Capítulo 4 Métodos e materiais
4.3.7 Setup fluorométrico para a classificação das três espécies de fitoplâncton
Por último, para os testes de classificação das três espécies de fitoplâncton é necessário fazer um varrimento nos comprimentos de onda de excitação e de emissão. Através deste teste obtém-se um espectro de fluorescência 3D de cada espécie, e é assim possível diferenciar e classificar as diferentes espécies de fitoplâncton com base nas suas caraterísticas óticas. Este teste realizou-se no fluorímetro comercial (figura 4.3), e para cada comprimento de onda de excitação, na gama espectral de 320 nm a 710 nm de 10 nm de intervalo, fez-se um varrimento no espectro de emissão, na gama espectral de 600 nm a 750 nm com um intervalo de 5 nm. Através deste teste obtém-se um gráfico 3D, que será uma “impressão ótica” de cada espécie de forma a ser possível distinguir oticamente cada espécie. O processo foi repetido para as espécies, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana e Tetraselmis suecica. Depois de se obter o gráfico de fluorescência 3D de cada espécie e de forma a entender melhor as diferenças entre as três espécies, padronizou-se a intensidade fluorescência em percentagem, entre 0% e 100%, e fez-se a diferença entre os dois gráficos. Obteve-se assim três gráficos (Nannochloropsis gaditana/Isochrysis galbana; Nannochloropsis gaditana/ Tetraselmis suecica e Isochrysis galbana/Tetraselmis suecica) que representam a relação de intensidade de fluorescência entre as espécies.
Materiais
Para o microssistema de deteção espectrofotométrica que se pretende desenvolver
Amostra da cultura (diluição1) gbhdfboriginal() () Diluição 1/10 Diluição 1/100 Diluição 1/1000
Capítulo 4
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(2) um fotodetetor; (3) um filtro ótico, de modo a rejeitar todos os comprimentos de onda que possam interferir com as medições; (4) e um circuito de leitura.
4.4.1 Fonte emissora de luz
Com base nos resultados obtidos no teste descrito na secção 4.3.1, procedeu-se à aquisição de um LED. Este será utilizado como fonte emissora de luz para excitar os pigmentos presentes nas diferentes amostras. Na sua escolha foram tidas em conta algumas caraterísticas, tais como, o pico de comprimento de onda, o fluxo luminoso, o tamanho e o preço. Uma das características do LED é apresentar grande intensidade luminosa, uma vez que a concentração de fitoplâncton na água do mar é extremamente baixa (figura 2.6, secção 2.2). Posto isto, escolheu-se o LED LUXEON Rebel Royal Blue da LUMILEDS (figura 4.18). Apresenta o seu pico nos 450 nm, suporta correntes até 700 mA e tem uma área de 1 𝑚𝑚2.
Através do setup descrito na secção 4.3.2 procedeu-se à sua caraterização. O resultado obtido apresenta-se na figura 4.19, e tal como esperado o pico de intensidade encontra-se no comprimento de onda de 450 nm.
Capítulo 4
4.4.2 Fotodetetor
De seguida, procedeu-se à escolha e compra de um fotodetetor que substituirá o fotodetetor comercial disponível no laboratório. Para tal, fez-se um estudo das caraterísticas essenciais a ter em conta na escolha de um fotodetetor, caraterísticas estas apresentadas a seguir.
4.4.2.1 Parâmetros de um fotodetetor
O tipo de fotodetetor escolhido foi um fotodíodo de silício. São dispositivos 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 350 400 450 500 550 600 650 700 750 In ten sid ad e relativ a Comprimento de onda (nm)
Curva LED
Figura 4.19. Curva caraterística do LED.
Capítulo 4
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espectrofotometria, fotografia, e também como sensores de posição ótica, entre outras [41]. Na figura 4.21 está representado a vista em corte de um fotodíodo de silício.
4.4.2.2 Caraterísticas elétricas
A figura 4.22 representa o esquema elétrico de um fotodíodo. Este pode ser representado por uma fonte de corrente, que representa a corrente gerada pela absorção da radiação incidente, em paralelo com um díodo ideal, que representa a junção N-P. Neste esquema são também considerados a capacidade da junção (Cj) e uma resistência shunt (Rsh) ambos em paralelo com a fonte de corrente e com o díodo. Em série com todos os componentes representa-se uma resistência (Rs) [41].
