TESTES DE SUSCETIBILIDADE AOS AGENTES ANTIFÚNGICOS

albicans, mas a resistência foi rara entre as espécies mais comuns (MARCO et al.,

2003).

Gaudlaugsson et al. (2003) encontraram somente três cepas resistentes ao fluconazol (1 C. glabrata e 2 C. krusei) em 108 casos de candidemia e a maioria (56%) dos isolamentos de C. glabrata apresentou suscetibilidade dose-dependente (16-32 µg/ml).

Na América Latina, em 4 países, as espécies de C. não-albicans representou 58% de todos os isolados de candidemia, sendo as espécies mais freqüentes: C.

tropicalis (24%), C. parapsilosis (21%) e C.glabrata (8%). Essas espécies foram

sensíveis ao fluconazol (GODOY et al., 2003).

No Brasil, ANTUNES et al. (2004) não encontraram resistência aos antifúngicos testados (anfotericina B, fluconazol e itraconazol) e a suscetibilidade dose- dependente ao fluconazol ocorreu em 1.6% dos isolados (todos da espécie C.

Krusei) já a sensibilidade ao itraconazol ocorreu em 14%: C. krusei (50%), C. glabrata (25%), C. parapsilosis (16%), C tropicalis (12%) , C. albicans (7%).

1-7 TESTES DE SUSCETIBILIDADE AOS AGENTES ANTIFÚNGICOS

Os testes de suscetibilidade a drogas antifúngicas vêm se tornando cada vez mais importantes, devido ao aumento das infecções fúngicas e à emergência da resistência a essas drogas.

Observa-se nos últimos anos uma mudança no espectro das etiologias das candidemias, atribuída principalmente ao aumento de hospedeiros imunocomprometidos e ao largo uso de terapia antifúngica profilática e empírica (NGUYEN et al.,1996), acompanhada da emergência de espécies não-albicans com menor sensibilidade ou, até mesmo, resistência a agentes antifúngicos (REX, RINALDI, PFALLER, 1995; DENNING et al., 1997).

Os testes são aplicados principalmente com a finalidade de se predizer uma resposta in vivo de uma infecção fúngica a um tratamento, ou pelo menos prever falência clínica, ou avaliar a eficácia de novas drogas antifúngicas recentemente introduzidas no mercado (HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004).

A terapia para micoses profundas incluía apenas o antibiótico poliênico anfotericina B e compostos sintéticos imidazólicos (cetoconazol) e triazólicos (fluconazol e itraconazol) (POWDERLY et al.,1988; ESPINEL-INGROFF, RODRÍGUEZ-TUDELA, MARTÍNEZ-SUÁREZ, 1995).

A anfotericina B foi por muitos anos o único agente terapêutico largamente utilizado em infecções fúngicas invasivas, apresentando constante eficácia, com poucos casos descritos de falência clínica (DRUTZ & LEHRER, 1978; POWDERLY et al.,1988). Seu mecanismo de ação se baseia na ligação ao ergosterol na membrana citoplasmática do fungo. Apesar de seu baixo custo, é associada à altíssima toxicidade renal, sendo as formulações lipídicas uma opção interessante, por apresentarem significativamente menos nefrotoxidade que a formulação desoxicolato, porém apresentam custo elevado (ROGERS, 2002). Ainda assim, a anfotericina B continua sendo largamente utilizada para o tratamento das infecções fúngicas (REX et al., 2001), apresentando um largo espectro de atividade, atuando sobre Candida spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Coccidioides spp.,

Paracoccidiodes spp., Sporothrix spp., Fusarium spp., Blastomyces spp., Aspergillus

spp., Penicillium spp., Mucor spp. e Rhizopus spp. (LACAZ et al., 2002).

O fluconazol e o itraconazol são agentes antifúngicos bem tolerados, com boa atividade sobre a maioria das espécies de Candida (MILAN, 1998; PFALLER et al., 1999c; PFALLER et al.,2001; COLOMBO et al., 2002) e seu mecanismo de ação, como os demais azólicos, baseia-se na inibição da síntese do ergosterol (PFALLER et al.,2003). O aumento do uso de fluconazol tem levado ao aumento da resistência entre espécies de Candida, principalmente C. glabrata (REX, RINALDI, PFALLER, 1995; MILAN et al.,1998), porém o seu uso em instituições pública, tem sido limitado, devido ao custo elevado (COLOMBO et al., 2002).

