Simula¸cões Numéricas e Discussões - Dinamica populacional de microrganismos e a conservação

A estabilidade dos pontos de equil´ıbrio pode ser determinada por simula¸cões numéricas do sistema ou por lineariza¸cão. Pela dificuldade de se provar analiticamente resultados de estabilidade observados nos diagramas de bifurca¸cão para o modelo em estudo, foram feitas simula¸cões numéricas com o propósito de ilustrar tais resultados.

Fixando os valores dos parâmetros (tabela 3.4) e mudando o parâmetro de controle (N ) e as condi¸cões iniciais (H0, Hc0, R0 e Rf 0), foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas do sistema (3.7) para cada uma das regiões dos diagramas de bifurca¸cão. O método numérico adotado em todas as simula¸cões foi Runge-Kutta de quarta ordem, utilizando-se o pacote Matlab.

SEÇ ÃO 3.5 • SIMULAÇ ÕES NUMÉRICAS E DISCUSS ÕES 72

Tabela 3.5: Conjunto de condi¸c˜oes iniciais, (H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)), utilizadas em cada uma

das simula¸cões numéricas das trajetórias do sistema (3.7).

Simula¸c˜ao H0 Hc0 R0 Rf 0 (1) 0 0 0 0 (2) 2 10 80 1 (3) 4, 4 34 210 16 (4) 4, 6 38 230 20 (5) 14 100 500 100 (6) 14 100 500 100

Dividimos o diagrama de bifurca¸cão em três regiões, de acordo com os intervalos de valores assumidos pelo parâmetro N . Os valores de N utilizados nas simula¸cões variam conforme região e são apresentados em seguida.

• Regi˜ao (I), onde 0 < N < N1. O valor utilizado na simula¸c˜ao (1) foi N = 2.

• Região (II), onde N1 < N < N2. O valor utilizado nas simula¸cões (2)-(5) foi N = 4. • Região (III), onde N > N2. O valor utilizado na simula¸cão (6) foi N = 6.

Os conjuntos de condi¸cões iniciais utilizadas nas simula¸cões são apresentados na tabela (3.5).

Para contemplar as três regiões do diagrama de bifurca¸cão (indicadas na figura 3.2), e analisar comportamentos distintos das trajetórias dinâmicas na região (II), foram feitas seis simula¸cões numéricas das trajetórias H(t), Hc(t), R(t) e Rf(t), que são apresentadas nas figuras (3.3) a (3.8).

Com rela¸cão a existência de pontos de equil´ıbrio, verificamos nos diagramas de bifurca¸cão (figura 3.2) que

• Na região (I), onde 0 < N < N1, existe um único ponto de equil´ıbrio com baixas concentra¸cões das prote´ınas histidina quinase e reguladora de resposta, assim como de

seus produtos. Denotemos esse ponto de equil´ıbrio por Q1;

• Quando N = N1 existem os pontos de equil´ıbrio Q1, e al´em dele, o ponto Q2, que coincide com Q3;

• Na região (II), onde N1 < N < N2, existem três pontos de equil´ıbrio que denotaremos por Q1, Q2 e Q3. O primeiro ponto, Q1, representa o ponto com baixos n´ıveis de H, Hc, R e Rf em equil´ıbrio estacionário. Indicamos por Q2, o ponto de equil´ıbrio com concentra¸cões intermediárias de histidina quinase (H), histidina quinase complexada (Hc), regulador de resposta (R) e regulador de resposta fosforilado (Rf), em estado estacionário, enquanto Q3 corresponde ao equil´ıbrio com n´ıveis maiores de tais prote´ınas;

• Quando N = N2 existem os pontos de equil´ıbrio Q3, e o ponto Q1 que coincide com Q2;

• Na regi˜ao (III), onde N > N2, existe apenas o ponto de equil´ıbrio Q3.

