Ocorrência e suscetibilidade a drogas antifúngicas de Candida não-albicans, no Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes, Vitória - ES

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO-UFES CENTRO BIOMÉDICO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS. NAZARETH MAGNAGO KLEIN. OCORRÊNCIA E SUSCETIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS DE Candida NÃO-albicans, NO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CASSIANO ANTÔNIO DE MORAES, VITÓRIA - ES. VITÓRIA 2006.

(2) 2. NAZARETH MAGNAGO KLEIN. OCORRÊNCIA E SUSCETIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS DE Candida NÃO-albicans, NO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO CASSIANO ANTÔNIO DE MORAES, VITÓRIA - ES. Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Doenças Infecciosas do Centro Biomédico da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências - Patologia Geral das Doenças Infecciosas. Orientadora: Profª. Drª. Mariceli Araújo Ribeiro.. Vitória 2006.

(3) 3.

(4) 4. Este trabalho foi financiado pela Companhia Siderúrgica de Tubarão (CST)- Arcelor, Brasil em convênio com a Fundação de Apoio ao Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes (FAHUCAM)..

(5) 5. Dedicatória. Aos meus pais, Napoleão Klein e Maria Edna Magnago Klein, acompanhando-me e contribuindo para minha formação moral e científica com amor ao longo da minha vida. Todo meu carinho e gratidão..

(6) 6. À minha filha, Gabriela Klein Bellotti, razão da minha felicidade, pelo tempo não dedicado em parte de sua infância, por todo o seu amor, alegria e carinho em momentos difíceis desta caminhada.. Aos meus irmãos, Edmar Magnago Klein e Ednalva Magnago Klein, sempre maravilhosos, sempre me apoiando, com demonstrações de otimismo e amor em todos os momentos de minha vida..

(7) 7. À minha orientadora, Profª. Drª. Mariceli Araújo Ribeiro, pela confiança e por ter me ajudado a realizar este trabalho, compartilhando. sua. experiência. profissional, carinho e equilíbrio.. com. ética.

(8) 8. AGRADECIMENTOS. Em primeiro lugar, a DEUS, meu Pai do Céu, que sempre me deu luz, força e sabedoria para administrar todas as atividades diárias e superar as tribulações. À minha Mãe do Céu, Nossa Senhora, que intercedeu por mim e me deu provas de seu amor infinito. À Kellen Klein Pereira, minha afilhada do coração, pela dedicação em todas as vezes que necessitei de seu auxílio. À amiga de estudo e de trabalho no setor de microbiologia do HUCAM, Drª.Conceição Ferreira Pinto Ribeiro. Aos técnicos e colegas de trabalho do Laboratório de Análises Clínicas do HUCAM. Agradeço especialmente à Edna Liberato Gonçalves e à Cláudia Valéria Siqueira Alves, técnicas do Setor de Microbiologia, com quem pude contar neste período de estudo, pois me ajudaram muito, com sua constante disposição para a leitura das culturas e organização do setor. Aos amigos da CCIH do HUCAM, Dr. Carlos Urbano Gonçalves Ferreira Junior, Maria de Lourdes Bertollo Soares e Silvia Márcia Santos, que me ajudaram com palavras amigas e entenderam minha ausência em muitas reuniões. Às amigas da CCIH do Hospital Vitória Apart, Drª. Cristiane Costa Gomes, Drª. Fabíola Assad Antunes e Drª. Simone Freitas Coelho Tosi, que sempre confiaram no meu trabalho e souberam entender as minhas necessidades, ausências, me apoiando nesta jornada. Aos colegas de trabalho do Hospital Vitória Apart e técnicos do Laboratório Carlos Chagas, por sua simplicidade e dedicação ao Setor de Microbiologia, em todos os momentos que precisei e me ausentei..

(9) 9. À todos os médicos do HUCAM, que souberam entender os momentos de necessária ausência. À Maria Zilma Rios, que sempre me atendeu prontamente, mesmo com tantos compromissos em seu novo cargo, não me negando nenhuma ajuda e me passando muita tranqüilidade nesta fase de estudos. À Idenir Rezende e ao José Mauro da Vitória, do laboratório de Micologia, pela maneira carinhosa e simpática que sempre me acolheram quando deles precisei durante a realização dos testes laboratoriais. À todos os Professores de todas as disciplinas do Mestrado. Com especial agradecimento ao Prof. Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, coordenador do Mestrado em Doenças Infeccciosas, mestre que admiro, por seus ensinamentos, pelo estímulo e pela confiança transmitidos. À Fátima Aparecida Pereira, secretária do Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas, sempre pronta a nos receber e demonstrar seu carinho para com todos. Aos meus colegas de Mestrado, que tive a felicidade de conhecer e com os quais dividi bons e tensos momentos. À Fundação de Apoio ao Hospital Universitário Antonio Cassiano Moraes (FAHUCAM), pelo apoio financeiro, por meio da parceria com a Companhia Siderúrgica de Tubarão (CST). Às estudantes do curso de Farmácia e bolsista do PIBIC da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da UFES. À todos os amigos, mencionados ou não, agradeço pelo apoio..

(10) 10. “Somos aprendizes de uma arte na qual ninguém se torna mestre.” Ernest Hemingway (1898-1961).

(11) 11. RESUMO Este estudo foi conduzido para se avaliar a prevalência e a distribuição das espécies de Candida spp., isoladas de diversos materiais biológicos, obtidos de pacientes internados no Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes (HUCAM), VitóriaES, durante o período de janeiro de 2003 a dezembro 2005, e descrever o perfil de suscetibilidade de Candida não-albicans a drogas antifúngicas. A identificação da espécie Candida albicans foi realizada no meio cromogênico CHROMagar-Candida® e confirmada pela indução positiva de tubo germinativo e/ou clamidoconídeo. A identificação das espécies não-albicans foi realizada pelos seus padrões morfológicos e bioquímicos e pelo sistema comercial API 20 C AUX. O perfil de suscetibilidade às drogas antifúngicas anfotericina B, itraconazol e fluconazol foi estabelecido pelo método de referência, microdiluição em caldo, de acordo com o documento M27-A2 do CLSI, 2002. Estudo comparativo foi realizado, empregandose o método Etest® para as cepas de Candida tropicalis, sendo incluída nesta etapa, a droga voriconazol. Os resultados mostraram 268 isolados de Candida spp., no geral, um predomínio de Candida não-albicans (54%), incluindo C. tropicalis (26%), C. parapsilosis (14%), C. glabrata (10%), C. Krusei (2%), C. guilliermondii (1.5%) e C. lusitaniae (0.5%). Ocorreu uma marcante transição na prevalência de Candida não-albicans, durante os três anos de estudo, oscilando na freqüência de 39% dos isolamentos em 2003 para 74% em 2005. As espécies não-albicans foram mais isoladas de urina (47%), seguido de sangue (39%) e cateter (8%). As maiores ocorrências foram na Unidade de Tratamento Intensivo Geral e Clínica Médica, com 23% em cada setor. A resistência para as espécies não-albicans ao fluconazol foi de 4% e, de suscetível dose-dependente (SDD) ao fluconazol e ao itraconazol foi de 2% e 3%, respectivamente (metodologia CSLI). Com esta metodologia, 98% das cepas de C. tropicalis foram sensíveis ao fluconazol e ao itraconazol, mas 2% foram SDD para estas drogas. Com o método Etest®, 2% dessas cepas foram resistentes (R) a ambas as drogas e 19% foram SDD ao itraconazol. Nenhum isolado de Candida não-albicans foi resistente a anfotericina B ou ao voriconazol. Todos os isolados de Candida albicans foram sensíveis às três drogas analisadas. Em conclusão: a) Houve uma marcante tendência para o isolamento de C. não-albicans no HUCAM, com predomínio de C. tropicalis. b) Observou-se, reduzida suscetibilidade ao fluconazol e ao itraconazol apenas para as espécies C. tropicalis, C. krusei e C. glabrata. c) O método Etest®, usando o meio de ágar Casitone, apresentou ótima concordância com o método de referência para as drogas anfotericina B (100%) e fluconazol (96%), no entanto, para o itraconazol, essa concordância foi de 62%. Palavras-chave: Candida spp., candidemia, teste de suscetibilidade, drogas antifúngicas, Etest®..

