Desenvolvimento e avaliação do potencial citotóxico de complexos de inclusão dronedarona/ciclodextrinas

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Ana Isa Pedroso Marcolino. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DRONEDARONA/CICLODEXTRINAS. Santa Maria, RS 2017.

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(3) Ana Isa Pedroso Marcolino. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DRONEDARONA/CICLODEXTRINAS. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração I Desenvolvimento e Avaliação de Produtos Farmacêuticos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em Ciências Farmacêuticas.. Orientadora: Prof. Dra. Clarice Madalena Bueno Rolim. Coorientadora: Prof. Dra. Daniele Rubert Nogueira Librelotto. Santa Maria, RS 2017.

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(7) AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, pelas bênçãos recebidas. De modo especial, agradeço: - a minha orientadora Prof. Dra. Clarice Rolim, pelas oportunidades de trabalho e crescimento; - a minha coorientadora Prof. Dra. Daniele Librelotto, cujo auxílio foi fundamental para a realização do trabalho, pela amizade, apoio e incentivo; - a Prof. Dra. Andréa Adams, pelo incentivo e apoio; - aos meus colegas do Laboratório de Pesquisa em Avaliação Biofarmacêutica e Controle de Qualidade (LABCQ) pela amizade, em especial a Ana Christ, Juliana Santos, Karla Ribas, Laís Scheeren, Letícia Macedo, Mariane Friedrich, Matheus Lago, Pauline Biscaino, Priscila Rosa e Suelen Burin; - as queridas IC’s Joana Fernandes, Francieli Bellé e Josiele de Vargas pelo auxílio na execução da parte experimental; - a la Prof. Dra. María Pilar Vinardell por la oportunidad de realizar mi estancia en su laboratório en la Facultad de Farmàcia de la Universitat de Barcelona; - a la Prof. Dra. Montserrat Mitjans por su amistad y por enseñarme la técnica del cultivo celular; - a la Dra. Carmen Morán por su amistad y apoyo y a los compañeros del grupo ITMC Lily Velazquez, Laura Marics, Marc Bilbao Asensio, Gloria Somalo Barranco y Guillem; - a minha querida mãe Jacira Pedroso por seu amor e apoio incondicionais; - a minha família, especialmente a minha tia Leodovina Soares, pelas orações; - as minhas grandes amigas (irmãs) Isabella Trevisan, Laura Portes e Sabrina Borin; - ao CNPq e CAPES pelo auxílio financeiro; - aos professores e funcionários do Departamento de Farmácia Industrial da UFSM por auxiliarem indiretamente o desenvolvimento do trabalho..

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(9) BRANCO. Brancas substâncias minuciosamente medidas, pesadas. Alvos jalecos mãos enluvadas movimentam-se pipetas, provetas termômetros, alcoômetros agitadores magnéticos vidraria, HPLC. Brancas, as aspirações científicas no cotidiano de mentes juvenis perseguidoras incessantes de significativos resultados. Sonhos muito brancos aos céus, elevam-se anjos da Ciência abraçam-nos sempre a postos e dispostos a realizá-los.... Jacira Pedroso.

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(11) RESUMO. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DRONEDARONA/CICLODEXTRINAS AUTORA: Ana Isa Pedroso Marcolino ORIENTADORA: Clarice Madalena Bueno Rolim COORIENTADORA: Daniele Rubert Nogueira Librelotto A dronedarona é um novo agente antiarrítmico análogo à amiodarona. Foi aprovado para a manutenção do ritmo cardíaco normal em pacientes com fibrilação atrial. A dronedarona possui baixa biodisponibilidade e é instável no trato gastrintestinal. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos com uma cavidade central relativamente hidrofóbica e superfície hidrofílica. Por formarem complexos com uma variedade de moléculas orgânicas, as ciclodextrinas têm sido amplamente utilizadas para aumentar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água. No presente estudo, complexos de inclusão de dronedarona com β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-βciclodextrina foram preparados com o objetivo de melhorar a solubilidade aquosa e as propriedades de dissolução da dronedarona. Os complexos de inclusão no estado sólido foram obtidos pela mistura de quantidades de β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina na proporção molar de 1:10 (fármaco:ciclodextrina). Os complexos foram preparados de acordo com os métodos de liofilização, coliofilização e malaxagem seguida de secagem por aspersão. Os estudos de solubilidade foram realizados pelo método do diagrama de solubilidade de fases. Os complexos no estado sólido foram caracterizados por calorimetria exploratória diferencial, difração de raios-X de pó, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier e microscopia eletrônica de varredura. A caracterização dos complexos de inclusão por calorimetria exploratória diferencial e difração de raios-X mostrou que a dronedarona aparenta estar na forma amorfa. A dissolução dos complexos foi estudada e comparada com o fármaco puro. Após a complexação, houve um aumento significativo na porcentagem dissolvida da dronedarona em fluido gástrico simulado. A citotoxicidade dos complexos de inclusão foi avaliada em cultivo de fibroblastos da linhagem 3T3 utilizando o ensaio de redução do MTT (brometo 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico). Os complexos de inclusão com ambas as ciclodextrinas apresentaram uma significativa redução dos efeitos citotóxicos da dronedarona em comparação ao fármaco livre. Com a finalidade de determinar o potencial hepatotóxico da dronedarona livre e dos complexos de inclusão, avaliou-se a citotoxicidade dos compostos em células da linhagem HepG2, células tumorais de hepatoma humano. Nesse ensaio verificou-se um efeito dose-resposta, ou seja, o aumento da concentração dos compostos gerou uma redução da viabilidade celular. Não foi observada diferença significativa entre os valores de concentração inibitória (IC50) do fármaco livre e complexos de inclusão, sugerindo que a complexação do fármaco com ciclodextrinas não aumenta seu efeito hepatotóxico. O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foi utilizado para verificar o potencial fototóxico e o fotoensaio utilizando células THP-1 e IL-8 foi usado para determinar o potencial fotossensibilizante do fármaco e dos complexos de inclusão de dronedarona com β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. O fármaco livre e os complexos de inclusão não apresentaram potencial fotoirritante. No ensaio de fotossensibilização, o complexo com β-CD obtido por malaxagem e secagem por aspersão mostrou potencial fotossensibilizante inferior ao do fármaco livre. Finalmente, as ciclodextrinas foram capazes de formar complexos com a dronedarona e desse modo, proporcionaram melhoria na solubilidade aquosa e estabilidade química do fármaco, além de reduzir seu potencial citotóxico. Assim, os complexos de inclusão demonstram ser uma alternativa promissora no âmbito farmacêutico, visando a obtenção de medicamentos com propriedades terapêuticas potencializadas.. Palavras-chave: Dronedarona. Antiarrítmico. Ciclodextrinas. Complexos de inclusão. Caracterização. Citotoxicidade..