Na simula¸cão (1), utilizamos condi¸cões iniciais nulas e fixamos o valor de N tal que 0 < N < N1. Estudando os diagramas de bifurca¸cão verificamos que, para este intervalo de N , existe um único ponto de equil´ıbrio que é local e assintoticamente estável. De fato, na simula¸cão (1) (figura 3.3), as trajetórias tendem para esse equil´ıbrio. Apesar de inicialmente as concentra¸cões de H, Hc, R e Rf serem nulas, e a concentra¸cão extracelular de nisina ser baixa, há produ¸cão de histidina quinase (H) e regulador de resposta (R), em decorrência da s´ıntese basal. Consequentemente aumentarão também as concentra¸cões de Hc e Rf, devido às rea¸cões qu´ımicas que transformarão H e R nestes produtos.

Uma caracter´ıstica interessante do modelo é a biestabilidade mantida para um intervalo do parâmetro de controle, representado por N1 < N < N2 nas curvas da figura (3.2). Peque- nas mudan¸cas no parâmetro de controle alteram o estado do sistema para dois patamares de Rf distintos. Para baixos valores de N , existe um único estado de equil´ıbrio assintoticamente estável (Q1) com baixo n´ıvel de Rf. Quando N aumenta, duas outras solu¸cões estacionárias aparecem (Q2 e Q3), sendo a intermediária (Q2) instável. Uma vez atingida uma concen-

SEÇ ÃO 3.5 • SIMULAÇ ÕES NUMÉRICAS E DISCUSS ÕES 74 0 200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 20 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.3: Simula¸cão (1). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 2, pertencente à região (I) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (0; 0; 0; 0).

tra¸cão de nisina limiar (N2), as duas solu¸cões com n´ıveis mais baixos de Rf desaparecem, deixando apenas uma única solu¸cão assintoticamente estável (Q3).

Para valores de N pertencentes à região (II), ou seja, para N1 < N < N2, devido a exis- tência de múltiplos equil´ıbrios e pela caracter´ıstica de biestabilidade, o comportamento das solu¸cões dependerá fortemente das condi¸cões iniciais. Para confirmar isso, nas simula¸cões (2) a (5) fixamos N = 4, tal que N pertence a região (II), e utilizamos diferentes condi¸cões iniciais (figuras 3.4 - 3.7).

0 200 400 600 800 1000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 20 25 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 50 100 150 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 6 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.4: Simula¸cão (2). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 4, pertencente à região (II) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (2; 10; 80; 1).

De modo geral, a regi˜ao (II) apresenta as seguintes caracter´ısticas:

• Para valores de N tais que, N1 < N < N2, e para todos os demais parâmetros fixos, o espa¸co (H, Hc, R, Rf), pode ser dividido em duas regiões de atra¸cão distintas: uma para o ponto de equil´ıbrio com baixos n´ıveis de H, Hc, R e Rf, que corresponde ao ponto Q1, e outra para o ponto com concentra¸cões maiores destas prote´ınas (ponto Q3).

SEÇ ÃO 3.5 • SIMULAÇ ÕES NUMÉRICAS E DISCUSS ÕES 76 0 200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 10 20 30 40 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 50 100 150 200 250 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 20 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.5: Simula¸cão (3). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 4, pertencente à região (II) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (4, 4; 34; 210; 16).

• O ponto Q2 representa o “ponto de ruptura”, que divide o espa¸co (H, Hc, R, Rf) nas duas regi˜oes de atra¸c˜ao.

• Para condi¸cões iniciais no ponto instável, pequenas pertuba¸cões podem levar as tra- jetórias para uma das regiões de atra¸cão.

• Se a condi¸cão inicial, (H0, Hc0, R0, Rf 0), pertence à região de atra¸cão de Q1, as tra- jetórias tendem para esse ponto de equil´ıbrio. Entretanto, se as condi¸cões iniciais

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 100 200 300 400 500 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.6: Simula¸cão (4). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 4, pertencente à região (II) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (4, 6; 38; 230; 20).

pertencem à região de atra¸cão de Q3, as trajetórias tendem para esse ponto, ou seja, (H(t), Hc(t), R(t), Rf(t)) → Q3.

Conforme esperado verificamos que, na simula¸cão (2) (figura 3.4), as trajetórias tenderam para as baixas concentra¸cões do ponto de equil´ıbrio assintoticamente estável (Q1), pois as condi¸cões iniciais fornecidas situavam-se na região de atra¸cão deste ponto.

