30) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 28. 3.4. Controle biol´ ogico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum com isolados de Trichoderma e Ulocladium atrum. 3.4.1. Determina¸c˜ ao da taxa de crescimento micelial dos isolados. Para se determinar a taxa de crescimento micelial dos isolados f´ ungicos, culturas destes isolados foram preparadas transferindo-se discos de mic´elio-´agar de 4 mm de diˆametro, retirados das margens das colˆonias, para o centro de placas de Petri contendo meio BDA, com quatro repeti¸c˜oes para cada isolado. Diariamente foram realizadas mensura¸c˜oes do diˆametro das colˆonias em dois sentidos diametralmente opostos, com aux´ılio de uma r´egua milimetrada, at´e o sexto dia. Para efeito de c´alculo da taxa de crescimento micelial, considerou-se apenas duas medi¸c˜oes, aplicando a seguinte f´ormula adaptada de Lilly e Barnet (1951): T c = (Clii − Cli)/(T ii − T i) Onde: T c – taxa de crescimento micelial Cli – crescimento radial da colˆonia obtida no tempo i Clii– crescimento radial da colˆonia obtida no tempo ii T i – tempo em que se realizou a primeira leitura T ii – tempo em que se realizou a segunda leitura.. 3.4.2. Pareamento entre isolados de Sclerotinia sclerotiorum e antagonistas. Para se determinar o potencial antagˆonico dos isolados de Trichoderma e U. atrum contra os isolados de S. sclerotiorum, foi empregado o m´etodo de pareamento entre antagonista e fitopat´ogeno, descrito por Dennis e Webster (1971), que consiste em inocular em placas de Petri, discos de mic´elio-´agar do fitopat´ogeno e do antagonista em pontos eq¨ uidistantes, 7 cm entre si e a 1 cm da borda (Figura 1) considerando-se a taxa de crescimento micelial de cada isolado, de tal forma que possibilitasse as colˆonias alcan¸carem simultaneamente o centro da placa. Foram feitas medi¸c˜oes di´arias do crescimento linear das colˆonias, uma em dire¸c˜ao `a outra e ap´os o encontro das mesmas, bem como a sobreposi¸c˜ao de um fungo pelo outro..
(31) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 29. Figura 1. Esquema ilustrando o teste de pareamento entre antagonista e pat´ogeno. Para avalia¸c˜ao do potencial antagˆonico dos isolados de Trichoderma e U. atrum foi realizada a classifica¸c˜ao baseada na escala de Bell, Wells e Markham (1982) e observadas as intera¸c˜oes entre os isolados sob microscopia ´optica (Tabela 3). Tabela 3. Classes de antagonismo para Trichoderma e Ulocladium atrum com Sclerotinia sclerotiorum, adaptado de (BELL; WELLS; MARKHAM, 1982). Classe. Caracter´ıstica. 1. Trichoderma ou Ulocladium cresce e cobre completamente toda a colˆonia de S. sclerotiorum e a superf´ıcie do meio.. 2. Trichoderma ou Ulocladium cresce e cobre dois-ter¸cos da superf´ıcie do meio.. 3. Os antagonistas e o fitopat´ogeno colonizam cada um, metade da superf´ıcie do meio e nenhum parece dominar o outro.. 4. S. sclerotiorum coloniza dois-ter¸cos da superf´ıcie do meio.. 5. S. sclerotiorum cresce e cobre completamente toda a colˆonia de Trichoderma ou Ulocladium atrum e a superf´ıcie do meio..