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(13) ABSTRACT. DEVELOPMENT AND EVALUATION OF THE POTENTIAL CYTOTOXICITY OF DRONEDARONE/CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES. AUTHOR: Ana Isa Pedroso Marcolino ADVISER: Clarice Madalena Bueno Rolim CO-ADVISER: Daniele Rubert Nogueira Librelotto Dronedarone is a new antiarrhythmic agent, analogue of amiodarone. Dronedarone was approved for the maintenance of the sinus rhythmic in adult patients with atrial fibrillation. Dronedarone show bioavailability problems due to its very low water solubility, slow dissolution rate and instability in the gastrointestinal tract. Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides with a relatively hydrophobic central cavity and a hydrophilic surface. Because cyclodextrins can form complexes with a variety of organic molecules, they have been widely used to increase the solubility, stability and bioavailability of poorly soluble drugs. In the present study, complexes of dronedarone with β-cyclodextrin (β-CD) and 2hydroxypropyl- β-cyclodextrin (HP-β-CD) were prepared with the aim to increase the aqueous solubility and dissolution properties of dronedarone. Solid inclusion compounds were obtained by mixing appropriate amounts of dronedarone and β-CD or HP-β-CD, in a 1:10 molar ratio. The preparation was carried out according to the lyophilization, co-lyophilization and kneading and spraydrying methods. Solubility studies were performed by phase solubility analysis. The complexes were characterized in the solid state by DSC, XRD, FTIR spectroscopy and SEM. Characterization of inclusion complexes by DSC and XRD showed that dronedarone appeared to exist in a non-crystalline form. The solubility of the complexes were evaluated and compared with pure drug. Dronedarone solubility was notably improved in simulated gastric fluid. The cytotoxicity of the inclusion complexes was evaluated by a simple method based on 3T3 embryonic mouse fibroblast monolayers culture using the reduction of 2,5-diphenyl-3,-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) tetrazolium bromide (MTT) as in vitro viability assay. The inclusion complexes with both cyclodextrins produced a significant reduction in cytotoxic effects compared with the free dronedarone. In order to determine the hepatotoxic potential of the free drug and inclusion complexes, the cytotoxicity was investigated using human hepatoma cell line HepG2. The assay results showed a dose response effect; higher drug concentrations induced a higher reduction in cell viability. No significant difference among the IC50 values of the free drug and inclusion complexes was observed, suggesting that inclusion complexation did not increase dronedarone hepatotoxic effect. The 3T3 Neutral Red Uptake phototoxic test was used to verify the phototoxic potential, while the in vitro photoassay using THP-1 human monocytes, with the interleukin 8 (IL-8) expression as endpoint, was used to determine the photosensitizing potential of free dronedarone and its inclusion complexes with β-CD or HP-β-CD. The free drug and inclusion complexes did not show photoirritant potential. In the photosensitizing assay, inclusion complexes prepared with β-CD by kneading following spray-drying induced lower photosensitization in comparison to free dronedarone. Finally, cyclodextrins were able to form inclusion complexes with dronedarone, and provided an improved solubility and chemical stability, reducing drug cytotoxic potential. Thus, inclusion complexes with cyclodextrins might be a promising alternative in the development of formulations with improved therapeutic efficacy.. Keywords: Dronedarone. Antiarrhythmic drug. Cyclodextrins. Inclusion complexes. Characterization. Cytotoxicity..

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(15) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. APRESENTAÇÃO Figura 1 - Estrutura química da amiodarona ............................................................. 29 Figura 2 - Estrutura química do cloridrato de dronedarona ....................................... 30 Figura 3 - Estrutura química da β-ciclodextrina (a) e representação esquemática da estrutura tronco-cônica (b), respectivamente ....................................................... 36 Figura 4 - Diagrama de solubilidade de fases ........................................................... 40 ARTIGO 1 Figura 1 - Chromatograms of DRO tablet solution (A), reference solution (B) and DRO inclusion complex with HP-β-CD prepared by lyophilization (C) at 20 μg mL -1 showing peak 1 = DRO; peaks 2,3,4 = degraded forms. (a) Nondegraded samples and samples submitted to stress degradation conditions such as: (b) alkaline hydrolysis with 1 M NaOH at 80°C for 0.5 h; (c) acidic hydrolysis with 3 M HCl at 80°C for 7 h and (d) after exposure to UVC light for 1.5 h. (D) UV reference solution spectchart obtained for the robustness assay of DRO in inclusion complex .................................. 64 Figura 2 - Pareto chart obtained for the robustness assay of DRO in inclusion complexhromatogram of DRO reference solution and DRO inclusion complex .................................................................................................... 68 Figura 3 - The full scan MS spectra (a-d) and the respective product ion spectra (e-h) of [M+H]+ of DRO reference substance (a) and degraded samples obtained under: (b) acidic hydrolysis; (c) alkaline hydrolysis and (d) after exposure to UV-C light.. ........................................................................... 70 Figura 4 - Plots of concentration (a) zero-order reaction, natural log of concentration (b) first-order reaction, and reciprocal of concentration (c) second-order reaction, against time, after the hydrolysis of DRO with 1.0 M NaOH at 60°C. ........................................................................................................ 72 Figura 5 - Cytotoxicity of DRO before and after degradation treatments (acidic, basic and photolytic stress conditions) on 3T3 cells as a function of concentration, as determined by MTT viability assay. Concentrations tested (from left to right) of 2.5 μg mL-1 (blank), 1.0 μg mL-1 (striped), 0.5 μg mL-1 (black) and 0.1 μg mL-1 (gray). The data represent the mean of three independent experiments ± SE (error bars). Statistical analyses were performed using ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test. * Statistically different (p < 0.05) and ** highly statistically different (p < 0.005) from non-degraded sample. Tukey’s multiple comparison test were also performed in order to verify if there is any difference on the cytotoxicity between the degradation times. However, no statistically significant differences were observed ....................................................... 73 ARTIGO 2 Figura 1 - Phase solubility diagrams of DRO with β-CD (blue) and HP-β-CD (red) in aqueous solution at (a) 25 °C and (b) 37 °C. ......................................... 100 Figura 2 - DSC curves obtained for DRO (a), β-CD (b), HP-β-CD (c), physical mixture with β-CD (d) and HP-β-CD (e), inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (f) and HP-β-CD (g), by colyophilization with β-CD (h) and HP-β-CD (i) and by kneading following spray-drying with HP-β-CD (j) and β-CD (k) (10 °C.min-1 variations in temperature and in nitrogen atmosphere. .......................................................................................... 105.

(16) Figura 3 - PXRD patterns of DRO (a), β-CD (b), HP-β-CD (c), physical mixture with βCD (d) and HP-β-CD (e), inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (f) and HP-β-CD (g), by colyophilization with β-CD (h) and HPβ-CD (i) and by kneading following spray-drying with HP-β-CD (j) and βCD (k). ................................................................................................... 111 Figura 4 - FT-IR spectra of DRO (a), β-CD (b), HP-β-CD (c), physical mixture with βCD (d) and HP-β-CD (e), inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (f) and HP-β-CD (g), by colyophilization with β-CD (h) and HPβ-CD (i) and by kneading following spray-drying with HP-β-CD (j) and βCD (k). ................................................................................................... 117 Figura 5 - SEM micrographs of DRO (a), β-CD (b), HP-β-CD (c), physical mixtures with β-CD (d) and HP-β-CD (e), inclusion complexes obtained by colyophilization with β-CD (f) and HP-β-CD (g), by lyophilization with β-CD (h) and HP-β-CD (i), and by spray drying with β-CD (j) and HP-β-CD (k). ............................................................................................................... 121 Figura 6 - Dissolution profiles of free DRO and inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (LB) and HP-β-CD (LH), by colyophilization with βCD (RB) and HP-β-CD (RH), and by kneading and spray drying with β-CD (SB) and HP-β- CD (SH) in pH 1.2 (a), 4.5 (b) and 6.8 (c). .................... 124 Figura 7 – Cell viability of free DRO and inclusion complexes with β-CD and HP-βCD obtained through different techniques on 3T3 cells, determined by the MTT assay. Assay concentrations (left to right): 1.25 µg mL-1 (dark gray), 2.5 µg mL-1 (light gray) and 5.0 µg mL-1. Statistical analyses were performed using ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test. * Statistically different (p < 0.05) using the free drug as control. .............. 127 Supplementary figure 1 - PXRD patterns of inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (a), and HP-β-CD (b), by colyophilization with β-CD (c), and HP-β-CD (d) and by kneading following spray-drying with HP-β-CD (e) and β-CD (f) after storage in climate stability chamber for 30 days. ............................................ 137 Supplementary figure 2 - PXRD patterns of inclusion complexes obtained by lyophilization with β-CD (a), and HP-β-CD (b), by colyophilization with β-CD (c), and HP-β-CD (d) and by kneading following spray-drying with HP-β-CD (e) and β-CD (f) after storage into desiccator for 30 days. ................................................................ 138 ARTIGO 3 Figura 1 - Dose response curves of DRO (A) and inclusion complexes prepared by colyophilization with β-CD (B) and HP-β-CD (C), by lyophilization with βCD (D) and HP-β-CD (E) and by kneading following spray-drying with βCD (F) and HP-β-CD (G) in non-irradiated (diamonds) and irradiated (squares) in NIH-3T3 cells. Results are presented as mean ± SE of three independent experiments, and statistical analysis was performed with Dunnett’s multiple comparison test (*p < 0.05). ...................................... 159 Figura 2 – Cytotoxicity rates measure by the MTT assay for non-irradiated (gray) and irradiated (black) conditions. The concentration tested for dronedarone (D) and inclusion complexes (LH, RH, SH, SB, RB, LB) were 2.5 µg/mL (a), 1.25 µg/mL (b) and 0.625 µg/mL (c). ..................................................... 162 Figura 3 – IL-8 release induced by increasing concentrations of free DRO (a), inclusion complexes prepared by colyophilization with β-CD (b) and HP-βCD (c), by lyophilization with β-CD (d) and HP-β-CD (e), and by kneading following spray-drying with β-CD (f) and HP-β-CD (g), and chlorpromazine (h) in non-irradiated (open circles) and irradiated cells (black squares). SI.

