UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE

INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

FORTALEZA - CEARÁ 2019

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE

INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.

Coorientadora: Dra. Laritza Ferreira de Lima.

FORTALEZA - CEARÁ 2019

CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE

INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Aprovado em: 15 de fevereiro de 2019.

Dedico,

A minha Avó, Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam).

À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram. A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, pelo auxílio financeiro dessa pesquisa.

Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo “Papito” por ter me recebido e orientado de forma competente e dedicada, sempre me fornecendo apoio acadêmico e incentivo profissional.

A Dra. Ariella Shikanov por ter me recebido na Universidade de Michigan e me orientado, sempre me fornecendo apoio acadêmico. Dr. Anu David, agradeço pela atenção e ensinamentos durante o período de Doutorado sanduíche nos Estados Unidos.

A Dra. Laritza minha “mãe profissional”, a quem não tenho palavras para agradecer toda ajuda, sempre de forma carinhosa durante o período de Doutorado no Brasil. Aos meus amigos e melhor equipe de trabalho Anna Clara, Naíza, Victor, Jesus e “Chefe João” por me receber em suas vidas de forma tão generosa. Agradeço pela amizade e por toda ajuda durante o tempo que estiveram no laboratório. Agradeço imensamente pelo ombro amigo, pelas histórias compartilhadas, pelos risos divididos comigo.

A minha família, agradeço pelo apoio, carinho e compreensão durante esses anos em que estive ausente. Obrigado em especial a minha avó Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam) que foi e sempre será um exemplo de vida, alegria, dedicação e força. A minha mãe Rosemeire Magalhães Vieira e ao meu Pai Carlos Henrique Correia que foram meus exemplos de vida, caráter e dedicação.

Ao amor da minha vida, Mônica Freitas Miranda Correia, que foi e é a base mais sólida de sustentação que eu poderia ter e que me deu todo apoio e ombro amigo para que eu continuasse forte nesses quatro anos de doutorado.

A Deus por estar presente me guiando, dando força, discernimento e protegendo durante todos os momentos desta caminhada.

Finalmente, agradeço a todos que aqui não foram citados, mas ajudaram direta ou indiretamente para que essa tese fosse feita.

Os objetivos da presente tese foram: 1) Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia, crescimento folicular, viabilidade, maturação oocitária, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados e cultivados por 18 dias (Fase I); 2) Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional na ausência (folículos primordiais isolados inclusos em Alginato - 0,8%) ou na presença de tecido ovariano (Fase II); 3) Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 7 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos babuínos (Fase III) inclusos em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou polyethyleneglycol-vinyl sulfone (PEG-VS) - 5%); 4) Investigar o efeito de diferentes concentrações de Cilostamida (10 e 20 µM) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante a MIV de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV). Na Fase I, os ovários caprinos foram transportados individualmente em MEM-HEPES a 4 ou 33 °C. Posteriormente, os folículos foram cultivados in vitro por 18 dias e os complexos cumulus-oócito (CCO) maturados por 32 horas. Na Fase II, os folículos primordiais caprinos inclusos em Alginato (10 folículos/gota), ou envoltos em tecido ovariano (in situ) encapsulado ou não em Alginato, foram cultivados por 7 dias. Na Fase III, os folículos babuínos previamente criopreservados foram cultivados por 10 dias incluso em tecido ovariano (in situ), na presença ou ausência de matrizes extracelulares (PEG-VS vs Alginato) e de FSH. Por fim, na Fase IV, CCOs caprinos e bovinos foram cultivados por 30 horas, iniciando com a adição da Cilostamida (10 ou 20 µM) e/ou parede folicular por 6 ou 12 horas durante a pré-maturação in vitro (PMIV) antes da MIV (24 ou 18h). O melhor resultado para produção de oócitos totalmente crescidos e retomada meiótica foi obtido utilizando baixa (4 °C) para folículos pré-antrais e alta (33 °C) para folículos pré-antrais iniciais (Fase I). Folículos primordiais caprinos isolados e encapsulados em Alginato apresentaram maiores percentuais de ativação folicular quando comparado aos demais tratamentos (Fase II). Na Fase III, a adição de FSH ao meio de cultivo no tratamento com matrizes (PEG-VS e Alginato) promoveu uma melhora na sobrevivência dos folículos pré-antrais babuínos inclusos em tecido ovariano após 10 dias cultivo in vitro. Na Fase IV, a combinação da concentração/tempo de exposição à Cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas na espécie bovina após 6 e 12 horas de cultivo. Como conclusão, a temperatura de transporte afetou diferencialmente o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais caprinos (Fase I); cultivo de folículos primordiais caprinos isolados e inclusos em Alginato permitiu uma

III). Por fim, na Fase IV, a Cilostamida retardou de forma concentração dependente a retomada da meiose somente na espécie bovina.

Palavras-chave: Temperatura de transporte. Matriz extracelular. Pré-maturação in vitro. Ruminantes. Babuíno.

The objectives of this thesis were: 1) To determine the effect of transport temperature (4 vs 33ºC) on morphology, follicular growth, viability and oocyte maturation, and production of reactive oxygen species (ROS) of preantral and early antral follicles goats for 18 days in vitro culture (Phase I); 2) to evaluate follicular survival and activation rates after 7 days of in vitro culture in a three-dimensional system in the absence (isolated primordial follicles and included in Alginate - 0.8%) or in the presence of ovarian tissue (Phase II); 3) To investigate the survival, activation and follicular growth after 7 days of in vitro culture of ovarian fragments of baboons (Phase III) included in different matrices (Alginate - 1% or poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG) - 5%); 4) Investigate the effect of different concentrations of Cilostamida (10 and 20 μM) and exposure times (6 and 12 hours) during IVF of bovine and goat oocytes (Phase IV). In Phase I, goat ovaries were individually transported in MEM-HEPES at 4 or 33 ° C. Subsequently, the follicles were cultured in vitro for 18 days and cumulus-oocyte (CCO) complexes matured for 32 hours. In Phase II, the primordial goat follicles included in Alginate (10 follicles / drop), or wrapped in ovarian tissue (in situ) encapsulated or not in Alginate, were cultured for 7 days. In Phase III, pre-cryopreserved baboon follicles were cultured for 10 days in ovarian tissue (in situ), in the presence or absence of extracellular matrices (PEG-VS vs. Alginate) and FSH. Finally, in the Phase IV, the goat and cattle COCs were cultured for 30 hours, starting with in vitro pre-maturation (IVPM) for 6 or 12 hours before IVM (24 or 18h). The best result for the production of fully-grown oocytes and meiotic resumption was obtained using low (4 ° C) for preantral follicles and high (33 ° C) for initial antral follicles (Phase I). Phase II results showed that caprine primordial follicles isolated and encapsulated in Alginate presented satisfactory rates of survival and higher percentages of follicular activation when compared to the other treatments. In the Phase III, treatments containing medium supplemented with FSH associated and extracellular matrices (Alginate and PEG-VS) promoted an improvement in the survival of baboon preantral follicles included in the ovarian tissue after 10 days in vitro culture. In the Phase IV, the combination of concentration/exposure time to cilostamide during IVPM delayed the meiotic progression only in the bovine species after 6 and 12 hours of culture. In conclusion, the transport temperature differentially affected the in vitro development of preantral follicles and initial antral follicles (Phase I); the in vitro culture of isolated goat primordial follicles enclosed in Alginate allowed a better rate of follicular activation (Phase II); In baboons, the use of extracellular matrices in the presence of FSH

bovine species only.