(12) 12. ABSTRACT This study was carried out to evaluate the prevalence and distribution of the species of Candida spp. Isolated from several biological materials obtained from patients interned at the “Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes” (HUCAM), Vitória-ES, during the period of January 2003 to December 2005, and to describe the profile of susceptibility of Candida non-albicans to antifungal drugs. The identification of the species of Candida albicans was made into the chromogenic medium CHROMagar-Candida® and confirmed through the positive induction of a germinative tube and/or clamidoconídeo. The identification of the species nonalbicans was made through of morphologic and biochemical patterns and through the commercial system API 20 C AUX. The profile of susceptibility to the antifungal drugs amphotencin B itraconazole and fluconazole was established by the reference method, broth microdilution, according to the document M27-A2 from CLSI, 2002. A comparative study was conducted, using the method Etest® for the strains of Candida tropicalis being included at this stage, the drug voriconazole. The results showed that 268 isolates of Candida spp. were obtained during the period of the study and, in general, a predominance was observed in the isolation of Candida nonalbicans (54%) at HUCAM, including C. tropicalis (26%), C. parapsilosis (14%), C. glabrata (10%), C. krusei (2%), C. guilliermondii (1.5%) and C. lusitaniae (0.5%). There was a relevant transition in the prevalence of Candida non-albicans during the three years of study, oscillating in the frequency from 39% of the isolations in 2003 to 74% in 2005. The non-albicans species were more isolated from urine (47%), followed by blood (39%) and catheter (8%). The biggest occurrences were noticed in patients interned at the General Intensive Care Unit and Medical Clinic with a rate of 23% in each one. The resistance rate noticed for the non-albicans species to fluconazol was of 4% and, of susceptible dose-dependent (SDD) to fluconazole and to itraconazole was of 2% and 3% respectively (methodology CSLI). With the use of this methodology, it was observed that 98% of the strains of C.tropicalis were sensitive to fluconazole and to itraconazole, but 2% were SDD to these drugs. When the method Etest® was used, 2% of these samples were resistant to both drugs and 19% were SDD to itraconazole. No isolated of Candida non-albicans was resistant to amphotericin B or to voriconazole. All the isolates of Candida albicans were sensitive to the three drugs analyzed. With this study it was concluded that there was a striking tendency to the isolation of C. non-albicans, with the predominance of C. tropicalis. Reduced susceptibility to fluconazole and itraconazole was also noticed only in the species C. tropicalis, C. krusei and C. glabrata, reinforcing the concern about a high number of isolations of these species non-albicans at HUCAM. The Etest® method using the medium of agar Casitone, showed an excellent concordance with the reference method to the drugs amphotericin B (100%) and fluconazole (96%). However, for the itraconazole this agreement was of 62%.. Key words: Candida spp., candidemia, susceptibility test, antifungal drugs, Etest®..

(13) 13. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANFO. Anfotericina B. Ca. Cateter venoso. CLSI (antigo NCCLS) Clinical and Laboratory Standards Institute CIM. Concentração Inibitória Mínima. CIMs. Concentrações Inibitórias Mínimas. CM. Clínica Médica. CC. Clínica Cirúrgica. CDC. Center for Disease Control and Prevention. CCIH. Comissão de Controle de Infecção Hospitalar. DIU. FLU. Dispositivo Intra Uterino Emerging Infections and Organisms Fluconazol. GO. Ginecologia/ Obstetrícia. HUCAM. Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes. HIV. Human Immunodeficiency Vírus. ITRA. Itraconazol. NCCLS. National Committee for Clinical Laboratory Standards. NDI. Núcleo de Doenças Infecciosas. No. Nódulo Subcutâneo. LP. Líquido peritoneal. LPL. Líquido pleural. PS. Pronto Socorro. Ped. Pediatria. R. Resistente. S. Sensível. Sa. Sangue. SDD. Suscetível dose-dependente. SR. Setor de Rins. U. Urina. UFES. Universidade Federal do Espírito Santo. UTI. Unidade de Tratamento Intensivo. UTIN. Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal. VORICO. Voriconazol. EIEIO. the. Epidemiology. of. Iowa.

(14) 14. LISTA DE TABELAS Tabela 1.. Freqüência das espécies de Candida isoladas no HUCAM............ Tabela 2.. Distribuição das espécies de Candida de acordo com os materiais biológicos......................................................................... Tabela 3.. Distribuição das espécies de Candida de acordo com os setores do HUCAM....................................................................................... Tabela 4.. Distribuição das três espécies não-albicans isoladas com maior freqüência no HUCAM, de acordo com o setor............................... Tabela 5.. Distribuição das espécies albicans e não-albicans de acordo com o período estudado.......................................................................... Tabela 6. Tabela 7. Tabela 8. Tabela 9. Tabela 10. Tabela 11. Tabela 12. Tabela 13.. 46 48 49 51. 53 Faixas de leituras das CIMs (µg/mL) para cepas-padrão, pelo método de referência CLSI 2002, após 24 e 48 h de incubação........................................................................................ 55 Comparação das CIMs (µg/mL) da cultura de cepa-padrão C.krusei ATCC 6258 pelo método Etest® e microdiluição (CLSI).............................................................................................. 56 CIMs determinadas pelo método de referência (CLSI) para as espécies de Candida ..................................................................... 57 Perfil de suscetibilidade das espécies de Candida a três drogas antifúngicas testadas pelo método de referência (CLSI, 2002) ..... 59 Faixas de CIMs e valores de CIM50 e CIM90 para cepas de C. tropicalis testadas pelas metodologias CLSI e Etest® ................. 60 Distribuição das cepas de C. tropicalis dentro de faixas de diluição de drogas, de acordo com as CIM determinadas pelas metodologias CLSI e Etest® .......................................................... 62 Perfil de suscetibilidade de C. tropicalis a quatro drogas antifúngicas, pelo método Etest® .................................................. 64 Determinação da porcentagem de concordância para a metodologia Etest® em relação ao método de referência CLSI, para cepas de C. tropicalis ............................................................ 66. LISTA DE FIGURAS.

(15) 15. Figura 1.. Representação gráfica das freqüências das espécies de Candida isoladas no HUCAM........................................................................ Figura 2.. Representação gráfica da distribuição das espécies de Candida, de acordo com os materiais biológicos............................................ Figura 3.. Representação gráfica da distribuição das espécies de Candida albicans de acordo com os setores do HUCAM.............................. Figura 4.. Representação gráfica da distribuição das espécies de Candida não-albicans de acordo com os setores do HUCAM....................... Figura 5.. Distribuição gráfica das três espécies não-albicans isoladas com maior freqüência no HUCAM, de acordo com o setor..................... Figura 6.. Representação gráfica da distribuição das espécies albicans e não-albicans de acordo com o período estudado ........................... Figura 7 e 8. Figura 9,10 e 11 Figura 12.. 47 48 50 50 52 53. Representações gráficas das distribuições das três espécies de C. não-albicans mais isoladas no HUCAM de acordo com período estudado ........................................................................... 54 Representações gráficas da distribuição das cepas de C. tropicalis dentro de faixas de CIMs para diferentes drogas, determinadas pelas metodologias CLSI e Etest® ........................ 63 Comparação dos perfis de suscetibilidade de C. tropicalis pelas metodologias CLSI e Etest® ......................................................... 64. SUMÁRIO.

