Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
Programa de Pós-Graduação em Entomologia – PPG-ENT
Smicridea McLachlan, 1871 (Trichoptera: Hydropsychidae: Smicrideinae)
do Brasil: Associação de larvas e adultos usando sequências de DNA
mitocondrial e metamorfótipo
Gleison Robson Desidério Gomes
Manaus, Amazonas Maio, 2016
Gleison Robson Desidério Gomes
Smicridea McLachlan, 1871 (Trichoptera: Hydropsychidae: Smicrideinae)
do Brasil: Associação de larvas e adultos usando sequências de DNA
mitocondrial e metamorfótipo
Orientadora: Dra. Ana Maria Oliveira Pes Coorientadora: Dra. Vanderly Andrade Souza
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Entomologia do INPA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Entomologia.
Manaus, Amazonas Maio, 2016
Ficha catalográfica
00 Gomes, Gleison Robson Desidério
Smicridea McLachlan, 1871 (Trichoptera: Hydropsychidae: Smicrideinae) do Brasil: Associação de larvas e adultos usando
sequências de DNA mitocondrial e metamorfótipo.---Manaus: [s.n], 2016. 000f.: il. Color.
Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2015. Orientadora: Dra. Ana Maria Oliveira Pes. Coorientadora: Dra. Vanderly Andrade Souza. Área de concentração: Entomologia.
1. Taxonomia. 2. COI. 3. Smicridea. I. Título.
CDD 000.000
Sinopse:
Realizou-se associações entre larvas e adultos de Smicridea do Brasil através de metamorfótipos e comparação de sequências do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI). Larvas coespecíficas a adultos foram ilustradas e caracterizadas morfologicamente. Novos registros de distribuição e uma chave taxonômica também são fornecidos.
Aos meus pais, Raimundo Gomes e Maria da Cruz Desidério, grandes pilares em minha vida, por todo amor dedicado e prioridade a minha educação.
A minha esposa, Samanta Kariella Gomes Figueiredo, por sua enorme compreensão, incentivo, grande amor e pelo simples fato de existir em minha vida.
Esta é, sem dúvidas, a secção mais “tensa” deste árduo trabalho, pois expressar em palavras a enorme gartidão a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para realização desta etapa não é uma tarefa fácil.
À minha orientadora, Dra. Ana Maria O. Pes, muito obrigado pelos inúmeros ensinamentos, pelo prazer de compartilhar de sua enorme experiência com os Trichoptera, especialmente os estágios imaturos, pela paciência com este menino teimoso, pela grande dedicação e auxilio fornecidos e por não ter poupado esforços para que esse trabalho fosse concluído. Obrigado pelas chamadas precisas nos momentos de dispersão (Desideriooooooooo...) e pela confiança. Ana obrigado por ter me proporcionado a oportunidade de conhecer lugares maravilhosos na expedição ao médio Rio Negro e, especialmente, por sua grande amizade, carinho de mãe com seus “fios” e conselhos.
À minha coorientadora, Dra. Vanderly Andrade Souza, pelas preciosas dicas e ensinamentos sobre biologia molecular e as práticas de laboratório e, por sua enorme paciência e confiança. Van muito obrigado por sua grande dedicação e persistência na obtenção do material genético essencial para realização deste estudo, desde a extração ao sequenciamento, e também por não ter poupado esforços para a realização deste trabalho.
À Dra. Neusa Hamada por todo suporte fornecido para a realização do trabalho, incluindo a ótima infraestrutura, equipamentos, e grande parte do material coletado em diversas regiões do Brasil, essenciais a este estudo e a outros a serem realizados.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao Curso de Pós-Graduação em Entomologia e aos professores que contribuíram com minha formação e crescimento profissional.
À coordenação de pessoal de nível superior - CAPES, pela concessão da bolsa de pós-graduação.
À Coordenação de Pós Graduação em Entomologia, através do Dr. José Wellington de Moraes e, à Lenir Mota, Secretária da Pós Graduação em Entomologia, por todo auxílio e atenção.
Aos projetos que subsidiariam esta dissertação: “Taxonomia de Trichoptera (Insecta) e associação de larvas e adultos no estado do Amazonas” (FIXAM/AM); “Sistemática Integrada de Insetos Aquáticos com ênfase em Simuliidae (Diptera: Nematocera) da América do Sul” (INPA/MCTI/PPI).
de minha existência, pelo amor incondicional, mimos, por se dedicarem incessantemente a minha educação, oferecendo todos os subsídios, sobretudo, por aceitarem vivermos distantes por este período, permitindo que eu pudesse correr atrás dos meus sonhos mesmo que partindo seus corações, mas sempre com muito apoio e incentivo. Minhas grandes referências de dignidade, persistência e luta, mesmo quando as forças parecem estar esgotadas. Os pais que todos sonham na vida, eu desfruto deles.
A minha amiga, namorada e esposa, Samanta K. G. Figueiredo, pelo grande amor, combustível para enfrentar as batalhas diárias, por sua compreensão e paciência com minha ausência, viradões, para a elaboração deste estudo com os “Ismicridia”, pelo apoio e exemplo de fé no momento que mais precisei em minha vida, tenho-a como um presente de Deus. Obrigado por ser minha grande companheira desde sempre e para sempre e por incentivar a dar passos maiores.
A toda minha família, em especial, aos meus irmãos Paixão e Fael, ao meu primo Jojão, por toda força, carinho e amor.
Ao meu grande brother, Patrik Barcelos, por seu enorme coleguismo, sempre prestativo e disposto a ajudar desde minha chegada a Manaus, ou melhor, desde as conversas através do “hangouts”, por nossas parcerias realizadas e pelas inúmeras que virão, por nossas discussões a respeito dos Trico. Obrigado por compartilharmos ótimos no Lab, em campo e nos momentos de descontração, quase sempre acompanhados daquela cervejinha. És um grande irmão para mim.
As “patroas”, Lívia Naman, Susany Lima e Samira Chaves pelos ótimos momentos de descontração, em nossas reuniões de casais.
A todos do Laboratório de Citotaxonima e Insetos Aquáticos, pelos momentos de descontração e ótimas risadas, conversas na hora do café.
Aos amigos da turma de mestrado de 2014 (Entomo 14) pela ótima convivência, festinhas, em especial, aos parceiros Luís e Mário.
Ao Dr. Carlos Augusto, orientador na graduação e um grande amigo, por ter me apresentado ao belo e engenhoso mundo dos insetos aquáticos, e aos amigos do Laboratório de Entomologia Aquática de Caxias/MA, Stênio Nascimento, Diego Sousa e Aparecida Gois, pela ajuda durante as coletas no Maranhão.
A natureza criou o tapete sem fim que recobre a superfície da terra. Dentro da pelagem desse tapete vivem todos os animais, respeitosamente. Nenhum o estraga, nenhum o rói, exceto o homem.
Smicridea McLachlan, 1871 é o único gênero de Smicrideinae presente no Novo Mundo. Suas espécies são bastante diversas na região Neotropical e estão agrupadas em dois subgêneros, Smicridea (Smicridea) e Smicridea (Rhyacophylax). Porém, em grande parte dessa diversidade, as larvas permanecem desconhecidas, principalmente no Brasil, onde das 50 espécies registradas, apenas sete têm larvas conhecidas. Fato que compromete sua aplicabilidade como bioindicadores em programas de biomonitoramento da qualidade de ambientes aquáticos. Portanto, para serem ilustradas e descritas morfologicamente em nível de espécie, larvas precisam ser associadas com adultos identificados. Nesse sentido, realizou-se associações entre larvas e adultos de Smicridea do Brasil através de metamorfótipos e comparação de sequências do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI). A partir da análise de material proveniente de diversas localidades do Brasil, quando metamorfótipos não foram encontrados ou disponíveis, foi extraído DNA mitocondrial dos espécimes, para posterior, amplificação, purificação e sequenciamento do fragmento do gene COI. As sequências obtidas, juntamente com algumas baixadas do banco de dados do DNA barcode (BOLD), foram editadas e alinhadas, resultando em um fragmento de 620 bp. Baseado nas sequências, distâncias genéticas intra e interespecífica foram calculadas usando modelo evolutivo Kimura 2-Parâmetros e a partir dessas distâncias foram construídos filogramas usando o método de Neighbor-Joining (NJ) com suporte dos ramos inferido por bootstrap com 1,000 replicações. Neste estudo, associações entre larvas e adultos foram realizadas para 11 espécies de Smicridea, quatro por meio de metamorfótipos e sete através de sequências do gene COI, com base nos agrupamentos do filograma gerado por NJ e de acordo com critérios de associação. Das espécies associadas, sete pertencem a S. (Rhyacophylax) e quatro a S. (Smicridea), das quais três são novas para a ciência. Larvas coespecíficas a adultos de espécies conhecidas juntamente com adultos machos das novas espécies são descritas, ilustradas e suas distribuições estendidas. Além disso, uma chave ilustrada de identificação taxonômica é fornecida para as 17 espécies de Smicridea com estágio larval conhecido que ocorrem no Brasil.