Keywords: Transport temperature. Extracellular matrix. In vitro pre-maturation. Ruminant. Baboon.

Figura 1 - Constituição do folículo ovariano. Classificação e desenvolvimento

folicular... 23 CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts

differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles

Figure.1. Schematic representation of the experimental design……… 69 Figure.2. Relationship of oocyte diameter and chromatin configuration

(GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of preantral (A,B) and antral follicles (C,D) from ovaries previously transported at 4ºC and

33ºC and (E) antral follicles developed in vivo……… 70 Figure.3. Linear regression analysis of zona pellucida thickness with

chromatin configuration (GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of oocytes from preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C)

developed in vivo……… 71

Figure.4. Relationship of zona pellucida thickness and oocyte diameter of preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C) developed in vivo. Each point observed in the graph is an oocyte

subjected to in vitro maturation………... 72 CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of

Alginate and ovarian tissue

Figure 1. Experimental design to assess the effect alginate encapsulation on the development of isolated primordial follicle or enclosed in

ovarian tissue after 0, 1 or 7 days of IVC……… 90 Figure 2. Representative images of follicles before (Day 0; A-C) and after

IVC for 1 (D-F) or 7 days (G-I) from Fragment, Fragment +

Alginate and Follicle + Alginate groups, respectively……… 90 Figure 3. Percentage of morphologically normal follicles before and after in

vitro culture for 1 or 7 days……….. 91 Figure 4. Primordial and primary follicles before and after in vitro culture

the in vitro growth and differentiation of baboon preantral follicles

Figure 1. Representative images of follicles after in vitro culture for 7 (A-E) 14 (B-F) 21 (C-G) 28 (D-H) days from Fragment (A-D), Fragment

+ PEG (E-H) groups, respectively. (Experiment I)... 105 Figure 2. (A-B) Representative images of these follicles enclosed in ovarian

tissue fresh (Fresh control) or after vitrified (Vitrified control). (C) Percentage of follicles in fresh ovarian tissue and after

vitrification (*P < 0.05)………. 106 Figure 3. Percentage of follicles in different stage of development in fresh

ovarian tissue (Fresh control) and after vitrification (Vitrified

control) (*P < 0.05)……… 107

Figure 4. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified ovarian tissue before (non-cultured control-Day 0) and after 7 days of culture of fragment without (fragment treatment) or

encapsulated in PEG (Fragment + PEG treatment) (*P < 0.05)…... 107 Figure 5. Representative images of follicles after in vitro culture for 3 (A-D)

and 10 (E-H) days from PEG + FSH (A and E), PEG (B and F), ALG + FSH (C and G) ALG (D and H) groups, respectively.

(Experiment II)... 108 Figure 6. Number of morphologically normal follicles in vitrified ovarian

before (non-cultured control-Day 0) and after 10 days of culture

from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups……… 109 Figure 7. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified

ovarian tissue before (non-cultured control- Day 0) and after 10

days of culture from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups.. 109 CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure

time-dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes

staining with Hoechst 33342 staining under fluorescence shows oocytes with a germinal vesicle (GV), with germinal vesicle breakdown (GVBD), at metaphase I (MI), at metaphase II (MII)

and a degenerating oocyte (DEG)……… 128

Fig. 2. Photographs of the viability and chromatin configuration of oocytes after in vitro maturation (IVM). Characterization of a viable oocyte after staining with Ethidium homodimer-1,

Calcein-AM and Hoechst 33342………. 128

Fig. 3. The percentage of germinal vesicle (GV) stage bovine (A) and caprine (B) oocytes after IVPM with different exposure times (6 and 12 hours), different concentrations of cilostamide (10 and 20 µM), follicular wall, and the combination of follicular wall and

cilostamide (FW + cilostamide)……… 129

Fig. 4. The percentage of metaphase II (MII) bovine (A) and caprine (B) oocytes after (IVPM + IVM - totaling 30 hours of culture) with different exposure times, different concentrations of cilostamide, follicular wall, and the combination of follicular wall and

Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e

Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D... 36 Tabela 2 - Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase... 44 CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently

the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles

Table 1. Percentage of morphologically normal follicles and antrum formation (AF) after in vitro culture of preantral and antral

follicles previously transported at 4 and 33 ºC……… 73 Table 2. Follicular growth rate (µm) (mean ± SEM) after in vitro culture of

preantral and antral follicle previously transported at 4 and 33 ºC.. 74 Table 3. Oocyte diameter (mean ± SEM), ZP thickness and oocyte

chromatin configuration after in vitro culture of preantral and

antral follicles previously transported at 4 and 33 ºC………. 75 Table 4. Oocyte diameter (µm) (mean ± SD) according to chromatin status

after 32 h of in vitro maturation……… 76 Table 5. Zona Pellucida thickness (µm) (mean ± SD) according to

chromatin status after 32 h of in vitro maturation……….. 77 Table 6. Levels of reactive oxygen species (relative fluorescence units)

(mean ± SEM) after in vitro culture of preantral and antral follicle

previously transported at 4 and 33 ºC……….. 78 CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of

Alginate and ovarian tissue

Table 1: Follicular, oocyte diameters (µm) and volume (mean ± SEM) filled

by granulosa cells in preantral follicles subjected to IVC………….. 92 CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure

time-dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes

Table 1. In vitro pre-maturation (IVPM) treatments of bovine and caprine oocyte in medium containing different concentrations of cilostamide (10 or 20 µM) and follicular wall alone or in

factors associated with germinal vesicle rates in caprine and bovine

oocytes………... 133

Table 4. Logistic regression coefficients and odds ratio (and 95% CI) for factors associated with metaphase II rates in caprine and bovine

BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) Calceína-AM Calceína acetoximetil

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2 Dióxido de Carbono

COCs Cumulus–oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito) DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)

Dr. Doutor

Dra. Doutora

EGF Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) FSH Hormônio Folículo Estimulante

G Gauge

GH Growth hormone (Hormônio do crescimento) GV Germinal vesicle (Vesícula germinal)

h Horas

HC Histologia clássica

IGF-I Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à insulina - I)

ITS Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio) IVC In vitro culture (cultivo in vitro)

IVM In vitro maturation (Maturação in vitro)

kg Quilograma

LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais LH Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)

M Molar

MEM Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)

MEM+ Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo suplementado)

MI Metaphase I (Metáfase I) MII Metaphase II (Metáfase II)

min Minutos

ng Nanograma

O2 Oxigênio

p < 0.05 Probabilidade de erro menor do que 5%

p. Página

PDEs Fosfodiesterases PEG-VS

PPGCV

Polietilenoglicol

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RVG Rompimento de vesícula germinal

SAS Statistical analysis system (Sistema de análise estatística)

SD Standard deviation (Desvio padrão)

SEM Standard error of means (Erro padrão da média) TCM-199 Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)

U Unidade

UECE Universidade Estadual do Ceará

VGBD Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal) α-MEM Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)