(16) 16. 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 19. 1.1. O GÊNERO Candida...................................................................................... 19. 1.2. IMPORTÂNCIA DAS INFECÇÕES NOSOCOMIAIS POR Candida spp......... 20. 1.3. PATOGÊNESE DAS CANDIDÍASES NOSOCOMIAIS ................................... 21. 1.4. OCORRÊNCIA E PREVALÊNCIA DO GÊNERO Candida EM INFECÇÕES NA CORRENTE SANGUÍNEA......................................................................... 1.5. OCORRÊNCIA E PREVALÊNCIA DE ESPÉCIES DE Candida NÃO albicans EM INFECÇÕES NA CORRENTE SANGUÍNEA............................... 1.6. SUSCETIBILIDADE. DAS. PRINCIPAIS. ESPÉCIES. DE Candida A. 23 24. DROGRAS ANTIFÚNGICAS............................................................................ 1.7. 27 TESTES DE SUSCETIBILIDADE AOS AGENTES ANTIFÚNGICOS............. 31. 2. OBJETIVOS ……………………………………………………………..…………. 2.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 38. 2.1.1. Objetivos específicos ................................................................................... 38. 3. METODOLOGIA ............................................................................................ 39. 3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS ............................................................................. 39. 3.2. ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS ................................................................. 39. 3.3. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Candida ............................................ 40. 3.3.1. Formação do tubo germinativo ................................................................... 40. 3.3.2. Indução de pseudohifa e clamidoconídeo .................................................. 40. 3.3.3. Assimilação de fontes de carbono .............................................................. 41. 3.3.4. Fermentação de fontes de carbono ............................................................ 41. 3.3.5. Identificação das espécies de Candida não-albicans pelo sistema API. 38. 20 C AUX ....................................................................................................... 3.4. 41 TESTE DE SUSCETIBILIDADE IN VITRO A AGENTES ANTIFÚNGICOS ... 42. 3.4.1. Microdiluição em caldo ................................................................................ 42.

(17) 17. 3.4.1.1 Controle de Qualidade .................................................................................... 42 3.4.1.2 Meio de cultura ............................................................................................... 42 3.4.1.3 Drogas ............................................................................................................ 43 3.4.1.4 Inóculo ............................................................................................................ 43 3.4.1.5 Leitura e interpretação .................................................................................... 44 3.4.2. Etest® ............................................................................................................ 44. 3.4.2.1 Drogas ............................................................................................................ 44 3.4.2.2 Inóculo ............................................................................................................ 45 3.4.2.3 Leitura e interpretação .................................................................................... 45 4. RESULTADOS ............................................................................................... 46. 4.1. ESPÉCIES DE Candida ISOLADAS E SUAS FREQÜÊNCIAS ..................... 46. 4.2. DISTRIBUIÇÃO DAS ESPÉCIES DE Candida DE ACORDO COM OS MATERIAIS BIOLÓGICOS ............................................................................. 4.3. DISTRIBUIÇÃO DAS ESPÉCIES DE Candida DE ACORDO COM SETORES DO HUCAM ................................................................................... 4.4. DISTRIBUIÇÃO DAS TRÊS ESPÉCIES NÃO-albicans ISOLADAS COM MAIOR FREQÜÊNCIA NO HUCAM, DE ACORDO COM O SETOR.............. 4.5. DISTRIBUIÇÃO DAS ESPÉCIES DE Candida spp. POR PERÍODO. 47 49 51. ANALISADO .................................................................................................... 4.6. 52 TESTES DE SUSCETIBILIDADE A DROGAS ANTIFÚNGICAS ................... 55. 4.6.1. Controle de qualidade do testes ................................................................. 55. 4.6.2. Valores das CIMs para as espécies de Candida isoladas neste estudo, determinadas pelo método de referência CLSI........................................... 4.6.3. Análise do perfil de suscetibilidade das espécies de Candida testadas pelo método CLSI........................................................................................... 4.6.4. 56 58. Valores de CIMs para C. tropicalis, determinados pela metodologia Etest® e comparados com aqueles determinados pela metodologia. 60.

(18) 18. CLSI............................................................................................................... 4.6.5. Distribuição, por faixas, das CIMs determinadas pelas metodologias CLSI e Etest® para C. tropicalis.................................................................... 61. 1. 4.6.6. Análise do perfil de suscetibilidade de C. tropicalis testadas pela metodologia Etest®........................................................................................ 4.6.7. Comparação dos perfis de suscetibilidade de C. tropicalis pelas. 64. metodologias CLSI e Etest®......................................................................... 5. 65 DISCUSSÃO................................................................................................... 67. 6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 82. 7. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 84 ANEXOS ........................................................................................................ 110. 1 INTRODUÇÃO.

(19) 19. 1.1 O GÊNERO Candida O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, ordem Deuteromycota (fungos imperfeitos) e é constituído por mais de 200 espécies descritas e distribuídas em diversos habitats (EGGIMANN, GARBINO, PITTET, 2003; MENDEZ & MAZUELO, 2006), mas apenas cerca de 10% dessas espécies são responsáveis por infecções humanas (JARVIS, 1995). As espécies de Candida spp. caracterizam-se morfológicamente por apresentaremse como leveduras, medindo cerca de 3 a 7 µm de diâmetro. Também podem produzir brotamentos, que quando unidos, formam estruturas filamentosas, conhecidas como pseudohifas, as quais, podem ainda alongar-se formando hifas verdadeiras (LACAZ et al., 2002). No meio de ágar Sabouraud Dextrose crescem em 24/ 48 h, a 30-37ºC, apresentando colônias brancas a creme, cremosas, lisas, circulares ou convexas (MACOLA et al., 2001). Algumas espécies têm grande importância pela alta freqüência com que colonizam a pele, trato gastrointestinal, geniturinário e respiratório do ser humano (MENDES & MAZUELOS, 2006), podendo ser encontradas no trato gastrointestinal de 20 a 80% dos adultos saudáveis; 20% a 30% das mulheres também apresentam colonização vaginal (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003). A Candida albicans é a espécie mais freqüente, dentre as isoladas de humanos (EGGIMANN, GARBINO, PITTET, 2003). Apesar de comensais, podem tornar-se microrganismos patogênicos. Devido a sua ampla distribuição no hospedeiro, podem originar infecções com diferentes localizações e gravidades, relacionadas principalmente com comprometimento dos mecanismos de defesa do hospedeiro (diabetes, idades extremas) ou rompimento das barreiras anatômicas (queimadura ou procedimentos médicos invasivos) (DIGNANI, SOLOMKIN , ANAISSIE, 2003 ).. 1.2 IMPORTÂNCIA DAS INFECÇÕES NOSOCOMIAIS POR Candida spp..

(20) 20. A incidência das infecções fúngicas tem aumentado dramaticamente nas últimas décadas, em diferentes partes do mundo (XU et al., 2000), como resultado do aumento significativo de pacientes portadores de imunodeficiências adquiridas ou induzidas. Considera-se como causa desse aumento, a terapia imunosupressiva para transplante de órgãos, quimioterapia em câncer, antibioticoterapia, além de intensos cuidados de suporte a vida (JARVIS, 1995; KAO et al., 1999; VERDUYN, MEIS, VOSS, 1999; ELLIS et al., 2000; RICHARDS et al., 2000). Esses microrganismos têm se tornado importantes patógenos por serem capazes de infectar seriamente pacientes hospitalizados, sendo responsáveis por cerca de 15% de todas as infecções nosocomiais e por 80% das micoses hospitalares (PFALLER, 1998;. GUDLAUGSSON. et. al.,. 2003; COLOMBO &. GUIMARÃES,. 2003),. representando a maior causa de fungemia. Esse é um grande desafio aos clínicos de diferentes especialidades, devido às dificuldades diagnósticas e terapêuticas que estas infecções apresentam (ABI-SAID et al.,1997). As candidíases disseminadas têm se apresentado freqüentemente de forma severa, de evolução rápida e com altas taxas de mortalidade (WENZEL,1995; REIMER, WILSON, WEINSTEIN, 1997; COLOMBO & GUIMARÃES, 2003; GUDLAUGSSON et al., 2003) e significativa elevação de custos hospitalares (RENTZ, HALPERN, BOWDEN,1998; LELEU, AEGERTER, GUIDET, 2002; TORTORANO et al., 2004). O custo decorrente do atendimento ao paciente é um item relevante. Tem sido estimado um custo de US$34.123,00 para o atendimento privado de cada paciente com candidemia nos EUA, sendo a maior parte dos gastos relacionada com o maior tempo necessário de internação (RENTZ , HALPERN, BOWDEN, 1998). Além da sua alta prevalência nos hospitais terciários de diversas partes do mundo, os índices de mortalidade geral chegam a 60% e de mortalidade atribuída, próximo a 40% (WENZEL,1995). As infecções fúngicas hospitalares caracterizam-se, ainda, por serem de difícil diagnóstico clínico, o qual é, muitas vezes realizado tardiamente com limitada sintomatologia, acompanhado de baixos índices de positividade nas hemoculturas, nos exames histopatológicos e nos testes sorológicos. Esses fatores, contribuem para as altas taxa de mortalidade (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003)..