(17) calculated for each concentration tested is also shown (black triangles). Results are presented as mean ± S.E.M., and statistical analysis was performed with two-sample t-test. (*p < 0.05; **p < 0.01). ..................... 163 Figura 4 – Effects of DRO and inclusion complexes on IL-8 release. THP-1 cells (irradiated and non-irradiated) were treated with the compounds at a concentration of 1.25 µg/mL for 24 h. IL-8 release was measured by ELISA in culture supernatants, results expressed in pg/mL, representing the mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed with two-sample ttest, with *p< 0.05 versus DRO. ............................................................. 164 Figura 5 –The increases of IL-8 release expressed as stimulation indexes for nonirradiated (NI-SI) and irradiated cells (I-SI). An overall stimulation index (ISI/NI-SI) was calculated as the ratio of the stimulation indexes in irradiated and non-irradiated cells. The concentrations assayed were: chlorpromazine (CPZ) 0.1 µg/mL, DRO 1.25 µg/mL and inclusion complexes (RB, RH, LB, LH, SB and SH) equivalent to 1.25 µg/mL of DRO. .................................................................................................... 164 Figura 6 – Concentration response curve from 24 h-exposure of HepG2 cells to free DRO. Data are expressed as mean ± S.E.M. of three independent experiments performed in triplicate. Statistical analysis was performed using two- sample t-test. *p<0.05 versus control, **p<0.001 versus controle, ***p<0.00001 versus controle, p<0.05 versus 7.50 µg/mL. ... 167 Figura 7 -Cytotoxicity of free DRO and inclusion complexes prepared by colyophilization with β-CD (RB) and HP-β-CD (RH), by lyophilization with β-CD (LB) and HP-β-CD (LH) and by kneading following spray-drying with β-CD (SB) and HP-β-CD (SH) expressed as IC50 values (µg/mL) in HepG2 cells measured by the MTT assay. Data represent the mean ± S.E.M. of three independent experiments. ........................................... 168.

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(19) LISTA DE TABELAS APRESENTAÇÃO Tabela 1 - Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas ...................................... 36 Tabela 2 – Métodos analíticos disponíveis na literatura para determinação de dronedarona .............................................................................................................. 44 ARTIGO 1 Table 1 - Amount of DRO degraded in each stress condition for tablet, reference and inclusion complex solutions. .............................................................. 65 Table 2 - Intra-day and inter-day precision data for the proposed HPLC method .... 66 Table 3 - Recovery studies for the HPLC method ................................................... 67 Table 4 - The robustness testing of the HPLC method for DRO in tablets. ............. 68 ARTIGO 2 Table 1 - Results of DRO intrinsic solubility (S0), maximum solubility (Smax), and solubility efficiency (SE), slope and stability (KC) and complexation efficiency (CE) constants, from phase solubility diagrams at 25°C. ....... 101 Table 2 - Drug content of inclusion complexes of DRO with β-CD and HP-β-CD obtained by the HPLC method and yield of each preparation technique. .............................................................................................................. 103 Table 3 - -Thermal analyses obtained by DSC for dronedarone, β-CD, HP-β-CD, physical mixtures and inclusion complexes prepared by different techniques. ............................................................................................ 109 Table 4 - -Thermal analysis by TGA to β-CD, HP-β-CD and DRO. ...................... 109.

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(21) LISTA DE ABREVIATURAS. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. β-CD. Betaciclodextrina. CD. Ciclodextrina. CLAE. Cromatografia líquida de alta eficiência. CYP. Citocromo P450. DAD. Detector de arranjo de diodos. DMSO. Dimetilsulfóxido. DPR. Desvio padrão relativo. DRO. Dronedarona. DRXP. Difração de raios-X de pó. DSC. Calorimetria exploratória diferencial. EMA. European Medicines Agency. FA. Fibrilação atrial. FDA. U. S. Food and Drug Administration. FBS. Soro fetal bovino. HP-β CD. 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. ICH. International Conference on Harmonisation. IV. Infravermelho. LB. MEV. Complexo de inclusão com β-CD obtido pela técnica de liofilização Complexo de inclusão com HP-β-CD obtido pela técnica de liofilização Microscopia eletrônica de varredura. MTT. Brometo 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico. r. Coeficiente de correlação. RB. Complexo de inclusão com β-CD obtido pela técnica de coliofilização Complexo de inclusão com HP-β-CD obtido pela técnica de coliofilização Complexo de inclusão com β-CD obtido pela técnica de malaxagem seguido de secagem por aspersão Complexo de inclusão com HP-β-CD obtido pela técnica de malaxagem seguido de secagem por aspersão. LH. RH SB SH.

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(23) SUMÁRIO 1 APRESENTAÇÃO ................................................................................................. 24 1.2 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 28 1.3 PROPOSIÇÃO .................................................................................................... 50 2 ARTIGO 1 – CINÉTICA DE DEGRADAÇÃO, ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO POR CLAE INDICATIVO DE ESTABILIDADE PARA CLORIDRATO DE DRONEDARONA EM COMPRIMIDOS E EM COMPLEXOS DE INCLUSÃO COM CICLODEXTRINAS ........................................ 52 3 ARTIGO 2 - PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DE CITOTOXICIDADE DE COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE DRONEDARONA E CICLODEXTRINAS .................................................................................................. 82 4 ARTIGO 3 - AVALIAÇÃO DO POTENCIAL HEPATOTÓXICO, FOTOTÓXICO E FOTOSSENSIBILIZANTE DO CLORIDRATO DE DRONEDARONA E SEUS COMPLEXOS DE INCLUSÃO COM CICLODEXTRINAS ..................................... 140 5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 172 6 CONCLUSÃO .................................................................................................... 180 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 184.

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(25) 1 APRESENTAÇÃO.