μg Microgramas

μL Microlitro

% Porcentagem ~ Aproximadamente < Menor = Igual > Maior ± Mais ou Menos ≥ Maior ou igual °C Graus Celsius µM Micromolar

1 INTRODUÇÃO... 20

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 22

2.1 O OVÁRIO MAMÍFERO... 22

2.2 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE... 22

2.3 REGULAÇÃO DAS DIFERENTES FASES DA FOLICULOGÊNESE ... 24

2.3.1 Formação dos folículos primordiais... 24

2.3.2 Transição de folículos primordiais para primários... 25

2.3.3 Progressão de folículos primários para secundários... 27

2.3.4 Progressão de folículos secundários para antrais... 29

2.4 POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR... 32

2.5 MOIFOPA - CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS... 33

2.5.1 Sistemas de cultivo in vitro... 33

2.5.1.1 Alginato... 35

2.5.1.2 Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS)……….... 36

2.5.2 Fatores que afetam o cultivo in vitro de folículos pré-antrais... 37

2.5.3 Estado atual da biotécnica de MOIFOPA... 38

2.6 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA... 39

2.6.1 Maturação Citoplasmática... 39

2.6.2 Maturação Nuclear... 41

2.6.3 Maturação Molecular... 41

2.7 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV)... 42

2.7.1 Co-cultivo de oócitos... 42

2.7.2 Co-cultivo com células somáticas... 43

2.7.3 Bloqueio temporário da maturação... 43

2.8 FOSFODIESTÉRASES (PDEs)... 44

2.8.1 Fosfodiesterase tipo 3... 45

2.8.2 Fosfodiesterase tipo 4... 46

2.9 FERRAMENTAS E PARÂMETROS PARA AVALIAR A EFICIÊNCIA DO CULTIVO IN VITRO... 46

3 JUSTIFICATIVA... 49

3.3 ORIGINALIDADE DO TRABALHO... 50

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA... 51

5 OBJETIVOS... 52

5.1 GERAL... 52

5.2 ESPECÍFICOS... 52

6 CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles……….. 54

7 CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of Alginate and ovarian tissue……….. 82

8 CAPÍTULO 3 - 3D Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone culture system supports the in vitro growth and differentiation of baboon preantral follicles……….. 95

9 CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure time-dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes……… 114

10 CONCLUSÃO... 139

11 PERSPECTIVAS... 140

1 INTRODUÇÃO

O Brasil tem se destacado mundialmente na produção de bovinos com o segundo maior rebanho comercial no mundo, com aproximadamente 209,5 milhões de cabeças (IBGE, 2010). Em caprinos, essa produção é menos expressiva, com cerca de 9.450.312 de cabeças, sendo 8.788.790 destas (93%) localizadas na região Nordeste do país (IBGE, 2009). Embora esses números sejam notoriamente expressivos, tanto bovinocultura, mas principalmente a caprinocultura ainda exibe baixos índices de produtividade, o que se mostra diretamente relacionado, dentre outros fatores (por exemplo, manejo sanitário e nutricional deficientes), à elevada rusticidade dos métodos de reprodução comumente adotados. Nesse contexto, faz-se necessária a utilização de biotécnicas reprodutivas sofisticadas a fim de aumentar a eficiência reprodutiva da espécie caprina, e ainda promover a melhoria e preservação da genética desses animais. No entanto, as biotécnicas utilizadas atualmente não otimizam o potencial reprodutivo das fêmeas, sendo necessário o desenvolvimento de biotécnicas alternativas, como a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), também conhecida como Ovário Artificial.

A MOIFOPA tem por objetivo recuperar folículos pré-antrais antes que se tornem atrésicos e promover o seu crescimento, bem como sua completa maturação, através da utilização de sistemas de cultivo in vitro (FIGUEIREDO et al., 2007). Os folículos pré-antrais constituem a maior parte da população folicular ovariana. No entanto, poucos folículos conseguem desenvolver até o estágio de folículo pré-ovulatório, pois a grande maioria morre por atresia após iniciar o crescimento in vivo (EPPIG; O’BRIEN, 1996), reduzindo assim o potencial reprodutivo das fêmeas. Assim, a MOIFOPA, no futuro, será capaz de contribuir, decisivamente, no sentido de oferecer condições propícias para a conservação e multiplicação de animais de alto valor genético e/ou em vias de extinção (FIGUEIREDO et al., 2011), bem como elucidar os mecanismos poucos conhecidos da foliculogênese ovariana. Além disso, a utilização desta biotécnica em modelos animais, como os babuínos, pode auxiliar no incremento da reprodução assistida em humanos, devido à alta similaridade entre as espécies. No entanto, até o presente momento, o resultado mais eficiente obtido pela MOIFOPA foi o nascimento de crias viáveis a partir de folículos primordiais crescidos in vitro, fato este que foi alcançado apenas em camundongos (O’BRIEN et al., 2003). Essa ineficiência da biotécnica pode ser devida a diversos fatores, como a temperatura de transporte dos ovários, o sistema e composição do meio de cultivo, limitando desde a ativação dos folículos

primordiais até seu completo desenvolvimento, comprometendo a produção in vitro de oócitos fertilizáveis e embriões.

Com relação à ativação folicular, diversos pesquisadores têm sugerido que folículos primordiais necessitam de um ambiente rígido, semelhante ao do córtex ovariano para iniciar seu desenvolvimento in vitro (WOODRUFF; SHEA, 2011). Nesse sentindo, diferentes sistemas de cultivo vêm sendo testados (HORNICK et al., 2012; LARONDA et al., 2014), na tentativa de mimetizar o ambiente ovariano, como por exemplo o cultivo de folículos isolados inclusos em uma matriz extracelular como por exemplo o Alginato e o Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) (SHIKANOV et al., 2011). No entanto, até o momento, não há na literatura estudos que avaliem os efeitos do sistema de cultivo empregando matrizes extracelulares sobre o desenvolvimento in vitro de folículos primordiais de caprinos e babuínos.

Outro fator limitante da MOIFOPA seria a aquisição de oócitos competentes ou maturados ao final do cultivo de folículos pré-antrais mais avançados (secundários) visando um aumento na produção de embriões. Sabe-se que maturação in vitro de oócitos de mamíferos é um processo complexo que envolve a sincronização entre a maturação citoplasmática e maturação nuclear (WATSON, 2007; MAO et al., 2014). Contudo, utilizando o cultivo in vitro de folículos secundários ainda não foi possível desenvolver um sistema que garanta o crescimento completo do oócito e uma perfeita e sicronização da maturação. Dessa forma, faz-se necessário desenvolver um sistema que permita aquisição da sincronização entre a maturação citoplasmática e nuclear in vitro.