Smicridea McLachlan, 1871 is the only genus of Smicrideinae in the New World. Its species are quite diverse in the Neotropics and are clustered into two subgenres, Smicridea (Smicridea) and Smicridea (Rhyacophylax). But, in much of this diversity larvae remain unknown, especially in Brazil, where the 50 species recorded, only seven has known larvae. Fact that compromises its applicability as biomarkers in biomonitoring programs of the quality of aquatic environments. Therefore, to be illustrated and described morphologically at the species level, larvae need to be associated with identified adults. In this sense, were carried associations between larvae and adult Smicridea of Brazil through metamorphotypes and sequence comparison of mitochondrial gene Cytochrome Oxidase subunit I (COI). As from the analysis of material from various locations in Brazil, when metamorphotypes were not found or available, mitochondrial DNA of the specimens was extracted for subsequent, amplification, purification and sequencing of the COI gene fragment. The sequences obtained, along with some of the downloaded DNA barcode database (BOLD) were edited and aligned, resulting in a fragment of 620 bp. Based on sequences, intra- and interspecific genetic distances were calculated using evolutionary model Kimura 2-parameters and from these distances were built filogramas using the neighbor-joining method (NJ) with branches of support inferred by bootstrapping with 1,000 replications. In this study, associations between larvae and adults were performed for 11 species of Smicridea, four by means of metamorphotypes and seven through gene sequences COI, based on the filograma groupings generated by NJ and according to association’s criteria. Of associated species, seven belong to S. (Rhyacophylax) and four S. (Smicridea), three of which are new to science. Larvae conspecific adult known species with adult males of the new species are described, illustrated and their extended distributions. In addition, an illustrated taxonomic identification key is provided for the 17 species of Smicridea with known larval stage that occur on Brazil.
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. Aspectos gerais da ordem Trichoptera ... 1
1.2. Família Hydropsychidae e subfamília Smicrideinae ... 3
1.3. Gênero Smicridea ... 4
1.4. Associação de estágios de vida: Método Metamorfótipo e DNA barcoding ... 6
2. OBJETIVOS ... 9
2.1. Objetivo geral ... 9
2.2. Objetivos específicos ... 9
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 10
3.1. Procedência do material biológico ... 10
3.2. Morfologia ... 14
3.2.1. Procedimentos para análise da genitália e identificação ... 14
3.2.2. Ilustrações e confecção de mapas de distribuição ... 14
3.2.3. Terminologia morfológica ... 15
3.2.4. Descrições e chave de identificação ... 15
3.2.5. Morfologia geral de Smicridea ... 16
3.3. Técnicas moleculares ... 19
3.3.1. Extração de DNA ... 19
3.3.2. Amplificação ... 20
3.3.3. Purificação e sequenciamento ... 21
3.3.4. Edição e alinhamento das sequências ... 22
3.4. Análises moleculares ... 23
3.5. Critérios para associação entre larvas e adultos de Smicridea ... 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 27
4.1. Associação de larvas e adultos ... 27
4.2. Taxonomia ... 32
4.2.1. Descrições de larvas de último estádio e adulto associado ... 32
4.2.1.1. Smicridea (Smicridea) ... 32
Smicridea (Smicridea) albosignata Ulmer, 1907 ... 32
Smicridea (Smicridea) chela sp. nov. ... 38
Smicridea (Smicridea) ipiranga sp. nov... 47
Smicridea (Rhyacophylax) caligata Flint, 1974 ... 62
Smicridea (Rhyacophylax) coronata Flint, 1980 ... 68
Smicridea (Rhyacophylax) froehlichi Almeida & Flint, 2002 ... 74
Smicridea (Rhyacophylax) gladiatorFlint, 1978 ... 80
Smicridea (Rhyacophylax) palmar Sganga, 2005 ... 85
Smicridea (Rhyacophylax) spinulosa Flint, 1972... 90
Smicridea (Rhyacophylax) weidneri Flint, 1972 ... 96
4.2.2. Chave de identificação para larvas conhecidas de espécies de Smicridea do Brasil ... 101
5. CONCLUSÕES ... 111
Tabela 1. Caracteres usados para distinguir os subgêneros de Smicridea no estágio adulto e larval ... 5 Tabela 2. Localidades de coleta de Smicridea no Brasil, incluindo estado e município, código de referência, e coordenadas geográficas ... 11 Tabela 3. Condições utilizadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) ... 21 Tabela 4. Espécimes em que foram obtidas sequências do gene COI com respectivas informações taxonômicas e procedência. Voucher são códigos de referência do espécime testemunho com sequência obtida em laboratório. BOLD são números de acesso para sequências obtidas a partir do banco de dados do BOLDSystems. ... 24 Tabela 5. Valores mínimos, máximos e médios de divergências intraespecíficas calculadas por meio do modelo K2P para sequências de COI das espécies de Smicridea com larvas coespecíficas a adultos... 30 Tabela 6. Valores de divergência interespecífica mínima calculadas por meio do modelo K2P entre sequências de COI das espécies de Smicridea com larvas coespecíficas a adultos. Valores são mostrados em porcentagem e aqueles em negrito valores <20%. ... 30
Figura 1. Mapa do Brasil com as localidades de coleta de Smicridea (Smicrideinae) ... 13 Figura 2. Morfologia geral das principais estruturas da larva de último estádio de Smicridea. ... 16 Figura 3. Morfologia geral das principais estruturas da cabeça e peças bucais da larva de último estádio de Smicridea. A – Cabeça, vista dorsal; B – Cabeça, vista lateral; C – Cabeça, vista ventral; D - Mandíbulas, vista dorsal; E – Labro, vista dorsal ... 17 Figura 4. Morfologia geral das principais estruturas do adulto macho de Smicridea. A – Asa anterior; B – Asa posterior; C – Segmentos abdominais V - IX, vista dorsal, mostrando sacos glandulares internos; D - Hábito, vista lateral, espécime a seco. ... 18 Figura 5. Morfologia geral das principais estruturas da genitália masculina do adulto de Smicridea. A – Vista lateral; B – Vista dorsal; C – Falo, vista lateral; D – Ápice do falo, vista dorsal. ... 19 Figura 6. Fotografia gerada por fotodocumentador sob iluminação UV, mostrando gel de agarose com bandas de DNA coradas com GelRed. Primeira fileira de bandas representa solução escada com tamanho dos fragmentos determinados em pares de bases (bp). * Fragmento COI amplificado com tamanho adequado. – Fragmento COI não amplificado ... 21 Figura 7. Critérios de associação larva/adulto: A - larva coespecífica com adulto compartilhando mesmo haplótipo; B - larva coespecífica com adulto formando clado monoespecífico; C - larva não associada a nenhum adulto. GE = grupo externo (adaptado de Zhou et al. 2007). ... 25 Figura 8. Filograma de Neighbor-joining para 56 sequências de COI (620 bp) de Smicridea e gêneros relacionados, usando divergências genéticas estabelecidas pelo modelo Kimura 2-Parâmetros. Valores em porcentagem de suporte de bootstrap maiores que 50% são mostrados sobre os clados. Linhas grossas e cores correspondem a clados com larvas coespecíficas a adultos de espécies de Smicridea. Código dos ramos de acordo Tabela 4. SMR - S. (Rhyacophylax) e SMS S. (Smicridea). ... 29 Figura 9. Smicridea (Smicridea) albosignata Ulmer 1907, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D – detalhe ventral da cabeça; E - labro, vista dorsal; F – mandíbulas, vista dorsal ... 36 Figura 10. Smicridea (Smicridea) albosignata Ulmer 1907, larva. A – hábito, vista lateral; B - D – pernas torácicas, face externa; E - H– notos torácicos, vista dorsal; I – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral. ... 37
