Selecção e transporte componentes para a membrana plasmática de S cerevisiae

Outro dos aspectos mais importantes na manutenção da estrutura da membrana plasmática prende-se com a selecção e transporte (sorting) de lípidos e proteínas das restantes estruturas celulares para a membrana plasmática. Este aspecto é particularmente relevante, já que a membrana plasmática não possui capacidades biossintéticas per se, pelo que a sua composição é dependente quer de um complexo sistema de transporte celular, quer da troca espontânea de elementos constituintes da membrana

Relativamente aos lípidos já foram identificados vários tipos de transportadores, sendo que estes podem ser vesiculares ou não, ocorrendo neste último caso com o auxílio de proteínas transportadoras. Mesmo o próprio transporte vesicular necessita da presença de algumas proteínas específicas, que facilitam a transferência de lípidos entre as bicamadas. Dentro deste grupo, uma das proteínas mais estudadas é a proteína Sec14p que funciona como um transportador específico de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina do complexo de Golgi para a membrana plasmática.

40 Interessantemente observou-se também que duas proteínas associadas à resistência a fármacos, a Pdr16p e a Pdr17p, induzem aparentemente alterações na composição lipídica de vários compartimentos celulares, quando estão ausentes (van den Hazel et al., 1999). Esta observação pode indicar uma associação entre as proteínas envolvidas na resposta à presença de compostos tóxicos e a própria composição lipídica da célula funcionando talvez estas mesmas alterações como uma resposta per se aos compostos tóxicos (van den Hazel et al., 1999).

Outro exemplo claro, desta diversidade de meios de transporte celular, é o transporte de ergosterol para a membrana plasmática de S. cerevisiae. Neste caso, os esteróis podem ser transportados por um complexo sistema vesicular, ou, alternativamente, via proteínas transportadoras específicas denominadas genericamente como proteínas da família OSH (do inglês Oxysterol-binding Protein Homologue) (Schulz e Prinz, 2007). Relativamente às proteínas, o seu transporte para a membrana plasmática é realizado maioritariamente através de vesículas. Embora este sistema contemple a hipótese de que ocorra um sorting simultâneo de lípidos e proteínas, dado o transporte ser vesicular, esta não é a situação mais habitual (van der Rest et al., 1995). O transporte de proteínas ocorre ao longo da via secretória. Os péptidos são sintetizados nos ribossomas associados ao retículo endoplasmático rugoso, daí os polipéptidos são transportados do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi sendo posteriormente transportados para a membrana plasmática através da via secretória (van den Hazel et al., 1999). Como já foi referido acima (secção 1.4.3), também as jangadas desempenham um papel importante no transporte de proteínas para a membrana plasmática, o que vem reforçar a interacção entre lípidos e proteínas durante o transporte dos mesmos (Bagnat et al., 2000).

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2 Objectivos

A adaptação ao H2O2 na levedura S. cerevisiae é um importante fenómeno biológico devido às potenciais aplicações biomédicas que a elucidação deste mecanismo celular pode ter na compreensão das respostas biológicas ao H2O2 nos eucariotas, nomeadamente em situações de inflamação. Estudos prévios (Branco et al., 2004) revelaram que o processo adaptativo ao H2O2 em S. cerevisiae, na presença de uma dose de 150 µM de H2O2 em estado estacionário, está intrinsecamente relacionado com uma diminuição da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2. Esta alteração da membrana foi ainda associada a uma diminuição da sua fluidez (Folmer et al., 2008). É ainda conhecido de estudos prévios que estirpes de levedura com delecções em genes do metabolismo dos esteróis (erg3 e erg6) são mais sensíveis ao H2O2 (Branco et al., 2004). Dada a reconhecida importância da membrana plasmática na adaptação ao H2O2, torna-se essencial a compreensão dos mecanismos subjacentes às alterações da permeabilidade da membrana observadas durante a resposta adaptativa.

O principal objectivo deste trabalho experimental foi tentar perceber quais os acontecimentos biológicos que levam a que haja uma diminuição da permeabilidade da membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2 em S. cerevisiae. Considerando a elevada heterogeneidade da composição da membrana, devido à presença de vários tipos de lípidos e proteínas, bem como a necessária dependência de eventuais alterações da composição da membrana durante a resposta adaptativa de alterações da expressão génica, esta tarefa revelava-se complexa. Assim, considerou-se que uma primeira abordagem para atingir este objectivo deveria contemplar a análise das eventuais alterações da expressão génica e da composição da membrana plasmática. Deste modo durante este trabalho fez-se a análise por microarrays das alterações de expressão génica, assim como uma análise exaustiva da constituição lipídica e do proteoma da membrana plasmática durante a adaptação ao H2O2.

Os resultados obtidos foram separados pelos capítulos IV, V e VI desta tese. No capítulo IV são analisadas as alterações de expressão génica ao longo de 90 minutos de adaptação a 150 µM de H2O2 em estado estacionário. Foi feita uma análise global das funções e processos biológicos dos genes alterados, bem como a análise das variações ocorridas em genes especificamente associados ao metabolismo dos lípidos. No capítulo V são analisadas as alterações na composição lipídica da membrana plasmática em células adaptadas ao H2O2 nas mesmas condições que no capítulo IV, bem como a heterogeneidade da mesma. São analisadas as alterações lipídicas em termos de composição celular total e feita uma análise comparativa entre a composição membranar e a composição lipídica total. No capítulo VI são analisadas as alterações no proteoma da membrana plasmática em células adaptadas ao H2O2 nas condições definidas no capítulo

42 IV, tendo em conta não só as proteínas directamente incorporadas na membrana como também as proteínas associadas (covalentemente ou não) à mesma.

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