Resistência de shunt (Rsh): traduz a inclinação da curva tensão-corrente do fotodíodo na origem e é usada para determinar a corrente de ruído no fotodíodo. Para um melhor desempenho deseja-se uma resistência de shunt elevada.
Figura 4.21. Fotodíodo de silício [41].
Figura 4.22. Esquema elétrico de um fotodíodo. Área Ativa N
Capítulo 4
Capacidade da junção (Cj): os limites da região de depleção atuam como as placas de um condensador paralelas. A capacidade da junção é diretamente proporcional à área difusa e inversamente proporcional à largura da região de depleção.
Resistência em série (Rs): resulta da resistência dos contactos e da resistência de silício “undepleted”.
4.4.2.3 Caraterísticas óticas
Na escolha de um fotodíodo é necessário ter em conta algumas caraterísticas óticas, tais como, a responsividade, a eficiência quântica, a não-uniformidade e a não- linearidade [41].
- Responsividade: é uma medida da eficácia da conversão da potência luminosa em corrente elétrica. Varia com o comprimento de onda incidente, com a polarização reversa aplicada e com a temperatura. Pode ser traduzida na seguinte expressão (Equação 3):
𝑅 = 𝐼𝑝
𝑃 [𝐴/𝑊]
(3) Em que R é a responsividade, Ip a corrente gerada pelo fotodíodo e P a potência luminosa incidente.
- Eficiência quântica: é definida com a fração de fotões incidentes que contribuem para a corrente gerada pelo fotodíodo, também designada por fotocorrente. É traduzida na seguinte expressão (Equação 4):
𝐸. 𝑄 =𝑅𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 𝑅𝑖𝑑𝑒𝑎𝑙
= 𝑅ℎ ∗ 𝑐 𝜆 ∗ 𝑞
Capítulo 4
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- Não-uniformidade: é definida como variações da responsividade observadas ao longo da superfície da área ativa do fotodíodo.
- Não-linearidade: se a fotocorrente aumentar linearmente com a potência da luz incidente, então o fotodíodo é considerado linear. A linearidade é determinada pela medição da pequena alteração na fotocorrente como resultado de uma pequena alteração na potência de luz incidente. A não-linearidade é a variação da razão entre a variação de corrente e da potência da luz incidente.
4.4.2.4 Ruído
Num fotodíodo estão identificadas duas fontes de ruído: Shot Noise e Johnson Noise.
Shot Noise: que é traduzido na seguinte expressão (Equação 5): 𝐼𝑠𝑛 = √2𝑞 ∗ (𝐼𝑝 + 𝐼𝑑)∆𝑓
(5) Em que q = 1,6*10−19 C (carga de um eletrão), Ip é a corrente gerada pelo fotodíodo, Id é a corrente no escuro e ∆𝑓 é a largura de banda da medição do ruído.
Johnson Noise: A resistência de shunt num fotodíodo tem um Johnson Noise
associado. É traduzido na seguinte expressão (Equação 6):
𝐼𝑗𝑛 = √4𝐾𝑏 ∗ 𝑇 ∗ ∆𝑓 𝑅𝑠ℎ
(6) Em que Kb = 1,38*10−23 J/K (constante de Boltzmann), T é a temperatura absoluta expressa em Kelvin, ∆𝑓 é a largura de banda da medição do ruído e Rsh a resistência de shunt.
Daqui pode-se deduzir o ruído total (Equação 7): 𝐼𝑡𝑛 = √𝐼𝑠𝑛2 + 𝐼𝑗𝑛2
(7) Posto isto, e com base nas caraterísticas anteriormente apresentadas foram escolhidos dois fotodíodos, o Hamamatsu S5973 e o Hamamatsu S5971. Na tabela 4.1 estão representados algumas das suas caraterísticas.
Capítulo 4
Tabela 4.1. Caraterísticas dos fotodetetores escolhidos.