asa anterior direita, vista dorsal. ... 40 Figura 12. Smicridea (Smicridea) chela sp. nov., genitália masculina. A – vista lateral; B – vista dorsal; C – ápice do falo, vista lateral; D – ápice do falo, vista dorsal ... 41 Figura 13. Smicridea (Smicridea) chela sp. nov., larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal .. 45 Figura 14. Smicridea (Smicridea) chela sp. nov., larva. A – hábito, vista lateral; B - D – pernas torácicas, face externa; E – notos torácicos, vista dorsal; F – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 46 Figura 15. Smicridea (Smicridea) ipiranga sp. nov., adulto macho. A – hábito, vista lateral; B – asa anterior direita, vista dorsal. ... 48 Figura 16. Smicridea (Smicridea) ipiranga sp. nov., genitália masculina. A – vista lateral; B – vista dorsal; C – falo retraído, vista lateral; D – falo retraído, vista dorsal; E – falo expandido, vista dorsal ... 49 Figura 17. Smicridea (Smicridea) ipiranga sp. nov., larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal .. 53 Figura 18. Smicridea (Smicridea) ipiranga sp. nov., larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 54 Figura 19. Smicridea (Smicridea) polyacantha sp. nov., asa anterior direita, vista dorsal ... 56 Figura 20. Smicridea (Smicridea) polyacantha sp. nov., genitália masculina. A – vista lateral; B – vista dorsal; C – falo retraído, vista lateral; D – falo retraído, vista dorsal; E – falo expandido, vista lateral; F – falo expandido, vista dorsal ... 57 Figura 21. Smicridea (Smicridea) polyacantha sp. nov., larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 60 Figura 22. Smicridea (Smicridea) polyacantha sp. nov., larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 61 Figura 23. Smicridea (Rhyacophylax) caligata Flint, 1974, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal. ... 66
pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 67 Figura 25. Smicridea (Rhyacophylax) coronata Flint, 1980, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 72 Figura 26. Smicridea (Rhyacophylax) coronata Flint, 1980, larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 73 Figura 27. Smicridea (Rhyacophylax) froehlichi Almeida e Flint 2002, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D – detalhe dos sulcos estridulatórios, vista ventral; E – mandíbulas, vista dorsal; F – labro, vista dorsal ... 78 Figura 28. Smicridea (Rhyacophylax) froehlichi Almeida & Flint, 2002, larva. A – hábito, vista lateral; B-D – pernas torácicas, face externa; E - H – notos torácicos, vista dorsal; I – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 79 Figura 29. Smicridea (Rhyacophylax) gladiator Flint, 1978, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 83 Figura 30. Smicridea (Rhyacophylax) gladiator Flint, 1978, larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 84 Figura 31. Smicridea (Rhyacophylax) palmar Sganga, 2005, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 88 Figura 32. Smicridea (Rhyacophylax) palmar Sganga, 2005, larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 89 Figura 33. Smicridea (Rhyacophylax) spinulosa Flint, 1972, larva. A – cabeça, vista dorsal; B – cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 94 Figura 34. Smicridea (Rhyacophylax) spinulosa Flint, 1972, larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 95
– cabeça, vista ventral; C – cabeça, vista lateral; D - labro, vista dorsal; E – mandíbulas, vista dorsal ... 99 Figura 36. Smicridea (Rhyacophylax) weidneri Flint, 1972, larva. A – hábito, vista lateral; B – pernas torácicas, face externa; C – notos torácicos, vista dorsal; D - labro, vista dorsal; E – escleritos dos esternos VIII e IX, vista ventral ... 100
As espécies novas descritas nesta dissertação foram atribuídos epítetos específicos, porém os mesmos não são válidos, pois não atendem aos critérios formais, de acordo com o Capítulo 3, Artigo 8 e 9 do Código Internacional de Nomenclatura Zoológica (1999).
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais da ordem Trichoptera
Estabelecida por Kirby (1813), a ordem Trichoptera representa a sétima maior ordem de insetos (Holzenthal et al. 2007a) e a mais diversa dentre os grupos estritamente aquáticos (Nebbois 1991), com 49 famílias distribuídas em 616 gêneros e aproximadamente 15.500 espécies válidas (Morse 2016) encontradas em quase todas as regiões biogeográficas, com exceção apenas da Antártida, e com maior diversidade nas regiões Oriental e Neotropical (De Moor e Ivanov 2008). São insetos holometábolos com estágios pupal e larval exclusivamente aquáticos e a grande maioria dulçaquícola, exceto algumas espécies da família Chathamiidae, encontradas na Nova Zelândia e Austrália, que colonizam o ambiente marinho (Nebbois 1991) e, alguns representantes da família Limnephilidae e Xiphocentronidae com larvas que habitam solos úmidos próximo aos cursos d’água (Wiggins 2004; Pes et al. 2013).
Trichoptera possui registro fóssil desde o Triássico (Morse 1997; Grimaldi e Engel 2005;), com maior diversificação no Jurássico tardio e Cretáceo (Ivanov e Sukatsheva 2002). Esta ordem é grupo-irmão de Lepidoptera, formando a superordem Amphiesmenoptera, sustentada por caracteres morfológicos, moleculares e evidências paleontológicas (Kristensen 1984; Wheeler et al. 2001; Whiting 2002; Grimaldi e Engel 2005; Misof et al. 2014; Peters et al. 2014). Algumas sinapomorfias que unem essas duas ordens podem ser destacadas, como cerdas cobrindo as asas dos adultos (as quais são modificadas em escamas em Lepidoptera) e larvas com hipofaringe e pré-lábio fusionados, com abertura de glândula produtora de seda (Kristensen 1984), usada na construção de casulos, abrigos e redes de captura. Outro caráter sinapomórfico é a permeabilidade da parede do abrigo da pupa, que em Trichoptera possivelmente capacitou o seu ancestral a invadir o ambiente aquático, sendo a primeira ordem a apresentar estágio pupal aquático entre os Holometabola (Calor 2009).
Adultos de Trichoptera são aéreos e assemelham-se a pequenas mariposas, podendo atingir de 1,5 mm a 4,5 cm de comprimento, geralmente são marrons a pretos ou com combinações de cores. Ambos os pares de asas e o corpo são cobertos por cerdas (Holzenthal et al. 2007a). Mandíbulas são ausentes ou vestigiais, apenas os palpos (maxilares e labiais) são proeminentes. Lábio e hipofaringe são fusionados formando uma tromba curta, o haustelo, o qual é membranoso com pequenos canais que permitem a absorção de fluidos (Crichton 1957;
Kubiak et al. 2015). Possuem olhos compostos bem desenvolvidos, ocelos podem estar presentes ou ausentes. O pronoto mais curto que meso e metanoto, geralmente com um par de verrugas de cerdas ou tubérculos. Mesonoto com mesoescutelo bem desenvolvido, podendo apresentar verrugas ou pequenas áreas cerdosas e metanoto com metaescutelo distinto. Asas possuem formato variável, mas anteriores são um tanto mais longas que posteriores, embora posteriores podem ser mais largas (Holzenthal et al. 2007a; Pes et al. 2014). Abdômen com quinto esterno podendo apresentar um par de glândulas de feromônios (Ivanov e Melnitsky 2002).
As pupas são exaradas (antenas, pernas e asas destacadas e livres do corpo), com mandíbulas bem desenvolvidas, geralmente voltadas para frente e cruzadas entre si; labro pequeno, geralmente trilobado; e antenas voltadas ventralmente ao longo do tórax e abdômen ou enroladas na região posterior do abdômen em espécies com antenas muito longas. O tórax é similar ao dos adultos, as pernas torácicas, algumas vezes, são achatadas, com franja de cerdas. O abdômen possui resquícios de brânquias das larvas e uma série de escleritos dorsais com ganchos e podem apresentar um par de processos anais na região posterior (Holzenthal et al. 2007a; Pes et al. 2014).
As larvas são campodeiformes ou eruciformes, com cabeça esclerosada, antenas curtas, mandíbula bem desenvolvida. Tórax com pronoto esclerosado, meso e metanoto com esclerosação variável ou ausente. Abdômen membranoso consiste de nove segmentos com último segmento suportando um par de falsas pernas anais providos de garras (Angrisano 1998). Algumas famílias apresentam brânquias respiratórias externas (traqueobrânquias filamentosas, isoladas ou em tufos). Outras famílias possuem o primeiro segmento abdominal com cutícula pouco esclerosada e três verrugas (ou calos), uma dorsal e duas laterais com função de fixar o corpo no casulo, durante a locomoção (Mugnai et al. 2010).
