5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.6. TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Foi realizada estatística descritiva, sendo os dados expressos em média e erro padrão da média (EPM). A normalidade dos dados foi testada por meio dos testes Skewness e Kurtosis. Para a análise de lactato pré e pós sessões foi empregada Anova Two-way com post hoc de Bonferroni . Para as variáveis NO, IL-6, TNFα e GLUT4 do Estudo 1, que foram utilizados analisados nos grupos G1, 2 e 4 (Intensidade) e G1, 3 e 4 (Duração) separadamente, o teste Anova One-way com post hoc de Tukey. Para as mesmas variáveis no Estudo 2, foi utilizado
teste t de Student, para dois grupos separadamente, e adicionalmente, o d de Cohen (1962) foi aplicado nos dois estudos para investigar a magnitude do efeito das comparações. Foi ainda analisado o Coeficiente de Correlação de Pearson entre NO, GLUT4 e glicemia. O nível de significância adotado no estudo foi de p≤0.05, sendo as análises realizadas através da utilização do software Graphpad Prism para Mac.
6. RESULTADOS
Os resultados encontram-se expressos através de média e erro padrão da média (EPM) e foram separados em Estudo 1 e 2 e em tópicos para melhor entendimento.
6.1. ESTUDO 1
Efeito da intensidade do exercício físico sobre a liberação de nitrito (NO2 -
). A figura 7A apresenta as comparações entre os grupos, sendo que o EF realizado de forma intensa promoveu maior liberação de NO2
-
(7.6 ± 0.3μM) quando comparado ao grupo de baixa intensidade – 3% 20’ (5.3 ± 0.7 μM) e CON (4.8 ± 0.7 μM), p≤0.05. CON 3% - 20 6% - 20 0 2 4 6 8 10 N O2 - (µ M ) * A CON 3% - 20 3% - 40 0 2 4 6 8 10 N O2 - ( µ M ) B
Figura 7: Resposta de nitrito (NO2 -
) após sessões realizadas em diferentes intensidades (A) e
durações (B).* p≤0.05 em relação aos grupos 3% 20’ e CON, por Anova One-way com post hoc
de Tukey.
Efeito da duração do exercício físico sobre a liberação de nitrito (NO2 -
). Quando realizadas comparações entre os grupos que se exercitaram em durações diferentes (3% 20’ e 3% 40’) não apresentaram diferenças na liberação de NO2
- entre si (5.3 ± 0.7 e 5.5 ± 1.0 μM)
e nem quando comparados ao grupo CON (Figura 7B). Ao contrário da intensidade, a duração do EF não alterou a produção de NO2
-
no pós-exercício.
Efeito da intensidade do exercício físico sobre o conteúdo de GLUT4 no músculo gastrocnêmio. No grupo submetido ao EF de alta intensidade (6% 20’) observou-se aumento significativo no conteúdo de GLUT4 (≅10.44pg/mL) quando comparado ao grupo que não
realizou EF (CON), sem diferença estatística para o grupo de baixa intensidade (3% 20’- 21.6 ±1.4 versus 29.2 ± 4.1 pg/mL – 6% 20’), apesar de um alto effect size= 1.23 quando calculado o d de Cohen (Figura 8A).
CON 3% - 20 6% - 20 0 10 20 30 40 G L U T 4 ( p g .m L -1) * A # CON 3% - 20 3% - 40 0 10 20 30 40 G L U T 4 ( p g .m L -1) B
Figura 8: Conteúdo de GLUT4 nos grupos experimentais após sessões de diferentes intensidades (A) e durações (B).* p≤0.05 em relação ao grupo CON, por Anova One-way com post hoc de Tukey; # effect size 1.23 em relação ao grupo 3% 20’, por d de Cohen.