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(27) 26. 1 APRESENTAÇÃO. A fibrilação atrial (FA) é a arritmia cardíaca mais comumente encontrada em pacientes idosos. Essa arritmia, resultante de etiologia cardíaca e não cardíaca, é um potente fator de risco para comorbidades como o acidente vascular cerebral, além de estar associada a altos custos para o sistema de saúde (GO; HYLEK; PHILLIPS, 2001; NATTEL, 2002; YALTA et al., 2009). A dronedarona é um novo agente antiarrítmico desenvolvido para o tratamento de pacientes com FA. Em 2009, foi aprovada pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA), pela European Medicines Agency (EMA) e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para reduzir o risco de hospitalização por arritmia nesses pacientes (BRASIL, 2009; EMA, 2012; U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014). Está disponível comercialmente na forma farmacêutica de comprimidos revestidos. A baixa solubilidade em água da dronedarona (0,64 mg/mL), associada ao metabolismo de primeira passagem, conduz a uma biodisponibilidade absoluta prejudicada (aproximadamente 15%), sendo necessária uma elevada quantidade de fármaco (400 mg administrados duas vezes ao dia) para a obtenção do efeito terapêutico adequado (AUSPAR, 2010; EMA, 2012; U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014). Quando um fármaco é administrado no estado sólido, este precisa estar inicialmente dissolvido nos fluidos corporais, a fim de permear as barreiras, como a mucosa do trato gastrintestinal para posteriormente alcançar o sítio de ação e tornarse terapeuticamente efetivo. As partículas do fármaco no estado sólido (na forma cristalina ou amorfa) devem se dissolver de forma apropriada após a administração, a fim de serem transportadas adequadamente até o sítio alvo. Nesse sentido, aumentar a solubilidade aquosa de fármacos pouco solúveis em água, para fármacos nos quais a dissolução é o fator limitante da absorção, pode aumentar a fração de fármaco absorvida (LOFTSSON; MUELLERTZ; SIEPMANN, 2013). Uma estratégia para melhorar a solubilidade de fármacos é a formação de complexos de inclusão. com. ciclodextrinas.. Esse. excipiente funcional tem. sido utilizado. principalmente para solubilizar fármacos pouco solúveis em água, no aumento da sua biodisponibilidade oral e da estabilidade de medicamentos e na redução de seus efeitos colaterais (OLIVEIRA; SANTOS; COELHO, 2009). As ciclodextrinas são.

(28) 27. moléculas que apresentam uma estrutura tronco-cônica, que se caracteriza pela presença de cavidade de natureza apolar. Essa cavidade pode acomodar moléculas no seu interior, sem que haja o estabelecimento de ligações covalentes entre as duas entidades, constituindo essa a principal base de sua utilização farmacêutica (LOFTSSON;. DUCHÊNE,. 2007;. SA. BARRETO;. CUNHA-FILHO,. 2008).. A. betaciclodextrina (β-CD) é a ciclodextrina mais empregada em formulações farmacêuticas devido ao seu baixo custo. Entretanto, sua solubilidade aquosa é limitada e considerando sua toxicidade, foi desenvolvido um derivado hidrofílico, a 2hidroxipropil-betaciclodextrina (HP-β-CD), que pode ser administrada por via intravenosa e atualmente é comercializada em muitos produtos farmacêuticos aprovados pelo FDA (JAMBHEKAR; BREEN, 2016). Nesse sentido, visando o aumento da solubilidade do fármaco, foram desenvolvidos complexos de inclusão de dronedarona com β-CD e HP-β-CD, que foram. caracterizados. através. de. técnicas. físico-químicas.. Além. disso,. a. citotoxicidade in vitro da dronedarona e dos complexos de inclusão em cultura de fibroblastos da linhagem 3T3 foi avaliada por meio do ensaio colorimétrico MTT. Posteriormente, a hepatotoxicidade, o potencial fototóxico e fotossensibilizante da dronedarona livre e dos complexos de inclusão foram investigados utilizando modelos celulares in vitro, a fim de investigar possíveis alterações na citotoxicidade do fármaco em função da complexação com ciclodextrinas..

(29) 28. 1.2 REFERENCIAL TEÓRICO. 1.2.1 Tratamento da fibrilação atrial. A fibrilação atrial (FA) é a perturbação do ritmo cardíaco mais encontrada na prática clínica, sendo responsável por cerca de um terço das hospitalizações devido a distúrbios cardíacos (GO; HYLEK; PHILLIPS, 2001). Essa disfunção é um dos principais determinantes de acidente vascular cerebral e pode reduzir a qualidade de vida e o desempenho cardíaco, além de estar associada com o aumento da mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca (NATTEL, 2002). A FA pode ser definida como “uma taquiarritmia supraventricular caracterizada pela ativação atrial descoordenada com consequente deterioração da função mecânica atrial” (FUSTER et al., 2006). A prevalência da FA aumenta com a idade e altas taxas são encontradas na população idosa. No ano de 2010, o número global estimado de indivíduos com FA foi de 33,5 milhões (20,9 milhões de homens e 12,6 milhões de mulheres). Em relação ao ônus associado a FA, medido como anos de vida perdidos por incapacidade, houve um aumento de 18,8% para os homens e 18,9% para as mulheres entre os anos de 1990 e 2010 (CHUGH et. al., 2014). As projeções para o ano de 2030 estimam que o número de pacientes com FA esteja entre 14-17 milhões, e o número de novos casos por ano seja entre 120.000 a 215.000 na Europa (ZONI-BERISSO et. al., 2014), justificando-se a necessidade de estratégias para a prevenção e tratamento da FA. O maior objetivo terapêutico para os pacientes com FA é a restauração e manutenção do ritmo cardíaco normal. Devido à alta taxa de recorrência da FA, há a necessidade de um tratamento contínuo com antiarrítmicos (SINGH; ALIOT, 2007). Os fármacos antiarrítmicos utilizados no tratamento da FA são geralmente classificados. em. quatro. categorias. baseadas. em. suas. propriedades. eletrofisiológicas: bloqueadores de canais de sódio (classe I), bloqueadores dos receptores beta-adrenérgicos (classe II), bloqueadores de canais de potássio (classe III) e bloqueadores de canais de cálcio (classe IV) (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006). A amiodarona (Figura 1) foi reconhecida primeiramente por prolongar a duração do potencial cardíaco após tratamento contínuo e, assim, foi classificada como agente classe III (VARRÓ et al., 2001). Esse agente antiarrítmico é efetivo no.

(30) 29. tratamento de arritmias ventriculares e supraventriculares e na prevenção de morte por cardiomiopatia não isquêmica. Entretanto, a amiodarona está associada a efeitos adversos significativos como toxicidade pulmonar, hepática, no sistema nervoso periférico, ocular, cutânea e disfunção tireoidiana (SINGH; ALIOT, 2007). Os efeitos deletérios têm sido relacionados à presença do iodo no anel aromático, que torna a molécula mais lipofílica e aumenta a sua distribuição em locais do organismo como a tireoide, pulmões, fígado, córnea, pele e nervos periféricos (LAUGHLIN; KOWEY, 2008). Figura 1 – Estrutura química da amiodarona.. A dronedarona foi desenvolvida como uma alternativa à amiodarona, com atividade. antiarrítmica. semelhante,. porém. com. menor. toxicidade.. No. desenvolvimento da molécula da dronedarona, os átomos de iodo foram eliminados e um grupo metanosulfonil foi adicionado ao grupamento benzofurano. As alterações estruturais reduziram a lipofilicidade da dronedarona e consequentemente, a sua meia-vida (para aproximadamente 24h), além de reduzir a acumulação tecidual. Essas alterações foram realizadas com o intuito de reduzir a toxicidade pulmonar e tireoidiana relacionada com a amiodarona (HOHNLOSER et al., 2009; SUN; SARMA; SINGH, 2002).. 1.2.2 Dronedarona. 1.2.2.1 Características físico-químicas. O cloridrato de dronedarona (SR33589B, Figura 2) é um derivado benzofurano. estruturalmente. relacionado. com. a. amiodarona,. denominado.