Os estágios imaturos são quase sempre aquáticos, podendo ser encontrados tanto em ambientes lênticos quanto lóticos. Os ovos são depositados em faixas ou massas em ambientes aquáticos e terrestres, como folhas da vegetação marginal sobre córregos, substratos presentes em áreas de correnteza ou remanso (Pes et al. 2014). As larvas geralmente possuem cinco estádios de desenvolvimento, por vezes, alcançando pouco mais de um ano nesse estágio. Além disso, possuem alta especialização na obtenção de alimento (Merritt e Cummins 1996), conferida ao uso da seda (Mackay e Wiggins 1979), utilizada por elas para construção de casulos, abrigos fixos, linhas de âncora (pelas espécies de vida livre), e redes de retenção de partículas (Wiggins 1996). A completa metamorfose do estágio pupal para o adulto dura em média três semanas (Wiggins 2004). O estágio adulto possui curta duração, podendo ser de
poucos dias à duas ou três semanas, e indivíduos nesse estágio são encontrados próximos aos cursos d’água, sobre a vegetação ripária ou pedras (Angrisano 1995).
Nos últimos anos, vários autores propuseram hipóteses de relacionamentos das subordens de Trichoptera, umas com base em caracteres morfológicos e história de vida (Frania e Wiggins 1997; Morse 1997) e outras usando dados morfológicos e moleculares combinados (Kjer et al. 2001, 2002; Holzenthal et al. 2007b). A mais recente tentativa em reconstruir a história evolutiva da ordem foi realizada por Malm et al. (2013), utilizando a combinação de dados moleculares e fósseis conseguiram recuperar três subordens dentre Trichoptera: Annulipalpia (larvas construtoras de abrigos fixos) e Integripalpia (larvas construtoras de casas portáteis) como monofiléticas, assim como nas hipóteses anteriores, porém as relações entre famílias dentre esses grupos, assim como a posição das famílias de Spicipalpia (larvas com comportamento de produção casulo bastante variável), recuperada como parafilética e ancestral de todos outros Trichoptera, foram notavelmente diferentes.
1.2. Família Hydropsychidae e subfamília Smicrideinae
A subordem Annulipalpia é composta de três grandes grupos: Hydropsychoidea, Philopotamoidea e Psychomyioidea (Holzenthal et al. 2011). Dentre os Hydropsychoidea está a família Hydropsychidae, estabelecida por Curtis (1835), com aproximadamente 1.700 espécies válidas, sendo a terceira maior família de Trichoptera e a mais diversa dos Annulipalpia (Holzenthal et al. 2007a). Em cada região, suas larvas exibem nichos ecológicos estratificados nos diversos cursos d’água (Geraci 2007), encontradas principalmente em águas correntes onde são abundantes e dominantes (Flint et al. 1999; Angrisano e Sganga 2009).
Os adultos de Hydropsychidae são caracterizados pela ausência de ocelos, palpos maxilares com o quinto artículo delgado e alongado (exceto em Leptonema, não muito longo, e Synoestropsis, reduzido) com estrias transversais conspícuas. O mesoescuto e mesoescutelo podem apresentar manchas, cerdas e/ou escamas coloridas, sem verrugas ou tubérculos. A coloração das asas é muito variável entre os gêneros, podendo ser importante para auxiliar na identificação das espécies (Pes et al. 2014). As larvas apresentam os tergos torácicos esclerosados, abdômen com brânquias ventrolaterais e ventrais, e garra da falsa perna anal com tufo de cerdas longas (Angrisano e Sganga 2009).
Holzenthal et al. (2007a) reconhecem atualmente cinco subfamílias em Hydropsychidae: Arctopsychinae, Macronematinae, Hydropsychinae, Diplectroninae e Smicrideinae, as quais possuem seus monofiletismos e relações filogenéticas entre elas sustentadas em caracteres morfológicos e moleculares de imaturos e adultos (Schefter 1996,
2005; Geraci et al. 2005), porém ainda não contam com uma classificação genérica estável. Historicamente, o posicionamento dos táxons que constituem a subfamília Smicrideinae tem sido problemático devido alguns exibirem características de Diplectroninae e Hydropsychinae, sendo então classificados dentre essas duas subfamílias por alguns autores (Ross 1947; Ulmer 1951, 1957). Flint (1974a) baseado em caracteres morfológicos de larvas, pupas e adultos propôs a tribo Smicrideini dentre Hydropsychinae para incluir os gêneros Smicridea McLachlan e Asmicridea Mosely. Diferentemente dos autores anteriores, Schefter (1996) utilizando análise cladística formal para propor hipóteses de relações filogenéticas dentre Hydropsychidae, elevou a então tribo Smicrideini, ao status de subfamília, recuperando-a como táxon irmão de Macronematinae baseado em sinapomorfia pupal.
Smicrideinae contém somente três gêneros: Smicridea McLachlan, com 228 espécies válidas encontradas apenas no Novo Mundo, Smicrophylax Neboiss e Asmicridea Mosely, com cinco e três espécies válidas, respectivamente, e distribuição restrita a região Australiana (Morse 2016). Flint (1974a) sugeriu que Smicrideinae tenha origem Gonduânica e atribuiu este fato as distribuições disjuntas de Smicridea nas Américas, e Asmicridea e Smicrophylax na Austrália.
1.3. Gênero Smicridea
Smicridea McLachlan, 1871 é o único gênero de Smicrideinae presente no Novo Mundo, sendo bastante abundante e com alta riqueza de espécies na região Neotropical. As espécies deste gênero estão agrupadas em dois subgêneros, Smicridea (Smicridea) McLachlan e Smicridea (Rhyacophylax) Müller, que são encontrados desde o sudeste dos Estados Unidos, América Central, América do Sul e Antilhas (Flint et al. 1999). Atualmente, das 228 espécies válidas de Smicridea 126 pertencem a S. (Smicridea) e 102 a S. (Rhyacophylax) (Morse 2016). No Brasil, Smicridea possui 50 espécies válidas, sendo 12 S. (Smicridea) e 38 S. (Rhyacophylax) (Pes e Santos 2016). Apesar de serem amplamente distribuídas no território brasileiro, grande parte do conhecimento sobre a diversidade de Smicridea está concentrado principalmente nas regiões Norte e Sudeste, sendo bastante incipiente na região Nordeste.
Os adultos são pequenos (5 a 10 mm de comprimento) quando comparados aos outros gêneros de Hydropsychidae, possuem antenas mais curtas que o comprimento das asas anteriores e apresentam asas com coloração característica que varia do preto ao cinza com bandas brancas ao amarelo-claro ou castanho-claro. As pupas caracterizam-se pelas mandíbulas típicas e posição e número das placas de ganchos dorsais sobre o abdômen. As larvas geralmente exibem manchas distintas sobre a cabeça; margem anterior do frontoclípeo côncava,
convexa ou reta com crenulações e/ou lóbulos; submento sem fissura mediana; gena com sulcos estridulatórios transversais conspícuos; esclerito gular ventral dividido em anterior e posterior; pronoto dividido por linha ecdisial longitudinal, meso e metanoto inteiros; trocantin anterior simples cônico; brânquias ventrais e ventrolaterais consistindo de haste grossa ramificando-se na base com poucos filamentos finos distribuídos irregularmente; abdômen coberto com cerdas curtas espatuladas como escamas. Os subgêneros de Smicridea podem ser distinguidos por quatro caracteres principais, estabelecidos por Flint (1974a, 1989) para adultos e Wiggins (1996) para larvas, como na Tabela 1.
Tabela 1. Caracteres usados para distinguir os subgêneros de Smicridea no estágio adulto e larval.
