Sistemas de cultivo in vitro

Os folículos podem ser cultivados “in situ”, ou seja, inseridos no córtex ovariano ou na forma isolada. Em adição, o cultivo pode ser realizado em dois passos, podendo ser iniciado com o cultivo de folículos primordiais in situ até o estágio de folículo secundário, seguido de uma etapa de cultivo in vitro destes folículos na forma isolada (O’BRIEN et al., 2003; TELFER et al., 2008). Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (FORTUNE, 2003). Contudo, em animais domésticos de médio e grande porte, não é possível utilizar este modelo devido às grandes dimensões dos ovários. Uma alternativa para superar este obstáculo é o cultivo de pequenos fragmentos do córtex ovariano, o qual tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos em diferentes espécies, como caprinos (SILVA et al., 2004b), bovinos (BRAW-TAL; YOSSEFI, 1997), babuínos (WANDJI et al., 1997) e humanos (ZHANG et al., 2004). Além da

praticidade, o cultivo in situ apresenta como vantagem a manutenção do contato celular (ABIR et al., 2006) e da integridade tridimensional dos folículos. No entanto, neste tipo de modelo, embora haja uma expressiva ativação folicular, poucos folículos primários cultivados progridem até o estádio de folículo secundário (FORTUNE, 2003).

O cultivo de folículos isolados apresenta como vantagens a possibilidade do acompanhamento individual dos folículos durante o cultivo, além de favorecer melhor perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). Este sistema pode ser realizado de forma bidimensional (camundongo: EPPIG; SCHROEDER 1989; CORTVRINDT et al., 1996), na qual o folículo é cultivado diretamente sobre o suporte de plástico ou sobre uma matriz, ou ainda de forma tridimensional, na qual o folículo é incluso em uma matriz.

O sistema de cultivo tridimensional evita a aderência das células foliculares ao suporte plástico e, consequentemente, a perda da integridade morfológica do folículo (NAYUDU; OSBORN, 1992). A manutenção da arquitetura folicular é de extrema importância para o desenvolvimento folicular e maturação oocitária, uma vez que o crescimento do oócito e sua competência meiótica citoplasmática são dependentes das junções gap entre oócito e células da granulosa, que controlam a passagem de fatores parácrinos. Além disso, a interrupção da comunicação entre as células durante o cultivo in vitro provoca a ovulação prematura e a degeneração do oócito liberado (EPPIG et al., 2005). Estudos têm demonstrado que o cultivo tridimensional modula a sobrevivência e crescimento celular, a secreção de substâncias e a resposta a estímulos (WEAVER et al., 1996). Hwa e colaboradores (2007) verificaram que o perfil de expressão gênica de células cultivadas em cultivo tridimensional mais se assemelha ao observado in vivo em comparação ao encontrado após cultivo bidimensional.

Outra vantagem atribuída ao cultivo tridimensional é o fato dos fatores liberados pelas células da granulosa permanecerem próximos ao oócito, exercendo um efeito positivo sobre o seu desenvolvimento e possibilitando a formação de novas junções gap. Em sistemas bidimensional, o volume de meio utilizado e a aderência das células da granulosa ao substrato, que promove alterações na arquitetura dos folículos, pode resultar em uma exposição menos uniforme dos fatores secretados, dificultando sua difusão até o oócito (LOCHTER; BISSEL 1995).

Diante das limitações que envolvem o cultivo 2D e tendo em vista a importância da manutenção do arranjo espacial das células, diferentes métodos de cultivo tridimensionais vêm sendo desenvolvidos a fim de mimetizar o microambiente encontrado in vivo pelas células dos mamíferos. Estes métodos podem ser baseados na utilização de hidrogéis.

Hidrogéis são polímeros capazes de absorver grande quantidade de água. Estruturalmente, são constituídos por uma ou mais redes poliméricas, formadas por cadeias macromoleculares interligadas por ligações covalentes ou interações físicas, como interações iônicas, hidrofóbicas ou pontes de hidrogênio (OVIEDO et al., 2008). Devido à sua estrutura reticulada, os hidrogéis são capazes de transportar oxigênio, nutrientes e resíduos (NGUYEN; WEST, 2002). De acordo com sua natureza, os hidrogéis podem ser naturais ou sintéticos. Dentre os hidrogéis naturais, o Alginato é o mais comumente utilizado para o cultivo tridimensional de folículos ovarianos (XU et al., 2006a; WEST et al., 2007). Já com relação aos polímeros sintéticos, podemos citar o Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS; SAWHNEY et al., 1993; SHIKANOV et al., 2011).