Com base nos resultados obtidos nos testes descritos na secção 4.3.3, escolheu-se o fotodetetor Hamamatsu S5971 para o microssistema espectrofotométrico que se pretende desenvolver.
4.4.3 Filtro ótico
Através dos resultados obtidos no teste de deteção de pigmentos presentes nas amostras de fitoplâncton, usando o LED como fonte emissora de luz e o fotodetetor HAMAMATSU S5971 (testes descritos na secção 4.3.3), procedeu-se à aquisição de um filtro ótico passa-banda. O filtro ótico tem como função deixar passar para o fotodetetor apenas a luz correspondente à gama espectral de interesse, sendo o seu pico de fluorescência centrado nos 682 nm (pico verificado nos testes de deteção, Teste 4). Isto é, o filtro tem como objetivo rejeitar todos os comprimentos de onda diferentes da gama espectral de interesse, como por exemplo, a luz proveniente do LED (pico centrado nos 450 nm) e toda a luz que possa interferir com a medição. Posto isto, e com base em algumas
HAMAMATSU S5973 HAMAMATSU S5971
Tensão Reversa (volts) 3.3 10
Capacidade (pF) 1.6 3
Resistência de shunt (GΩ)
50 50
Corrente de pico (nA) 10 10
Fotossensibilidade (A/W) 0.44 0.44
λ(nm) 660 660
Preço (€) 22.94 9.87
Capítulo 4
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passante compreendida entre 650 nm e 705 nm, uma transmissão superior a 85 % (figura 4.23) e um diâmetro de 4.5 mm.
4.4.4 Circuito de leitura
Uma vez que a corrente gerada pelo fotodetetor apresenta uma amplitude bastante reduzida, acoplou-se ao fotodetetor um amplificador Lock-in, desenvolvimento por um aluno pertencente ao projeto NextSea. Este amplificador Lock-in foi projetado para uma frequência de 1 kHz. O amplificador Lock-in é usado para medir sinais de baixíssima amplitude, mesmo quando estes então embebidos em ruído superior ao sinal desejado [42], como apresentado em exemplo na figura 4.24.
Figura 4.24. Exemplo ilustrativo de um sinal embebido em ruído [43]. Figura 4.23. Largura de banda passante e transmissão do filtro ótico 685AF40 [49].
Capítulo 4
De modo a rejeitar todo o ruído para que não afete as medições, este amplificador utiliza uma técnica designada por phase-sensitive detetion de forma a isolar o sinal através de uma referência com determinada frequência e fase [42]. Assim, todo o ruído presente em frequências diferentes do sinal de referência será rejeitado.
O processo de eliminação do ruído indesejado não é conseguido, apenas, por filtragem, mas através de um bloco adicional ao amplificador Lock-in designado de multiplicador [43]. No amplificador Lock-in, o sinal de entrada é originalmente modulado a uma frequência fixa (designada Fref) na figura 4.25.
Tal como um retificador de onda completa, o multiplicador retifica o sinal de entrada através de um sinal de referência, obtendo-se à saída uma componente contínua proporcional ao sinal de entrada. O sinal é assim recuperado e deslocado para a gama de frequência original, ao qual através de um filtro passa-baixo é possível eliminar o ruído que se encontra nas frequências elevadas (figura 4.26).
Capítulo 4
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4.4.4.1 Arquitetura do amplificador Lock-in
O amplificador Lock-in é constituído por cinco principais blocos: amplificador de transimpedância; filtro passa banda; amplificador; multiplicador; e filtro passa baixo. Na figura 4.27 está representado a arquitetura do amplificador lock-in.
Uma vez que é necessário deslocar o sinal desejado para frequências elevadas, para o desviar das frequências caraterísticas de ruído dos circuitos integrados, a fonte emissora de luz terá que ser pulsada à mesma frequência garantindo assim a sincronização dos blocos do amplificador Lock-in. O sinal usado como referência será o mesmo que pulsa a fonte emissora de luz, para que ambos se encontrem em fase no bloco multiplicador [44].
O amplificador de transimpedância, ligado ao fotodetetor, permite que o sinal gerado pelo fotodetetor seja convertido em tensão [43]. O sinal embebido em ruído, além
Figura 4.26. Representação do efeito do filtro passa-baixo [43].
