TESTES DE SENSIBILIDADE IN VITRO

5.4.1 Preparo do inóculo

O preparo do inóculo para o teste de sensibilidade foi feito a partir de colônias crescidas em ágar Batata dextrose por 24 h a 35 ºC. Resumidamente, colônias foram resuspensas em 5 mL de solução salina estéril a 0,85 % e a suspensão obtida foi ajustada a turbidez a 0,5 na escala de Mc Farland. Em seguida, a suspensão foi diluída na proporção 1:100 e, em seguida, 1:20 em meio RPMI, para obtenção de um inóculo com concentração final de variando de 0,5 a 2,5 x 103 _{células / ml (CLSI, 2008).}

5.4.2 Microdiluição

O teste de sensibilidade foi realizado por meio da técnica de microdiluição em caldo de acordo com documento M27 -A3 (CLSI, 2008). Para realização do teste foram utilizadas 39 cepas do Complexo C. parapsilosis identificadas e confirmadas anteriormente. Foram usadas placas de poliestireno de 96 poços com fundo em U com capacidade de 200 μL, em que primeiramente foi adicionado 100 µL do meio RPMI em cada poço, em seguida acrescentou-se 100 µL da droga na primeira coluna, em uma concentração quatro vezes maior que a concentração esperada no primeiro poço e, posteriormente, a droga foi diluída até a décima coluna. A coluna 11 de cada placa foi destinada ao controle negativo do experimento, ou seja, o inóculo e o meio sem a droga; a coluna 12 foi dividida em duas partes com quatro poços cada uma, onde em uma metade era feito o controle de esterilidade da droga em teste e, na outra, era usada para controle de esterilidade do meio RPMI 1640. As placas foram incubadas a 35 ºC e lidas após 24 h para FCZ, VRZ e CASP e 48 h para AMB e CsA.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor concentração do fármaco que causou a inibição completa para AMB e uma diminuição significativa de crescimento de 50% de inibição para VRZ, FCZ, CASP, quando comparados ao controle (CLSI, 2008). Para CsA, a CIM foi definida como 50% de inibição, de acordo com o protocolo de Shinde e colaboradores de 2012.

A avaliação do efeito sinérgico entre CsA e as drogas antifúngicas foi realizada em um ensaio conhecido como modelo de Checkerboard (ODDS, 2003). Foram utilizadas 39 cepas do Complexo C. parapsilosis. Em suma, este teste permite avaliar o efeito inibitório de soluções contendo diferentes concentrações de cada droga em combinação. As concentrações das drogas combinadas variaram de acordo com as concentrações contidas na quadro 2.

Quadro 2. Concentrações de cada droga testada isoladamente ou em combinações. Drogas Concentração inicial

(µg/mL) Concentração final (µg/mL) Fluconazol (FCZ) 0,03125 16 Voriconazol (VRZ) 0,03125 16 Caspofungina (CASP) 0,03125 16 Anfotericina B (AMB) 0,125 64 Ciclosporina A (CsA) 6,25 100 FCZ/ CsA 0,0156/ 0,312 1/ 2,5 VRZ/ CsA 0,0039/ 0,3125 0,0625/ 20 CASP/ CsA 0,0039/ 0,625 0,0625/ 2,5 AMB/ CsA 0,0156/ 0,156 1/ 2,5

A concentração inibitória mínima de cada fármaco em combinação (CIMsin) foi definida como a menor concentração que causou 50% de inibição do crescimento para a combinação de CsA com FCZ, VRZ e CASP e de 100% quando combinada com AMB. As interações foram classificadas como sinérgicas, indiferentes ou antagônicas, de acordo com o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (FICI). Desta forma, foram considerados os seguintes parâmetros: FICI ≤ 0,5: sinergismo, FICI > 4,0: antagonismo e 0,5 < FICI > 4,0: sem interação (ODDS, 2003).