(32) 30. Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 3.5. Controle qu´ımico sclerotiorum. in vitro. de. Sclerotinia. Para essa etapa da pesquisa foram selecionados trˆes fungicidas: Cercobin (tiofanato met´ılico), Derosal (carbendazim) e Rovral (iprodione). Esses produtos foram incorporados ao meio BDA, segundo o m´etodo descrito por Caldari J´ unior (1998) em quatro concentra¸c˜oes distintas do ingrediente ativo (1, 10, 50 e 100 ppm), sendo a seguir inoculados discos de mic´elio-´agar dos isolados do fitopat´ogeno no centro da superf´ıcie do meio contendo os fungicidas, em quatro repeti¸c˜oes para cada tratamento, incluindo a testemunha que foi inoculada em meio isento de fungicidas. Para avalia¸c˜ao do controle qu´ımico foi medido o crescimento micelial em intervalos regulares de 24 horas, al´em de observadas quaisquer altera¸c˜oes no aspecto macrosc´opico das colˆonias. Os dados obtidos foram submetidos `a an´alise estat´ıstica para compara¸c˜ao entre os fungicidas testados. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 4x3x4, representado por 4 isolados do pat´ogeno, 3 fungicidas e 4 concentra¸c˜oes do ingrediente ativo, sendo quatro repeti¸c˜oes para cada tratamento. Foi aplicada an´alise de variˆancia e as m´edias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa ASSISTAT vers˜ao 7.2 beta (SILVA, 2004).. 3.6. Compara¸c˜ ao entre controle biol´ ogico e qu´ımico em plantas de feij˜ ao in vivo. Foi selecionado o isolado de melhor desempenho no biocontrole in vitro assim como o fungicida mais eficiente no controle qu´ımico in vitro de S. sclerotiorum, ambos foram testados in vivo, em casa-de-vegeta¸c˜ao. Sementes de feij˜ao da variedade IPA-10 foram semeadas em vasos contendo solo esterilizado com brometo de metila. Ap´os quinze dias, inoculou-se o fitopat´ogeno como citado no ´ıtem 3.3 e, posteriormente, foram aplicados o antagonista e o fungicida, em tratamentos distintos, exceto em um tratamento, onde o antagonista foi inoculado antes do fitopat´ogeno. Os tratamentos est˜ao especificados na Tabela 4. O antagonista foi adicionado ao solo dos vasos contendo as plantas de feij˜ao, veiculado em arroz autoclavado, conforme descrito por Noronha et al. (1996), sendo incorporado ao solo numa concentra¸c˜ao de 2 g de in´oculo/kg. O fungicida selecionado para esta etapa da pesquisa foi aplicado como recomendado pelo fabricante (p´o dilu´ıdo, aspergido sobre as plantas). A avalia¸c˜ao dos resultados foi feita como anteriormente descrito para o teste de patogenicidade..
(33) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 31. Tabela 4. Esquema de tratamento e tempo de aplica¸c˜ao do antagonista e fungicida selecionado para compara¸c˜ao entre controle qu´ımico e biol´ogico de Sclerotinia sclerotiorum. Tratamento. Tempo de inocula¸c˜ ao/aplica¸c˜ ao do antagonista ou fungicida. 3601xSs11. Inocula¸c˜ao do antagonista 8 dias antes do pat´ogeno.. Ss11=3601. Inocula¸c˜ao do antagonista ao mesmo tempo que o pat´ogeno.. Ss11x3601. Inocula¸c˜ao do antagonista 8 dias ap´os o pat´ogeno.. Ss11x Cercobin. Aplica¸c˜ao do fungicida (p´o dilu´ıdo em ´agua aspergido sobre as plantas)..
(34) 32. 4. ˜ RESULTADOS E DISCUSSAO. 4.1. Patogenicidade dos isolados de sclerotiorum ` a plantas de feij˜ ao. Sclerotinia. Os primeiros sintomas do mofo branco foram observados j´a na primeira avalia¸c˜ao que ocorreu no 10o dia ap´os a inocula¸c˜ao. Estes sintomas revelaram-se inicialmente com o amarelecimento das folhas, seguido de murcha das mesmas, posteriormente observaram-se les˜oes u ´midas nos pec´ıolos, ramos e caules, culminando com a morte da planta, presen¸ca de mic´elio branco e forma¸c˜ao de escler´ocios nos ramos, caules e vagens (Figura 2). Ap´os o 25o dia da inocula¸c˜ao os sintomas apresentaram-se severos com os quatro isolados testados, contrastando-os com as plantas utilizadas como controle, que se mostraram isentas de sintomas (Figura 3). Os quatro isolados inoculados foram reisolados a partir das plantas com sintomas e apresentaram-se macrosc´opica e microscopicamente idˆenticos aos utilizados.. Figura 2. Vagens de feij˜ao, (A) de uma planta testemunha e infectada com isolados de Sclerotinia sclerotiorum: (B) Ss5 e (C) Ss11..