CARACTERES TÁXONS
S. (Smicridea) S. (Rhyacophylax)
Venação asa posterior (♂, ♀) Sistema radiomedial bem separado de Cu1
Porção basal do sistema radiomedial próximo a Cu1
Fórmula dos esporões tibiais (♂) 1-4-4 1-4-2
Processos glandulares abdominais Um par ventrolateral externo no segmento V (diminutos nas fêmeas)
Dois pares internos entre os segmentos VI-VII e VII-VIII (apenas em machos)
Escleritos do esterno VIII (larvas) Único esclerito Dois escleritos
Larvas de Smicridea são encontradas em ambientes lóticos, desde pequenas nascentes a grandes rios. Constroem abrigos fixos de seda sobre substratos (rochas, troncos), com rede de captura estendida à frente da correnteza d’água para obter alimento, como partículas de matéria orgânica, em grande parte diatomáceas, bem como fragmentos de insetos e algas verdes. Ao empupar, a larva tece um abrigo em forma de cúpula, com fragmentos vegetais, areia e revestimento de seda (Flint 1978, 1989; Oliveira e Froehlichi 1996). Larvas de S. (S.) travertinera Paprocki, Holzenthal & Cressa 2003 são encontradas colonizando formações rochosas calcárias (travertinos), outras como S. (R.) thermophila Rueda-Martin & Sganga 2011 são tolerantes a nascentes com águas quentes, e S. (S.) truncata Flint 1974 encontradas em cursos d’água em áreas abertas e perturbados antropicamente (ex.: saídas de represas) (Pes et al. 2008).
Além disso, larvas de Smicridea são utilizadas como bioindicadores no biomonitoramento de ambientes aquáticos com diferentes condições de conservação ou poluição (Biasus et al. 2015), atribuído a sua alta abundância e por apresentarem diferentes
níveis de sensibilidade ou tolerância aos estresses ambientais, sejam naturais ou antrópicos (Lenat 1993). Porém, esses níveis podem variar entre habitats e regiões (Dapkey 2008), dentro da família ou gênero (Lenat 1993; Lenat e Resh 2001), podendo gerar possíveis interpretações errôneas em relação aos impactos gerados sobre determinado táxon para diferentes categorias taxonômicas ou regiões, a menos que as larvas possam ser identificadas e ilustradas em nível de espécie.
Entretanto, a utilidade dessa abordagem para Smicridea tem sido limitada pela carência de conhecimento específico das larvas. Com isso, grande parte da fauna ainda permanece desconhecida, pois do total de espécies válidas somente 31 possuem estágios imaturos associados e descritos, sendo todas as associações obtidas através de métodos convencionais. Deve-se salientar que grande parte das descrições larvais realizada por Flint (1964, 1968a, 1968b, 1974a) foram feitas há algum tempo e consistem apenas de uma diagnose de caracteres que ele considera mais importantes. O conhecimento dos estágios imaturos de Smicridea é ainda mais incipiente no Brasil, pois das espécies registradas para o país apenas sete espécies têm estágios imaturos descritos, quatro pertencentes a S. (Smicridea), S. (S.) bivittata (Hagen), S. (S.) obliqua Flint, S. (S.) palifera Flint e S. (S.) truncata Flint, e três a S. (Rhyacophylax), S. (R.) appendiculata Flint, S. (R.) helenae Albino, Pes & Hamada, S. (R.) spinulosa Flint.
1.4. Associação de estágios de vida: Método Metamorfótipo e DNA barcoding
Para serem ilustradas e descritas em nível de espécie, as larvas são associadas com adultos identificados (Zhou et al. 2007). Essas associações têm sido historicamente realizadas por três métodos convencionais distintos que envolvem: 1. Criação de larvas, onde essas são colocadas em um aquário e quando atingem o último instar algumas são retiradas para descrição e outras mantidas para que possam desenvolver em adultos identificáveis (Wiggins 1996); 2. Associação indireta, a frequência de machos adultos de determinada espécie e larvas, relativamente abundantes, são correlacionadas de uma localidade definida (Johanson 2007); 3. Método Metamorfótipo, dentro do mesmo casulo pupal são encontrados a exúvia da pupa, os escleritos larvais e adultos farados, onde esses adultos não emergidos com genitália esclerosada são identificados em espécies conhecidas na literatura e os escleritos larvais comparados com larvas de último instar coletadas no mesmo local (Milne 1938; Wiggins 1996).
Entretanto, existem algumas limitações quanto à utilização desses métodos que podem explicar o fato de grande parte da fauna de Trichoptera permanecer não associada, embora o problema seja também indubitavelmente vinculado à carência de pesquisas, conhecimento especializado e esforços aplicados à associação larval. Criar de larvas é muitas vezes
ineficiente, particularmente em Hydropsychidae, onde as larvas geralmente requerem condições ecológicas e físicas muito específicas ou semelhantes ao ambiente natural (Zhou et al. 2007). A associação indireta pode ser considerada mais convincente quando ocorrem machos de somente uma espécie, pois quando envolve mais espécies na localidade há grande imprecisão (Johanson 2007). Metamorfótipos são relativamente raros, devido esta parte do ciclo de vida ocorrer apenas por um curto período de tempo (Schefter e Wiggins 1986), porém este método, comparado aos anteriores, além de confiável, possui a vantagem de servir como material testemunho a ser depositado em coleções científicas, onde futuros pesquisadores podem consultar e chegar a veracidade da associação estabelecida (Milne 1938).
Um método mais atual que faz uso de ferramentas moleculares, surge como uma forma de acelerar o processo de identificação e associação larva/adulto, sendo o “DNA barcoding” a mais empregada e efetiva, que consiste de uma sequência curta (aproximadamente 650 pares de bases) próxima ao final 5’ da subunidade I do gene Citocromo Oxidase (COI) do DNA mitocondrial (Hebert et al. 2003a), a qual é uma região padronizada do gene que serve como etiqueta interna de espécies. Ao contrário da maior parte de caracteres morfológicos, as sequências de DNA para um gene particular são idênticas para todos os estágios de vida (Zhou et al. 2007) e no caso do DNA barcode, fatores como ausência de íntrons, simples alinhamento, disponibilidade de primers robustos, normalmente possuem baixa variação intraespecífica e alta interespecífica que permitem esclarecer delineamentos de espécies baseados em agrupamentos genéticos (Hebert et al. 2003a, 2003b; Zhou et al. 2007; Floyd et al. 2009).
Em Trichoptera, a associação de larvas e adultos com base em sequências de DNA mitocondrial tem sido extremamente útil para descrição e ilustração do estágio larval (Shan et al. 2004a, 2004b; Graf et al. 2005; Johanson 2007; Zhou et al. 2007; Zhou 2009; Ruiter et al. 2013; Previšić et al. 2014; Shackleton e Webb 2015; Waringer et al. 2015; Xu et al. 2016). Além disso, sendo amplamente utilizado para auxiliar na delimitação de espécies e inventários de biodiversidade (Geraci et al. 2010, 2011; Zhou et al. 2010, 2011); inferir relações filogenéticas e padrões filogeográficos (Kjer et al. 2001; Johanson e Keijsner 2008; Pauls et al. 2009; Hogg et al. 2010; Johanson e Espeland 2010; Johanson e Malm 2010; Malm e Johanson 2011; Johanson et al. 2012; Malicky e Pauls 2012; Malm et al. 2013; Kjer et al. 2014; Wahlberg e Johanson 2014).
A associação de diferentes estágios de vida também pode ajudar a delimitar espécies cujos limites morfológicos são imprecisos nas formas adultas (Ruiter et al. 2013), como encontrado para espécies chinesas de Mexipsyche Ross (Hydropsychidae) (Zhou et al. 2007) e no complexo Diplectrona modesta Banks (Hydropsychidae) na América do Norte (Harvey et
al. 2012), as quais apresentam adultos machos com genitália críptica, mas suas larvas com manchas distintas sobre a cabeça.
Nesse contexto, o uso de métodos como Metamorfótipo e sequências de DNA barcoding para associar estágios de vida, demonstram ser ferramentas efetivas e seguras para acelerar significativamente o processo de descrições larvais para a fauna brasileira de Smicridea, insuficientemente conhecida. Além disso, a associação larva/adulto das espécies de Smicridea do Brasil é importante não apenas para aumentar o conhecimento taxonômico do grupo, mas principalmente para aplicações em biomonitoramento da qualidade da água e estudos ecológicos, visto que informações em nível de espécie são extremamente valiosas em decisões sobre conservação ou gestão, especialmente para espécies não nativas ou ameaçadas de extinção, bem como também são fonte de novos caracteres morfológicos e moleculares a serem testados em futuras reconstruções filogenéticas.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Realizar associações entre larvas e adultos de Smicridea do Brasil através de metamorfótipos e comparação de sequências do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI), bem como caracterizar morfologicamente larvas de espécies associadas.