Efeito da duração do exercício físico sobre o conteúdo de GLUT4 no músculo gastrocnêmio. Resultado semelhante ao do NO2
-
também foi obtido ao se analisar o conteúdo de GLUT4 em diferentes durações de EF (Figura 8B), não houve diferença entre os tempos e a sessão CON (21.6 ± 1.4; 21.9 ± 4.8 e 18.8 ±1.1pg/mL).
Tabela 4. Correlações entre variáveis obtidas após sessões experimentais.
NO2- GLUT4 Glicemia
NO2- 0,20 -0,06
GLUT4 0,20 0,44
Glicemia -0,06 0,44
NO2
-: nitrito plasmático; GLUT4: transportador de glicose tipo 4.
Efeito do exercício físico sobre a liberação IL-6 e TNFα. A tabela 5 apresenta os valores absolutos de IL-6 e TNFα no plasma e no músculo. Ao se realizar comparações entre os grupos experimentais pode-se averiguar diferenças estatísticas (P≤0.05) entre o exercício realizado em baixa intensidade (3% 20’) e o grupo CON para IL-6, somente no plasma. A respeito das concentrações de TNFα muscular houve um aumento após sessão CON em
relação à sessão de baixa intensidade (3% 20’) e alta duração (3% 40’) e diferenças estatísticas (p≤0.05) também foram observadas entre as sessões de baixa e alta intensidade. Para concentrações de TNFα plasmático não observou-se diferenças consideráveis.
Tabela 5. Valores absolutos de IL-6 (plasma e músculo) e TNFα (plasma e músculo) nas
quatro sessões experimentais (n=16).
CITOCINAS CON 3% 20’ 6% 20’ 3% 40’
IL-6 Plasma (pg/mL) 1656±46 1516±22 * 1536±41 1578 ± 24
IL-6 Músculo (pg/mL) 2135±28 2075±21 2133±33 2053±21
TNFα Plasma (pg/mL) 640±5 621±11 616±5 610±8
TNFα Músculo(pg/mL) 1463±19 1299±9 * # 1450±23 1372±29 *
IL-6: Interleucina 6; TNFα: Fator de Necrose Tumoral; CON: sessão controle. * p≤0.05 em relação ao grupo
CON; # p≤0.05 em relação ao grupo 6% 20’, por Anova One-way com post hoc de Tukey.
6.2. ESTUDO 2
Efeito do exercício físico sobre a liberação de nitrito (NO2 -
). A figura 9 (A-D) apresenta as comparações entre os grupos, sendo que analisando separadamente a presença da obesidade e resistência à insulina (Figura 9A e B) averigou-se menor liberação de NO2
-
após EF nos grupos Bk2r-/-/ob (8.3 ± 1.8μM) e ob/ob (20.1 ± 5.4μM) quando comparados aos
grupos Bk2r-/-/OB (19.4 ± 4.6μM) e OB/ob (39.1 ± 8.7μM) respectivamente. Quando a
ausência do receptor B2 é analisada isoladamente (Figura 9C e D), observou-se a influência
desse receptor na liberação de NO2 -
pós EF, sendo que os animais nocautes apresentam menores concentrações deste metabólito (p≤0.05).
Bk2 r -/- /ob Bk2r -/- /OB 0 10 20 30 40 50 N O2 - (µ M ) * (A) Bk2 r -/- /ob ob/ob 0 10 20 30 40 50 N O2 - (µ M ) * (C) ob/ob OB/ob 0 10 20 30 40 50 N O2 - (µ M ) (B) * Bk2 r -/- /OB OB/ob 0 10 20 30 40 50 N O2 - (µ M ) * (D)
Figura 9: Resposta de nitrito (NO2
-) após sessões experimentais em diferentes grupos. Bk 2r-/-/ob:
nocautes obesos; Bk2r-/-/OB: nocautes magros; ob/ob: obesos resistentes à insulina; OB/ob: heterozigotos
não resistentes à insulina * p≤0.05 em relação ao outro grupo analisado, por teste t de Student.