Antes de 1980, não se fazia necessário a realização de teste de suscetibilidade aos antifúngicos, devido ao baixo número de infecções por espécies de Candida, ao pequeno número de drogas antifúngicas disponíveis comercialmente e também pela constante eficácia da anfotericina B. A partir dos anos 90 houve um avanço no tratamento das infecções fúngicas, tornando-se necessária a avaliação da eficiência de novas drogas, consideradas mais potentes e menos tóxicas, como o novo triazólico de segunda geração (voriconazol) e a equinocandina (caspofungina) (PFALLER et al., 2003).

O voriconazol é atualmente disponibilizado comercialmente para o tratamento de varias micoses sistêmicas, apresentando um largo espectro de atividade contra a maioria dos fungos patogênicos (SWINNE, WATELLE, NOLARD, 2005; PFALLER et al., 2006a).

As equinocandinas (caspofungina) representam uma nova classe de antifúngicos, apresentando um mecanismo de ação baseado na inibição da síntese de beta- glucana, polímero importante da parede celular dos fungos (PFALLER et al., 2003).

Os novos antifúngicos tiveram o espectro de ação estendido para isolados de

Candida spp. menos susceptíveis aos outros azólicos ( C. krusei e C. glabrata), e

fungos filamentosos como o Aspergillus spp.( PFALLER et al., 2002a, PFALLER et al.,2006a).

Contudo, ao contrário dos teste de suscetibilidade para bactérias, que tem sido um guia para clínicos na seleção de terapia apropriada, testes de suscetibilidade aos antifúngicos permanecem em evolução (REX et al.,1995b; ESPINEL-INGROFF, 1997; REX et al., 1997; MILAN et al., 1998; NEELY & GHANNOUM, 2000 ). Por essa razão, a necessidade de introdução de teste de suscetibilidade para drogas antifúngicas, com metodologia rápida, confiável e de fácil execução, foi recebendo mais e mais atenção (POWDERLY et al.,1988; PFALLER & RINALDI, 1993; ESPINEL-INGROFF, 1994).

Vários estudos multicêntricos foram realizados para definir as padronizações ideais para o teste, com o objetivo de se obter uma boa reprodutibilidade inter e intra laboratorial, incluindo o controle de importantes variáveis que poderiam interferir no

resultado final. Essas variáveis são o preparo do inóculo, a composição química, o pH do meio, a temperatura de incubação e os critérios de leitura e interpretação do teste (PFALLER, et. al.,1988; PFALLER, et. al.,1990; ESPINEL-INGROFF et. al., 1992; PFALLER & RINALDI, 1993; REX et. al.,1993; REX et. al., 2001; NCCLS, 2002).

Esses estudos foram fundamentais para o estabelecimento de normas técnicas padronizadas e embasaram a publicação, em 1997, pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), antigo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), do documento M27-A como método de referência para teste de suscetibilidade in vitro de leveduras (Candida spp. e Cryptococcus spp.) a cinco agentes antifúngicos de uso sistêmico (NCCLS, 1997).

Posteriormente, em 2002, foi aprovado e publicado o documento M27-A2, uma nova edição do método de referência, introduzindo alguns aperfeiçoamentos (NCCLS, 2002). O M27-A2 foi considerado como padrão ouro para teste de suscetibilidade a antifúngicos, com aceitação e utilização em todo o mundo.

Contudo, esse teste é ainda considerado laborioso, não prático para aplicação na rotina de laboratório clínico, requerendo pessoal treinado e especializado, principalmente para as leituras dos resultados com os antifúngicos azólicos, devido ao crescimento remanescente tipo trailing, que muitas espécies de Candida spp. apresentam com estas drogas. Observando-se assim, a necessidade de desenvolvimento de outros tipos de teste, com metodologia mais simples e aplicável a rotina de laboratório clínico. Alguns testes alternativos vêm sendo avaliados nos últimos anos (ANAISSE, PAETZNICK, BODEY, 1991; ESPINEL-INGROFF et al., 1991; ESPINEL-INGROFF et al.,1994; SEWELL, PFALLER, BARRY, 1994; PFALLER et al.,1994; ESPINEL-INGROFF, RODRÍGUEZ-TUDELA, MARTÍNEZ- SUÁREZ ,1995; COLOMBO et al.,1995; ELDER et al.,1996, MAGALDI et al., 2001; COLOMBO, 2002 , MAXWELL et al., 2003).

Entre as novas propostas de testes disponíveis comercialmente, o Etest® é um método para a determinação das CIMs de droga antifúngica, baseado na difusão de droga em meio sólido, a partir de fitas plásticas com diferentes gradientes de

concentração de agente antifúngico, e tem mostrado ser um método alternativo e confiável (COLOMBO et al.,1995a; WANGER et al.,1995; CHEN et al.,1996; ESPINEL-INGROFF et al.,1998, LOZANO CHIU et al., 1998; PFALLER et al.,1998b; SZEKELY, JOHNSON, WARNOCK 1999; PFALLER, 2000).