(21) 21. Existem dois grandes grupos de pacientes, onde as infecções nosocomiais por Candida spp. podem ocorrer: aqueles que são severamente imunocomprometidos (receptores de transplantes de órgãos sólidos e medula óssea ou os portadores de neoplasias, aqueles que são considerados persistentemente neutropênicos, como conseqüência de terapia imunossupressora ou citotóxica) e aqueles submetidos a cirurgia complexas (cardíaca ou abdominal) que debilitados e expostos a vários procedimentos invasivos, têm sua resposta imune decrescida pelo uso sistêmico de corticosteróides (PFALLER, 1996). Os principais fatores de risco associados a estes pacientes são: hospitalização prolongada, terapia antimicrobiana de amplo espectro e emprego de procedimentos invasivos como cateteres e ventilação mecânica (FRIDKIN, WELBEL, WEINSTEIN, 1997; KAO et al., 1999; VERDUYN, MEIS, VOSS, 1999). 1.3 PATOGÊNESE DAS CANDIDÍASES NOSOCOMIAIS Acredita-se que a maioria dos casos de candidíase de origem nosocomial seja pela invasão na corrente sanguínea através de via endógena, ou pela translocação do patógeno através do trato gastrointestinal, local onde há rica colonização por Candida spp. Métodos de genotipagem demonstram a existência de similaridades genéticas entre cepas colonizantes e infectantes, comprovando a provável origem endógena na maioria das infecções por tais patógenos (COLE, HALAWA, ANAISSE, 1996; NUCCI & ANAISSE, 2001). Muitos fatores podem contribuir para o aumento da colonização; segundo Alexander et al., 1990 essa ocorrência se dá porque o processo de translocação de Candida spp. até os capilares mesentéricos, pode ser facilitado por qualquer variável que provoque desequilíbrio da microbiota ou lesão da mucosa gastrointestinal. Portanto, todos os fatores que aumentam a colonização intestinal por Candida (uso de antibióticos, oclusão intestinal) ou determinam atrofia ou lesão de mucosa intestinal (jejum prolongado, nutrição parenteral total, hipotensão, quimioterapia) podem potencializar o fenômeno de translocação no trato gastrointestinal..

(22) 22. As infecções nosocomiais por Candida spp. podem também ser adquiridas por via exógena, através do contato das mãos de profissionais de saúde, facilitando a transmissão de paciente para paciente (TRICK & JARVIS, 1998 ) ou ainda, através de manipulação de pacientes portadores de cateteres vasculares em posição central, implante de próteses contaminadas ou administração parenteral de soluções contaminadas (WENZEL,1995; PFALLER, 1996). O uso de cateter venoso central também é um importante fator de risco para desenvolvimento da candidemia. Independentemente do tipo de material do cateter, este dispositivo pode facilitar o crescimento fúngico e se converter em um sítio adicional de infecção, estabelecendo uma fonte de fungemia persistente para o hospedeiro (OSTROSKY-ZEICHNER et al., 2002). As infecções por Candida spp. podem ocorrer em diferentes sítios anatômicos. As infecções da corrente sanguínea (candidemias) podem estar associadas ao envolvimento de diferentes órgãos. O aparecimento de lesões cutâneas podem ser um marcador de disseminação da doença, ocorrendo entre 10% a 15% dos casos, apresentando-se caracteristicamente como máculas-pápulas ou pequenos nódulos (BODEY & LUNA, 1974), enquanto o envolvimento do globo ocular (endoftamite) pode ocorrer entre 10% a 30% dos casos (KRISHNA et al., 2000; COLOMBO & GUIMARÃES, 2003; DEBUSK et al.,1994; COLOMBO, 2000; DIGNANI, SOLOMKIN, ANAISSIE, 2003; COLOMBO & GUIMARÃES, 2003; FILLER & KULLBERG, 2003). Infecções do trato urinário por Candida spp. merecem atenção por sua freqüência. Podem ser a expressão de uma simples colonização, uma verdadeira infecção ou, menos frequentemente, uma conseqüência da manifestação de uma candidemia (FEBRÉ et al.,1999; SOBEL et al., 2000). Corresponde a 27% das infecções associadas a cateter e 10 a 15% das infecções urinárias nosocomiais em geral. Poucos são os trabalhos publicados a respeito de infecções por Candida spp. no trato respiratório e urinário, provavelmente pela dificuldade de serem diferenciadas de colonização (SOBEL et al., 2000). A maior parte das investigações publicadas sobre. infecções. nosocomiais. referem-se. as. candidemias. (COLOMBO. &. GUIMARÃES, 2003), por isto, esta será a forma clínica mais abordada no presente estudo..

(23) 23. 1.4 OCORRÊNCIA E PREVALÊNCIA DO GÊNERO Candida EM INFECÇÕES NA CORRENTE SANGUÍNEA Entre os anos de 1980 e 1990, o Center for Disease Control and Prevention (CDC) coletou dados de infecções fúngicas nosocomiais referente a 115 hospitais, reunindo um total de 30.477 infecções fúngicas documentadas. Foi possível observar que na década de 80 houve um aumento de 400% na incidência de candidemia nos principais hospitais americanos (BECK-SAQUÉ & JARVIS, 1993) e nos anos 90 Candida spp. já era considerada o quarto principal agente de infecção em corrente sanguínea (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003). Nos Estados Unidos da América (EUA), Pfaller et al. (1998a) e Edmond et al. (1999) observaram que o gênero Candida foi o quarto agente mais isolado em hemoculturas, representando 8% das infecções da corrente sanguínea, precedido apenas. por. Staphylococcus. coagulase-negativo,. Staphylococcus. aureus. e. Enterococcus spp. No Canadá, foi realizado um estudo retrospectivo e a Candida spp., foi o 13° agente mais isolado em hemocultura entre 1976 e 1980, o 9° entre 1981 e 1985, o 6° entre 1986 e 1990, passando para o 4° lugar entre 1991 a 1996, perdendo em freqüência apenas. para. Staphylococcus. coagulase-negativo,. Staphylococcus. aureus. e. Escherichia coli (KARLOWSKY et al.,1997). Na Europa, Voss et al. (1996) conduziram um estudo retrospectivo entre 1987 e 1994 em cinco hospitais terciários da Holanda. Resultados de 395.000 hemoculturas foram avaliados e observou-se um aumento de quase 100% no número de casos de candidemia, com uma transição de 53 para 95 episódios/ano durante o período analisado. O aumento da candidemia foi paralelo ao aumento de Candida nãoalbicans, principalmente C. glabrata. Na Ásia, em um estudo retrospectivo no período de 1981 a 1999 sobre infecções hospitalares em Taiwan, foram analisados 35.000 microrganismos envolvidos em infecções nosocomiais, grande parte deles recuperados de hemocultura. Durante o.

(24) 24. estudo, a ocorrência de fungemias por Candida spp. aumentou de 1% em 1981 para 16.2% em 1999 (HSUEH et al., 2002). No Brasil, um estudo epidemiológico reunindo dados sobre infecções de corrente sanguínea, documentados em quatro hospitais da cidade de São Paulo, durante um período de 12 meses (março/2002 a fevereiro/2003) avaliou-se 7.038 episódios de bacteremias e fungemias, sendo que Candida spp. correspondeu a 4,3% do total das infecções (COLOMBO, 2003). A candidemia tem sido considerada a quarta causa de infecção hospitalar no Brasil, apresentando uma freqüência de duas a quinze vezes maior do que a observada em outros países (COLOMBO et al., 2006). Foi detectada no Brasil, uma freqüência de 2.49 casos de candidemia para cada mil admissões em hospitais. Nos Estados Unidos esta freqüência tem variado de 0.3 a 1.0 /1.000 admissões, no Canadá é de 0.45/1.000 admissões (GUDLAUGSSON et al., 2003; TORTORANO et al., 2004) e na Europa, a frequência é ainda menor, variando de 0.2 a 0.8/1.000admissões (NUCCI, M. Entrevista disponível no site http://www.sbrafh.org.br/noticias/158.html , acessado em março 2006; COLOMBO et al.,2006). 1.5 OCORRÊNCIA E PREVALÊNCIA DE ESPÉCIES DE Candida NÃO-albicans EM INFECÇÕES NA CORRENTE SANGUÍNEA A espécie Candida albicans é a mais freqüente na etiologia das infecções humanas (EGGIMANN, GARBINO, PITTET, 2003), mas as espécies de Candida não-albicans tendem a ocupar este lugar, pois são emergentes e em muitos estudos, já aparecem com porcentuais similares aos de C. albicans (PFALLER et al., 2004; PFALLER & DIEKEMA, 2004). O interesse na identificação de espécies não-albicans em episódios de infecções invasivas, deve-se não apenas à relevância epidemiológica desta informação mas, também às dificuldades terapêuticas esperadas para algumas destas espécies, seja em relação ao tratamento com drogas triazólicas, como o fluconazol, ou mesmo a anfotericina B (FREYDIERE, GUINET, BOIRON, 2001). As espécies de Candida,.