5.5 INIBIÇÃO DE BIOFILMES DO COMPLEXO C. parapsilosis

5.5.1 Formação de biofilme

O protocolo foi realizado, de acordo com o estabelecido por Ruiz e colaboradores (2013), com adaptações. Foram utilizadas 7 cepas de cada espécie do Complexo, escolhidas aleatoriamente mais as cepas ATTC´s das respectivas espécies, totalizando um de n = 24 cepas, ver quadro 3. As leveduras foram cultivadas em ágar Sabouraud dextrose por 24 h a 35 °C. Para preparo do inóculo, uma colônia foi transferida para tubos contendo 3 mL de solução salina estéril a 0,85%, sendo a turvação ajustada ao padrão 4,0 da escala de Mc Farland. Para a formação do biofilme, foram utilizadas placas de poliestireno de 96 poços com fundo chato com capacidade para 200 μL; em cada poço, foram adicionados 180 µL de caldo Sabouraud suplementado com glicose a 8% e 20 µL do inóculo em salina. As placas foram incubadas a 35 ºC por 24 h. Após esse período, todo o líquido foi aspirado e os poços lavados duas vezes com 200 µL de PBS. As placas foram mantidas em repouso por 20 minutos em cabine de fluxo laminar e, decorrido esse tempo, adicionou-se a cada poço 110 µL de cristal violeta a 0,4% por 45 minutos. Em seguida, as placas foram lavadas três vezes com 200 µL de água destilada estéril e adicionado 200 µL de etanol (99,5%) em cada poço por mais 45 minutos; 100 µL de cada poço foram transferidos para uma nova placa para leitura em espectrofotômetro (leitor automático de microplacas) a 595 nm. Os valores de absorbância do controle negativo (poços com apenas as culturas) foram subtraídos a partir dos valores das cepas testadas para minimizar potenciais interferências; todo o experimento foi realizado em triplicata e com controle de crescimento e reagentes utilizados.

Quadro 3. Relação de cepas utilizadas para os testes com biofilme. Candida parapsilosis strcito sensu n = 8 Candida metapsilosis n = 8 Candida orthopsilosis n = 8

ATCC 22019 ATCC 96143 ATCC 96139

CEMM 05-1-054 CEMM 05-5-087 CEMM 05-5-083 CEMM 03-5-029 CEMM 05-5-092 CEMM 05-5-084 CEMM 05-6-054 CEMM 05-5-095 CEMM 03-5-040

CEMM 05-5-070 URM6407 CEMM 05-5-078

CEMM 05-1-051 URM6408 CEMM 05-1-053

CEMM 03-5-043 CEMM 05-5-094 CEMM 05-5-099

USP01 CEMM 05-5-088 CEMM 05-1-058

A capacidade da CsA e drogas antifúngicas na inibição da formação de biofilmes de C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis foi avaliada, de acordo com o protocolo usado por Ruiz et al. (2013), com adaptações. Foram utilizadas as mesmas 24 cepas do experimento anterior.

A formação de biofilme foi realizada conforme descrito acima, exceto pela a adição das drogas em teste, ao caldo Sabouraud suplementado com glicose a 8%. Para o teste, foram escolhidas três concentrações (CIM, CIM10X e CIM50X) da CsA baseado em dados do efeito da mesma sobre a célula no estado planctônico. Posteriormente, foi realizado o estudo da ação da combinação de CsA e drogas antifúngicas nas mesmas concentrações sobre a formação de biofilme. Os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos de forma independentes.

5.5.3 Efeito da CsA e drogas antifúngicas sobre biofilme formado no Complexo C. parapsilosis

O efeito da CsA e drogas antifúngicas sobre o biofilme maduro de C. parapsilosis stricto sensu, C. orthopsilosis e C. metapsilosis foi avaliado, de acordo Ruiz et al. (2013). Resumidamente, foram utilizadas 24 cepas, cultivadas em ágar Sabouraud dextrose por 24 h a 35 °C. Foi adicionado em cada poço com fundo chato 180 µL de Sabouraud caldo, suplementado com glicose a 8% mais 20 µL do inóculo com turvação de escala 4,0 de Mac Farland, incubação a 35 ºC por 24 h. Os poços foram lavados 2 vezes com PBS; em seguida, foi adicionado 200 µL de solução de meio mais droga, nas concentrações em teste: CIM, CIM10X e CIM50X com base nos dados da célula no estado planctônico, e as placas foram incubadas por 24 h a 35 °C. Estas foram novamente lavadas 2 vezes com PBS, em seguida, deixadas entre abertas durante 20 minutos em cabine de fluxo laminar para secar. Logo após, foram adicionados a cada poço 110 µL de cristal violeta a 0,4%, deixando em repouso por 45 minutos. Estes foram lavados 3 vezes com água destilada estéril e, a cada poço, foi adicionado 200 µL de etanol (99,5%) por mais 45 minutos. Passado o tempo, 100 µL foram transferidos para uma nova placa para realização da leitura. A produção de biofilme foi medida com um espectrofotômetro (leitor automático de microplacas) em absorbância de 595 nm.

Posteriormente, foi realizado o estudo da ação da combinação da CsA e drogas antifúngicas nas mesmas concentrações sobre a formação de biofilme. Os experimentos foram realizados em triplicata e independentes.