Teste de citotoxicidade in vitro

Os estudos de segurança são uma etapa importante durante o desenvolvimento de novas formulações. Desde a publicação do conceito dos R’s (redução, refinamento e substituição) em 1959 por Russel & Burch em relação aos experimentos com animais, foram desenvolvidos métodos alternativos à experimentação animal, principalmente voltados a identificação de propriedades tóxicas de produtos químicos (SPIELMANN, 2005). A avaliação de efeitos adversos e desenvolvimento de toxicidade de novos produtos químicos pode ser realizada por métodos in vitro, como uma etapa preliminar aos estudos de segurança toxicológica

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sofrimento, e auxiliando os pesquisadores na tomada de decisão para modificar estruturas químicas antes do seu reteste de toxicidade (MCKIM, 2010). Assim, os ensaios de citotoxicidade in vitro têm sido empregados para elucidar questões relativas aos mecanismos de toxicidade, pois muitos produtos químicos exercem seu efeito tóxico sobre a estrutura e funções dos componentes celulares.

Os ensaios de citotoxicidade in vitro com linhagens celulares estabelecidas são ferramentas úteis para o estudo dos efeitos toxicológicos de produtos químicos. Dentre esses ensaios, o ensaio colorimétrico MTT é um dos métodos mais comumente utilizados no estudo da viabilidade celular após a exposição a substâncias tóxicas (NOGUEIRA et al., 2011). Esse teste de citotoxicidade é um ensaio colorimétrico padrão para mensurar a proliferação celular, que também pode ser utilizado para avaliar a citotoxicidade de fármacos e outros agentes tóxicos. O sal MTT (brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólico) é um reagente de coloração amarela. O ensaio do MTT é baseado na redução desse sal, em células viáveis, para produzir os cristais de formazan, um produto de coloração púrpura. O MTT é reduzido na mitocôndria das células viáveis, através da clivagem da enzima succinato desidrogenase, e a produção do formazan reflete o estado funcional da cadeia respiratória. A quantidade de cristais formados é diretamente proporcional ao número de células viáveis e, portanto, o teste pode ser utilizado para determinar a viabilidade celular com precisão em estudos de citotoxicidade (MOSMANN, 1983; BERRIDGE; TAN, 1993).

Os efeitos adversos fototóxicos de fármacos e cosméticos têm sido alvo de preocupação de pacientes, dermatologistas e indústria farmacêutica. A fotorreação geralmente ocorre em resposta à luz ultravioleta A (UVA) (315-400 nm) e abrange dois fenômenos: fotoirritação (fototoxicidade) e fotoalergia. Reações fototóxicas agudas tem sua intensidade máxima imediatamente após o início da reação e decrescem até 48h e são semelhantes a queimaduras solares, com eritema, infiltração e edema, podendo evoluir para queratose actínica e câncer de pele. Já a fotoalergia é uma reação imunologicamente mediada e clinicamente é similar a dermatite de contato, com eritema, infiltração e erupção cutânea (NEUMANN et al., 2005). Ao nível celular, a radiação UVA causa estresse oxidativo, pois leva a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais exercem efeitos nocivos incluindo oxidação de ácidos nucleicos, proteínas e lipídeos das membranas (ZANATTA et. Al., 2010).

1.2.5.1 Ensaio de fototoxicidade

O teste de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (OECD TG 432) foi o primeiro método validado aprovado pela OECD como alternativa ao uso de animais na avaliação da fototoxicidade. Para avaliação da citotoxicidade, o ensaio utiliza cultura de fibroblastos da linhagem 3T3 e a captação do corante vital vermelho neutro,corante catiônico, que penetra na membrana celular por difusão passiva não iônica e se acumula nos lisossomos. Após 24 h da aplicação do tratamento com a substância química analisada e exposição à radiação, a citotoxicidade é determinada pela redução da captação do corante vital, medida por espectrofotometria. Esse ensaio baseia-se na comparação entre a citotoxicidade de uma substância na presença e ausência de radiação simulando a luz solar.

Avalia-se a fototoxicidade através do cálculo do fator de fotoirritação (PIF, do inglês Photo Irritation Factor), determinado pela relação entre a concentração do produto que inibe a viabilidade celular em 50% (IC50) sem (Irr-) e com (Irr+) exposição a doses não tóxicas de UVA (OECD, 2004):

As substâncias identificadas por esse teste são provavelmente fototóxicas in

vivo, após administração sistêmica e distribuição para a pele, ou após uso tópico. No

caso de não demonstrar potencial fototóxico no teste, as substâncias analisadas estão desobrigadas a realizar futuros ensaios fototóxicos in vivo (OECD, 2004; ZANATTA et al., 2010; LYNCH; WILCOX, 2011; KIM; PARK; LIM, 2015).