(25) 25. diferem na suscetibilidade às drogas antifúngicas e por isto, a rápida identificação das espécies reveste-se de importância fundamental. Nos EUA, Debusk et al.(1994), avaliando 106 episódios de candidemia, verificaram que antes de 1990, a Candida albicans correspondia de 60% a 80% dos casos isolados. As espécies não-albicans predominaram após esse período e C. tropicalis e C. parapsilosis foram as mais freqüentes. Pfaller et al. (1998d) reuniram amostras de Candida spp. de cinqüenta hospitais dos EUA e demonstraram que as espécies não-albicans correspondiam a 48% do total de 379 episódios de candidemia, sendo as espécies mais prevalecentes: C. glabrata (17%), C. parapsilosis (16%), C. tropicalis (12%) e C. krusei (3%). Baseado em diversos programas de vigilância nos EUA, Pfaller & Diekema (2002) revelaram que, no período de 1992 a 2001, a distribuição das espécies de Candida mostrou a emergência de C. glabrata como a segunda causa mais comum de candidemia. Vários programas de vigilância têm documentado as tendências na distribuição das espécies de Candida spp. Algumas variações têm ocorrido em diferentes instituições, entre as localidades e até mesmo entre países (NGUYEN et al.,1996; PFALLER et al.,1998a; SANDVEN et al., 1998; YAMAMURA et al., 1999; COLOMBO et al.,1999; KAO et al.,1999; PFALLER et al.,1999b; PFALLER et al., 2000a; STGERMAIN et al., 2001, ALMIRANTE et al., 2003, MARCO et al., 2003, DURAN et al., 2003). Este fato pode ser devido às diferenças de prescrição antifúngica ou as práticas de controle de infecção (PFALLER et al.,1998a). No Canadá, um estudo multicêntrico de vigilância (1996 a 1998) em 51 hospitais, com 442 isolados de Candida spp., isolados de diferentes sítios, mostrou que a distribuição das espécies, incluiu: C. albicans (54%), C. glabrata (15%), C. parapsilosis (12%), C. tropicalis (9%), C. lusitaniae (3%), C. krusei (3%) e Candida spp. (3%) (ST-GERMAIN et al., 2001), mostrando distribuição similar à encontrada pelos programas de vigilância dos EUA (PFALLER et al., 2000a). Pfaller et al. (1998e) estudaram 306 episódios de candidemia envolvendo 34 centros nos EUA, Canadá e América do Sul, e observaram que 53% das candidemias.

(26) 26. estavam relacionadas à C. albicans, 16% à C.parapsilosis, 15% à C.glabrata, 8% à C. tropicalis, 2% à C.krusei, 0.7% à C. guilliermondii e 5.8% à outras espécies de Candida. Entretanto, observou-se marcante variação na distribuição dessas espécies entre os diferentes países. Nos EUA, 44% foi por espécies não-albicans (C. glabrata a mais comum) e no Canadá, 47% (C. parapsilosis a mais comum). Na América do Sul, Candida albicans representou 40% dos isolados da corrente sanguínea, seguida por 38% de C. parapsilosis e 12% de C. tropicalis. A espécie C. glabrata foi isolada apenas em um caso na América do Sul. Ainda, Pfaller & Diekema (2004) determinaram a prevalência entre as espécies de Candida em 6082 casos de candidemia, coletados em 250 centros médicos de 32 países. Variações foram observadas durante todo o período e nas áreas geográficas estudadas. A proporção de candidemia por C. albicans e C. glabrata aumentou e por C. parapsilosis diminuiu no Canadá, nos EUA e na Europa. Na América Latina e Ásia, a C. glabrata foi uma causa infrequente de candidemia. Em geral, C. parapsilosis e C. tropicalis foram os patógenos mais comumente isolados de candidemia na América Latina, juntos eles representam 55% dos casos, enquanto a C. glabrata foi a segunda espécie mais freqüente nos EUA/Canadá e incomun na América Latina (COLOMBO et al.,1999; PFALLER et al., 2000a). No Brasil, os episódios de candidemia foram sistematicamente estudados em seis hospitais universitários do Rio de Janeiro e São Paulo e as espécies não-albicans representaram 63% dos casos de candidemia, sendo a C. parapsilosis e a C. tropicalis, as espécies mais freqüentes (COLOMBO et al.,1999; COLOMBO, 2000; COLOMBO et al., 2003b). Os dados citados foram confirmados por outros autores, que mostraram a relevância de infecções invasivas por C. parapsilosis e por C. tropicalis no nosso meio. (COSTA et al., 2000; GODOY et al., 2003; GOLDANI & MÁRIO, 2003). Ainda no Brasil, Antunes et al. (2004), encontraram no Estado do Rio Grande do Sul uma prevalência de 52% de Candida albicans enquanto que as espécies não-.

(27) 27. albicans mais encontradas foram C. parapsilosis (26%), C. tropicalis (13%), C.glabrata (3%) e C. krusei (2%). Um estudo retrospectivo dos casos de candidemia em um hospital de Fortaleza, Ceará, assinalou que as espécies não-albicans foram responsáveis por 72% dos casos de fungemia, onde a C. parapsilosis se constituiu como a espécie mais isolada (MEDRANO et al., 2006). 1.6 SUSCETIBILIDADE DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES DE Candida A DROGAS ANTIFÚNGICAS Na década de 60, somente cinco espécies do gênero Candida eram consideradas de importância clínica: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii e C. stellatoidea (atual sinônimo de C. albicans). Atualmente, existem mais de dezessete espécies do gênero reconhecidas como causadoras de infecções em humanos (HAZEN,1995; DIGNANI, SOLOMKIN, ANAISSIE, 2003). Entretanto, as principais espécies de interesse clínico são: C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae. Alguns casos têm sido atribuídos a outras espécies emergentes, agentes de doenças superficiais e invasivas, como: C. dubliniensis, C. kefyr, C. rugosa, C. famata, C. utilis, C. lipolytica, C. norvegensis e C. inconspícua (COLEMAN et al.,1998). Candida albicans continua sendo a espécie mais frequentemente associada à infecções superficiais e profundas (SOBEL et al., 2000; SANT’ANA et al., 2002, COLOMBO et al., 2003b). Trata-se de uma levedura com grande potencial patogênico, devido a sua capacidade de aderência a diferentes tipos de epitélios e mucosas e ao seu dimorfismo, capaz de produzir estruturas filamentosas que auxiliam a invasão tissular, bem como a produção de enzimas extracelulares como proteinases e fosfolipases (DIGNANI, SOLOMKIN, ANAISSIE, 2003). A maioria das espécies de Candida é naturalmente suscetível aos antifúngicos utilizados na terapia, porém, são conhecidos casos de resistência intrínseca ou adquirida a azólicos, em cepas isoladas de pacientes que foram expostos a terapia prolongada com estes agentes (COLOMBO & GUIMARÃES, 2003). Por outro lado,.