(35) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 33. Figura 3. Plantas de feij˜ao variedade IPA-10 (A) com sintomas do mofo branco causados pelo isolado Ss11 de Sclerotinia sclerotiorum e (B) testemunha. Todos os isolados testados foram patogˆenicos `as plantas de feij˜ao, sendo os isolados Ss11, Ss17 e 806 os que induziram maior severidade da doen¸ca, com 89,4%, 87,2% e 89,8% de sintomas, respectivamente e o isolado Ss5 com menor percentual de sintomas, 76,5% (Tabela 5). A an´alise estat´ıstica dos dados revelou diferen¸ca significativa entre os isolados e o controle, e apenas o isolado Ss5 foi significativamente menos patogˆenico que os demais (Tabela 6). O sucesso dos isolados quanto `a patogenicidade, pode ser atribu´ıdo em parte `as condi¸c˜oes clim´aticas favor´aveis ocorridas durante o experimento, j´a que a temperatura m´edia foi de 22◦ C, e a umidade relativa do ar m´edia foi de 76,7%. Bianchini, Maringoni e Carneiro (1997) afirmam que temperaturas amenas associadas `a alta umidade s˜ao fatores primordiais para a manifesta¸c˜ao e aumento da severidade da doen¸ca. Tabela 5.. Percentual de patogenicidade apresentado pelos isolados de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feij˜ao.. Isolado. Patogenicidade (%). 806. 89,8. Ss11. 89,4. Ss17. 87,2. Ss5. 76,5.
(36) 34. Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... Tabela 6. Compara¸c˜ao entre os tratamentos utilizados e suas respectivas correspondentes estat´ısticas para os percentuais de patogenicidade de Sclerotinia sclerotiorum em plantas de feij˜ao. Tratamentos comparados. Correspondentes estat´ısticas. Testemunha x Ss11. 2,885827 – 0,00000000*. Testemunha x Ss17. 2,885828 – 0,00000000*. Testemunha x Ss5. 2,885827 – 0,00000000*. Testemunha x 806. 2,885829 – 0,00000000*. Ss11 x Ss17. 2,725556 – 0,60162255. Ss11 x Ss5. 3,095548 – 0,07850673*. Ss11 x 806. 1,024242 – 0,91938787. Ss17 x Ss5. 3,605397 – 0,05759230*. Ss17 x 806. 4,622716 – 0,49656424. Ss5 x 806. 4,992292 – 0,02546046*. *S˜ ao estatisticamente diferentes ao n´ıvel de 10% de probabilidade. Para determinar as diferen¸cas estat´ısticas entre os tratamentos foram calculadas as correspondentes estat´ısticas de Wald, a partir da matriz de covariˆ ancia.. Bolland e Hall (1994) relatam a existˆencia de uma ampla gama de hospedeiros para S. sclerotiorum. Carrasco (1997) em estudos sobre o mofo branco, isolou o pat´ogeno de diversas. culturas. importantes. na. Venezuela,. inclusive. novos. hospedeiros. como:. Amaranthus dubius, Hydrocotyle umbellata, Sonchus oleraceus, Leonurus sibiricus, Brassica nigra. Charchar, Anjos e Ossipi (1999) testaram isolados obtidos de algod˜ao em diferentes esp´ecies de plantas ,tais como: feijoeiro, quiabeiro e algodoeiro e observaram que todos elas foram infectadas pelo fitopat´ogeno. Cother (2000) observou que isolados obtidos de crisˆantemos nativos da Austr´alia foram patogˆenicos a 45 esp´ecies vegetais, pertencentes a 21 fam´ılias de plantas nativas da costa Leste da Austr´alia. Do mesmo modo Lithourgidis, Tzavella-Klonari e Roupakias (2003) constataram tamb´em a inespecificidade hospedeira de isolados obtidos de fava e pepino em plantas de faveira, ambos induzindo sintomas no hospedeiro testado. Neste estudo, tamb´em foi observada a inespecificidade do pat´ogeno, pois os isolados de diferentes origens testados em feij˜ao, apresentaram percentuais de patogenicidade muito pr´oximos, sendo o isolado 806 com maior percentual de patogenicidade (89,8%) e Ss5 com o menor percentual (76,5%)..