Para uma melhor compreensão deste trabalho, a revisão de literatura a seguir abordará aspectos relacionados à foliculogênese, população e atresia folicular, cultivo in vitro de folículos pré-antrais e seu estado atual, a importância dos sistemas de cultivo in vitro, competência oocitária, co-cultivo durante a maturação in vitro e inibidores da maturação nuclear.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O OVÁRIO MAMÍFERO

Em todas as espécies mamíferas, o ovário é composto de duas regiões distintas, uma cortical e outra medular, e é circundado externamente por uma superfície epitelial, comumente conhecida como epitélio germinativo. A região medular é localizada na porção mais interna do ovário, com exceção dos equídeos, e contém nervos, vasos sanguíneos e linfáticos responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário. Já o córtex ovariano é composto de tecido conjuntivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares), folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento, bem como corpos lúteos, albicans e hemorrágicos. O ovário desempenha duas funções prioritárias para o sistema reprodutivo das fêmeas, sendo responsável pela diferenciação e liberação de um oócito maturo para a fecundação (MCGEE; HSUEH, 2000), bem como pela síntese e secreção de hormônios (HIRSHFIELD, 1991). Tais eventos caracterizam, respectivamente, as funções gametogênica e endócrina do ovário.

2.2 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE

A oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. Este processo inicia-se antes e termina após o processo de foliculogênese (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). O início do desenvolvimento ovariano em mamíferos é caracterizado pela migração das CGPs a partir do saco vitelínico para a gônada primitiva, com sua posterior colonização (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). As CGP migram para a crista genital e colonizam a gônada ainda indiferenciada, onde recebem a denominação de oogônias e começam a multiplicar-se por divisões mitóticas, formando ninhos de oogônias interligados por pontes intercelulares (PEPLING, 2006). Posteriormente, as oogônias entram na primeira divisão meiótica e param no estádio de diplóteno, sendo chamadas de oócitos primários, os quais apresentam-se com seus núcleos em vesícula germinativa (VG) (FIGUEIREDO et al., 2011). Em seguida, os oócitos perdem suas pontes intercelulares e são circundados por uma camada de células somáticas planas, também conhecidas como células da pré-granulosa, originárias do mesonefron e/ou epitélio ovariano (MCNATTY et al., 2000). A partir desse momento, são formados os folículos primordiais, dando início ao processo de foliculogênese. O folículo, por sua vez, é considerado a unidade morfofuncional do ovário, cuja função é proporcionar um

ambiente adequado para a sobrevivência, o crescimento e a maturação do oócito, mantendo sua viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001).

A foliculogênese é um processo complexo que envolve a formação, o crescimento e a maturação folicular sob a ação de hormônios e fatores de crescimento. O processo de foliculogênese tem seu início com a formação dos folículos primordiais, culminando com a geração dos folículos pré-ovulatórios ou de De Graaf (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; FIGUEIREDO et al., 2011). Durante o seu desenvolvimento, a estrutura folicular sofre alterações devido ao crescimento oocitário, diferenciação e multiplicação das células da granulosa e teca (HONDA et al., 2007), sendo os folículos classificados em pré-antrais (primordial, primário e secundário) e antrais (terciários e pré-ovulatórios) (FIGUEIREDO et al., 2011).

Na maioria das espécies, os folículos pré-ovulatórios são caracterizados por apresentarem um oócito maturo no momento da ovulação. A maturação oocitária consiste em uma etapa crucial pela qual o oócito sofre modificações citoplasmáticas, completa sua primeira divisão meiótica (maturação nuclear), progredindo até a metáfase II (MEHLLMANN, 2005). Este processo é composto por inúmeras modificações estruturais e moleculares no citoplasma (maturação citoplasmática). Didaticamente, essa maturação citoplasmática pode ser subdivida em: redistribuição das organelas, dinâmica dos filamentos do citoesqueleto e maturação molecular.

Figura 1 - Constituição do folículo ovariano. Classificação e desenvolvimento folicular.

2.3 REGULAÇÃO DAS DIFERENTES FASES DA FOLICULOGÊNESE

2.3.1 Formação dos folículos primordiais

Evidências sugerem o envolvimento de importantes moléculas e fatores de transcrição na formação dos folículos primordiais. Dentre estes, pode-se destacar o fator de linhagem germinal α (FIGα), detectado em oócitos ainda na fase embrionária e considerado um dos primeiros fatores identificados com atuação efetiva nesse processo. Experimentos com camundongos knockout para o gene do FIGα têm revelado que este fator é crucial para a formação de folículos primordiais, uma vez que a inibição de FIGα funcional resultou na ausência de folículos primordiais ao nascimento e consequente esterilidade (SOYAL; AMLEH; DEAN, 2000). Outro fator que vem demonstrando importante papel durante o processo de formação folicular é o LHX8 (CHOI et al., 2008). Esse fator está envolvido no padrão de formação e sobrevivência do folículo primordial, sendo preferencialmente expresso no oócito de ovários de camundongas. Estudos recentes demonstraram que camundongas com ausência de expressão de LHX8 falharam em manter os folículos primordiais e que estes desapareceram na primeira semana de vida (CHOI et al., 2008).

Após a formação dos folículos primordiais, os oócitos sofrem uma parada da meiose no estádio de diplóteno ou VG (prófase I) e as células da pré-granulosa interrompem sua multiplicação, atingindo uma fase de quiescência. A progressão da divisão meiótica ocorre somente na puberdade, com o pico pré-ovulatório dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), formação dos oócitos secundários e outra parada da meiose na fase de metáfase II (FIGUEIREDO et al., 2011). A meiose será retomada novamente somente após a fecundação do oócito pelo espermatozóide, originando, ao final, o oócito haplóide fecundado (FIGUEIREDO et al., 2011).

Estudos in vitro sugerem que hormônios como a progesterona e o estrógeno inibem a formação folicular (KEZELE; SKINNER, 2003) e que mudanças nos níveis desses hormônios nos ovários em desenvolvimento contribuem para regular o momento do processo de formação dos folículos primordiais (CHEN et al., 2007; NILSSON; SKINNER, 2009). Aliado a isto, Nilsson et al., (2011) reportaram o envolvimento do hormônio anti-Mulleriano (AMH) na inibição da formação folicular, destacando o seu papel na redução do tamanho da reserva inicial de folículos primordiais em ovários de ratas.

Em mamíferos, os folículos primordiais representam cerca de 95% da grande totalidade de folículos presentes no ovário. Até alguns anos atrás, acreditava-se que os

folículos primordiais formados durante a vida intrauterina ou logo após o nascimento (roedores) constituíam o pool de células germinativas disponíveis durante toda a vida reprodutiva de uma fêmea (EPIFANO; DEAN, 2002). Contudo, estudos mais aprofundados acerca desse tema demonstraram mecanismos envolvidos na síntese de novos oócitos e folículos no ovário de mulheres (BUKOVSKY et al., 2004) e camundongas (JOHNSON et al., 2004, 2005) durante a vida adulta, por meio de células germinativas intra e extraovarianas, questionando a idéia do estoque finito de folículos ao nascimento. Atualmente, a possibilidade da nova formação folicular (ou neofoliculogênese) tem se tornado algo bem estabelecido mundialmente, uma vez que estudos recentes associando técnicas in vitro e in vivo têm comprovado, em ovários de camundongas (ZOU et al., 2009) e mulheres (WHITE et al., 2012), o surgimento de novos oócitos e folículos a partir de células-tronco germinativas ovarianas, resultando até mesmo na obtenção de nascimentos em camundongas após a fecundação desses oócitos (ZOU et al., 2009).