Efeito do exercício físico sobre o conteúdo de GLUT4 no músculo gastrocnêmio. Diferenças significativas (p≤0.05) foram obtidas ao se analisar a influência do receptor B2 na
concentração de GLUT4 após realização de EF (Figura 10D), no qual somente o grupo magro dos nocautes apresentou menores valores (24.2 ± 1.8pg/mL) desta proteína quando comparado ao grupo OB/ob (35.4 ± 2.3pg/mL). Porém ao se calcular o d de Cohen, observou- se um bom effect size=1.20 ao verificar a influência da obesidade nas comparações dos grupos ob/ob (28.6 ± 3.2pg/mL) e OB/ob (Figura 10B).
Bk2 r -/-/ob Bk2 r -/-/OB 0 10 20 30 40 G L U T 4 ( p g /m L ) (A) G L U T 4 ( p g /m L ) Bk2 r-/-/ob ob/ob 0 10 20 30 40 (C) G L U T 4 ( p g /m L ) ob/ob OB/ob 0 10 20 30 40 (B) # G L U T 4 ( p g /m L ) Bk2 r-/-/OB OB/ob 0 10 20 30 40 * (D)
Figura 10: Conteúdo de GLUT4 após sessões experimentais em diferentes grupos. Bk2r-/-/ob: nocautes
obesos; Bk2r-/-/OB: nocautes magros; ob/ob: obesos resistentes à insulina; OB/ob: heterozigotos não
resistentes à insulina * p≤0.05 em relação ao outro grupo analisado, por teste t de Student; # effect size 1.20 em relação ao grupo OB/ob, por d de Cohen.
Tabela 6. Correlações entre variáveis obtidas após sessões experimentais nos grupos ob/ob e
Bk2r-/-/ob. NO2- GLUT4 Glicemia NO2- 0,10 -0,47 GLUT4 0,10 -0,70* Glicemia -0,47 -0,70* * p≤0.05. NO2
Tabela 7. Correlações entre variáveis obtidas após sessões experimentais do estudo 1 e 2. NO2- GLUT4 Glicemia NO2- 0,44* -0,13 GLUT4 0,44* 0,02 Glicemia -0,13 0,02 * p≤0.05. NO2
-: nitrito plasmático; GLUT4: transportador de glicose tipo 4.
Efeito do exercício físico sobre a liberação IL-6 e TNFα. Em relação as concentrações de IL-6 plasmático (Tabela 8) observou-se maiores valores nos grupos nocautes (Bk2r-/-/ob e
Bk2r-/-/OB) comparados com os grupos ob/ob e OB/ob respectivamente, não se averiguando o
mesmo comportamento no IL-6 muscular.
A tabela 8 também apresenta comparações de TNFα plasmático e muscular nos diferentes grupos, sendo que o grupo nocaute magro (Bk2r-/-/OB) apresenta maiores valores
plasmáticos (p≤0.05) desta citocina em relação ao grupo sem tal alteração (OB/ob). Já em níveis musculares, os grupos nocautes (Bk2r-/-/ob e Bk2r-/-/OB) também apresentaram maiores
valores quando comparados aos grupos ob/ob e OB/ob respectivamente. Analisando somente o efeito da obesidade e resistência à insulina sobre a citocina podemos verificar também maiores valores no grupo ob/ob em comparação ao grupo OB/ob (p≤0.05).