Capítulo 4
de convertido, será também amplificado para um nível adequado à entrada do multiplicador. Na maioria do componentes eletrónicos, quanto menor é a frequência maior será o ruído associado [45]. Afastando o sinal de interesse das baixas frequências, possibilita a deteção de sinais de amplitude bastante reduzida, como é o caso em estudo. Isto é conseguido através da modulação da fonte emissora de luz (pulsada a 1 kHz), deslocando o sinal desejado para as frequências de menor ruído [45]. O circuito de leitura possui duas entradas, em que uma delas corresponde à corrente gerada pelo fotodetetor e a outra ao sinal de comutação da fonte emissora de luz. Esse sinal de pulsagem, gerado por um Arduino Uno, tem como caraterísticas principais, um sinal quadrado entre 0 V e 5 V, com uma frequência de 1 kHz e um duty-cycle de 50 % (este duty-cycle foi escolhido com base nos resultados obtidos no teste descrito na secção 4.4.4.2). Este sinal é usado para a comutação da fonte emissora de luz e como sinal de referência, garantindo a sincronização das fases dos sinais no módulo de multiplicação no circuito de leitura. O filtro passa-banda isola o sinal pulsado, removendo as frequências indesejadas. O bloco de amplificação tem como principal objetivo a diminuição do ganho aplicado ao amplificador de transimpedância para que o nível de ruído introduzido seja menor. O bloco multiplicador permite recuperar o sinal de interesse de baixa frequência. Este, deslocará o sinal que até esta fase se encontrava pulsado a 1 kHz, para o domínio contínuo (DC), rejeitando todos os sinais que não estejam sincronizados com a referência de excitação. Por último, o filtro passa-baixo é responsável por eliminar o ruído que se encontra a frequências superiores à frequência de corte, obtendo assim o sinal desejado limpo e sem ruído.
4.4.4.2 Setup e procedimento para escolha do melhor duty-cycle
O sinal usado para a referência será o mesmo que pulsa a fonte de excitação, para que ambos se encontrem em sincronização de fase no multiplicador. Para a modulação do LED usou-se um Arduino Uno para gerar uma onda quadrada entre 0 V e 5 V com uma frequência de 1kHz e fez-se variar o seu duty-cycle. Quanto maior fosse o valor de duty- cycle, maior seria a resposta de fluorescência das espécies de fitoplâncton, porém por limitação da frequência projetada para o circuito de leitura, é necessário proceder a este teste de modo a escolher o melhor valor de duty-cycle a usar para o melhor funcionamento do circuito de leitura.
Capítulo 4
74 Quantificação e Classificação de Fitoplâncton por Espetrofotometria Carlos José de Sousa Pereira – Universidade do Minho
A escolha deste LED recaiu pelo facto de este estar disponível em laboratório e porque o fotodetetor apresenta uma maior fotossensibilidade a 655 nm do que a 450 nm (pico do LED LUXEON Rebel Royal Blue). Com este teste, era esperando que quanto maior fosse o duty-cycle, maior seria a tensão à saída do amplificador Lock-in. Na figura 4.28 é possível visualizar o setup usado para este teste.
No circuito de comutação da fonte de excitação, usou-se a fonte variável de tensão do DigitalLab como fonte de alimentação do circuito e um transístor bipolar 2N2222 (figura 4.29). Circuito de comutação da fonte de excitação Amplificador Lock-in Saída Osciloscópio Circuito para gerar sinal de referência Sinal de referência Sinal de entrada
Figura 4.28. Set up para a escolha do melhor duty-cycle.
Figura 4.29. Circuito de comutação da fonte de excitação.
Capítulo 4
Para o sinal de referência, usou-se um circuito que recebe a onda quadrada gerada pelo Arduido Uno entre 0 V e 5V e coloca-a entre -1 V e 1 V (figura 4.30). Este circuito apenas foi usado neste teste para uma melhor compreensão de todo o circuito de leitura.
No capítulo anterior descreveu-se o microssistema espectrofotométrico que se pretende desenvolver. Foram também descritos os setup utilizados para cada teste e os materiais escolhidos com base nos resultados obtidos nos diferentes testes.