2.2. Objetivos específicos
Associar larvas e adultos de Smicridea através de metamorfótipos e sequências de DNA mitocondrial;
Ilustrar e descrever morfologicamente larvas de espécies de Smicridea associadas aos adultos;
Descrever eventuais novas espécies de Smicridea com adultos e larvas associados; Elaborar chave ilustrada de identificação taxonômica para larvas das espécies de Smicridea do Brasil.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Procedência do material biológico
O material utilizado para este estudo foi proveniente de localidades de coletas situadas em diversos estados das cinco regiões do Brasil: Norte (Amapá, Amazonas, Pará, Roraima), Nordeste (Bahia, Maranhão, Piauí), Centro-Oeste (Goiás, Mato Grosso), Sudeste (Espírito Santo) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina) (Tabela 2; Figura 1). Grande parte desse material foi obtida através de coletas realizadas pela equipe do Laboratório de Citotaxonomia e Insetos Aquáticos (LACIA) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) coordenada pela Dra. Neusa Hamada. Outra parte foi adquirida por meio de coletas adicionais em algumas localidades com registros prévios de espécies de Smicridea, com o intuito de obter material fresco, principalmente larvas, para realizar extração de DNA mitocondrial e consequentes associações entre estágios de vida, bem como locais pouco amostrados a fim de aumentar a abrangência geográfica do táxon no território brasileiro. Material adicional de poucas espécies foi proveniente de empréstimo de instituições nacionais: Coleção Zoológica Norte Capixaba - Universidade Federal do Espírito Santo (CZNC / UFES), Coleção Entomológica de Santa Cruz do Sul – Universidade de Santa Cruz do Sul (CESC / UNISC).
Larvas de último estádio foram coletadas por catação manual com uso de pinças entomológicas em substratos como raízes, folhas, troncos e pedras em áreas de correnteza moderada a forte de igarapés a grandes rios ou com auxílio de rede entomológica aquática em D ou rapiché. Os adultos foram coletados através de armadilhas luminosas como Pennsylvania com luz branca (Frost 1952) ou UV e pano branco com luz mista, ambas colocadas próximas aos cursos d’água, além de armadilhas de interceptação de voo do tipo Malaise (Townes 1972), posicionadas sobre o curso d’água onde podem permanecer por dias ou semanas.
Todo material coletado foi fixado em álcool etílico absoluto PA. Após triagem e identificação em laboratório, alguns espécimes de cada espécie ou morfótipo foram selecionados e, no freezer, mantidos individualmente em microtubos sob temperatura aproximada de -18° C para conservação do material genético (Dillon et al. 1996) a ser utilizado no estudo molecular. Cada metamorfótipo encontrado foi acondicionado em microtubos separados e colocados em um frasco juntamente com as larvas correspondentes e da mesma coleta. Alguns espécimes adultos
foram mantidos a seco em alfinetes entomológicos para preservação da coloração do corpo e das asas. Todo material examinado testemunho do estudo será depositado na Coleção de Invertebrados do INPA e os provenientes de empréstimo, em suas instituições de origem, como indicado na descrição ou registro geográfico de cada espécie.
Tabela 2. Localidades de coleta de Smicridea no Brasil, incluindo estado e município, código de referência, e coordenadas geográficas.
Estado/Código Município Localidade Coordenadas Geográficas AM / 01 Barcelos Serra do Aracá (Base), igarapé
do Cobra 00°52'34,21"N / 63°27'03,60"W
AM / 02 Acampamento no Igarapé da
Cobra 00°52'24,78''N / 63°27'18,97''W
AM / 03 Serra do Acará, igarapé da
Anta 00°54'38,70"N / 63°25'54,70"W AM / 04 Manaus Balneário Km 18,5, BR-174 02°49'00,80''S / 60°02'05,60''W
AM / 05 Cachoeira da ASFRAMA,
BR-174 02°1'48,77"S / 60°1'25,96"W AM / 06 Balneário Km 18,5, BR-174 02°49'00,80''S / 60°02'05,60''W
AM / 07 Reserva Ducke, Igarapé
Ipiranga 02°58'53,6''S / 59°54'24,4''W AM / 08 Novo Airão Igarapé Mato Grosso 02°49'03,8''S / 60°55'47,1''W AM / 09 Presidente Figueiredo Igarapé do Canoas 01º49'51"S / 60º04'15”W
AM / 10 Fazenda Marupiara, Rio
Urubu 02°03'43,08"S / 60°06'13,28"W
AM / 11 Balneário Sossego da Pantera,
Igarapé da Onça 02°05'57"S / 60°01'02"W
AM / 12 Igarapé do Mutum, Cachoeira
da Porteira 02°52'21''S / 059°55'15,6''W
AM / 13 Corredeira da Dona Maroca,
AM-240, Km 13 02°02'00,1"S / 59°51'45,1"W
AM / 14 Afluente igarapé Pantera,
AM-240 02° 00'52,0''S / 60° 01'43,0''W AM / 15 São Gabriel da
Cachoeira BR-307, Km 19 00°02'58,40"N / 66°57'47,10"W AP / 16 Amapá Rio Amapá Grande, Cachoeira
Grande 02º09'43,1"N / 050º55'17,3"W AP / 17 Oiapoque Balneário Rio Pantanahy 03º47'54,3"N / 051º48'05,5"W AP / 18 Pedra Branca do
Amaparí
Igarapé da Estrada BR 210,
próximo a Pedra Branca 00°37'38,00"N / 51°38'15,20"W AP / 19 Serra do Navio Rio Cachaço, Cachoeira do
Fernando 00°53'18,8"N / 52°01'22,9"W AP / 20 Tartarugalzinho Rio Tracajatuba, Cachoeira da
Funasa 01°02'47,10"N / 51°02'46,50"W BA / 21 Camacan Igarapé na RPPN Serra Bonita 15°22'59,1''S / 39°33'21,2''W BA / 22 Correntina Cachoeira Rio das Éguas 13°31'08,30"S / 45°21'00,20''W BA / 23 Tanquinho Morro Branco, Rio que corta a
estrada 12°00'21,10"S / 39°06'07,20"W CE / 24 Morajaú Riacho dos Porcos 03°23'21,3”S / 040°41'01,7”W ES / 25 Alegre Cachoeira da Fumaça 20°37'52,1"S / 41°36'18,8"W ES / 26 Alfredo Chaves
Nova Mantova, Fazenda Nego Boldrini, Córrego Nova Estrela
20°39'22,60"S / 40°50'12,90"W
...Continuação
ES / 27 Caparaó Mundo Novo, Pousada Águas
do Caparaó 20°36'03,8"S / 41°46'37,4''W ES / 28 Fundão Timbuí, Hotel Fazenda Monte
Sião 19°56'02,0"S / 40°24'45,0"W ES / 29 Linhares Lagoa Paminhas 19°25'49,45"S / 40°11'0,26"W ES / 30 Pinheiros REBIO Córrego do Veado,
Córrego Água Limpa 18°22'04,1"S / 40°08'23,8''W
ES / 31 REBIO Córrego do Veado,
Córrego São Roque 18°18'53,5"S / 40°09'10,4''W ES / 32 Sooretama Rio São José 19°07'33,1"S / 40°14'26,1"W GO / 33 Mambaí Rio próximo a cidade 14°28'36,0"S / 46°07’03,0"W MA / 34 Caxias Igarapé Piscina do Ponte 4°52'43,40"S / 43°21'53,66"W MA / 35 Igarapé São José 4°51'19,00"S / 43°21'55,73"W MA / 36 Igarapé Riachão, MA-034 4°56'8,59"S / 43°21'26,65"W
MA / 37 Sitio Tarumã, Igarapé
Itapecuruzinho 4°53'42,30"S / 43°20'31,30"W MT / 38 Barra do Garças Rio Pindaíba 14°54'10"S / 52°00'21"W PA / 39 Santarém Igarapé Branco, BR 163,
ramal da Galileia 03°28'55,50" / 54°50'25,00"W PI / 40 Brasileira Riacho abaixo da 1ª ponte,
estrada Domingos Mourão 04⁰10'06,2"S / 41⁰34'55,0"W PI / 41 Monsenhor Gil Povoado Olho d'água, Riacho
Calça na Mão 05°34'38,60"S / 42°29'59,50"W PR / 42 Lapa Cachoeira atrás do Hotel
Estrela, BR-476, Km 231 25º52'47,8"S / 49º59'38,1"W PR / 43 Mangueirinha Afluente do Rio Mareco 26º00'04,3"S / 52º08'15,4"W PR / 44 Marquinhos Rio do Cobre 25º08'25,6"S / 52º17'20,6"W PR / 45 Tibagi Rio Tibagi 24°31'34,2''S / 50°23'47,9''W RR / 46 Caroébe Rio Caroébe 00°57'09,2"N / 59°37'00,5"W RR / 47 Pacaraima Fazenda São Sebastião, Rio
Ereu 04°02'02,9"N / 61°23'09,5"W RS / 48 Agudo Cascata Raddatz 29°35'12,05''S / 53°10'49,8''W RS / 49 Arroio do Tigre Rio Jaquirana 29°17'24,5"S / 53°03'42,7"W RS / 50 Bossoroca Barra do Angico, Rio
Piratinim 28°32'06,2''S / 54°57'29,9''W RS / 51 Estrela Velha Rio Jacuizinho 29°16'43,9"S / 53°08'40,3"W RS / 52 Gramado Linha Tapera [Arroio] 29°23'22,58''S / 50°56'51,07''W
RS / 53 Linha Araripê, Córrego Sr.