Tabela 8. Valores absolutos de IL-6 (plasma e músculo) e TNFα (plasma e músculo) dos
quatro grupos experimentais (n=16)
CITOCINAS Bk2r-/-/ob Bk2r-/-/OB ob/ob OB/ob
IL-6 Plasma (pg/mL) 1897±79 * 1845±82 # 1602±39 1536±25
IL-6 Músculo (pg/mL) 2218±51 2120±24 2107±31 2054±45
TNFα Plasma (pg/mL) 678±20 684±16 # 650±27 597±13
TNFα Músculo(pg/mL) 1459±26 * 1491±72 # 1299±16 # 1242±23
IL-6: Interleucina 6; TNFα: Fator de Necrose Tumoral; Bk2r-/-/ob: nocautes obesos; Bk2r-/-/OB: nocautes magros;
ob/ob: obesos resistentes à insulina; OB/ob: heterozigotos não resistentes à insulina * p≤0.05 em relação ao
7. DISCUSSÃO
No estudo 1 ao se analisar os efeitos da intensidade e da duração do exercício aeróbio, na liberação de NO e translocação de GLUT4, os resultados do presente estudo demonstram a eficácia da natação, especialmente a realizada em alta intensidade (6% 20’), em promover um aumento na liberação de NO e no conteúdo de GLUT4 muscular, sugerindo que a intensidade na qual o EF é realizado tem um papel primordial no controle glicêmico, bem como nos seus mecanismos, enfatizando a importância do EF na prevenção e tratamento de doenças crônicas não-transmissíveis, como o diabetes e a obesidade.
Nos animais que se exercitaram em alta intensidade (6% 20’) o conteúdo de GLUT4 apresentou maiores valores que a sessão controle (CON), 29.2 ± 4.1pg/mL versus 18.8 ± 1.1pg/mL, respectivamente (p≤0.05) e quando comparado com a sessão de baixa intensidade (3% 20’) apesar de não apresentar diferença estatística observou-se um effect size considerável (1.23) (Figura 8A). Porém não houve diferença significativa em comparações (Figura 8B) realizadas envolvendo a duração do EF, sugerindo que esta não promove alterações no GLUT4, ao contrário do que foi visto com a intensidade.
Para comprovar a utilização de diferentes intensidades do EF no Estudo 1 foram realizadas coletas sanguíneas na cauda de cada animal no pré e pós exercício, para posterior mensuração de lactato. Assim, a Tabela 2 e Figura 5 evidencia maior estresse metabólico sofrido pelo grupo de alta intensidade, que se mantém diferente em relação ao momento repouso e as demais sessões, o que poderia justificar os resultados obtidos.
Evidências de que o EF realizado de forma aguda promove maior translocação de GLUT4, já vem sido relatados na literatura. Em humanos saudáveis, Thorell, Hirshman et al. (1999), verificaram uma aumento de 35% no conteúdo de GLUT4 após a realização de uma sessão a 70% do VO2máx por 60min. Resultado semelhante foi encontrado por Kennedy,
Hirshman et al. (1999) que observaram um aumento de 71% nessa proteína no momento pós- exercício (45-60min a 60-70% VO2máx) em comparação aos valores de repouso em cinco
indivíduos saudáveis. O mesmo estudo ainda mostrou uma maior concentração de GLUT4 na membrana, cerca de 74%, em relação aos valores de repouso, em indivíduos com DM2. Investigação recente ainda reforça este achado, mostrando que tanto em indivíduos saudáveis quanto diabéticos, há uma maior expressão de GLUT4 (60% e 66%, respectivamente) após a realização de 60min de EF, mantendo-se por até 3h do seu término (Hussey, Mcgee et al., 2012).
No que ainda diz respeito à intensidade, o efeito do EF continua controverso. Kraniou, Cameron-Smith et al. (2006) avaliaram o efeito de uma sessão de EF a 40% e 80% do VO2máx
na expressão de GLUT4 e verificaram que ambas produzem um aumento nesta proteína, sem diferença entre elas. Achados semelhantes a estes foram encontrados após oito dias de exercício de alta (14% PC) e baixa intensidade (2%PC) em ratos não sendo observado nenhuma diferença no conteúdo de GLUT4 (Terada, Yokozeki et al., 2001), contrapondo os achados do presente estudo.
Corroborando com a presente investigação segue Cunha (2011) como os seus achados que verificou um aumento na translocação de GLUT4 principalmente nos animais C57BL6 que se exercitaram em alta intensidade (20min, 6%PC), por oito semanas, quando comparados aos sedentários. Já em relação à duração do EF sobre a concentração de GLUT4 nenhum estudo foi encontrado para contrapor os presentes achados.