1.2.5.2 Determinação do potencial fotossensibilizante

A fotosensibilidade é semelhante a dermatite de contato, sendo ambas reações de hipersensibilidade tardio tipo IV mediadas por células T específicas, que se desenvolvem em duas fases definidas como fase de sensibilização e fase efetora. O primeiro estágio do processo consiste na absorção dos fótons do comprimento de onda apropriado pelas moléculas do fármaco, que atinge o estado excitado e transfere a energia às moléculas de oxigênio, gerando as espécies reativas de

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oxigênio. Após, o hapteno (fármaco fotoquimicamente modificado) se combina com uma proteína carreadora, formado um antígeno completo. Em uma próxima etapa, as células de Langerhans, células dendríticas imaturas residentes na pele, internalizam o antígeno. As células de Langerhans ativadas migram para as áreas corticais dos linfonodos regionais, onde se diferenciam em maduras e apresentam o antígeno aos linfócitos T específicos, através das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade de classe II. Após estímulo apropriado, células T específicas são produzidas com a capacidade de reagir ao antígeno, que na fase efetora, migram para o sítio de inflamação, ativando-se e formando o eczema. Durante a fase de sensibilização, as células de Langerhans se diferenciam e amadurecem, expressando moléculas co-estimulatórias e de adesão, e secretando várias citocinas, incluindo interleucina-1 e interleucina-8 (IL-8) (NEUMANN et. al., 2005; ONOUE et. al., 2008; MITJANS et. al., 2010; MARTÍNEZ et. al., 2013). A IL-8 tem um papel importante na fase efetora, não somente desencadeando o influxo de leucócitos ao sítio da inflamação, mas também aproximando os leucócitos das células dendríticas maduras (MITJANS et. al., 2008).

Considerando o mecanismo da reação de hipersensibilidade, foram desenvolvidos ensaios (MITJANS et. al., 2008; MITJANS et. al., 2010) para a identificação de alergenos utilizando a linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana (THP-1), visto que foi observado que essas células podem responder especificamente aos sensibilizantes, através da expressão de moléculas co- estimulatórias e produção de IL-8.

Martínez e col. (2013) desenvolveram um fotoensaio usando as células THP-1 e a liberação de IL-8 a fim de discriminar fotoirritantes e fotoalergenos. Após 24 h da aplicação do tratamento com os fármacos e exposição a doses de UVA, a viabilidade celular foi medida pelo ensaio do MTT. Clorpromazina foi utilizada como controle positivo, pois é um fármaco fototóxico e fotoalergeno. O estudo propõe o cálculo de índices de estimulação, calculados pela relação entre as liberações de IL- 8 a partir das células irradiadas (I-SI) e não-irradiadas (NI-SI) comparadas com os controles não-tratados. Um índice de estimulação global, obtido pela relação entre os dois índices (I-SI/NI-SI) foi proposto para discriminar os fármacos fotoalergenos dos fármacos fotoirritantes.

1.2.5.3 Ensaios de citotoxicidade em células HepG2

Após a introdução da dronedarona no mercado, dois casos de lesões hepáticas graves foram reportados, inclusive evoluindo para transplante de fígado. Estudos conduzidos por Felser e col. (2013) investigaram o mecanismo associado a hepatotoxicidade celular do fármaco utilizando mitocôndrias de fígado de rato, cultivo primário de hepatócitos humanos e células tumorais de hepatoma humano (HepG2). As investigações demonstraram que a dronedarona comprometeu a função mitocondrial em concentrações entre 10 e 20 µM, e citotoxicidade foi observada a partir de 20 µM. Os autores ressaltam que mesmo que as concentrações plasmáticas do fármaco sejam baixas após administração oral (0,2 µM), o fármaco sofre extenso metabolismo de primeira passagem, que conduz a uma baixa biodisponibilidade (15%) e sugerem que as concentrações hepáticas possam ser mais elevadas. O estudo concluiu que a dronedarona inibe a cadeia transportadora de elétrons e a β-oxidação, bem como desacopla a fosforilação oxidativa nas mitocôndrias hepáticas.

1.3 PROPOSIÇÃO