Ernesto 29°24'35,4''S / 50°55'33,5''W RS / 54 Monte Alverne Rio Castelhano 29°33'24,85"S / 52°20'3,12"W RS / 55 Santa Cruz do Sul Rio Pardinho 29º43'01"S / 52º25'00"W RS / 56 São Francisco de
Paula FLONA, Arroio Lageado 29°25'57,01''S / 50°22'22,5''W
RS / 57 FLONA, Arroio Pinheiros
Centenários 29°25'13,4''S / 50°23'40,4''W RS / 58 FLONA, Arroio Casulo 29°25'57,87''S / 50°22'24,14''W RS / 59 Passo da Ilha, Rio Tainhas 29°07'19,77''S / 50°21'25,39''W SC / 60 Campos Novos Rio Leão, BR-282 27º19'54,1''S / 51º19'21,2''W SC / 61 Dionísio Cerqueira Linha Toldo, afluente da
Cachoeira do Toldo 26º18'11,4"S / 53º37'01,6"W SC / 62 Iraní Rio Iraní, BR-282 26º55'48,8"S / 51º52'28,0"W SC / 63 Paraíso Rio Peperiguaçú 26º36'49,9"S / 53º43'53,8"W
...Continuação
SC / 64 Vargeão Arroio afluente do Rio Iraní;
BR-282 26º56'55,8"S / 52º10'52,6"W SC / 65 Romelândia Rio Sargento 26º40'50,0"S / 53º17'07,5"W SC / 66 São Joaquim Riacho na Estrada S. Joaquim
/S. José dos Ausentes 28º25'31,2"S / 49º53'46,1"W RS / 67 São José dos
Ausentes Rio Pelotas 28º26'50,3"S / 49º52'58,3"W SC / 68 São Joaquim Rio Envernadinha 28º26'29,5"S / 49º53'16,5"W
SC / 69 Rio I 28º22'49,9"S / 49º55'12,2"W
SC / 70 Tangará Rio Bonito 27º06'55,5"S / 51º13'04,6"W SC / 71 Tunápolis Rio Peperí 26°56'35,5''S / 53°40'18,4''W SC / 72 Urubicí Arroio do Funil, Cascata do
Avencal 28º03'00,7"S / 49º37'02,3"W AM – Amazonas, AP – Amapá, BA – Bahia, CE – Ceará, ES – Espírito Santo, GO – Goiás, MA - Maranhão, MT – Mato Grosso, PA - Pará, PI – Piauí, PR - Paraná, RS – Rio Grande do Sul, SC – Santa Catarina; RPPN - Reserva Particular do Patrimônio Natural; FLONA – Floresta Nacional; REBIO – Reserva Biológica.
3.2. Morfologia
3.2.1. Procedimentos para análise da genitália e identificação
Para observar estruturas internas e externas da genitália masculina de adultos de Smicridea, a mesma foi destacada do abdome, dissecada e colocada em tubos de vidro em ácido lático 85%, aquecidos a 125°C em banho-maria por 30 a 40 minutos. Posteriormente a genitália foi retirada e transferida para água destilada, e neutralizada em ácido acético 50% (Blahnik et al. 2007). Após a remoção do ácido lático, a genitália foi transferida para lâminas escavadas com uma mistura de glicerina e álcool gel (± 60/40%), coberta com lamínula, para serem observadas e examinadas em microscópio óptico.
Morfologicamente, os adultos machos foram identificados em nível de espécie através de bibliografia especializada contendo descrições e redescrições originais, além de chaves de identificação, quando disponíveis (e.g., Flint 1974a, 1974b; 1978, 1981, 1989, 1991; Blahnik 1995; Almeida e Flint 2002). Com relação à identidade das larvas em nível específico, estas foram primeiramente classificadas em morfoespécies com base em caracteres morfológicos extraídos das poucas descrições existentes (e.g., Flint 1964, 1968a, 1968b, 1974a; Paprocki et al.2003; Sganga e Fontanarrosa 2006; Pes et al. 2008; Albino et al. 2011; Rueda-Martín e Sganga 2011).
3.2.2. Ilustrações e confecção de mapas de distribuição
As ilustrações de larvas e pupas são fotografias obtidas através de estereomicroscópio Leica M165C com objetiva Planapo 1.0x e câmera de vídeo DFC420 acoplada, utilizando uma cúpula de iluminação LED para reduzir reflexos de luz sobre os espécimes (Kawada e Buffington 2016). Para genitália masculina de adultos as fotografias foram adquiridas através de microscópio óptico Olympus BX51 com câmera de vídeo Olympus DP72 acoplada. Após obtenção das fotografias, uma série de imagens digitais com diferentes distâncias focais foram produzidas de uma mesma estrutura de um espécime (larva ou adulto), em seguida foram combinadas automaticamente em uma única imagem com maior profundidade de campo usando os softwares Leica LAS Microsystems (Leica Application Suite V3.8.0) por Leica (Switzerland) Limited ou Zerene Stacker (V1.04) por Zerene Systems. Fotografias da genitália masculina foram vetorizadas no Adobe Illustrator CS6. Ao final, as ilustrações foram editadas e organizadas em pranchas para cada espécie no Adobe Photoshop CS6 ambos com versão Trial.
Os mapas de distribuição geográfica foram confeccionados no software Diva-Gis (V5.2.0) (Hijmans et al. 2004). Coordenadas geográficas dos pontos de coleta das espécies foram convertidas em graus/decimais. Na ausência de coordenadas exatas do ponto de coleta da espécie, coordenadas aproximadas foram extraídas do banco de dados no website SpeciesLink (http://splink.cria.org.br/) através da ferramenta geoLoc.
3.2.3. Terminologia morfológica
A terminologia morfológica utilizada na descrição das larvas de Smicridea segue as de Pes et al. (2008) e Albino et al. (2011), com adaptações e adição de novos caracteres. Adotou-se a nomenclatura do sistema de quetotaxia das cerdas primárias de Williams e Wiggins (1981) e secundárias de Schefter e Wiggins (1986). Terminologia da genitália masculina segue as de Blahnik (1995) e Holzenthal e Blahnik (1995), com algumas adaptações.
3.2.4. Descrições e chave de identificação
Descrições padronizadas das espécies foram geradas utilizando o software livre DELTA [DEscriptive Language for TAxonomy] (Dallwitz et al. 1999). Utilizando o Delta Editor [V1.02], uma matriz de caracteres para larva e adultos machos foi criada em que estados de caráter para cada espécie foram codificados. Essa matriz foi traduzida em descrições de linguagem natural através dos comandos da função “Action Sets”: “layout for natural language descriptions”, para editar opções de pontuações, vincular caracteres em frases e definir parágrafos e, “translate into natural language – RTF, single file for all taxa”, que ao ser executado gerou um arquivo de descrições no formato Microsoft Word RTF (Rich Text Format).
A chave de identificação taxonômica para larvas de último instar associadas com adultos das espécies de Smicridea ocorrentes no Brasil é do tipo dicotômica com ilustrações dos caracteres tratados. Foi elaborada com base em caracteres diagnósticos selecionados da matriz criada no Delta para descrição.
Para cada espécie, também foram fornecidas lista sinonímica, diagnose comparativa, distribuição geográfica conhecida, aspectos biológicos e comentários, material examinado e ilustrações organizadas em pranchas. Para verificar a atual distribuição geográfica de cada espécie foi consultado o website “Fauna do Brasil” (Pes e Santos 2016), constantemente atualizado. Listas de material examinado foram feitas usando AUTOMATEX macro (Brown 2013).