(31) 30. quimicamente. cloridrato. de. N-{2-butil-3-[4-(3-dibutil-aminopropóxi). benzoil]. benzofurano-5-il} metanosulfonamida. É um pó fino branco, praticamente insolúvel em água e em alguns pHs fisiológicos e livremente solúvel em cloreto de metileno e metanol. Na literatura, a solubilidade descrita é 0,64 mg/mL em água e 0,01 mg/mL em pH 1,2 e em tampão fosfato pH 7,0 (AusPAR, 2010). A solubilidade em meio fracamente ácido (pH 3-5) é de aproximadamente 1 a 2 mg/mL, sendo, portanto, pHdependente (HAN et al., 2015a). A fórmula empírica é C31H44N2O5S, HCl com massa molecular de 593,2 g/mol (U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014). A dronedarona possui grupo nitrogênio terciário em sua estrutura e seu valor de pKa calculado é 9,4. O valor de log P calculado é 6,36 (XIE et al., 2011). Figura 2 – Estrutura química do cloridrato de dronedarona.. 1.2.2.2 Propriedades eletrofisiológicas da dronedarona e farmacocinética. Em modelos animais, a dronedarona previne a ocorrência de taquicardia e fibrilação ventricular e restaura o ritmo cardíaco normal, devido a seus efeitos eletrofisiológicos semelhantes à amiodarona (VARRÓ et al., 2001; SUN; SARMA; SINGH, 2002; GAUTIER et al., 2003). Esses efeitos se devem as suas propriedades eletrofisiológicas de um agente antiarrítmico de classe III, embora demonstre atividade eletrofisiológica de várias classes (GAUTIER et al., 2003; EMA, 2012). Por ser um bloqueador multicanal, a dronedarona prolonga o potencial de ação cardíaco e os períodos refratários (curto período de tempo em que a célula não pode ser reestimulada) através da inibição das correntes de sódio, potássio e cálcio, incluindo as correntes de potássio regeneradoras rápidas e a corrente de cálcio do tipo L (VARRÓ et al., 2001; SUN; SARMA; SINGH, 2002; GAUTIER et al., 2003; LALEVÉE et al., 2003; WATANABE; KIMURA, 2008)..

(32) 31. A dronedarona é bem absorvida (~70% a 94%) após administração oral dos comprimidos contendo 400 mg quando a administração é concomitante com uma refeição rica em gorduras, que aumenta a absorção de 2 a 3 vezes (PATEL; YAN; KOWEY, 2009). Assim, é afetada significativamente pela ingestão de alimentos. Sua biodisponibilidade absoluta é de 4% sem a presença de alimentos, que aumenta para 15% com uma dieta rica em lipídeos, entretanto esses baixos valores se devem ao efeito de primeira passagem associado ao seu metabolismo pré-sistêmico (BIN JARDAN; GABR; BROCKS, 2014; U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014). Após a administração oral no estado alimentado, as concentrações plasmáticas. máximas. da. dronedarona. e. de. seu. metabólito. ativo. N-. debutildronedarona são alcançadas entre 3 e 6 horas. Após a administração repetida de 400 mg duas vezes ao dia juntamente com a refeição, o estado de equilíbrio é alcançado dentro de 4 a 8 dias de tratamento, com a mediana da Cmax da dronedarona de 84-147 ng/mL. Acima de 80% da dose oral é excretada nas fezes, principalmente na forma de metabólito e menos de 6% é recuperada na urina, também em sua maior parte como metabólito (BIN JARDAN; BROCKS, 2016). A dronedarona possui meia-vida de eliminação terminal de aproximadamente 25 a 30 horas, sendo a do seu metabólito N-debutil de aproximadamente 20 a 25 horas (YALTA et al., 2009; EMA, 2012; U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014; HAN et al., 2015). A dronedarona é um substrato e inibidor moderado do CYP3A4 e um fraco inibidor do CYP2D6 (CHENG, 2010). Estudos de interações medicamentosas demonstraram que a dronedarona afeta a farmacocinética do carvedilol através da inibição da atividade hepática do CYP2D6 (KIM; BAEK, 2018). A dronedarona tem o potencial para inibir o sistema de efluxo da glicoproteína-P (P-gP), aumentando a exposição a substratos da P-gP como a digoxina, quando da administração concomitante (HOY; KEAM, 2009). O perfil farmacocinético da dronedarona após administração oral e intraperitoneal em ratos e o efeito da hiperlipidemia foram estudados por Bin Jardan e Brocks (2016). Os resultados do estudo demonstraram um alto volume de distribuição no rato e alta ligação às proteínas plasmáticas, tanto no plasma normolipidêmico. como. no. hiperlipidêmico.. O. fármaco. apresentou. baixa. biodisponibilidade (<20%) após ambas as vias de administração. As elevadas concentrações plasmáticas após a administração oral a ratos hiperlipidêmicos foi.

(33) 32. atribuída a um efeito direto nas enzimas metabolizadoras ou nas proteínas de transporte. A dronedarona foi aprovada em 2009 pelo FDA (PAGE; HAMAD; KIRKPATRICK, 2009; U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014), indicada para reduzir o risco de hospitalização relacionada à FA, em pacientes com ritmo cardíaco normal e com histórico de FA paroxística ou permanente. De acordo com a European Medicines Agency, é indicada para manutenção do ritmo cardíaco normal após cardioversão elétrica em pacientes adultos clinicamente estáveis com presença atual de FA não permanente (EMA, 2012). Em relação aos seus efeitos adversos relatados na literatura, destaca-se a hepatotoxicidade (U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014) e reação de fotossensibilidade após a administração do fármaco (KUO; MENON; KUNDU, 2014).. 1.2.2.3 Forma farmacêutica comercial. O fármaco está disponível comercialmente na União Europeia e em alguns países como Estados Unidos, Canadá, Austrália, Índia e Cingapura na forma farmacêutica de comprimidos revestidos contendo 400 mg de dronedarona (na forma de cloridrato) (Multaq®, Sanofi, França). Os excipientes declarados são: - Núcleo dos comprimidos: hidroxipropilmetilcelulose, amido de milho, crospovidona, poloxâmero 407, lactose mono-hidratada, sílica coloidal anidra, estearato de magnésio. -. Revestimento/polimento. dos. comprimidos:. hidroxipropilmetilcelulose,. polietilenoglicol 6000, dióxido de titânio, cera de carnaúba (U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2014). Em relação ao revestimento dos comprimidos, a hidroxipropilmetilcelulose é um polímero formador de filme de caráter hidrofílico, que por possuir a capacidade de intumescimento/relaxamento, pode ser utilizado para controlar a liberação de fármacos a partir da matriz em sistemas de liberação modificada (ROLIM et al., 2009). A cera de carnaúba é um agente de revestimento utilizado isolado ou em conjunto com outros excipientes como a hidroxipropilmetilcelulose, para produzir formas farmacêuticas sólidas de liberação controlada (ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006). O polietilenoglicol pode ser empregado como plastificante, para melhorar a qualidade dos filmes de revestimento (ROLIM et al., 2009). Além disso, o.

(34) 33. polietilenoglicol pode melhorar a solubilidade aquosa e conferir permeabilidade ao filme, para garantir a penetração pelos fluidos biológicos, melhorando assim a dissolução de compostos pouco solúveis em água (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007). O fabricante original desenvolveu uma formulação baseada em uma dispersão sólida contendo o agente solubilizante poloxâmero 407, com a finalidade de. aumentar. a. dissolução. no. trato. gastrintestinal. e,. assim,. aumentar. significativamente a sua biodisponibilidade no estado de jejum. O fabricante afirma que o aumento da biodisponibilidade da dronedarona causado pelo poloxâmero na formulação é devido ao aumento da solubilidade. Entretanto, dados da literatura sugerem que o poloxâmero possui ação inibitória da P-gP, que pode ser um fator contribuinte (EMA, 2012). Nesta dispersão sólida preparada pelo método do solvente, o fármaco pode estar disperso molecularmente no carreador hidrofílico, formando uma estrutura amorfa. Assim, a formulação apresenta uma maior superfície, que aumenta a velocidade de dissolução da molécula pouco solúvel em água (HAN et al., 2015a).. 1.2.2.4 Sistemas de liberação contendo dronedarona. Veena e col. (2013) prepararam péletes microporosos carregados com dronedarona formados por mistura (blenda) de celulose microcristalina com cloreto de sódio, através da técnica de extrusão/ esferonização. Os péletes foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura, que confirmou sua morfologia porosa. A análise da formulação por espectroscopia no infravermelho revelou a presença de bandas características da dronedarona no espectro, e a análise por calorimetria exploratória diferencial indicou ponto de fusão próximo ao ponto de fusão do fármaco puro, sugerindo a ausência de interação entre o fármaco e o polímero. Estudos de liberação foram realizados em meios ácido (pH 1,2) e alcalino (pH 7,4), demonstrando que o aumento da concentração de polímero nos péletes reduziu a liberação do fármaco, devido a hidrofobicidade do polímero. Ressalta-se que não houve liberação significativa do fármaco em pH gástrico. Já em pH alcalino, a liberação do fármaco a partir dos péletes variou entre 73 a 92%, que pode ser associada a diferente concentração de polímero empregada nas formulações avaliadas..