(28) 28. tem sido observado que à anfotericina B, este tipo de resistência é muito rara (SANGLARD & ODDS, 2002). Candida tropicalis apresenta importante potencial biológico como agente oportunista, quando o hospedeiro encontra-se neutropênico, quando existe supressão da microbiota normal pela antibioticoterapia e ainda, quando ocorrem danos à mucosa gastrointestinal (WINGARD, 1995). Tem sido relatada como segunda ou terceira espécie mais isolada de hemoculturas em pacientes com neoplasias (mais freqüente em leucemias e menos em tumores sólidos) ou submetidos a transplante de medula óssea (WINGARD, 1995) No Brasil, essa espécie de Candida é frequentemente isolada, mesmo em pacientes não portadores de neoplasias sendo considerada a segunda ou terceira espécie mais observada em casos de candidemia (COLOMBO et al., 1999; COSTA et al., 2000; GODOY et al., 2003; GOLDANI & MÁRIO, 2003). São sensíveis a anfotericina B e geralmente aos triazólicos (GOLDANI & MÁRIO, 2003). Candida glabrata é um importante patógeno hospitalar, que apresenta menor suscetibilidade ao fluconazol e, consequentemente, tem sido observado maior índice de colonização/infecção por esta espécie em diferentes grupos de pacientes sob uso prolongado de fluconazol (SAFRAN & DAWSON, 1997; SENDID et al., 2006). Estudos evidenciam que, em geral, 10% das cepas de C. glabrata, recuperadas de casos de candidemia, apresentaram-se resistentes ao fluconazol (DIEKEMA, PFALLER, JONES, 2002). Pfaller et al. (2001) documentaram também menor sensibilidade dessa espécie à anfotericina B. Em uma análise de 949 isolados clínicos de C. glabrata, observou-se que cerca de 53% das amostras avaliadas apresentavam Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) >1µg/mL, valor considerado alto para terapêutica com doses convencionais deste medicamento. Outro aspecto epidemiologicamente interessante é a sua maior ocorrência em pacientes idosos (PFALLER et al., 2002b). Em um estudo de vigilância realizado na América do Norte, do Programa EIEIO (Emerging Infections and the Epidemiology of Iowa Organisms), observou-se que C. glabrata teve maior prevalência entre.

(29) 29. pacientes idosos, representando 25% de todas as fungemias documentadas em pacientes maiores de 65 anos (DIEKEMA, PFALLER, JONES, 2002). Candida parapsilosis é um importante patógeno hospitalar desde os anos 80, sendo responsável por 7% a 15% dos casos de candidemias publicados nos EUA e Europa (PFALLER, 1996; VOSS et al., 1996). Por outro lado, em crianças e recém-nascidos prematuros internados em UTIN, sua prevalência em candidemia pode representar 17% a 50% dos casos (LEVY, 1998; PFALLER & DIEKEMA, 2002, DURÁN, 2005). A aquisição nosocomial, tem sido descrita também em pacientes receptores de transplante de medula óssea e internados em UTI (SANCHEZ et al.,1993). O isolamento da mesma cepa de pacientes, de profissionais da saúde e de superfícies hospitalares sugere a via exógena como a principal fonte de infecção e potencial para surtos nosocomiais (SANCHEZ et al.,1993; STRAUSBAUGH et al.,1994). Essa espécie frequentemente coloniza a pele, prolifera-se em soluções contendo glicose e em nutrição parenteral (WINGARD, 1995; CLARK et al., 2004; DURÁN et al., 2005) e tem grande capacidade de produzir biofilmes, aderindo-se à superfície de cateter venoso (LEVIN et al., 1998). Vários estudos estabelecem claramente uma associação entre a utilização de cateter venoso em posição central e maior ocorrência de fungemia por este agente (LEVIN et al.,1998, BRITO et al., 2006). Cepas desta espécie são geralmente sensíveis a anfotericina B e aos triazólicos (DIEKEMA, PFALLER, JONES, 2002; SANGLARD & ODDS, 2002). Candida krusei parece ser um patógeno hospitalar ocasional, isolado principalmente de pacientes portadores de doenças malignas e submetidos a transplante de medula óssea (GOLDMAN, POTTAGE, WEAVER, 1993; WINGARD, 1995; IWEN et al., 1995; SAFDAR et al., 2001).. Essa espécie é intrinsecamente resistente ao. fluconazol e alguns autores relataram aumento da ocorrência de candidemia por esta levedura em pacientes neutropênicos expostos ao uso desse antifúngico (fluconazol) por períodos prolongados (WINGARD et al.,1991; GOLDMAN, POTTAGE, WEAVER, 1993; REX et al., 2001). Pode ser também menos suscetível a anfotericina B (TRICK & JARVIS, 1998). Candida lusitaniae é uma espécie considerada oportunista e de isolamento pouco freqüente em amostras clínicas, mas tem sido relatada como agente de candidemia.

(30) 30. em pacientes imunocomprometidos. Dos 86 casos descritos de doença invasiva por esta espécie, 70 foram de pacientes com câncer. Alguns isolados clínicos de C. lusitaniae têm resistência primária a anfotericina B ou a desenvolvem rapidamente quando expostos in vivo a este antifúngico. Essas espécies são sensíveis aos triazólicos (MERZ, 1984; HADFIELDI et al.,1987; WINGARD, 1995; PIETRUCHADILANCHIAN et al., 2001; McCLENNY et al., 2002 ). Candida guilliermondii é também infrequente, mas vem sendo reconhecida como uma espécie emergente na América Latina (Pfaller et al., 2006b), principalmente em pacientes com câncer. Tem sido reportada, com diminuição na suscetibilidade a drogas antifúngicas. Há relatos de resistência in vitro a anfotericina B e pode apresentar uma insatisfatória resposta clínica em pacientes tratados com este poliênico, embora seja ainda limitado o número de informações disponíveis na literatura. Existem dúvidas sobre a real eficácia da anfotericina B como terapia em pacientes com candidemia (HAZEN,1995; KRCMERY et al.,2002; KRCMERY & BARNES, 2002). Entre as diferentes espécies de Candida, com resistência ao fluconazol (CIM ≥64 µg/mL) e ao itraconazol (CIM ≥ 1.0 µg/mL) foram observadas em cepas de C. glabrata e C. krusei e, raramente entre cepas de outras espécies. Isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. guilliermondii apresentaram elevada sensibilidade ao fluconazol (99.4 a 100%) e ao itraconazol (95.8 a 100%). Ao contrário, 8.7% dos isolados de C. glabrata e 100% de C. krusei foram resistentes ao fluconazol e, 36.9% de C. glabrata e 66.6% de C krusei foram resistentes ao itraconazol, não havendo diferenças geográficas na suscetibilidade a estes agentes (PFALLER et al.,1998a). Avaliando a tendência global, Pfaller & Diekema (2004) observaram pouca variação na suscetibilidade ao fluconazol entre isolados de C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis (91 a 100% sensíveis), independentemente da área geográfica, porém foram observadas taxas que variavam entre 0 a 23% de resistência ao fluconazol em isolados de C. glabrata, de acordo com regiões e países..

(31) 31. Da mesma forma, um estudo espanhol revelou a prevalência de espécies nãoalbicans, mas a resistência foi rara entre as espécies mais comuns (MARCO et al., 2003). Gaudlaugsson et al. (2003) encontraram somente três cepas resistentes ao fluconazol (1 C. glabrata e 2 C. krusei) em 108 casos de candidemia e a maioria (56%) dos isolamentos de C. glabrata apresentou suscetibilidade dose-dependente (16-32 µg/ml). Na América Latina, em 4 países, as espécies de C. não-albicans representou 58% de todos os isolados de candidemia, sendo as espécies mais freqüentes: C. tropicalis (24%), C. parapsilosis (21%) e C.glabrata (8%). Essas espécies foram sensíveis ao fluconazol (GODOY et al., 2003). No Brasil, ANTUNES et al. (2004) não encontraram resistência aos antifúngicos testados (anfotericina B, fluconazol e itraconazol) e a suscetibilidade dosedependente ao fluconazol ocorreu em 1.6% dos isolados (todos da espécie C. Krusei) já a sensibilidade ao itraconazol ocorreu em 14%: C. krusei (50%), C. glabrata (25%), C. parapsilosis (16%), C tropicalis (12%) , C. albicans (7%). 1-7 TESTES DE SUSCETIBILIDADE AOS AGENTES ANTIFÚNGICOS Os testes de suscetibilidade a drogas antifúngicas vêm se tornando cada vez mais importantes, devido ao aumento das infecções fúngicas e à emergência da resistência a essas drogas. Observa-se nos últimos anos uma mudança no espectro das etiologias das candidemias,. atribuída. principalmente. ao. aumento. de. hospedeiros. imunocomprometidos e ao largo uso de terapia antifúngica profilática e empírica (NGUYEN et al.,1996), acompanhada da emergência de espécies não-albicans com menor sensibilidade ou, até mesmo, resistência a agentes antifúngicos (REX, RINALDI, PFALLER, 1995; DENNING et al., 1997)..

