Técnicas moleculares

Para cada espécie ou morfótipo de Smicridea foram selecionados três espécimes, quando disponível, perfazendo um total de 205 espécimes selecionados para extração de DNA. Os espécimes utilizados são provenientes de coletas a partir do ano de 2009 e que estavam preservados em álcool absoluto PA, conservadas em freezer -20ºC. Para alguns espécimes, no estágio larval ou adulto, o DNA foi extraído através do método destrutivo em que as pernas do lado esquerdo com musculatura torácica associada foram maceradas com auxílio de pistilos plásticos, utilizando o kit de extração DNeasy® blood & tissue e seguindo protocolo recomendado pelo fabricante.

Entretanto, para a maioria dos espécimes foi utilizado o tórax e abdômen para larvas e, quando se tratava de adultos, o abdômen contendo a genitália. Nestes casos, foi utilizado o protocolo do kit de extração ampliando de 3 para 48 horas o período de temperatura de incubação para lise tecidual, aumentando sua eficiência e evitando a maceração do material biológico, também, a incubação da coluna com o tampão de eluição (AE) em banho-maria a 70º C por 8 minutos, a fim de facilitar a passagem do DNA pela membrana da coluna. Desta forma, por se tratar de uma técnica não destrutiva, o material utilizado na extração juntamente com o restante do espécime foi preservado em álcool absoluto em frascos individuais com um número de acesso único para estudo morfológico e material testemunho. O DNA extraído foi armazenado em freezer a -20°C para posterior utilização nas Reações em Cadeia da Polimerase.

3.3.2. Amplificação

A amplificação do fragmento do gene COI foi feita via reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores (primers): HCO2198 [5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′]; LCO1490 [5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′] (Folmer et al. 1994).

As reações de PCR foram realizadas com volume total de 25 µl, consistindo de 2,5 μl de tampão Colorless GoTaq® 5X PROMEGA© (100 mM), 3,5 μl de MgCl2 PROMEGA© (25 mM), 2,5 μl de dNTP Promega© (2,5 mM de cada base), 1,2 μl de cada iniciador, direto e reverso, Síntese Biotecnologia (20 µM), 0,3 μl de GoTaq® DNA polimerase PROMEGA (5 U/μl), 3 μl do DNA extraído e 11,3 μl de ddH2O. Amostras que a amplificação não foi

satisfatória a PCR foram feitas com 4 μl de DNA. As reações foram realizadas em termocicladores automáticos Swift Maxi Thermal Cycler (ESCO) e TC-512 (Techine) no Laboratório de Bioprospecção de Bioativos de Insetos do INPA, utilizando as condições detalhadas na Tabela 3.

Para confirmar a amplificação do fragmento do gene COI foram utilizados 2 μl produto de cada PCR, misturados com 3 μl de GelRedTM Uniscience+tampão de carregamento (1:2) e submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1%. Cada eletroforese foi realizada em cuba contendo gel de agarose submergido em tampão TBE 0,5X, por cerca de 40 minutos com uma carga de 70 V. Os produtos amplificados foram visualizados através de fotodocumentador com luz ultravioleta (UV). Para estimar o tamanho do fragmento amplificado foi utilizado o marcador molecular ΦX174 DNA/BsuRI (Fermentas).

3.3.3. Purificação e sequenciamento

Os produtos de PCR com bandas positivas e tamanho adequados (Figura 6) foram selecionados para purificação para e remover excesso de nucleotídeos e primers. A purificação foi realizada utilizando as enzimas EXO I [Exonuclease I] (Thermo Scientific™) e FastAP [Fosfatase Alcalina Termosensível] (Thermo Scientific™) ou pelo Kit de Purificação Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Em ambos os métodos foram seguidas as recomendações dos fabricantes. A concentração dos produtos purificados foi estimada por comparação com marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen). Neste caso a eletroforese foi feita em gel de agarose a 2% durante 1:30 hora com carga de 60 V.

Tabela 3. Condições utilizadas na reação em cadeia da polimerase (PCR). CONDIÇÃO I

Nº DE CICLOS ETAPA TEMPERATURA TEMPO

1 Desnaturação inicial 94°C 1 min

36

Desnaturação 94°C 1 min

Anelamento 45°C 1,5 min

Extensão 72°C 1,5 min

1 Extensão final 72°C 5 min

CONDIÇÃO II

1 Desnaturação inicial 94°C 1 min

5 Desnaturação 94°C 1 min Anelamento 45,5°C 1,5 min Extensão 72°C 1,5 min 35 Desnaturação 94°C 1 min Anelamento 50°C 1,5 min Extensão 72°C 1 min

1 Extensão final 72°C 5 min

Figura 6. Fotografia gerada por fotodocumentador sob iluminação UV, mostrando gel de agarose com bandas de DNA coradas com GelRed. Primeira fileira de bandas representa solução escada com tamanho dos fragmentos determinados em pares de bases (bp). * Fragmento COI amplificado com tamanho adequado. – Fragmento COI não amplificado.

Os produtos de PCR purificados com concentração estimada igual ou maior que 20 ng foram submetidos a reações de sequenciamento com base no método de Sanger et al. (1977), utilizando o kit BigDye® Terminator v3.1 de acordo com protocolo sugerido por Platt et al. (2007), com modificações. Cada fragmento de DNA foi sequenciado em ambas as direções e as sequências geradas pelo sequenciador automático de DNA ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems) no Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM) do INPA.

Em grande parte do material selecionado não foi obtido sucesso no processo de sequenciamento e consequentemente na obtenção de sequências de DNA, fato que pode atribuído a problemas na extração de DNA e/ou amplificação do fragmento desejado possivelmente devido aos espécimes estarem mal acondicionados (temperaturas elevadas e/ou em álcool bastante diluído como 70 ou 80%) ou serem muito antigos.

3.3.4. Edição e alinhamento das sequências

Com base na análise do eletroferograma das fitas direta e reversa obtidas para cada espécime foi verificada a qualidade das mesmas e a partir do alinhamento par a par das mesmas foi gerada uma sequência consenso usando o software BioEdit versão 7.2.5 (Hall 1999), que foram editadas manualmente para remoção de resíduos não comparáveis. As sequências consenso geradas foram comparadas com aquelas disponíveis no GenBank® (http://ncbi.nlm.nih.gov), através da plataforma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), a fim de confirmar a identidade do fragmento analisado e ausência de contaminação.

Para o alinhamento múltiplo foram utilizadas todas as sequências consensos obtidas além de algumas sequências de espécies de Smicridea e espécies dos gêneros Asmicridea e Smicrophylax baixadas no website do banco de dados do DNA barcode (BOLD) (http://www.boldsystems.org/). O alinhamento foi realizado através do software Clustal W (Larkin et al. 2007) implementado no software MEGA (v. 6.06) (Tamura et al. 2013), usando parâmetros padrão de custos de abertura (15) e extensão de gap (6,66). O alinhamento gerado foi editado para remover trechos não comparáveis das regiões iniciais e finais das sequências. Em seguida, as sequências do gene COI foram traduzidas em aminoácidos para detecção de erros de edição e alinhamento ou amplificação de pseudogenes gerados pela presença de códons de parada no meio da sequência de aminoácidos. Após ser editado e verificado, o alinhamento resultou em um fragmento de 620 bp de 54 espécimes de Smicridea (Tabela 4).