(37) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 4.2. 35. Potencial antagˆ onico de isolados de Trichoderma e Ulocladium atrum contra Sclerotinia sclerotiorum in vitro. Dos nove isolados antagonistas analisados quanto ao potencial de biocontrole a S. sclerotiorum, apenas trˆes revelaram a¸c˜ao satisfat´oria T. harzianum (3601), T. aureoviride (4915 e 4916), pertencendo `a classe 1 de antagonismo, adaptado de Bell, Wells e Markham (1982). Os demais isolados de Trichoderma apresentaram potencial antagˆonico mediano, pertencendo `a classe 2 de antagonismo. O isolado 3180 (U. atrum) n˜ao demonstrou a¸c˜ao antagˆonica `a S. sclerotiorum (Figura 4 e Tabela 7). Li, Huang e Acharya (2003) relataram a existˆencia do potencial antagˆonico de U. atrum contra S. sclerotiorum, embora n˜ao demonstrando caracter´ısticas de micoparasitismo. Neste estudo ou ´nico isolado de U. atrum testado n˜ao revelou potencial antagˆonico frente ao pat´ogeno, tal fato pode ser atribu´ıdo provavelmente `a condi¸c˜ao de preserva¸c˜ao do isolado, j´a que este foi obtido da cole¸c˜ao de culturas Micoteca URM. Segundo alguns pesquisadores (SMITH; ONIONS, 1994) a preserva¸ c˜ao de microrganismos pode alterar ou inativar caracter´ısticas. fisiol´ogicas importantes como a patogenicidade, esporula¸ca˜o ou libera¸c˜ao de enzimas e outros compostos metab´olicos.. Figura 4. Crescimento em cultivo pareado entre os isolados de Sclerotinia sclerotiorum, Trichoderma spp. e Ulocladium atrum. Os isolados 3601, 4915 e 4916, pertencentes `a classe 1 de antagonismo apresentaram diferen¸cas quanto ao tempo necess´ario para crescer sobre o pat´ogeno, sendo o isolado.
(38) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 36. 3601 (T. harzianum) o que apresentou melhor desempenho (Figura 5). Dennis e Webster (1971) afirmam que esta caracter´ıstica ´e muito vantajosa para os antagonistas na disputa por ´area colonizada, pois vencendo a competi¸c˜ao por espa¸co e nutrientes o antagonista est´a exercendo uma das formas de biocontrole. Tabela 7. Classes de antagonismo para os isolados de Trichoderma contra Sclerotinia sclerotiorum, ap´os 144 horas de pareamento. Isolado. Classe de antagonismo. 3601 (T. harzianum). 1. 2820 (T. viride). 2. 2745 (T. viride). 2. 3180 (T. viride). 3. 4912 (U. atrum). 2. 4913 (T. aureoviride). 2. 4914 (T. aureoviride). 2. 4915 (T. aureoviride). 1. 4916 (T. aureoviride). 1. Figura 5. Pareamentos entre os isolados de Trichoderma spp. e Sclerotinia sclerotiorum (A) T. harzianum (3601xSs11); (B)T. aureoviride (4915xSs17) e (C)T. aureoviride (4916x806). Al´em do crescimento micelial tamb´em foi observado o grau de esporula¸c˜ao dos isolados antagonistas. Nesse sentido, a produ¸c˜ao de esporos dos isolados 3601, 4914, 4915, 4916 e 3180 n˜ao foi afetada durante o pareamento com o pat´ogeno. J´a os isolados 4912 e 4913, apresentaram uma esporula¸c˜ao levemente diminu´ıda, enquanto os isolados 2745 e 2820 praticamente n˜ao esporularam. Batista (2002) ressalta que o processo de produ¸c˜ao de esporos possivelmente seria uma caracter´ıstica favor´avel aos antagonistas, pois ´e altamente.