No presente capítulo são expostos e discutidos os resultados obtidos nos diferentes testes efetuados. Como já foi mencionado no capítulo anterior os testes experimentais foram divididos em três partes de acordo com o que se pretende medir: (1) deteção de pigmentos fotossintéticos presentes nas amostras; (2) quantificação das espécies de fitoplâncton; (3) e classificação das três espécies de fitoplâncton.
Deteção de pigmentos fotossintéticos
Os testes de deteção de pigmentos fotossintéticos têm como objetivo verificar a existência de pigmentos capazes de absorver e fluorescer luz nas diferentes espécies de fitoplâncton. Nestes testes foram utilizados os setup fluorométrico e espectrofotométrico descritos nas secções 4.3.1 e 4.3.3, respetivamente.
Inicialmente usou-se o setup fluorométrico. Primeiramente, obteve-se o espectro de absorbância, visível na figura 5.1.
Capítulo 5
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Através da análise do espectro de absorbância verificam-se dois picos. O primeiro, apesar de não ser muito nítido, mas claramente visível na espécie Nannochloropsis gaditana, está centrado a 450 nm e o outro pico, este claramente visível nas duas espécies, está centrado a 685 nm. Estes resultados de absorbância permitiram concluir que estas duas espécies apresentam uma maior absorbância para os comprimentos de onda de 450 nm e 685 nm, comprimento este à volta do qual será feita a excitação para a emissão de luz fluorescente das espécies. De seguida, obteve-se o espectro de fluorescência. Para tal, fixou-se o comprimento de onda de excitação, de acordo com o resultado de absorbância, nos 450 nm, e fez-se um varrimento no comprimento de onda de emissão, na gama espectral de 350 nm a 750 nm. De seguida variou-se de cerca de 20 nm o comprimento de onda de excitação (430 a 470 nm) de forma a obter-se a melhor resposta de fluorescência. O melhor comprimento de onda de excitação foi aos 435 nm e a resposta de fluorescência encontra- se na figura 5.2. 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 250 350 450 550 650 750 A b so rb ân cia [u .a] Comprimentos de onda [nm]
Espectro de absorbância
Nannochloropsis gaditana Isochrysis galbanaCapítulo 5
Pode concluir-se que para um comprimento de onda de excitação centrado a 435 nm, as espécies Nannochloropsis gaditana e Isochrysis galbana apresentam uma fluorescência centrada a 685 nm. Estes valores de comprimento de onda de excitação e fluorescência vão de encontro ao pigmento clorofila-a.
Por último realizou-se o teste inverso, ou seja, fixou-se o comprimento de onda de emissão e detetou-se onde havia excitação de moléculas nas diferentes amostras. Pode-se constatar que com o comprimento de onda de emissão fixado nos 685 nm, ocorre uma maior excitação de moléculas nos 435 nm nas duas espécies, comprovando assim o teste anterior. A imagem 5.3 representa o resultado obtido.
0.00E+00 5.00E+05 1.00E+06 1.50E+06 2.00E+06 2.50E+06 500 550 600 650 700 750 In ten sid ad e d e Flu o rescên cia [u .a] Comprimento de onda [nm]
Espectro de fluorescência
Nannochloropsis gaditana Isochrysis galbanaFigura 5.2. Espectro de fluorescência das espécies Nannochloropsis gaditana e Isochrysis
Capítulo 5
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Com base nos resultados obtidos neste teste, compraram-se uma fonte emissora de luz (secção 4.4.1) e dois fotodetetores (secção 4.4.2) para serem utilizados no sistema final. De seguida, procedeu-se aos mesmos testes descritos, mas agora utilizando estes componentes. Tal como é descrito na secção 4.3.3, inicialmente usou-se o LED como fonte emissora de luz e o fotodetetor comercial Hamamatsu S1336-5BQ. Nas figuras 5.4, 5.5 e 5.6 estão demonstrados os resultados obtidos.