(32) 32. Os testes são aplicados principalmente com a finalidade de se predizer uma resposta in vivo de uma infecção fúngica a um tratamento, ou pelo menos prever falência clínica, ou avaliar a eficácia de novas drogas antifúngicas recentemente introduzidas no mercado (HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). A terapia para micoses profundas incluía apenas o antibiótico poliênico anfotericina B e compostos sintéticos imidazólicos (cetoconazol) e triazólicos (fluconazol e itraconazol) (POWDERLY et al.,1988; ESPINEL-INGROFF, RODRÍGUEZ-TUDELA, MARTÍNEZ-SUÁREZ, 1995). A anfotericina B foi por muitos anos o único agente terapêutico largamente utilizado em infecções fúngicas invasivas, apresentando constante eficácia, com poucos casos descritos de falência clínica (DRUTZ & LEHRER, 1978; POWDERLY et al.,1988). Seu mecanismo de ação se baseia na ligação ao ergosterol na membrana citoplasmática do fungo. Apesar de seu baixo custo, é associada à altíssima toxicidade renal, sendo as formulações lipídicas uma opção interessante, por apresentarem. significativamente. menos. nefrotoxidade. que. a. formulação. desoxicolato, porém apresentam custo elevado (ROGERS, 2002). Ainda assim, a anfotericina B continua sendo largamente utilizada para o tratamento das infecções fúngicas (REX et al., 2001), apresentando um largo espectro de atividade, atuando sobre Candida spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Coccidioides spp., Paracoccidiodes spp., Sporothrix spp., Fusarium spp., Blastomyces spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp. e Rhizopus spp. (LACAZ et al., 2002). O fluconazol e o itraconazol são agentes antifúngicos bem tolerados, com boa atividade sobre a maioria das espécies de Candida (MILAN, 1998; PFALLER et al., 1999c; PFALLER et al.,2001; COLOMBO et al., 2002) e seu mecanismo de ação, como os demais azólicos, baseia-se na inibição da síntese do ergosterol (PFALLER et al.,2003). O aumento do uso de fluconazol tem levado ao aumento da resistência entre espécies de Candida, principalmente C. glabrata (REX, RINALDI, PFALLER, 1995; MILAN et al.,1998), porém o seu uso em instituições pública, tem sido limitado, devido ao custo elevado (COLOMBO et al., 2002)..

(33) 33. Antes de 1980, não se fazia necessário a realização de teste de suscetibilidade aos antifúngicos, devido ao baixo número de infecções por espécies de Candida, ao pequeno número de drogas antifúngicas disponíveis comercialmente e também pela constante eficácia da anfotericina B. A partir dos anos 90 houve um avanço no tratamento das infecções fúngicas, tornando-se necessária a avaliação da eficiência de novas drogas, consideradas mais potentes e menos tóxicas, como o novo triazólico de segunda geração (voriconazol) e a equinocandina (caspofungina) (PFALLER et al., 2003). O voriconazol é atualmente disponibilizado comercialmente para o tratamento de varias micoses sistêmicas, apresentando um largo espectro de atividade contra a maioria dos fungos patogênicos (SWINNE, WATELLE, NOLARD, 2005; PFALLER et al., 2006a). As equinocandinas (caspofungina) representam uma nova classe de antifúngicos, apresentando um mecanismo de ação baseado na inibição da síntese de betaglucana, polímero importante da parede celular dos fungos (PFALLER et al., 2003). Os novos antifúngicos tiveram o espectro de ação estendido para isolados de Candida spp. menos susceptíveis aos outros azólicos ( C. krusei e C. glabrata), e fungos filamentosos como o Aspergillus spp.( PFALLER et al., 2002a, PFALLER et al.,2006a). Contudo, ao contrário dos teste de suscetibilidade para bactérias, que tem sido um guia para clínicos na seleção de terapia apropriada, testes de suscetibilidade aos antifúngicos permanecem em evolução (REX et al.,1995b; ESPINEL-INGROFF, 1997; REX et al., 1997; MILAN et al., 1998; NEELY & GHANNOUM, 2000 ). Por essa razão, a necessidade de introdução de teste de suscetibilidade para drogas antifúngicas, com metodologia rápida, confiável e de fácil execução, foi recebendo mais e mais atenção (POWDERLY et al.,1988; PFALLER & RINALDI, 1993; ESPINEL-INGROFF, 1994). Vários estudos multicêntricos foram realizados para definir as padronizações ideais para o teste, com o objetivo de se obter uma boa reprodutibilidade inter e intra laboratorial, incluindo o controle de importantes variáveis que poderiam interferir no.

(34) 34. resultado final. Essas variáveis são o preparo do inóculo, a composição química, o pH do meio, a temperatura de incubação e os critérios de leitura e interpretação do teste (PFALLER, et. al.,1988; PFALLER, et. al.,1990; ESPINEL-INGROFF et. al., 1992; PFALLER & RINALDI, 1993; REX et. al.,1993; REX et. al., 2001; NCCLS, 2002). Esses estudos foram fundamentais para o estabelecimento de normas técnicas padronizadas e embasaram a publicação, em 1997, pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), antigo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), do documento M27-A como método de referência para teste de suscetibilidade in vitro de leveduras (Candida spp. e Cryptococcus spp.) a cinco agentes antifúngicos de uso sistêmico (NCCLS, 1997). Posteriormente, em 2002, foi aprovado e publicado o documento M27-A2, uma nova edição do método de referência, introduzindo alguns aperfeiçoamentos (NCCLS, 2002). O M27-A2 foi considerado como padrão ouro para teste de suscetibilidade a antifúngicos, com aceitação e utilização em todo o mundo. Contudo, esse teste é ainda considerado laborioso, não prático para aplicação na rotina de laboratório clínico, requerendo pessoal treinado e especializado, principalmente para as leituras dos resultados com os antifúngicos azólicos, devido ao crescimento remanescente tipo trailing, que muitas espécies de Candida spp. apresentam. com. estas. drogas.. Observando-se assim,. a. necessidade de. desenvolvimento de outros tipos de teste, com metodologia mais simples e aplicável a rotina de laboratório clínico. Alguns testes alternativos vêm sendo avaliados nos últimos anos (ANAISSE, PAETZNICK, BODEY, 1991; ESPINEL-INGROFF et al., 1991; ESPINEL-INGROFF et al.,1994; SEWELL, PFALLER, BARRY, 1994; PFALLER et al.,1994; ESPINEL-INGROFF, RODRÍGUEZ-TUDELA, MARTÍNEZSUÁREZ ,1995; COLOMBO et al.,1995; ELDER et al.,1996, MAGALDI et al., 2001; COLOMBO, 2002 , MAXWELL et al., 2003). Entre as novas propostas de testes disponíveis comercialmente, o Etest® é um método para a determinação das CIMs de droga antifúngica, baseado na difusão de droga em meio sólido, a partir de fitas plásticas com diferentes gradientes de.