2.3.2 Transição de folículos primordiais para primários

Os folículos primordiais podem permanecer meses a anos em estado quiescente até serem recrutados para iniciar o crescimento (OKTEM; URMAN, 2010; NILSSON et al., 2011). O início do crescimento dos folículos primordiais, também conhecido como ativação, caracteriza-se pelo início do crescimento oocitário, multiplicação das células da granulosa e transformação da morfologia dessas células da forma pavimentosa para a cúbica (AERTS; BOLS, 2010a). Quando o oócito é circundado por uma camada completa de células da granulosa de morfologia cúbica, os folículos atingem um estágio mais avançado de desenvolvimento e são classificados como primários (GOUGEON; BUSSO, 2000). Nesse tipo de folículo, as células da granulosa aumentam em número e tornam-se mais volumosas, passando a manter um estreito contato com o oócito mediado por endocitose (VAN DEN HURK; BEVERS; BECKER, 1997). Na espécie caprina, os folículos primários possuem diâmetro de aproximadamente 50 µm e são inicialmente observados por volta do 71° dia de vida fetal (BEZERRA et al., 1998).

Sabe-se que o desenvolvimento folicular inicial, incluindo a transição de folículo primordial para folículo primário, é independente de gonadotrofinas e que é regulado, principalmente, por fatores intraovarianos (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Diversos estudos comprovaram que (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998; FORTUNE, 2003; AERTS; BOLS, 2010a), a ativação de folículos primordiais é controlada por um delicado balanço entre

fatores inibitórios e estimulatórios presentes no próprio ovário. Nesse sentido, tem sido sugerido que a prevalência de fatores inibitórios no ambiente ovariano influencia a permanência dos folículos primordiais em seu pool de reserva, bloqueando a progressão folicular, e contribuindo para a preservação da vida reprodutiva das fêmeas (FORTUNE et al., 1998; BROEKMANS et al., 2007). Pesquisas nesse tema, utilizando camundongos geneticamente modificados, têm de fato relatado a atuação de algumas moléculas inibidoras da ativação folicular, incluindo a Tsc-1, PTEN, Foxo3a, p27 e Foxl2. De acordo com tais pesquisas, a perda da função dessas moléculas inibitórias resultou na ativação prematura do pool de folículos primordiais (CASTRILLON et al., 2003; RAJAREDDY et al., 2007; REDDY et al., 2008), causando uma inevitável exaustão da reserva folicular e falha ovariana prematura.

Outra importante substância intraovariana de ação inibitória é o AMH. Esse hormônio é um dos membros da superfamília do fator de crescimento transformante β (TGF-β) e é sintetizado pelas células da granulosa de folículos em crescimento (WEENEN et al., 2004). Em camundongos nocaute para o gene do AMH, verificou-se um aumento no recrutamento de folículos primordiais, associado a um maior número de folículos em crescimento no ovário (DURLINGER et al., 1999, 2002). Tais achados foram posteriormente reforçados por estudos utilizando folículos de vacas (GIGLI et al., 2005) e mulheres (CARLSSON et al., 2006), os quais também constataram o papel inibitório do AMH sobre o crescimento dos folículos primordiais. Contudo, apesar da maioria dos trabalhos convergirem para tal efeito do AMH, existem relatos na literatura que defendem a atuação positiva desse hormônio no início do desenvolvimento de folículos primordiais em humanos (SCHMIDT et al., 2005).

Além dos sinais inibitórios que bloqueiam a ativação prematura dos folículos primordiais, há também outros sinais no ovário, os estimulatórios, que promovem a transição desses folículos para o estágio primário. Tais sinais correspondem, principalmente, a fatores de crescimento originados de diferentes compartimentos foliculares, incluindo oócitos, células somáticas (granulosa e teca) e estroma, que atuam de maneira coordenada e sinérgica para promover o início do crescimento dos folículos (OKTEM; URMAN, 2010). Dentre os fatores de crescimento conhecidamente efetivos na ativação de folículos primordiais, destaca-se o kit ligand (KL). O KL é sintetizado pelas células da granulosa e atua em seu receptor (c-kit) expresso no oócito e células intersticiais/tecais (PARROTT; SKINNER, 1999; NILSSON; SKINNER, 2001), regulando o início do crescimento folicular. Aliado a isto, o KL exerce um efeito antiapoptótico sobre as CGP, oogônias, oócitos e folículos pré-antrais, e ainda controla

o crescimento dos oócitos e o recrutamento de células da teca (DRIANCOURT et al., 2000; HUTT; MCLAUGHLIN; HOLLAND, 2006). O fator inibidor de leucemia (LIF) e o fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2 ou FGF básico), sintetizados pelas células da granulosa e pelo oócito, respectivamente, também possuem papel comprovado na ativação dos folículos primordiais, sendo capazes ainda de estimular a expressão do KL nas células da granulosa e, deste modo, otimizar o crescimento de folículos até o estágio primário (NILSSON; KEZELE; SKINNER, 2002).

2.3.3 Progressão de folículos primários para secundários

Com o crescimento dos folículos primários, inicia-se a formação dos chamados folículos secundários (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Estes folículos são caracterizados pela presença de duas ou mais camadas de células da granulosa cúbicas localizadas em torno do oócito, bem como pela formação de uma camada de células tecais envolvendo a membrana basal folicular (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). À medida que o folículo cresce, a camada de células tecais se estratifica e se diferencia em duas partes distintas. A parte mais periférica, denominada teca externa, composta de células não diferenciadas, ao passo que as células localizadas mais internamente, formando a teca interna, contêm algumas células precursoras de fibroblastos capazes de se diferenciar e secretar esteróides (GOUGEON, 2010). As células da teca interna correspondem à porção vascularizada do folículo e são definidas quando há a formação de quatro ou mais camadas de células da granulosa (LUCCI et al., 2001).

Outra importante característica que marca a passagem de folículos primários para o estágio de folículos secundários corresponde à nítida identificação da zona pelúcida ao redor do oócito (LUCCI et al., 2001; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Além disso, nos folículos secundários as células da granulosa apresentam uma extensiva rede de junções do tipo gap ou junções intercomunicantes, que correspondem a canais membranários que permitem a passagem de nutrientes, íons inorgânicos, segundos mensageiros e pequenos metabólitos entre as células (KIDDER; MHAWI, 2002; GOUGEON, 2010), fundamentais para manter a funcionalidade do folículo. Nesse estágio, os oócitos entram em extensiva fase de crescimento, resultando em uma complexa organização citoplasmática dependente da síntese de novos produtos gênicos e organelas, bem como da modificação e redistribuição das organelas já existentes (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Além do expressivo aumento no número de ribossomos, mitocôndrias e outras organelas, os oócitos em crescimento

acumulam grânulos glicogênicos, proteínas e lipídios e sofrem ainda um incremento na síntese de RNA e proteínas, considerados importantes para garantir a futura competência meiótica (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005).

O desenvolvimento de folículos secundários com multicamadas a partir de folículos primários é um processo lento que pode demandar meses. Vários estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que o número de folículos secundários, seu tamanho, número de células e taxa de atresia são influenciados por gonadotrofinas, das quais o FSH é o fator de sobrevivência predominante, atuando ainda no estímulo à formação de junções gap entre as células da granulosa (VAN DEN HURK; BEVERS; BECKERS, 1997; VAN DEN HURK et al., 2000). Embora os folículos primários e secundários sejam responsivos às gonadotrofinas, estes podem se desenvolver com níveis mínimos de FSH circulante ou na ausência de receptores funcionais para esse hormônio, o que torna duvidoso o significativo papel in vivo do FSH nessa fase (VAN DEN HURK et al., 2000; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; OKTEM; URMAN, 2010). Por outro lado, diversos fatores intraovarianos, neurotrofinas e neurotransmissores vêm demonstrando relevante atuação na formação de folículos secundários em diferentes espécies.