Boa correlação tem sido reportada entre Etest® e o método de referência, de microdiluição em caldo (CLSI), quando fungos patogênicos foram testados contra vários agentes antifúngicos como anfotericina B (WANGER et al.,1995; ESPINEL- INGROFF et al.,1996; LOZANO-CHIU et al., 1998; PFALLER, MESSER, BOLMSTRÖM, 1998), e triazólicos como fluconazol (COLOMBO et al.,1995a; ESPINEL-INGROFF et al.,1996; CHEN et al.,1996; MAXWELL et al., 2003), itraconazol (COLOMBO et al.,1995b; CHEN et al.,1996; ESPINEL-INGROFF et al., 1996; MAXWELL et al., 2003) e voriconazol (RUHNKE, SCHMIDT-WESTHAUSEN, TRAUTMAN, 1997; ESPINEL-INGROFF,1998; MARCO et al., 1998; PFALLER et al., 1998c; PFALLER et al., 1999a; ESPINEL-INGROFF, WHITE, PFALLER, 1999; PFALLER et al., 2000b).

Um estudo realizado no Brasil por Colombo et al. (1995b), avaliou como boa a correlação entre as duas metodologias para diferentes leveduras, considerando valores entre duas diluições, porém com concordância para C. tropicalis de apenas 53% para fluconazol e 33% para itraconazol, entre os valores de CIMs dentro uma diluição.

De um modo geral, estudos comparando Etest® com o método de referência têm mostrado mais de 90% de concordância entre os resultados para fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol, obtidos dentro de duas diluições (COLOMBO et al.,1995a ;CHRYSSANTHOU & CUENCA-ESTRELLA, 2002; MATAR et al., 2003). A correlação clínica e o resultado do teste de suscetibilidade para infecções profundas por Candida spp. permanece ainda em controvérsia (REX et al.,1995b), porque essas infecções usualmente ocorrem em pacientes imunodeficientes ou debilitados, com infecções bacterianas comumente associadas, dificultando assim a avaliação da resposta clínica ao agente antifúngico (FISHER-HOCH & HUTWAGNER, 1995), além do uso de materiais protéticos ou cateteres, da

dificuldade de acesso da droga ao sítio da infecção e à farmacocinética ou biodisponibilidade do antifúngico (HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004).

Contudo, em um estudo realizado com 32 pacientes HIV negativos, observou-se boa correlação clínica entre valores de CIMs (CLSI) e resposta ao tratamento com fluconazol. A taxa de sucesso terapêutico foi de 79% para os pacientes com cepas consideradas sensíveis, de 66% para os pacientes com cepas classificadas como suscetíveis dose-dependente (SDD) e de 0% para os pacientes com cepas na categoria resistente (LEE et al., 2000).

Apesar dos avanços obtidos na correlação clínico-laboratorial dos testes de suscetibilidade com triazólicos, o mesmo não acontece em relação ao cetoconazol e a anfotericina B (REX et al.,1995b; FISHER-HOCH & HUTWAGNER, 1995; NGUYEN et al.,1998; CLANCY & NGUYEN, 1999, HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). Vários autores sugerem que a metodologia do CLSI apresenta dificuldades na detecção de isolados resistentes a anfotericina B, devido a estreita variação das CIMs nessa metodologia, obtidas com diferentes isolados clínicos. Consequentemente, o CLSI ainda não estabeleceu, até o momento, valores de corte para anfotericina B e cetoconazol (NCCLS, 2002; HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). O ponto de corte para o voriconazol foi estabelecido recentemente, sendo considerado sensível: CIM ≤1 µg/mL, SDD: CIM= 2 µg/mL e resistente(R) CIM ≥4 µg/mL (PFALLER et al., 2006).

Existem poucos estudos descrevendo o impacto dos testes de suscetibilidade no sucesso do tratamento das infecções fúngicas. Infelizmente a correlação entre os resultados dos testes, realizados por qualquer metodologia, e os resultados clínicos ainda não é satisfatória. Magiorakos & Hadley (2004), sugerem que a execução do teste de suscetibilidade em tempo real, permita uma terapia mais adequada para pacientes com candidemia.

A epidemiologia das infecções nosocomiais causadas por Candida spp. tem mudado nos últimos anos, com emergência de espécies com reduzida suscetibilidade a agentes antifúngicos (EGGIMANN, GARBINO, PITTET, 2003), justificando a

importância de pesquisas que levem ao aperfeiçoamento de métodos de diagnóstico, controle e tratamento de infecções causadas por esses microrganismos.