A influência das condi¸cões iniciais é claramente observada nas simula¸cões (3) e (4). De- vido à proximidade dessas condi¸cões ao equil´ıbrio instável, pequenas perturba¸cões fizeram

SEÇ ÃO 3.5 • SIMULAÇ ÕES NUMÉRICAS E DISCUSS ÕES 78 0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 100 200 300 400 500 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.7: Simula¸cão (5). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 4, pertencente à região (II) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (14; 100; 500; 100).

com que as trajetórias tendessem para o ponto assintoticamente estável Q1 (figura 3.5), se as condi¸cões iniciais pertenciam a região de atra¸cão deste ponto, ou para o ponto Q3, com n´ıveis maiores das prote´ınas, se as condi¸cões iniciais fornecidas pertenciam à região de atra¸cão deste ponto (figura 3.6).

Nas simula¸cões (5) e (6) foram utilizados valores de N pertencentes às regiões (II) e (III), respectivamente (veja figuras 3.7 e 3.8). Entretanto fixamos os valores para as condi¸cões iniciais. Ambas simula¸cões apresentaram o mesmo tipo de comportamento, sendo que as

trajet´orias tenderam para o ponto de equil´ıbrio local e assintoticamente est´avel Q3. 0 200 400 600 800 1000 0 5 10 15 Tempo H (nmol) por 10 6 células (a) H 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo Hc (nmol) por 10 6 células (b) Hc 0 200 400 600 800 1000 0 100 200 300 400 500 Tempo R (nmol) por 10 6 células (c) R 0 200 400 600 800 1000 0 20 40 60 80 100 120 Tempo Rf (nmol) por 10 6 células (d) Rf

Figura 3.8: Simula¸cão (6). Fixando a concentra¸cão de nisina em um valor, N = 6, pertencente à região (III) do diagrama de bifurca¸cão, foram feitas simula¸cões numéricas das trajetórias dinâmicas: (a) H(t) (histidina quinase); (b) Hc(t) (histidina quinase complexada); (c) R(t) (regulador de

resposta); e (d) Rf(t) (regulador de resposta fosforilado). As condi¸c˜oes iniciais utilizadas foram

(H(0), Hc(0), R(0), Rf(0)) = (14; 100; 500; 100).

3.6 Conclus˜oes

No cap´ıtulo anterior, analisamos a a¸cão antimicrobiana de bacteriocinas sobre a bactéria Listeria monocytogenes. Pesquisas demonstraram que, além de agir como pept´ıdeo antimicrobiano, a bacteriocina nisina também age como sinal que induz sua própria bioss´ıntese.

SEÇ ÃO 3.6 • CONCLUS ÕES 80

O objetivo da modelagem apresentada aqui é analisar essa segunda fun¸cão da nisina. Com esse propósito, foi desenvolvido neste cap´ıtulo um modelo matemático de “quorum sensing” em Lactococcus lactis, baseado no conhecimento bioqu´ımico do sistema regulatório da bioss´ıntese da nisina.

Para avaliar o efeito do aumento da concentra¸cão de nisina, na resposta do sistema regu- latório, constru´ımos o diagrama de bifurca¸cão considerando N como parâmetro de controle. Conforme vimos, o sistema dinâmico apresenta um, ou três pontos de equil´ıbrio, dependendo da concentra¸cão extracelular de nisina. No diagrama de bifurca¸cão, verificamos o comportamento t´ıpico de histerese, pois pode-se saltar de um ramo assintoticamente estável para outro, conforme se varia o valor do parâmetro de controle. Através de simula¸cões numéricas, foi poss´ıvel comprovar a estabilidade dos pontos de equil´ıbrio, pois analisando o comportamento das trajetórias dinâmicas do sistema, observou-se o comportamento assintótico esperado.

A concentra¸cão do regulador de resposta fosforilado é determinante na a¸cão do sistema regulatório, pois é essa prote´ına que irá ativar a transcri¸cão dos genes responsáveis pela produ¸cão das prote´ınas histidina quinase (H) e reguladora de resposta (R). Sendo assim, a s´ıntese dessas prote´ınas será maior, quando houver a s´ıntese induzida por Rf. Essa s´ıntese induzida será máxima para concentra¸cão suficientemente alta do regulador de resposta fosforilado. A a¸cão eficiente do sistema regulatório, corresponde ao equil´ıbrio com n´ıveis maiores de Rf, ou seja, Q3, enquanto que, para as concentra¸cões do ponto de equil´ıbrio Q1, o sistema encontra-se desativado.