(35) 35. concentração de agente antifúngico, e tem mostrado ser um método alternativo e confiável (COLOMBO et al.,1995a; WANGER et al.,1995; CHEN et al.,1996; ESPINEL-INGROFF et al.,1998, LOZANO CHIU et al., 1998; PFALLER et al.,1998b; SZEKELY, JOHNSON, WARNOCK 1999; PFALLER, 2000). Boa correlação tem sido reportada entre Etest® e o método de referência, de microdiluição em caldo (CLSI), quando fungos patogênicos foram testados contra vários agentes antifúngicos como anfotericina B (WANGER et al.,1995; ESPINELINGROFF et al.,1996; LOZANO-CHIU et al., 1998; PFALLER, MESSER, BOLMSTRÖM, 1998), e triazólicos como fluconazol (COLOMBO et al.,1995a; ESPINEL-INGROFF et al.,1996; CHEN et al.,1996; MAXWELL et al., 2003), itraconazol (COLOMBO et al.,1995b; CHEN et al.,1996; ESPINEL-INGROFF et al., 1996; MAXWELL et al., 2003) e voriconazol (RUHNKE, SCHMIDT-WESTHAUSEN, TRAUTMAN, 1997; ESPINEL-INGROFF,1998; MARCO et al., 1998; PFALLER et al., 1998c; PFALLER et al., 1999a; ESPINEL-INGROFF, WHITE, PFALLER, 1999; PFALLER et al., 2000b). Um estudo realizado no Brasil por Colombo et al. (1995b), avaliou como boa a correlação entre as duas metodologias para diferentes leveduras, considerando valores entre duas diluições, porém com concordância para C. tropicalis de apenas 53% para fluconazol e 33% para itraconazol, entre os valores de CIMs dentro uma diluição. De um modo geral, estudos comparando Etest® com o método de referência têm mostrado mais de 90% de concordância entre os resultados para fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol, obtidos dentro de duas diluições (COLOMBO et al.,1995a ;CHRYSSANTHOU & CUENCA-ESTRELLA, 2002; MATAR et al., 2003). A correlação clínica e o resultado do teste de suscetibilidade para infecções profundas por Candida spp. permanece ainda em controvérsia (REX et al.,1995b), porque essas infecções usualmente ocorrem em pacientes imunodeficientes ou debilitados, com infecções bacterianas comumente associadas, dificultando assim a avaliação. da. resposta. clínica. ao. agente. antifúngico. (FISHER-HOCH. &. HUTWAGNER, 1995), além do uso de materiais protéticos ou cateteres, da.

(36) 36. dificuldade de acesso da droga ao sítio da infecção e à farmacocinética ou biodisponibilidade do antifúngico (HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). Contudo, em um estudo realizado com 32 pacientes HIV negativos, observou-se boa correlação clínica entre valores de CIMs (CLSI) e resposta ao tratamento com fluconazol. A taxa de sucesso terapêutico foi de 79% para os pacientes com cepas consideradas sensíveis, de 66% para os pacientes com cepas classificadas como suscetíveis dose-dependente (SDD) e de 0% para os pacientes com cepas na categoria resistente (LEE et al., 2000). Apesar dos avanços obtidos na correlação clínico-laboratorial dos testes de suscetibilidade com triazólicos, o mesmo não acontece em relação ao cetoconazol e a anfotericina B (REX et al.,1995b; FISHER-HOCH & HUTWAGNER, 1995; NGUYEN et al.,1998; CLANCY & NGUYEN, 1999, HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). Vários autores sugerem que a metodologia do CLSI apresenta dificuldades na detecção de isolados resistentes a anfotericina B, devido a estreita variação das CIMs nessa metodologia, obtidas com diferentes isolados clínicos. Consequentemente, o CLSI ainda não estabeleceu, até o momento, valores de corte para anfotericina B e cetoconazol (NCCLS, 2002; HOSPENTHAL, MURRAY, RINALDI, 2004). O ponto de corte para o voriconazol foi estabelecido recentemente, sendo considerado sensível: CIM ≤1 µg/mL, SDD: CIM= 2 µg/mL e resistente(R) CIM ≥4 µg/mL (PFALLER et al., 2006). Existem poucos estudos descrevendo o impacto dos testes de suscetibilidade no sucesso do tratamento das infecções fúngicas. Infelizmente a correlação entre os resultados dos testes, realizados por qualquer metodologia, e os resultados clínicos ainda não é satisfatória. Magiorakos & Hadley (2004), sugerem que a execução do teste de suscetibilidade em tempo real, permita uma terapia mais adequada para pacientes com candidemia. A epidemiologia das infecções nosocomiais causadas por Candida spp. tem mudado nos últimos anos, com emergência de espécies com reduzida suscetibilidade a agentes antifúngicos (EGGIMANN, GARBINO, PITTET, 2003), justificando a.

(37) 37. importância de pesquisas que levem ao aperfeiçoamento de métodos de diagnóstico, controle e tratamento de infecções causadas por esses microrganismos..

(38) 38. 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL. Estabelecer a ocorrência e a suscetibilidade a drogas antifúngicas de Candida nãoalbicans, isoladas de amostras clínicas de pacientes internados no Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes (HUCAM), Vitória-ES, durante o período de janeiro de 2003 a dezembro 2005.. 2.1.1 Objetivos específicos. I- Identificar todas. as espécies de Candida. isoladas no Hospital Universitário. Cassiano Antonio de Moraes (HUCAM) e distribuir as espécies não-albicans de acordo com o material clínico e setor do hospital.. II- Determinar a suscetibilidade in vitro das espécies pesquisadas aos seguintes antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e. itraconazol, através de teste de. microdiluição em caldo, de acordo com o documento M27-A2 (CLSI).. III- Comparar os resultados das CIMs obtidas, pelo método de referência, para cepas de C. tropicalis, com os resultados do teste de difusão em ágar, através de fitas Etest®.. IV- Avaliar a suscetibilidade de Candida tropicalis ao voriconazol, pelo método Etest®..

(39) 39. 3 METODOLOGIA 3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS Os materiais biológicos estudados consistiram de sangue, urina, swabs de secreções, ponta de cateter, líquidos orgânicos (pleural, ascítico e peritoneal) e outros (Anexo 9 e 11). Todos os materiais estudados foram obtidos dos pacientes internados no Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes (HUCAM), entre janeiro de 2003 e dezembro de 2005. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo e os pacientes foram dispensados de assinar o termo de consentimento. 3.2 ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS Amostras de sangue e líquidos orgânicos foram processadas no Laboratório de Análises Clínicas, Setor de Microbiologia do HUCAM, pelo sistema automatizado BactAlert (Organon Teknika, França), enquanto os demais materiais foram processados manualmente. Os meios de cultura empregados para isolamento de microrganismos detectados por sistema automatizado ou manualmente foram: ágar Sangue, ágar Chocolate e ágar Cled. O isolamento de leveduras foi confirmado pela sua morfologia característica, observada na coloração pelo método de Gram. Leveduras pertencentes a outros gêneros, como Cryptococcus e Trichosporon, foram excluídas nesta etapa, pelas suas micromorfologias distintas: presença de cápsula e artroconídios, respectivamente. As leveduras foram encaminhadas ao Laboratório de Micologia do Núcleo de Doenças Infecciosas (NDI) da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), documentadas e congeladas em um banco de cepas, e as cepas foram mantidas a uma temperatura de – 80ºC em meio de caldo Sabouraud, com 20% de glicerol..

(40) 40. 3.3 IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Candida As leveduras foram subcultivadas em ágar Sabouraud Dextrose (Difco, Detroit, MI, USA). Em seguida subcultivadas no meio cromogênico CHROMagar Candida® (Instituto Pasteur, França), que permitiu a diferenciação de algumas espécies de Candida (Anexo 2). Nesse meio de cultivo, cepas de C. albicans foram inicialmente triadas pela formação de colônias verdes e a sua identificação foi confirmada pela técnica de indução positiva do tubo germinativo e/ou produção de clamidoconídeo. As demais espécies foram identificadas. pelo método clássico, baseado em. características micromorfológicas e bioquímicas, como a indução de pseudohifas e testes de assimilação e fermentação de fontes de carbono (WARREN & HAZEN,1995). As espécies não-albicans, com resultados duvidosos, foram também identificadas por análise do perfil de assimilação, detectado pelo método comercial manual API 20 C. AUX. (bioMérieux. Marcy-I’Étoile,França),. complementada. por. análise de. microcultivo. 3.3.1 Formação do tubo germinativo Um inóculo da cultura de Candida spp a ser identificada, foi inoculado em 0,5 mL de soro fetal bovino, incubado por 2 h a 35°C e observado ao microscópio com aumento de 400x. A formação de início de filamentação (tubo germinativo) dentro deste período foi considerada como resultado positivo e confirmou a identificação da espécie C. albicans. 3.3.2 Indução de pseudohifa e clamidoconídeo Um inóculo da cepa a ser estudada foi semeado com três estrias paralelas, sobre superfície de ágar Cornmeal (Anexo 1a), em uma lâmina. O local destas estrias foi coberto com lamínula esterilizada e o meio incubado à temperatura ambiente, dentro de uma placa estéril de Petri, durante 48-72 horas e em atmosfera úmida..