0.00E+00 1.00E+05 2.00E+05 3.00E+05 4.00E+05 5.00E+05 6.00E+05 7.00E+05 370 420 470 520 570 E x citaç ão [ u .a] Comprimento de onda [nm]
Excitação
Nannochloropsis gaditana Isochrysis galbanaFigura 5.3. Confirmação dos picos de excitação nas espécies Nannochloropsis gaditana e
Isochrysis galbana. -2.0E-11 0.0E+00 2.0E-11 4.0E-11 6.0E-11 8.0E-11 1.0E-10 1.2E-10 550 600 650 700 750 C o rr en te [A ] Comprimento de onda [nm]
Nannochloropsis gaditana
Figura 5.4. Espectro de fluorescência usando o LED como fonte emissora de luz da espécie Nannochloropsis gaditana.
Capítulo 5
Os resultados obtidos neste teste comprovam os valores obtidos através do setup fluorométrico. De notar que nos testes efetuados usando o setup fluorométrico obteve-se a intensidade de fluorescência e no setup espectrofotométrico obteve-se a corrente gerada
-2.0E-11 0.0E+00 2.0E-11 4.0E-11 6.0E-11 8.0E-11 1.0E-10 1.2E-10 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimentode onda [nm]
Isochrysis galbana
Figura 5.5. Espectro de fluorescência usando o LED como fonte emissora de luz da espécie Isochrysis galbana.
-2.0E-11 0.0E+00 2.0E-11 4.0E-11 6.0E-11 8.0E-11 1.0E-10 1.2E-10 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimento de onda [nm]
Tetraselmis suecica
Figura 5.6. Espectro de fluorescência usando o LED como fonte emissora de luz da espécie Tetraselmis suecica.
Capítulo 5
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espectrofotométrico obteve-se um valor de corrente maior a 673 nm. Esta variação pode ter ocorrido devido a que no setup fluorométrico obteve-se uma melhor resposta de fluorescência para uma excitação a 435 nm e no setup espectrofotométrico, o pico de excitação estava centrado a 450 nm, devido às caraterísticas escolhidas para o LED.
De seguida, substituiu-se o fotodetetor comercial Hamamatsu S1336-BQ pelos fotodetetores Hamamatsu S5971 e Hamamatsu S5973. As figuras 5.7, 5.8 e 5.9 representam os resultados obtidos usando o fotodetetor Hamamatsu S5971 e a figura 5.10 representa o resultado obtido usando o fotodetetor Hamamatsu S5973.
0.0E+00 5.0E-12 1.0E-11 1.5E-11 2.0E-11 2.5E-11 3.0E-11 3.5E-11 4.0E-11 4.5E-11 5.0E-11 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimento de onda [nm]
Nannochloropsis gaditana
Figura 5.7. Espectro de fluorescência usando o fotodetetor Hamamatsu S5971 da espécie
Nannochloropsis gaditana. 0.00E+00 1.00E-11 2.00E-11 3.00E-11 4.00E-11 5.00E-11 6.00E-11 7.00E-11 8.00E-11 9.00E-11 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimento de onda [nm]
Isochrysis galbana
Figura 5.8. Espectro de fluorescência usando o fotodetetor Hamamatsu S5971 da espécie
Capítulo 5 0.0E+00 1.0E-11 2.0E-11 3.0E-11 4.0E-11 5.0E-11 6.0E-11 7.0E-11 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimento de Onda [nm]
Tetraselmis suecica
0.0E+00 2.0E-12 4.0E-12 6.0E-12 8.0E-12 1.0E-11 1.2E-11 550 600 650 700 750 Fo to co rr en te [A ] Comprimento de onda [nm]Nannochloropsis gaditana
Figura 5.9. Espectro de fluorescência usando o fotodetetor Hamamatsu S5971 da espécie
Tetraselmis suecica.
Figura 5.10. Espectro de fluorescência usando o fotodetetor Hamamatsu S5973 da espécie Nannochloropsis gaditana.
Capítulo 5
84 Quantificação e Classificação de Fitoplâncton por Espetrofotometria Carlos José de Sousa Pereira – Universidade do Minho
S5971 obteve-se uma corrente maior e um sinal “mais limpo”, daí não se repetirem os testes para as restantes duas espécies. Em comparação com o fotodetetor comercial, disponível no laboratório, constatou-se que o pico de fluorescência está deslocado, 673 nm com o