3.2.5. Morfologia geral de Smicridea
Esquemas sumarizados das principais estruturas utilizadas para descrições padronizadas de larvas, pupas, adultos machos e chave de identificação das espécies de Smicridea são apresentados nas Figuras 2 - 5.
Figura 3. Morfologia geral das principais estruturas da cabeça e peças bucais da larva de último estádio de
Smicridea. A – Cabeça, vista dorsal; B – Cabeça, vista lateral; C – Cabeça, vista ventral; D - Mandíbulas, vista
Figura 4. Morfologia geral das principais estruturas do adulto macho de Smicridea. A – Asa anterior; B – Asa posterior; C – Segmentos abdominais V - IX, vista dorsal, mostrando sacos glandulares internos; D - Hábito, vista lateral, espécime a seco.
Figura 5. Morfologia geral das principais estruturas da genitália masculina do adulto de Smicridea. A – Vista lateral; B – Vista dorsal; C – Falo, vista lateral; D – Ápice do falo, vista dorsal.
3.3. Técnicas moleculares 3.2.1. Extração de DNA
Para cada espécie ou morfótipo de Smicridea foram selecionados três espécimes, quando disponível, perfazendo um total de 205 espécimes selecionados para extração de DNA. Os espécimes utilizados são provenientes de coletas a partir do ano de 2009 e que estavam preservados em álcool absoluto PA, conservadas em freezer -20ºC. Para alguns espécimes, no estágio larval ou adulto, o DNA foi extraído através do método destrutivo em que as pernas do lado esquerdo com musculatura torácica associada foram maceradas com auxílio de pistilos plásticos, utilizando o kit de extração DNeasy® blood & tissue e seguindo protocolo recomendado pelo fabricante.
Entretanto, para a maioria dos espécimes foi utilizado o tórax e abdômen para larvas e, quando se tratava de adultos, o abdômen contendo a genitália. Nestes casos, foi utilizado o protocolo do kit de extração ampliando de 3 para 48 horas o período de temperatura de incubação para lise tecidual, aumentando sua eficiência e evitando a maceração do material biológico, também, a incubação da coluna com o tampão de eluição (AE) em banho-maria a 70º C por 8 minutos, a fim de facilitar a passagem do DNA pela membrana da coluna. Desta forma, por se tratar de uma técnica não destrutiva, o material utilizado na extração juntamente com o restante do espécime foi preservado em álcool absoluto em frascos individuais com um número de acesso único para estudo morfológico e material testemunho. O DNA extraído foi armazenado em freezer a -20°C para posterior utilização nas Reações em Cadeia da Polimerase.
3.3.2. Amplificação
A amplificação do fragmento do gene COI foi feita via reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores (primers): HCO2198 [5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′]; LCO1490 [5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′] (Folmer et al. 1994).
As reações de PCR foram realizadas com volume total de 25 µl, consistindo de 2,5 μl de tampão Colorless GoTaq® 5X PROMEGA© (100 mM), 3,5 μl de MgCl2 PROMEGA© (25 mM), 2,5 μl de dNTP Promega© (2,5 mM de cada base), 1,2 μl de cada iniciador, direto e reverso, Síntese Biotecnologia (20 µM), 0,3 μl de GoTaq® DNA polimerase PROMEGA (5 U/μl), 3 μl do DNA extraído e 11,3 μl de ddH2O. Amostras que a amplificação não foi
satisfatória a PCR foram feitas com 4 μl de DNA. As reações foram realizadas em termocicladores automáticos Swift Maxi Thermal Cycler (ESCO) e TC-512 (Techine) no Laboratório de Bioprospecção de Bioativos de Insetos do INPA, utilizando as condições detalhadas na Tabela 3.
Para confirmar a amplificação do fragmento do gene COI foram utilizados 2 μl produto de cada PCR, misturados com 3 μl de GelRedTM Uniscience+tampão de carregamento (1:2) e submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1%. Cada eletroforese foi realizada em cuba contendo gel de agarose submergido em tampão TBE 0,5X, por cerca de 40 minutos com uma carga de 70 V. Os produtos amplificados foram visualizados através de fotodocumentador com luz ultravioleta (UV). Para estimar o tamanho do fragmento amplificado foi utilizado o marcador molecular ΦX174 DNA/BsuRI (Fermentas).
3.3.3. Purificação e sequenciamento
Os produtos de PCR com bandas positivas e tamanho adequados (Figura 6) foram selecionados para purificação para e remover excesso de nucleotídeos e primers. A purificação foi realizada utilizando as enzimas EXO I [Exonuclease I] (Thermo Scientific™) e FastAP [Fosfatase Alcalina Termosensível] (Thermo Scientific™) ou pelo Kit de Purificação Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Em ambos os métodos foram seguidas as recomendações dos fabricantes. A concentração dos produtos purificados foi estimada por comparação com marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen). Neste caso a eletroforese foi feita em gel de agarose a 2% durante 1:30 hora com carga de 60 V.
Tabela 3. Condições utilizadas na reação em cadeia da polimerase (PCR). CONDIÇÃO I
Nº DE CICLOS ETAPA TEMPERATURA TEMPO
1 Desnaturação inicial 94°C 1 min
36
Desnaturação 94°C 1 min
Anelamento 45°C 1,5 min
Extensão 72°C 1,5 min
1 Extensão final 72°C 5 min
CONDIÇÃO II
1 Desnaturação inicial 94°C 1 min
5 Desnaturação 94°C 1 min Anelamento 45,5°C 1,5 min Extensão 72°C 1,5 min 35 Desnaturação 94°C 1 min Anelamento 50°C 1,5 min Extensão 72°C 1 min
1 Extensão final 72°C 5 min
Figura 6. Fotografia gerada por fotodocumentador sob iluminação UV, mostrando gel de agarose com bandas de DNA coradas com GelRed. Primeira fileira de bandas representa solução escada com tamanho dos fragmentos determinados em pares de bases (bp). * Fragmento COI amplificado com tamanho adequado. – Fragmento COI não amplificado.
Os produtos de PCR purificados com concentração estimada igual ou maior que 20 ng foram submetidos a reações de sequenciamento com base no método de Sanger et al. (1977), utilizando o kit BigDye® Terminator v3.1 de acordo com protocolo sugerido por Platt et al. (2007), com modificações. Cada fragmento de DNA foi sequenciado em ambas as direções e as sequências geradas pelo sequenciador automático de DNA ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems) no Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM) do INPA.
Em grande parte do material selecionado não foi obtido sucesso no processo de sequenciamento e consequentemente na obtenção de sequências de DNA, fato que pode atribuído a problemas na extração de DNA e/ou amplificação do fragmento desejado possivelmente devido aos espécimes estarem mal acondicionados (temperaturas elevadas e/ou em álcool bastante diluído como 70 ou 80%) ou serem muito antigos.
3.3.4. Edição e alinhamento das sequências
Com base na análise do eletroferograma das fitas direta e reversa obtidas para cada espécime foi verificada a qualidade das mesmas e a partir do alinhamento par a par das mesmas foi gerada uma sequência consenso usando o software BioEdit versão 7.2.5 (Hall 1999), que foram editadas manualmente para remoção de resíduos não comparáveis. As sequências consenso geradas foram comparadas com aquelas disponíveis no GenBank® (http://ncbi.nlm.nih.gov), através da plataforma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), a fim de confirmar a identidade do fragmento analisado e ausência de contaminação.
Para o alinhamento múltiplo foram utilizadas todas as sequências consensos obtidas além de algumas sequências de espécies de Smicridea e espécies dos gêneros Asmicridea e Smicrophylax baixadas no website do banco de dados do DNA barcode (BOLD) (http://www.boldsystems.org/). O alinhamento foi realizado através do software Clustal W (Larkin et al. 2007) implementado no software MEGA (v. 6.06) (Tamura et al. 2013), usando parâmetros padrão de custos de abertura (15) e extensão de gap (6,66). O alinhamento gerado foi editado para remover trechos não comparáveis das regiões iniciais e finais das sequências. Em seguida, as sequências do gene COI foram traduzidas em aminoácidos para detecção de erros de edição e alinhamento ou amplificação de pseudogenes gerados pela presença de códons de parada no meio da sequência de aminoácidos. Após ser editado e verificado, o alinhamento resultou em um fragmento de 620 bp de 54 espécimes de Smicridea (Tabela 4).