(39) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 37. desej´avel que estes produzam novos in´oculos na presen¸ca do pat´ogeno, inibindo assim a a¸c˜ao destes, devido a maior densidade do in´oculo antagonista. A inibi¸c˜ao do crescimento micelial de S. sclerotiorum ocorreu em maior intensidade com os isolados 2745 (T. viride), 2820 (T.viride), 4912 (T. aureoviride), 4913 (T. aureoviride) e 4914 (T. aureoviride), que colonizaram 2/3 da placa sem no entanto crescer sobre o fitopat´ogeno (Figura 6). Esta inibi¸c˜ao deve-se provavelmente `a capacidade de produ¸c˜ao de substˆancias antibi´oticas por estes antagonistas, que podem interferir no desenvolvimento do pat´ogeno (CHET; BAKER, 1981; BLAKEMAN; FOKKEMA, 1982; PAPAVIZAS, 1985). De fato, Campbell (1989) afirma que entre os efeitos provocados por. substˆancias antibi´oticas liberadas por antagonistas, podem ser observadas a redu¸c˜ao ou paralisa¸c˜ao do crescimento micelial e esporula¸c˜ao, redu¸c˜ao na germina¸c˜ao de esporos, al´em de distor¸c˜oes na hifa e end´olise.. Figura 6.. Pareamento entre isolados de Trichoderma e Sclerotinia sclerotiorum: (A)T. aureoviride (4913x806); (B) T. viride(2820xSs11) e (C) T. aureoviride (914xSs5).. Tamb´em foram observadas altera¸c˜oes morfol´ogicas relevantes no pat´ogeno, tais como: o tempo de forma¸c˜ao dos escler´ocios, que foi maior em alguns pareamentos (3601xSs11, 4915xSs11 e 2820xSs17); a quantidade reduzida de escler´ocios produzidos que ocorreu nos pareamentos 2745 x Ss5 e 4913 x Ss17 ou ainda, a n˜ao produ¸ca˜o destas estruturas de resistˆencia caracter´ıstica de S. sclerotiorum (3601 x Ss17, 4912 x Ss5 e 4914 x Ss5). Resultados semelhantes foram relatados por Cassiolato, Baker e Mello (1997), GraciaGarza, Reeleder e Paulitz (1997) em estudos sobre a a¸c˜ao de esp´ecies de Trichoderma na forma¸c˜ao de escler´ocios de S. sclerotiorum, verificando que T. hamatum, T. harzianum, T.viride e T. aureoviride provocaram uma redu¸c˜ao do n´ umero de escler´ocios formados. As observa¸c˜oes microsc´opicas dos pareamentos ocorridos entre os antagonistas e o fitopat´ogeno, demonstraram altera¸c˜oes morfol´ogicas dos mesmos, tais como: crescimento.
(40) Figueirˆedo, G. S. Controle biol´ ogico de Sclerotinia sclerotiorum.... 38. paralelo das hifas do antagonista e do pat´ogeno; forma¸c˜ao de an´eis de hifas no antagonista; enrolamento das hifas do pat´ogeno pelo antagonista; fragmenta¸c˜ao de hifas; mic´elio sem conte´ udo protoplasm´atico e penetra¸c˜ao de hifas de S. sclerotiorum por todos os isolados de Trichoderma analisados nesse estudo (Figura 7).. Figura 7.. Entrela¸camento de hifas de (B)Trichoderma harzianum (3601).. (A)Sclerotinia sclerotiorum. por. Elad (2000) relata que existem etapas sucessivas que envolvem o micoparasitismo de fungos pat´ogenos por esp´ecies de Trichoderma, tais como: crescimento quimiotr´ofico (onde exsudatos do pat´ogeno atraem o antagonista); reconhecimento entre o fitopat´ogeno e o antagonista; ades˜ao das hifas do pat´ogeno pelo antagonista e por fim a degrada¸c˜ao, onde o antagonista utiliza-se de enzimas como proteases e quitinases para degradar e penetrar na parede celular do pat´ogeno. De acordo com Brunner, Peterbauer e Mach (2003) a enzima 73-KDA N-acetyl-β-D-glucosaminidase est´a relacionada aos genes envolvidos na indu¸c˜ao da quitinase, sendo esta enzima a de maior relevˆancia para o biocontrole pois est´a relacionada com a degrada¸c˜ao da parede das c´elulas f´ ungicas. Durante a an´alise microsc´opica dos pareamentos observou-se a grande quantidade de hifas sem conte´ udo protoplasm´atico, sugerindo micoparasitismo necrotr´ofico. Cook e Baker (1983), Trutmann e Keane (1990) afirmam que em muitos casos de antagonismo, as esp´ecies T. harzianum e T. koningii podem ser classificadas como parasitas necrotr´oficos,.
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