(35) 34. Com a finalidade de aumentar a velocidade de dissolução do fármaco, Han e col. (HAN et al., 2015a, 2015b) desenvolveram uma dispersão sólida preparada por extrusão por fusão com um solubilizante polimérico (Soluplus®). As dispersões sólidas foram caracterizadas quanto ao teor de fármaco e caracterizadas por difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura. Os difratogramas mostraram uma amorfização do fármaco nas dispersões sólidas, em comparação com a mistura física fármaco-polímero e as micrografias demonstraram que o fármaco estava incorporado ao carreador polimérico. Além disso, foram preparados comprimidos com as dispersões sólidas, que juntamente com as últimas e com o fármaco puro, foram submetidos ao teste de dissolução na faixa de pH de 1,2 a 6,8. A quantidade cumulativa de fármaco liberada em 120 min a partir das dispersões sólidas foi de aproximadamente 80% em todos os meios testados, e foi superior ao fármaco livre nos meios com pH 1,2 e 6,8 (HAN, 2015a). Os mesmos autores também. desenvolveram. um. sistema. de. liberação. de. fármacos. auto-. microemulsificante, a fim de reduzir a interação medicamento-alimento (food effect). A formulação lipídica consistiu em dronedarona base (não na forma de cloridrato) dissolvida em um pré-concentrado, com o solubilizante Labrafil M 1944CS (oleil-6 glicerídeo de polietilenoglicol) e Kolliphor EL (óleo de rícino polietoxilado). A formulação foi comparada ao produto comercial (Multaq®) quanto ao perfil de dissolução e ao perfil farmacocinético após administração oral em cães da raça beagle. A taxa de dissolução do fármaco a partir da formulação foi significativamente maior, em torno de 80% de liberação em 60 min, em relação ao produto comercial, principalmente nos pHs 1,2 e 6,8. No perfil farmacocinético, a interação fármacoalimento foi menor no grupo da formulação, entretanto não houve diferença significativa nas concentrações do estado alimentado. Já no estado de jejum, a área sob a curva e concentração máxima foram em torno de três vezes maiores para a formulação em comparação aos comprimidos comerciais (HAN, 2015b). Nanopartículas contendo cloridrato de dronedarona foram preparadas pela técnica da precipitação com anti-solvente, utilizando goma de Caesalpinia pulcherrima como estabilizante (YEOLE et al., 2016). A morfologia das nanopartículas foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura, que mostrou agregados de nanopartículas na forma esférica, com tamanho entre 300 e 600 nm. O espectro no infravermelho (FT-IR) das nanopartículas demonstrou ser idêntico ao espectro do fármaco livre, sugerindo que não houve alteração da estrutura química do fármaco.

(36) 35. após o processo de precipitação. As nanopartículas também foram examinadas por calorimetria exploratória diferencial e o ponto de fusão detectado foi inferior (141,55°C) ao ponto de fusão do fármaco puro (146,55°C). Os autores afirmam que a diferença se deve a redução do tamanho de partícula do fármaco para a escala nanométrica e redução da cristalinidade devido ao rápido processo de nucleação, resultando em um cristal imperfeito. As análises por difração de raios-X indicaram que o fármaco presente nas nanopartículas se encontra no estado cristalino, com uma leve redução da cristalinidade, evidenciada pela redução na intensidade dos picos característicos da dronedarona. A solubilidade das nanopartículas em pH 4,5 foi ligeiramente superior ao fármaco puro, possivelmente devido a redução do tamanho de partícula. O mesmo efeito foi evidenciado nos estudos de dissolução em tampão fosfato pH 4,5, com aumento na velocidade de dissolução, favorecida também pelo aumento da área superficial, pela presença do agente estabilizante hidrofílico nas nanopartículas e pela redução da cristalinidade do fármaco.. 1.2.3 Ciclodextrinas e complexos de inclusão. 1.2.3.1 Ciclodextrinas. As ciclodextrinas (CD) são oligossacarídeos cíclicos, constituídos por um número variável de unidades de D-glicose, obtidas a partir da degradação enzimática do amido pela enzima ciclodextrina-α-glicosil-transferase (CGtase). As ciclodextrinas naturais mais comuns apresentam seis, sete ou oito unidades de Dglicopiranose unidas por ligações α (1,4) e são denominadas α-, β-, γ-ciclodextrinas, respectivamente (SA BARRETO; CUNHA-FILHO, 2008). A estrutura molecular das ciclodextrinas apresenta a forma tronco-cônica com propriedades únicas (Figura 3). Essa forma é devido à ausência de livre rotação das ligações glicosídicas e da conformação em cadeira das moléculas de glicose. Nessa conformação, todos os grupos hidrofílicos estão orientados para o exterior da molécula, conferindo-lhe um caráter hidrofílico e promovendo a sua solubilização em meio aquoso. A cavidade apresenta natureza hidrofóbica devido à formação de dois anéis de grupos C-H e de um anel composto por átomos de oxigênio incluídos nas ligações glicosídicas (JAMBHEKAR, BREEN, 2016)..

(37) 36. Figura 3 – Estrutura química da β-ciclodextrina (a) e representação esquemática da estrutura tronco-cônica (b), respectivamente.. Fonte: (JAMBHEKAR, BREEN, 2016).. A β-CD é a ciclodextrina mais empregada em formulações farmacêuticas. Isso se deve a sua fácil produção e consequentemente baixo custo, seu preço médio é de aproximadamente 5 dólares/kg. Entretanto, sua solubilidade aquosa é limitada,e por isso é inadequada para administração parenteral. Essa limitação impulsionou o desenvolvimento de derivados da β-CD, através da substituição das múltiplas hidroxilas da β-CD em ambos os anéis da molécula. A 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD) é um derivado da β-CD e pertence ao grupo das ciclodextrinas hidroxialquiladas. É obtida por condensação do óxido de propileno com a βciclodextrina. A solubilidade aquosa dos derivados é superior a solubilidade das ciclodextrinas naturais (Tabela 1), pois as últimas se apresentam no estado cristalino, caracterizado por fortes ligações de hidrogênio entre as moléculas, enquanto que os derivados apresentam uma redução da cristalinidade (a ligação de cadeias orgânicas causa a quebra das ligações de hidrogênio intermoleculares (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007; KURKOV, LOFTSSON, 2013). Tabela 1 – Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas. Propriedade Massa molecular (g/mol) Solubilidade em água (mg/ mL) 25°C Faixa de fusão (°C) pKa a 25°C a. β-CD 1135 18,5 255-265 12,2. HP-β-CD 1400a >600 -. Valor informado pelo fornecedor ou calculado de acordo com o grau de substituição. Fonte:(MURA, 2014; JAMBHEKAR; BREEN, 2016; IACOVINO et. al., 2017)..