Verificamos que à medida que a nisina acumula-se no meio, aumenta-se a concentra¸cão do regulador de resposta fosforilado (Rf), devido a s´ıntese basal de histidina quinase (H) e reguladora de resposta (R), e devido ao processo de fosforila¸cão. Quando a concentra¸cão de nisina atinge um valor limiar, representado por N2, há um aumento brusco do n´ıvel de Rf. Entretanto, se a concentra¸cão de nisina diminui, há uma queda brusca no n´ıvel de Rf quando atinge-se N1.

Mostramos, assim, o efeito da nisina na resposta do sistema de regula¸cão da expressão de genes, pois a transi¸cão entre estado desativado, representado pelo equil´ıbrio com n´ıveis inferiores de Rf (Q1), ou ativado, representado pelo equil´ıbrio Q3 com n´ıveis maiores de regulador de resposta fosforilado, depende da concentra¸cão extracelular de nisina.

Regula¸c˜ao da bioss´ıntese de nisina

4.1 O mecanismo de “quorum sensing” na produ¸c˜ao

de nisina

Desde 1995, a produ¸cão de várias bacteriocinas da classe II tem mostrado ser induz´ıvel. Nesses sistemas induz´ıveis, pequenos pept´ıdeos secretados, com ou sem atividade antimicrobiana, funcionam como auto-indutores. Os auto-indutores estão envolvidos na indu¸cão de seus próprios genes estruturais e outros genes necessários para produ¸cão e imunidade para bacteriocinas da classe II [27]. A regula¸cão da produ¸cão de bacteriocinas da classe II, mediada por auto-indutores, tem sido investigada em algumas bactérias lácticas, incluindo Carnobacterium psicola, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus sakei.

Em cepas produtoras de bacteriocinas pertencentes à classe I (lantibióticos como a nisina), a própria bacteriocina age como ferormônio (auto-indutor). Cepas produtoras de bacteriocinas da classe II, tais como sakacina A e sakacina P, produzem, separadamente, um pept´ıdeo ferormônio não modificado, cujo gene é geralmente co-transcrito com os genes que codificam a histidina quinase e o regulador de resposta [40]. Em ambos os casos, o regulador de resposta ativado aumenta a transcri¸cão de todos operons envolvidos na produ¸cão da bacteriocina.

SEÇ ÃO 4.1 • O MECANISMO DE “QUORUM SENSING” NA PRODUÇ ÃO DE

NISINA 82

A transcri¸cão dos genes para bioss´ıntese de nisina depende da concentra¸cão extracelular desse pept´ıdeo que, por sua vez, é dependente da densidade da popula¸cão da cultura produtora. Além de agir como antimicrobiano, a nisina age como pept´ıdeo ferormônio que induz sua própria bioss´ıntese, desencadeando o processo de transcri¸cão, o que corresponde a um mecanismo de “quorum sensing”.

Duas ocorrências naturalmente variantes da nisina são a nisina A e a nisina Z que diferem estruturalmente em apenas um res´ıduo de aminoácido, porém com atividade semelhante. A nisina A (figura 4.1) apresenta na posi¸cão 27 um res´ıduo de histidina e a nisina Z uma asparagina [37].

Figura 4.1: Representa¸cão esquemática da molécula de nisina A [46].