Entre as neurotrofinas e neurotransmissores, o NGF e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP), respectivamente, têm se mostrado bons candidatos para estimular a transição de folículos primários para secundários. Na presença de níveis séricos normais de FSH, ovários de camundongas deficientes em NGF exibiram números acentuadamente reduzidos de folículos primários e secundários, havendo ainda uma marcada diminuição na proliferação de células da granulosa após o cultivo dos tecidos ovarianos dessas camundongas (DISSEN et al., 2001). O VIP também tem sido apontado como um importante regulador do desenvolvimento de folículos primários e secundários iniciais em bovinos (HULSHOF et al., 1994), além de ter sido implicado na função esteroidogênica das células da granulosa em estágios foliculares iniciais e mais avançados em roedores (MCGEE; HSUEH, 2000). Além destas substâncias, Yang e Fortune (2006, 2007) relataram ainda a influência da testosterona e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) na transição de folículos primários para secundários, o que foi constatado após cultivos in vitro utilizando folículos pré-antrais bovinos.

Dentre os fatores de crescimento envolvidos na formação dos folículos secundários, pode-se dar enfoque ao GDF-9 e à BMP-15. Tais substâncias são consideradas essenciais para a progressão até folículos secundários, uma vez que animais geneticamente deficientes para esses fatores mostraram um bloqueio do desenvolvimento folicular além do

estágio de folículo primário (DONG et al., 1996; MCNATTY et al., 2007). Além disso, diversos estudos recentes em folículos pré-antrais caprinos evidenciaram a importância da atuação do GDF-9 (MARTINS et al., 2008) e da BMP-15 (CELESTINO et al., 2011) na progressão de folículos primários até o estágio secundário in vitro, destacando ainda os seus efeitos positivos sobre a manutenção da viabilidade folicular nesta fase. Além desses fatores, o KL também tem sido associado a uma série de eventos relativos à formação dos folículos secundários, incluindo a proliferação das células da granulosa, regulação da esteroidogênese e recrutamento de células da teca (PARROTT; SKINNER, 1997, 2000; REYNAUD et al., 2000). Por meio do estímulo de alguns fatores, como a BMP-15 e o LIF, o KL sofre aumento da sua expressão nas células da granulosa (OTSUKA; SHIMASAKI, 2002; NILSSON; KEZELE; SKINNER, 2002), o que pode culminar na influência positiva do KL sobre a formação dos folículos secundários (DRIANCOURT et al., 2000).

Vários outros fatores de crescimento intraovarianos, como o TGF-β, fator de crescimento epidermal (EGF), ativina e FGF-2, têm sido implicados na formação, desenvolvimento e também sobrevivência de folículos secundários em roedores e espécies domésticas, o que tem sido constatado por meio de estudos in vitro que identificaram a influência positiva destas substâncias sobre a proliferação das células da granulosa e/ou inibição da apoptose celular (ZHOU; ZHANG, 2005; OKTEM; OKTAY, 2007). Em contraste, outros estudos apontam o papel negativo do AMH não somente na formação e ativação folicular, mas também no desenvolvimento de folículos primários até o estágio secundário e demais estágios foliculares (OKTEM; URMAN, 2010).

2.3.4 Progressão de folículos secundários para antrais

Após o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido folicular denominada antro. A partir deste estágio, os folículos passam a ser denominados antrais ou cavitários. O crescimento dos folículos durante a fase antral é caracterizado pela proliferação e diferenciação das células da granulosa e da teca, aumento da vascularização folicular, crescimento do oócito e aumento do espaço contendo o fluido antral. Tal fluido corresponde ao ambiente ao qual o oócito é submetido durante o seu desenvolvimento e maturação e é composto de substâncias reguladoras derivadas do sangue ou de secreções das células foliculares (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Entre essas substâncias, estão presentes

gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, enzimas, proteoglicanas e lipoproteínas, consideradas fundamentais para a determinação da qualidade oocitária (WU et al., 2007).

Os sinais e mecanismos que regulam a formação da cavidade antral durante o desenvolvimento dos folículos secundários ainda não são plenamente compreendidos. Contudo, sabe-se que além da participação de aquaporinas presentes nas células da granulosa, bem como de ácido hialurônico e versicano produzidos por essas células, há ainda o envolvimento de hormônios e fatores de crescimento na formação antral (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). De fato, estudos in vitro utilizando FSH (MAO et al., 2002; SARAIVA et al., 2011), LH (CORTVRINDT; HU, SMITZ, 1998), hormônio do crescimento (GH - MAGALHÃES et al., 2011), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1 - MAGALHÃES-PADILHA et al., 2012), ativina (ZHAO et al., 2001), KL (REYNAUD et al., 2000) e EGF (GUTIERREZ et al., 2000) têm comprovado os efeitos destas substâncias na formação de antro em folículos secundários em crescimento. Aliado a isto, outros fatores locais, como o TGF-β (LIU et al., 1999), FGF-2 (ROBERTS; ELLIS, 1999), GDF-9 (HAYASHI et al., 1999) e BMP-15 (OTSUKA et al., 2000) têm sido considerados estimuladores da proliferação das células da granulosa nesta fase, evento fundamental para a ocorrência da progressão folicular. Em ratas, bovinos e primatas, o neutransmissor VIP foi apontado ainda como um importante regulador do desenvolvimento de folículos secundários (VAN DEN HURK et al., 2000; MCGEE; HSUEH, 2000).

Os folículos antrais são primeiramente observados em ovários caprinos no 110° dia de crescimento fetal (BEZERRA et al., 1998). É importante destacar que pequenos folículos antrais podem ter diâmetros similares aos dos folículos secundários (~200 μm), embora aumentem rapidamente em tamanho com o contínuo acúmulo de fluido folicular (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). Em roedores, com o desenvolvimento do antro é possível identificar o crescimento e a aquisição da competência meiótica do oócito (EPPIG; SCHROEDER, 1989). Já em humanos e bovinos, o desenvolvimento da competência meiótica não é estritamente relacionado à formação do antro, mas há uma correlação direta entre a capacidade do oócito superar o bloqueio da meiose e o tamanho folicular nestas espécies (TROUNSON; ANDERIESZ; JONES, 2001). Em caprinos, a competência meiótica completa é adquirida em folículos de 3 mm, os quais correspondem a um oócito de aproximadamente 110 μm de diâmetro (HYTTEL et al., 2002).