2.5.1.1 Alginato

O Alginato é um polissacarídeo presente na parede celular de algas marinhas pardas da classe Phaeophyta e na parede celular de algumas bactérias, em que desempenha funções primariamente estruturais. Trata-se especificamente de um poli-uronídeo, formado por dois monômeros de base, β-D-manuronila e α-L-guluronila, conectados entre si por ligações glicosídicas entre seus carbonos de número 1 e 4. (ROWLEY et al., 1999). A gelificação, em particular, ocorre quando sais presentes no cálcio, ou quando o polímero é acidificado (transformado em ácido algínico). Diversos estudos têm utilizado com sucesso o Alginato no cultivo de folículos de murinos, macacos e humanos (PANGAS et al., 2003; KREEGER et al., 2006; XU et al., 2006a, 2009a, 2009b). Além disso, oócitos recuperados de folículos encapsulados em Alginato foram capazes de retomar a meiose, serem fertilizados e produzirem crias saudáveis (XU et al., 2006a).

Alguns autores têm sugerido que concentrações baixas de Alginato (0,25% e 0,5%) foram mais eficientes em promover a manutenção da sobrevivência, a formação de antro, o crescimento folicular, a secreção de esteróides e a retomada da meiose em oócitos oriundos de folículos secundários cultivados in vitro (camundongas: XU et al., 2006b; WEST et al., 2007, 2009; macacas: XU et al., 2009b). Em caprino Brito et al., (2014), relata que o cultivo em 0,25 de Alginato garante a manutenção da comunicação intercelular, o que favorece o transporte de andrógenos a partir de células da teca interna para mural de células da granulosa e otimiza o processo de esteroidogênese. Contudo, estudos têm sugerido que concentrações mais altas e, consequentemente, géis mais rígidos são mais eficazes para o desenvolvimento de folículos primordiais e primários, uma vez que propiciam uma rigidez

semelhante ao do córtex ovariano in vivo (macacas: HORNICK et al., 2012; camundongas: TAGLER et al., 2014).

2.5.1.2 Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS)

Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) é um sistema de hidrogel sintético, cuja estrutura também pode ser modificada para imitar várias condições in vivo. Nesse sentido, o hidrogel de PEG-VS é um dos melhores hidrogéis sintéticos testados para o cultivo de folículos ovarianos (SHIKANOV et al., 2011). A maior vantagem do uso do PEG-VS é a natureza bioquímica da sua molécula que permite o encapsulamento do folículo e é lentamente degradada por proteases secretadas pelas células foliculares durante o cultivo in vitro. A degradação do gel permite a expansão do folículo, mas continua exercendo uma força compressiva sobre o mesmo, mantendo sua integridade. Este sistema de cultivo foi capaz de suportar um aumento de 17 vezes do tecido durante o cultivo em um modelo murino, tornando-se uma opção viável para o cultivo em uma espécie maior, como seres humanos.

Estudos têm demonstrado que o hidrogel de PEG é capaz de manter a viabilidade de células encapsuladas (BRYANT; ANSETH 2002), bem como possibilita a sobrevivência e crescimento de folículos secundários até o estágio antral inicial. Em adição, os oócitos oriundos desses folículos antrais foram capazes de retomar a meiose e alcançar a metáfase II (SHIKANOV et al., 2011). As desvantagens deste sistema de cultura incluem a falta de pistas ambientais, como a rigidez da matriz ou a presença de moléculas sinalizadoras biológicas. Outra desvantagem deste sistema é a quantidade de tensão de cisalhamento no folículo, que é prejudicial ao seu crescimento e desenvolvimento.

Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D

(continua)

A

LG

IN

A

T

O

Desenvolvimento folicular normal com oócitos capazes de retomar a meiose. Xu et al.,

2006 Rata 150-180 8

Desenvolvimento folicular normal com nascidos vivos.

Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D

(conclusão)

A

LG

IN

A

T

O

Maior crescimento folicular, formação de antro e produção de estrogênio.

Xu et al., 2009

Macaca

Rhesus 100-300 30

Aumento da sobrevida e diâmetro do folículo.

Brito et al.,

2014 Cabra 173-255 18

Maior taxa de crescimento e retomada meiótica.

Silva et al.,

2015 Cabra 150–250 18

Oócitos em MII com a obtenção de embriões.

PEG

Shikanov et

al., 2011 Rata 140-150 10

69% de formação de antro com condições intermediárias de degradação da matriz. Ahn et al.,

2015

Camund

ongo 100-125 9

Maturação oocitária com formação de pro-nucleos e blastocistos.

Fonte: Elaborado pelo autor.