A figura (4.2) apresenta modelo da bioss´ıntese, e regula¸cão da s´ıntese de nisina. A bioss´ıntese da nisina é determinada por um conjunto de 11 genes: nisA, -B, -T, -C, -I, -P, -R, -K, -F, -E e -G. Inicialmente, a nisina é sintetizada ribossomicamente como um precursor (codificado pelo gene nisA), contendo 57 aminoácidos. A modifica¸cão e transporte do precursor são feitos por um complexo ancorado na membrana composto pelos fatores B, C e T (codificados pelos genes nisBCT). Finalmente, a pré-nisina modificada é processada por uma protease codificada por nisP, gerando a molécula de nisina madura com 34 aminoácidos. Uma das fun¸cões da nisina é atuar como pept´ıdeo antimicrobiano, sendo que a própria célula produtora é protegida pelos fatores I e FEG (codificado pelos genes nisI e nis- FEG). Uma segunda fun¸cão da nisina é como pept´ıdeo ferormônio, que é percebido pelo dom´ınio de entrada do sensor quinase (NisK). Posteriormente, ocorre fosfotransferência do dom´ınio transmissor do sensor quinase (NisK) para o dom´ınio receptor do regulador de

Figura 4.2: Modelo para bioss´ıntese, regula¸cão e imunidade da nisina. Bioss´ıntese: após sintetizada, a pré-nisina é modificada no interior da célula bacteriana pela enzimas desidratase (NisB), e ciclase (NisC). É então translocada através da membrana pelo transportador (NisT). A protease (NisP) remove o pept´ıdeo l´ıder da nisina, tornando-a ativa. Regula¸cão: nisina liga-se ao sensor quinase (NisK). Autofosforila¸cão da histidina quinase proporciona fosforila¸cão (P) do regulador (NisR). Fosforilado, o regulador ativa os promotores induz´ıveis dos operons nisABTCIPRK e nisFEG. Imunidade: A prote´ına de imunidade (NisI) liga-se a nisina. NisI existe ancorado na membrana, e na forma livre de lip´ıdeo secretado (LF-I). O complexo transportador NisFEG ex- porta a nisina associada à célula para o ambiente externo. Triângulos em preto indicam promotores induz´ıveis pela nisina, e triângulo em branco representa promotor não induz´ıvel. Adaptado de [8].

resposta (NisR). Fosforilado, NisR ativa os promotores induz´ıveis pela nisina dos operons nisA/ZBTCIPRK e nisFEG, iniciando a ativa¸cão da transcri¸cão e aumentando a produ¸cão de nisina [26].

A curva de crescimento microbiano divide-se em quatro etapas: adapta¸cão (fase lag), logar´ıtmica (fase log), estacionária e de decl´ınio. Na fase logar´ıtmica as células estão plena-

SEÇ ÃO 4.1 • O MECANISMO DE “QUORUM SENSING” NA PRODUÇ ÃO DE

NISINA 84

mente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Na fase estacionária os nutrientes tornam-se escassos e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento l´ıquido da popula¸cão. A produ¸cão detectável de nisina é iniciada no meio da fase logar´ıtmica de crescimento, e atinge um n´ıvel máximo no ´ınicio da fase estacionária.

Figura 4.3: Conjunto de genes para bioss´ıntese de nisina. P* representa promotor induz´ıvel pela nisina. Adaptado de [48].

O gene estrutural nisA é transcrito a uma taxa elevada como mRNA monocistrônico, além de ser produzido como parte de mRNA policistrônico nisABTCIP, e que está pre- sente em um n´ıvel mais baixo. Tanto nisA quanto nisABTCIP são derivados de um único promotor (PnisA). Para os demais mRNA’s, nisRK e nisFEG, a transcri¸cão depende dos promotores PnisR e PnisF, respectivamente. O n´ıvel de atividade dos promotores PnisA e PnisF (indicados por P* na figura 4.3), demonstrou ser diretamente dependente da concentra¸cão extracelular da nisina, indicando assim uma rela¸cão entre a concentra¸cão do indutor (nisina), e o n´ıvel de unidades transcritas.

No cap´ıtulo anterior foi desenvolvido um modelo matemático com o objetivo de avaliar, especificamente, como o sistema regulatório se comporta quando aumenta a concentra¸cão extracelular de nisina no meio. Com esse propósito foram considerados apenas os componentes pertencentes ao sistema regulatório.

Neste cap´ıtulo iremos expandir aquele modelo, considerando também os componentes relacionados à s´ıntese de nisina e introduzindo as equa¸cões que descrevem as varia¸cões nas concentra¸cões totais dessas prote´ınas.

No documento Dinamica populacional de microrganismos e a conservação de alimentos (páginas 83-97)