O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de crescimento, recrutamento, seleção e dominância (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005), sendo a formação de folículos pré-ovulatórios um pré-requisito para a ovulação e formação do corpo

lúteo, bem como para manutenção da fertilidade (DRUMMOND, 2006). A fase antral terminal é dependente das gonadotrofinas, FSH e LH, que induzem o recrutamento e o crescimento sincronizado de folículos antrais em ondas foliculares (FORTUNE et al., 2001). Além das gonadotrofinas, peptídeos sintetizados localmente desempenham papel-chave na regulação da fase antral, tanto por meio de mecanismos parácrinos como endócrinos (WEBB et al., 2003). Dentre esses peptídeos, merecem destaque o sistema IGF, os IGFs são sinérgicos ao FSH na promoção do crescimento folicular e produção de estradiol (FORTUNE; RIVERA; YANG, 2004). Ademais, a interação entre os FGFs e o FSH contribui positivamente para a manutenção do crescimento folicular nessa fase, uma vez que o FSH estimula a expressão dos receptores para os FGFs (FGFR-2b e FGFR-3c) em células da granulosa, sensibilizando as células de folículos recém-recrutados à ação mitogênica dos FGFs (BURATINI et al., 2005a,b).

O aumento (pico) das concentrações plasmáticas de FSH constitui o estímulo necessário para o recrutamento e emergência da onda folicular (ADAMS et al., 1992). Em espécies monovulatórias, apenas um folículo é selecionado dentre os recrutados para continuar a crescer e diferenciar-se em folículo ovulatório, enquanto os demais têm como destino a atresia. O folículo selecionado é conhecido como folículo dominante e suprime ativamente o crescimento dos subordinados pela secreção de estradiol e inibina (GINTHER et al., 1996). Segundo Baker e Spears (1999), o aparecimento de folículos subordinados e dominantes é resultante de uma complexa interação entre ações endócrinas indiretas, resultantes da secreção de estradiol e inibina pelos grandes folículos selecionados, e regulações intraovarianas diretas, que envolvem a participação de fatores de crescimento locais e iniciam ou exarcebam a diferença entre folículos.

Na fase final do desenvolvimento folicular, ocorre uma diminuição dos níveis circulantes de FSH em resposta ao alto nível de estradiol e inibina produzidos pelo folículo. Nesse momento, o LH passa a otimizar a foliculogênese, acelerando o desenvolvimento folicular e determinando uma redução nas exigências de FSH pelos folículos (FILICORI et al., 2001). Observa-se então a formação do folículo pré-ovulatório, caracterizado por um oócito circundado por células da granulosa especializadas, denominadas células do cumulus. Em resposta ao LH, as células da granulosa dos folículos pré-ovulatórios param de se multiplicar e iniciam o programa final de diferenciação. Com o pico pré-ovulatório de LH a partir da puberdade, o oócito retoma a meiose e progride da prófase I para a metáfase II, proporcionando a ovulação de um oócito maturo (AERTS; BOLS, 2010b).

2.4 POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR

A população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma grande variação individual (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006), sendo de aproximadamente 1.500 em camundongo fêmea (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000) e 2.000.000 na mulher (BAKER, 1963). Durante a vida reprodutiva das fêmeas, ocorre uma redução ordenada no número de folículos pré-antrais (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000). Essa redução é devido a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega à ovulação (NUTTINCK et al., 1993), pois a maioria (99,9%) torna-se atrésica durante as fases de crescimento e maturação oocitária (OTALA et al., 2002).

O processo de atresia usualmente ocorre de forma diferenciada entre folículos pré-antrais e pré-antrais. Em folículos pré-pré-antrais, os primeiros sinais de morte folicular surgem no oócito, onde se pode observar a retração da cromatina nuclear e a fragmentação oocitária (SILVA et al., 2002). Após a formação do folículo antral ocorre uma alteração na sensibilidade do oócito e das células da granulosa. A partir deste estágio, o oócito torna-se altamente resistente e as primeiras alterações indicativas de atresia são observadas nas células da granulosa (JORIO et al., 1991).

A atresia, apesar de causar a perda de vários folículos ovarianos, é um evento crucial para manutenção da homeostase ovariana em mamíferos (para revisão veja CELESTINO et al., 2009), assegurando a ciclicidade dos animais e prevenindo o desenvolvimento de múltiplos embriões durante a gestação (AMSTERDAM et al., 2003). É um fenômeno natural, comum a todas as espécies domésticas, e acomete folículos em qualquer fase do desenvolvimento, sendo mais comum nos estágios antrais mais avançados (GLAMOCLIJA et al., 2005) e pode ocorrer por via apoptótica ou degenerativa (MARKSTRÖM et al., 2002).

A apoptose, também conhecida como morte celular programada, é um processo determinado geneticamente, ou seja, depende da expressão de genes pró- e anti-apoptóticos e tem como característica marcante a fragmentação do DNA a cada 180-200 pares de base e a formação de corpos apoptóticos (HUSSEIN, 2005). De acordo com o estímulo inicial, a apoptose pode ocorrer através de receptores de superfície celular (receptores de morte), constituindo a via extrínseca, ou ainda através da mitocôndria com liberação de conteúdos citoplasmáticos para o espaço extracelular, a necrose geralmente resulta em resposta inflamatória intensa (CARINI et al., 1995).

Diante disso, visando evitar a enorme perda folicular pela atresia, nas últimas décadas, têm sido desenvolvidos vários modelos de cultivo in vitro que possibilitam o estudo dos fatores que controlam a atresia e estimulam o crescimento folicular.

2.5 MOIFOPA - CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS

A MOIFOPA é uma biotécnica da reprodução que vem sendo aprimorada nos últimos tempos e consiste numa das principais ferramentas utilizadas atualmente para a elucidação da foliculogênese inicial. Tal biotécnica tem como principal objetivo resgatar oócitos oriundos de folículos pré-antrais, a partir do ambiente ovariano, e posteriormente cultivá-los in vitro até a maturação, prevenindo-os da atresia e possibilitando sua utilização em outras biotécnicas como FIV, transgênese e clonagem. Para alcançar esse objetivo é necessário o desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro ideal para cada etapa do desenvolvimento folicular (FIGUEIREDO et al., 2011).

O cultivo in vitro de folículos pré-antrais é uma técnica que vem sendo largamente empregada com o intuito de avaliar o efeito de diferentes substâncias e concentrações sobre o desenvolvimento folicular, com o objetivo de mimetizar o ambiente ovariano proporcionando aos folículos as condições ideais para que se desenvolvam in vitro (FIGUEIREDO et al., 2011).

2.5.1 Sistemas de cultivo in vitro

Os folículos podem ser cultivados “in situ”, ou seja, inseridos no córtex ovariano ou na forma isolada. Em adição, o cultivo pode ser realizado em dois passos, podendo ser iniciado com o cultivo de folículos primordiais in situ até o estágio de folículo secundário, seguido de uma etapa de cultivo in vitro destes folículos na forma isolada (O’BRIEN et al., 2003; TELFER et al., 2008). Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (FORTUNE, 2003). Contudo, em animais domésticos de médio e grande porte, não é possível utilizar este modelo devido às grandes dimensões dos ovários. Uma alternativa para superar este obstáculo é o cultivo de pequenos fragmentos do córtex ovariano, o qual tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos em diferentes espécies, como caprinos (SILVA et al., 2004b), bovinos (BRAW-TAL; YOSSEFI, 1997), babuínos (WANDJI et al., 1997) e humanos (ZHANG et al., 2004). Além da

praticidade, o cultivo in situ apresenta como vantagem a manutenção do contato celular (ABIR et al., 2006) e da integridade tridimensional dos folículos. No entanto, neste tipo de modelo, embora haja uma expressiva ativação folicular, poucos folículos primários cultivados progridem até o estádio de folículo secundário (FORTUNE, 2003).