(38) 37. Dentre os excipientes farmacêuticos, as CD tem um perfil toxicológico mais favorável em relação a surfactantes, polímeros solúveis em água e solventes orgânicos. Devido a sua origem, a partir de degradação enzimática do amido, e sua característica hidrofílica, considerando o elevado número de hidrogênios doadores e receptores, sua biodisponibilidade oral é muito baixa (abaixo de 4%) e, portanto atua como um carreador. Após administração oral, as CDs são muito pouco absorvidas na circulação sistêmica e são metabolizadas pelo trato gastrintestinal principalmente por digestão bacteriana, formando oligossacarídeos, monossacarídeos e gases como hidrogênio, dióxido de carbono e metano. Os derivados das CDs, como a HPβ-CD, possuem um perfil toxicológico melhorado em relação as CDs naturais de origem e por isso têm sido amplamente utilizados em formulações injetáveis. Após administração parenteral, as ciclodextrinas hidrofílicas são excretadas inalteradas por via renal com depuração plasmática total próxima a taxa de filtração glomerular (LOTFSSON; BREWSTER, 2012; LOFTSSON et. al., 2016). As ciclodextrinas são utilizadas em inúmeras áreas, incluindo a indústria farmacêutica e cosmética, agroquímica, alimentar, entre outras. O uso de ciclodextrinas em formulações farmacêuticas deve-se, sobretudo, às suas propriedades de complexação, permitindo aumentar a solubilidade aquosa de fármacos lipofílicos, sua estabilidade e biodisponibilidade, quando a solubilidade e a dissolução são fatores limitantes na liberação do fármaco. Ciclodextrinas amorfas como a HP-β-CD são úteis para a inibição da transição polimórfica e taxa de cristalização de fármacos pouco solúveis em água durante o armazenamento, que pode consequentemente manter as características de elevada dissolução e biodisponibilidade oral dos fármacos (UEKAMA, 2004; LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Além disso, as ciclodextrinas podem ser utilizadas para mascarar odores e sabor desagradáveis de certos fármacos, na prevenção de interações e incompatibilidades e na conversão de fármacos líquidos em produtos sólidos. O aumento da atividade do fármaco e a redução de seus efeitos colaterais podem ser obtidos através da formação de complexos de inclusão. Esse grupo de excipientes farmacêuticos úteis e seus complexos de inclusão podem ser utilizados na preparação de formas farmacêuticas sólidas, líquidas e semissólidas com aplicação nas vias de administração oral, parenteral, pulmonar, nasal, bucal, sublingual, retal, ocular e dérmica (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007; SA BARRETO; CUNHA-FILHO,.

(39) 38. 2008).. 1.2.3.2 Complexos de inclusão com ciclodextrinas. Os complexos de inclusão são compostos moleculares com a estrutura característica de um aduto, em que um composto (designado como hospedeiro) encerra outro no seu interior (o hóspede). A complexação ocorre quando uma molécula hóspede preenche totalmente ou parcialmente a cavidade interna da ciclodextrina que, devido ao caráter apolar, favorece a formação de complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas. Ligações covalentes não são formadas ou rompidas durante a formação do complexo de inclusão e, em soluções aquosas, os complexos são prontamente dissociados (OLIVEIRA; SANTOS; COELHO, 2009). Em solução aquosa, moléculas livres do fármaco estão em equilíbrio com moléculas ligadas a ciclodextrinas. As características mais importantes dos complexos são sua estequiometria e os valores numéricos de suas constantes de estabilidade (K). Se m moléculas do fármaco (D, “drug”) se associam a n moléculas de ciclodextrina (CD) para formar um complexo (Dm / CDn), então o seguinte equilíbrio é alcançado (LOFTSSON; MÁSSON; BREWSTER, 2004):. (1). O tipo de complexo de inclusão mais comum é o que possui estequiometria 1:1 (fármaco: ciclodextrina), no qual uma molécula do fármaco (D, do inglês drug) forma um complexo com uma molécula de ciclodextrina (CD) (LOFTSSON; HREINSDÓTTIR; MÁSSON, 2005): (2). Ressalta-se também que, para fármacos ionizáveis, a constante de estabilidade é muito maior para a forma não ionizada em relação à forma ionizada Portanto, pode-se melhorar a solubilização de fármacos ionizáveis em ciclodextrinas através da modificação do pH (LOFTSSON; HREINSDÓTTIR; MÁSSON, 2007; LOFTSSON; BREWSTER, 2012). A complexação também pode ser melhorada através da formação de complexos ternários entre a molécula do fármaco,.

(40) 39. ciclodextrina e um terceiro componente. A adição de pequenas quantidades de polímeros solúveis em água ao meio de complexação, seguido de aquecimento em autoclave, pode aumentar significativamente a constante de estabilidade do complexo fármaco-ciclodextrina (MIRANDA et. al., 2011). O resultado final é uma alteração das propriedades físico-químicas da molécula-hóspede, incluindo sua solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade. A molécula da ciclodextrina pode proteger o fármaco do ataque de várias moléculas reativas, reduzindo assim a hidrólise, oxidação, rearranjo estérico, racemização e degradação enzimática dos fármacos (POPIELEC; LOFTSSON, 2017). Existem vários métodos para o preparo de complexos de inclusão, como a liofilização, pasta, mistura física, co-precipitação, atomização e fluidização supercrítica. Dentre esses métodos, destaca-se a atomização, devido à maior complexação das moléculas e menor tempo de preparo (DA CUNHA FILHO; SÁBARRETO, 2007; IACOVINO et.al, 2017).. 1.2.4 Caracterização do complexo de inclusão. Para avaliar a formação de complexos de inclusão com ciclodextrinas são utilizadas técnicas físico-químicas que, em conjunto, provam a existência dessa nova entidade: o complexo de inclusão fármaco-ciclodextrina.. 1.2.4.1 Diagrama de solubilidade de fases. O diagrama de solubilidade de fases, desenvolvido por Higuchi e Connors (1965), baseia-se na medição do efeito da complexação na solubilidade do substrato e permite fazer inferências sobre a estequiometria de inclusão e estimar uma constante relacionada com o grau de estabilidade do complexo formado. O método “shake-flask”. é. amplamente. utilizado. para. determinação. da. solubilidade. termodinâmica. Para a preparação da amostra, um excesso de fármaco é adicionado ao meio de solubilidade, suficiente para produzir uma solução saturada em equilíbrio com a fase sólida. O tempo para que o equilíbrio (entre o fármaco em solução e o excesso de sólido) seja atingido depende da taxa de dissolução e o tipo de agitação utilizada, por isso recomenda-se que um perfil de dissolução seja realizado. Para a separação das fases das soluções saturadas, os dois métodos.

(41) 40. mais utilizados são a filtração e a centrifugação. Em seguida, a concentração de fármaco é determinada por método analítico adequado. Os valores obtidos correspondem a solubilidade intrínseca do substrato (So) mais a quantidade do fármaco dissolvida no complexo de inclusão, que é a solubilidade aparente (JOUYBAN, 2010, p. 3). O diagrama de solubilidade de fases é um gráfico (Figura 4) onde é representada a solubilidade aparente do substrato em função da concentração da molécula hospedeira, ou seja, é plotada uma curva da solubilidade do fármaco (eixo y) versus a concentração de ciclodextrina (eixo x) (LOFTSSON; MÁSSON; BREWSTER, 2004). Figura 4 – Diagrama de solubilidade de fases.. Fonte: (DA CUNHA FILHO; SÁ-BARRETO, 2007).. Nos perfis classificados como tipo A, a solubilidade aparente do fármaco aumenta em função da concentração de CD e três perfis são possíveis: AL, AP e AN. No perfil AL, há um aumento linear da solubilidade com o aumento na concentração de CD, ou seja, o complexo é de primeira ordem em relação a CD. O perfil A P corresponde a um desvio positivo da linearidade, sendo o complexo de primeira ordem em relação ao fármaco, mas de segunda ordem em relação a CD e, assim, a ciclodextrina seria mais efetiva em concentrações elevadas. O perfil do tipo AN corresponde a um desvio negativo, e sua interpretação é mais complexa devido a interações entre soluto-soluto e soluto-solvente que podem ocorrer. Já nos perfis do.