Uma maior translocação de GLUT4 produzida pelo EF torna-se um importante mecanismo para o controle glicêmico após a sua realização, principalmente para indivíduos diabéticos e obesos, mais propensos a apresentar resistência à insulina. Chibalin, Yu et al. (2000), mostram que após 16h da realização de EF ainda se tem um aumento na expressão de GLUT4, no transporte de glicose estimulado pela insulina, além de uma maior fosforilação dos componentes da cascata insulínica (IRS e PI3K). Moreira, Simões et al., (2011) sugeriram que tanto baixas (23% de 1RM) quanto moderadas intensidades (43% de 1RM) promovem controle da glicemia nessa população.
Entre os mecanismos envolvidos na translocação de GLUT4 e na captação de glicose estão a AMPK, o Ca+, o NO (Merry e Mcconell, 2009) e a BK (Mcconell e Kingwell, 2006). Como a AMPK encontra-se aumentada no pós-exercício, pode constituir um importante mecanismo para a maior translocação de GLUT4, juntamente com o NO que também encontra-se elevado nesse período (Torres-Leal, Capitani et al., 2009). O presente estudo ao verificar a influência do NO no conteúdo de GLUT4 após realização de EF, constatou que na sessão em que houve maior liberação de NO também ocorreu maior concentração de GLUT4, podendo ser confirmada tal hipótese. Além disso, pode-se perceber uma influência da intensidade do EF (Figura 7A) e não da duração nessa liberação (Figura 7B), no qual o exercício mais intenso (6% 20’) promoveu maior disponibilidade de NO2
- (7.6 ± 0.3μM)
quando comparado ao grupo de baixa intensidade – 3% 20’ (5.3 ± 0.7μM) e CON (4.8 ± 0.7 μM), p≤0.05 (Figura 7A).
Tais achados vão de encontro com os de Santana, Moreira et al. (2011) que ao submeterem idosas a três sessões experimentais (alta, moderada intensidade e sessão controle)
verificaram um aumento de NO2 -
imediatamente após ao EF de alta intensidade (401.3 ± 52.8μM), quando comparado ao período pré-exercício (286.6 ± 29.4 μM).
O papel do NO sobre a captação de glicose durante e após o EF é enfatizado por Roberts, Barnard et al. (1997), ao examinarem o efeito de uma sessão de EF no transporte de glicose no músculo esquelético com e sem inibição de NOS, verificaram que somente o EF aumenta o conteúdo de GLUT4 no sarcolema, o que não ocorre quando associados ao inibidor, o L-NAME. Corroborando com os achados de Kingwell, Formosa et al. (2002), que ao utilizarem o L-NAME perceberam uma maior redução na absorção de glicose durante o EF em DM2 quando comparado com os saudáveis, mostrando assim a importância do NO no metabolismo da glicose principalmente em indivíduos patológicos. No entanto, não existem evidências, a não ser a do presente estudo, quanto ao papel da intensidade do EF na disponibilidade de NO e benefício na concentração de GLUT4.
Ainda, Kishi, Muromoto et al. (1998) mostraram que a BK também pode promover a translocação de GLUT4 e maior absorção de glicose independente da insulina, provavelmente pelo número de receptores B2 presentes na superfície celular. Assim Taguchi, Kishikawa et al., (2000), ao avaliarem o envolvimento da BK na captação de glicose em humanos e ratos DM2 e saudáveis, concluíram que o EF aumentou as concentrações de BK e a translocação de GLUT4.