O cultivo de folículos isolados apresenta como vantagens a possibilidade do acompanhamento individual dos folículos durante o cultivo, além de favorecer melhor perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). Este sistema pode ser realizado de forma bidimensional (camundongo: EPPIG; SCHROEDER 1989; CORTVRINDT et al., 1996), na qual o folículo é cultivado diretamente sobre o suporte de plástico ou sobre uma matriz, ou ainda de forma tridimensional, na qual o folículo é incluso em uma matriz.

O sistema de cultivo tridimensional evita a aderência das células foliculares ao suporte plástico e, consequentemente, a perda da integridade morfológica do folículo (NAYUDU; OSBORN, 1992). A manutenção da arquitetura folicular é de extrema importância para o desenvolvimento folicular e maturação oocitária, uma vez que o crescimento do oócito e sua competência meiótica citoplasmática são dependentes das junções gap entre oócito e células da granulosa, que controlam a passagem de fatores parácrinos. Além disso, a interrupção da comunicação entre as células durante o cultivo in vitro provoca a ovulação prematura e a degeneração do oócito liberado (EPPIG et al., 2005). Estudos têm demonstrado que o cultivo tridimensional modula a sobrevivência e crescimento celular, a secreção de substâncias e a resposta a estímulos (WEAVER et al., 1996). Hwa e colaboradores (2007) verificaram que o perfil de expressão gênica de células cultivadas em cultivo tridimensional mais se assemelha ao observado in vivo em comparação ao encontrado após cultivo bidimensional.

Outra vantagem atribuída ao cultivo tridimensional é o fato dos fatores liberados pelas células da granulosa permanecerem próximos ao oócito, exercendo um efeito positivo sobre o seu desenvolvimento e possibilitando a formação de novas junções gap. Em sistemas bidimensional, o volume de meio utilizado e a aderência das células da granulosa ao substrato, que promove alterações na arquitetura dos folículos, pode resultar em uma exposição menos uniforme dos fatores secretados, dificultando sua difusão até o oócito (LOCHTER; BISSEL 1995).

Diante das limitações que envolvem o cultivo 2D e tendo em vista a importância da manutenção do arranjo espacial das células, diferentes métodos de cultivo tridimensionais vêm sendo desenvolvidos a fim de mimetizar o microambiente encontrado in vivo pelas células dos mamíferos. Estes métodos podem ser baseados na utilização de hidrogéis.

Hidrogéis são polímeros capazes de absorver grande quantidade de água. Estruturalmente, são constituídos por uma ou mais redes poliméricas, formadas por cadeias macromoleculares interligadas por ligações covalentes ou interações físicas, como interações iônicas, hidrofóbicas ou pontes de hidrogênio (OVIEDO et al., 2008). Devido à sua estrutura reticulada, os hidrogéis são capazes de transportar oxigênio, nutrientes e resíduos (NGUYEN; WEST, 2002). De acordo com sua natureza, os hidrogéis podem ser naturais ou sintéticos. Dentre os hidrogéis naturais, o Alginato é o mais comumente utilizado para o cultivo tridimensional de folículos ovarianos (XU et al., 2006a; WEST et al., 2007). Já com relação aos polímeros sintéticos, podemos citar o Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS; SAWHNEY et al., 1993; SHIKANOV et al., 2011).

2.5.1.1 Alginato

O Alginato é um polissacarídeo presente na parede celular de algas marinhas pardas da classe Phaeophyta e na parede celular de algumas bactérias, em que desempenha funções primariamente estruturais. Trata-se especificamente de um poli-uronídeo, formado por dois monômeros de base, β-D-manuronila e α-L-guluronila, conectados entre si por ligações glicosídicas entre seus carbonos de número 1 e 4. (ROWLEY et al., 1999). A gelificação, em particular, ocorre quando sais presentes no cálcio, ou quando o polímero é acidificado (transformado em ácido algínico). Diversos estudos têm utilizado com sucesso o Alginato no cultivo de folículos de murinos, macacos e humanos (PANGAS et al., 2003; KREEGER et al., 2006; XU et al., 2006a, 2009a, 2009b). Além disso, oócitos recuperados de folículos encapsulados em Alginato foram capazes de retomar a meiose, serem fertilizados e produzirem crias saudáveis (XU et al., 2006a).

Alguns autores têm sugerido que concentrações baixas de Alginato (0,25% e 0,5%) foram mais eficientes em promover a manutenção da sobrevivência, a formação de antro, o crescimento folicular, a secreção de esteróides e a retomada da meiose em oócitos oriundos de folículos secundários cultivados in vitro (camundongas: XU et al., 2006b; WEST et al., 2007, 2009; macacas: XU et al., 2009b). Em caprino Brito et al., (2014), relata que o cultivo em 0,25 de Alginato garante a manutenção da comunicação intercelular, o que favorece o transporte de andrógenos a partir de células da teca interna para mural de células da granulosa e otimiza o processo de esteroidogênese. Contudo, estudos têm sugerido que concentrações mais altas e, consequentemente, géis mais rígidos são mais eficazes para o desenvolvimento de folículos primordiais e primários, uma vez que propiciam uma rigidez

semelhante ao do córtex ovariano in vivo (macacas: HORNICK et al., 2012; camundongas: TAGLER et al., 2014).

2.5.1.2 Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS)

Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) é um sistema de hidrogel sintético, cuja estrutura também pode ser modificada para imitar várias condições in vivo. Nesse sentido, o hidrogel de PEG-VS é um dos melhores hidrogéis sintéticos testados para o cultivo de folículos ovarianos (SHIKANOV et al., 2011). A maior vantagem do uso do PEG-VS é a natureza bioquímica da sua molécula que permite o encapsulamento do folículo e é lentamente degradada por proteases secretadas pelas células foliculares durante o cultivo in vitro. A degradação do gel permite a expansão do folículo, mas continua exercendo uma força compressiva sobre o mesmo, mantendo sua integridade. Este sistema de cultivo foi capaz de suportar um aumento de 17 vezes do tecido durante o cultivo em um modelo murino, tornando-se uma opção viável para o cultivo em uma espécie maior, como seres humanos.

Estudos têm demonstrado que o hidrogel de PEG é capaz de manter a viabilidade de células encapsuladas (BRYANT; ANSETH 2002), bem como possibilita a sobrevivência e crescimento de folículos secundários até o estágio antral inicial. Em adição, os oócitos oriundos desses folículos antrais foram capazes de retomar a meiose e alcançar a metáfase II (SHIKANOV et al., 2011). As desvantagens deste sistema de cultura incluem a falta de pistas ambientais, como a rigidez da matriz ou a presença de moléculas sinalizadoras biológicas. Outra desvantagem deste sistema é a quantidade de tensão de cisalhamento no folículo, que é prejudicial ao seu crescimento e desenvolvimento.

Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D

(continua)

A

LG

IN

A

T

O

Desenvolvimento folicular normal com oócitos capazes de retomar a meiose. Xu et al.,

2006 Rata 150-180 8

Desenvolvimento folicular normal com nascidos vivos.