(42) 41. tipo B, há a formação de complexos com solubilidade aquosa limitada. No diagrama do tipo BS, há inicialmente a formação de um complexo solúvel, com aumento da solubilidade do substrato. Entretanto, a seguir, a solubilidade máxima é atingida e a adição de mais CD forma um platô e, quando todo o substrato foi consumido, a adição de CD forma um complexo insolúvel que precipita. No perfil do tipo BI, o complexo é tão insolúvel que não há aumento na solubilidade aparente do substrato (BREWSTER; LOFTSSON, 2007; DA CUNHA FILHO; SÁ-BARRETO, 2007). No caso de perfil do tipo AL e assumindo-se que a estequiometria é do tipo 1:1, o diagrama também permite a obtenção da constante de estabilidade (Kc), calculada a partir da inclinação da isoterma e da concentração intrínseca do substrato (So), dada pela equação 3 (LOFTSSON; HREINSDÓTTIR; MÁSSON, 2005; BREWSTER; LOFTSSON, 2007; LYRA et al., 2010):. 11. inclinação So. (1 - inclinação). ( ). Um método mais preciso para avaliar os efeitos das ciclodextrinas na solubilização de fármacos, é determinar sua eficiência de complexação (EC). Para complexos com estequiometria 1:1, a eficiência de complexação pode ser calculada a partir da inclinação do diagrama de solubilidade de fases (Equação 4) (LOFTSSON; HREINSDÓTTIR; MÁSSON, 2007):. EC. So. 11. D CD. inclinação. CD. 1 - inclinação. (4). O valor de EC pode ser utilizado para calcular a razão molar fármaco: ciclodextrina (D:CD), que pode ser correlacionada com o aumento esperado na quantidade de formulação:. D CD. 1. 1. 1 EC. ( ). A equação 6 mostra a correlação entre o aumento no volume de formulação e as massas moleculares (MW, do inglês molecular weight) da ciclodextrina (MW CD) e do fármaco (MW Drug), e o valor de EC (LOFTSSON; HREINSDÓTTIR; MÁSSON, 2007):.

(43) 42. Aumento no volume de formulação. M CD M Drug. 1. 1 EC. (6). As massas moleculares da CDs estão descritas na Tabela 1. Para encontrar o novo “volume” de formulação, multiplica-se o resultado encontrado na equação 6 pela dose do fármaco.. 1.2.4.2 Análise térmica. Os estudos de análise térmica, utilizando as técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC, do inglês Differential Scanning Calorimetry) e termogravimetria (TG), permitem identificar mudanças na estabilidade térmica do fármaco, podendo ser um indicativo da formação de um complexo de inclusão (GIODARNO; NOVAK; MOYANO, 2001). A técnica de DSC é a ferramenta analítica mais utilizada para avaliar as interações entre fármaco e ciclodextrinas no estado sólido. A comparação entre as curvas de DSC dos componentes individuais, sua mistura física e os complexos de inclusão pode fornecer indicações em relação a modificações no estado sólido e interações entre os componentes como consequência dos métodos usados na preparação dos complexos e comprovar a real formação dos mesmos (MURA, 2015).. 1.2.4.3 Difração de raios-X de pó (DRXP). O emprego da técnica de difração por raios-X baseia-se na comparação dos difratogramas das substâncias puras e do complexo formado. A difração de raios-X de pó é a técnica cristalográfica mais empregada, devido a sua simplicidade e é considerada uma das melhores técnicas para a caracterização de complexos de inclusão. O perfil difratométrico dos complexos é comparado com o perfil dos compostos separados e da mistura física, e eventos, como surgimento ou desaparecimento de picos e mudança nas intensidades relativas, sugerem a formação dos complexos (DA CUNHA FILHO; SÁ-BARRETO, 2007; TAKAHASHI et al., 2012)..

(44) 43. 1.2.4.4 Espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier. A espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) é uma técnica bastante utilizada para avaliar a ocorrência de interações entre diferentes moléculas que apresentam alteração do momento dipolo intrínseco, provocado pela absorção da energia radiante, como consequência do seu movimento vibracional ou rotacional. A caracterização dos complexos de inclusão é baseada nos deslocamentos que ocorrem nas bandas de absorção da ciclodextrina ou do fármaco, podendo ocorrer mudanças de posição, diminuição e mesmo desaparecimento. de. picos. característicos,. causados. pela. ocorrência. da. complexação (LYRA et al., 2010; TAKAHASHI et al., 2012; AGUIAR et al., 2014).. 1.2.4.5 Dissolução. Os estudos de dissolução constituem um dos mais importantes testes in vitro, uma vez que fornecem informações que permitem relacionar de forma mais estreita a possível melhoria na biodisponibilidade do fármaco quando complexado com ciclodextrinas. Este ensaio evidencia não somente os incrementos de solubilidade intrínseca conseguidos pela complexação, mas também permite o estudo cinético da liberação (SA BARRETO; CUNHA-FILHO, 2008).. 1.2.4.6 CLAE. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um método amplamente utilizado para se determinar com exatidão e precisão as constantes de associação dos complexos de inclusão e sua estequiometria (MURA, 2014). Na literatura estão disponíveis alguns métodos para a determinação de dronedarona (Tabela 2) em materiais biológicos, matéria-prima e comprimidos. Dentre os métodos mais utilizados para determinação de impurezas relacionadas e produtos de degradação destacam-se a CLAE e cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS). Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um método por cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) para quantificação de dronedarona em comprimidos (MARCOLINO et. al., 2013). Não existem métodos disponíveis na literatura para determinação do fármaco em complexos de inclusão com ciclodextrinas até o.

(45) 44. presente momento. Tabela 2 – Métodos analíticos disponíveis na literatura para determinação de dronedarona Referência. Amostra. Observações. Plasma e miocárdio Plasma humano Plasma de rato. Método analítico CLAE -UV. Bolderman et. al., 2009 Xie et. al., 2011 Bin Jardan et al., 2014 Ahirrao et. al., 2012 Tondepu et. al., 2012 Bhatt et. al., 2013 Landge et. al., 2013. LC-MS/MS CLAE -UV. Fonte de ionização: APCI Estudo farmacocinético. Comprimidos. CLAE -UV. Comprimidos e matéria-prima Comprimidos. CLAE -UV. Comprimidos e matéria-prima. CLAE -UV LC-MS. Marcolino et. al., 2013 Pydimarry et. al., 2014 Chadha et. al., 2016. Comprimidos. MEKC - UV. Comprimidos e matéria-prima Matéria-prima. CLAE -UV e LC-MS CLAE -UV e LC-MS/TOF. Impurezas relacionadas. CLAE -UV Impurezas relacionadas. Produtos de degradação nas condições ácida e oxidativa. Fonte: ESI. Fonte de ionização: ESI Identificação de produtos formados na hidrólise alcalina e fotólise. 1.2.5 Teste de citotoxicidade in vitro. Os. estudos. de. segurança. são. uma. etapa. importante. durante. o. desenvolvimento de novas formulações. Desde a publicação do conceito dos R’s (redução, refinamento e substituição) em 1959 por Russel & Burch em relação aos experimentos. com. animais,. foram. desenvolvidos. métodos. alternativos. à. experimentação animal, principalmente voltados a identificação de propriedades tóxicas de produtos químicos (SPIELMANN, 2005). A avaliação de efeitos adversos e desenvolvimento de toxicidade de novos produtos químicos pode ser realizada por métodos in vitro, como uma etapa preliminar aos estudos de segurança toxicológica in vivo, reduzindo assim a exposição dos animais aos produtos químicos e seu.