Sabe-se que quando ativados, os receptores B2 estimulam a formação de NO (Bhoola,
Figueroa et al., 1992). Desta forma, o objetivo do estudo 2 foi verificar a influência desse receptor na liberação de NO e consequente no conteúdo de GLUT4 e ainda a presença da obesidade e resistência à insulina na disponibilidade desses componentes. De acordo com os resultados da presente investigação, verificou-se que a ausência do receptor B2 prejudicou a
produção de NO induzida pelo EF tanto nos Bk2r-/- obesos (8.3 ± 1.8μM), quanto nos magros
(19.4 ± 4.6μM) em relação aos grupos ob/ob (20.1 ± 5.4μM) e OB/ob (39.1 ± 8.7μM) (Figura 11A-D) e ainda os nocautes magros apresentaram menor concentração de GLUT4 quando comparado ao grupo OB/ob (24.2 ± 1.8 versus 35.4 ± 2.3, p≤0.05 – Figura 9D).
Esses achados são similares aos encontrados por Loiola, Reis et al. (2011), que ao observarem camundongos Bk1r-/- e Bk2r-/- encontraram uma menor biodisponibilidade de NO,
apesar do aumento da NOS, porém sem sessão de EF prévia. Já Schweitzer, Castorena et al. (2011), observaram a importância do receptor B2 de BK no aumento da captação de glicose,
assim verificaram que a ausência desse receptor promove menor captação de glicose durante o EF, o que poderia ser justificado por uma menor concentração de GLUT4 nesses animais, comprovado no presente estudo.
Sabe-se que a glicose sanguínea de jejum é uma ferramenta útil para o diagnóstico do DM. De acordo com a American Diabetes Association (2010) níveis glicêmicos de jejum inferiores a 100 mg.dL-1 entram na normalidade, entre 100-125 mg.dL-1 o indivíduo é classificado como resistentes à insulina e para DM valores acima de 126 mg.dL-1. Na presente investigação os animais obesos e resistentes à insulina (ob/ob e Bk2r-/-/ob) apresentam níveis
glicêmicos de 113.0 ± 12.4 e 102.5 ± 7.7 mg.dL-1 (Tabela 2), respectivamente, sendo assim considerados pré-diabéticos.
Sabe-se que a obesidade e a resistência insulínica geram uma disfunção endotelial e assim uma menor produção de NO (Abate, 2000; Van Den Oever, Raterman et al., 2010). Os achados do presente estudo, expostos na Figura 9B demonstram que mesmo após uma sessão de exercício os animais obesos e pré-diabéticos apresentam menor liberação de NO quando comparado aos magros (20.1 ± 5.4 versus 39.1 ± 8.7μM). Apesar de não ter sido encontrada diferença estatística, pode-se verificar também uma redução no conteúdo de GLUT4 nos obesos (28.6 ± 3.2pg/mL) em relação aos magros (35.4 ± 2.3pg/mL), com um alto effect size (1.20) (Figura 10B).
Goodyear, Giorgino et al. (1995) mostraram que em músculo esquelético de pacientes obesos há uma redução da expressão (54%) e fosforilação de IRS-1 e diminuição da ativação da PI3K, o que também é visto em diabéticos tipo 2 magros e moderadamente obesos (Ryder, Gilbert et al., 2001), o que poderia influenciar na concentração de GLUT4 visto no presente estudo.
Ainda, maiores concentrações de citocinas inflamatórias, como o TNFα foram vistas no tecido muscular dos obesos em relação aos magros (Tabela 8), o que poderia prejudicar ainda mais o controle glicêmico e a translocação de GLUT4 nesse grupo. De Alvaro, Teruel et al. (2004) verificaram que o TNF-α impede a captação de glicose, mediante a uma cascata que gera uma fosforilação em serina do IRS, o que prejudica a ativação de PI3K e Akt e menor translocação de GLUT4.
Deste modo, o presente estudo demostra primeiramente que o exercício agudo realizado de forma intensa gera maior disponibilidade de NO e aumento na concentração de GLUT4 em animais convencionais podendo ser uma ferramenta útil para a prevenção e tratamento de patologias como a DM2 e a obesidade. Além disso, demonstra que a bradicinina, especificamente o receptor B2, bem como a presença obesidade e a resistência à
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