utilizadas na maturação ovocitária do sistema de produção in vitro de embriões bovinos

Bruna Santos

Priscila Santos Silva

Maria Gabriela Tavares Rheingantz

Margot Alves Dode

Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro

1_{Universidade Federal de Pelotas}

2_{Embrapa Centro de Recursos Genéticos e Biotecnologia} 3_{Embrapa Clima Temperado (ligia@cpact.embrapa.br)}

Palavras-chave: maturação ovocitária; fontes de FSH; embriões bovinos.

Introdução

A produção in vitro de embriões tem-se constituído em eficiente instrumento de auxílio para a produção de animais zootecnicamente explorados; no entanto, essa biotécnica ainda não atingiu sua máxima eficiência e a regularidade de resultados. Uma série de fatores precisam ser melhor esclarecidos para contribuir com a difusão desta tecnologia. A maturação ovocitária continua sendo assunto de relevância por conferir ao ovócito a competência de desenvolvimento até estágios adequados à transferência. Esta etapa envolve eventos citoplasmáticos, nucleares e moleculares com ocorrência simultânea (YANG et al., 1998), para não haver prejuízo da fecundação e do posterior desenvolvimento embrionário (SUSS et al., 1988).

Ovócitos imaturos bovinos são capazes de sofrer maturação nuclear, sem qualquer estímulo hormonal. Entretanto, a ação de gonadotrofinas parece ser determinante na aquisição de sua competência para atingir o desenvolvimento completo até o estágio embrionário de pré- implantação. A adição de gonadotrofinas no meio de maturação, com a finalidade de propiciar competência para o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro (FIV), tem sido largamente investigada, mas ainda com resultados contraditórios (COELHO et al, 2002).

Estudos efetuados com a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, utilizando na maturação soro de égua ou vaca no estro, demonstraram que a taxa de clivagem e de produção de

blastocistos não foi influenciada pela adição de hormônio folículo estimulante e hormônio luteinizante (FSH/LH) (FIGUEIRÓ et al, 2004).

O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito da adição de diferentes fontes de FSH ao meio de maturação, sobre o desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro. Foram avaliados 3 grupos: G1 (controle), sem a adição de gonadotrofinas, G2, com a adição de FSH bovino recombinante (Gonalâ) e G3 com a adição de FSH suíno (Folltropinâ).

Material e métodos

O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima

Temperado, localizado na Estação Experimental Terras Baixas, no Capão do Leão, Rio Grande do Sul.

Os ovários de bovinos foram coletados em frigoríficos da região de Pelotas e transportados à 35ºC em solução fisiológica 0,9% adicionada de gentamicina 0,5 mg/mL, até o laboratório. No laboratório, foram puncionados os folículos de 2-8 mm com agulha 18 G e seringa. Foram selecionados ovócitos de qualidade I e II para a maturação. Após a seleção, os ovócitos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: G1 (meio de maturação sem gonadotrofinas), G2 (meio de maturação com10 µg/mL de Gonal®) e G3 (meio de maturação com 0,5 µg/mL de Folltropin®). O meio base para maturação utilizado foi o TCM 199 adicionado de antibióticos, piruvato e 10% de soro fetal. Os ovócitos foram maturados em gotas de 200 ml sob óleo mineral, em placas de Petri de 30 mm, em estufa a 39°C e 5% de CO₂ , durante 24 horas.

O método de preparação dos espermatozóides utilizado foi o Gradiente de Percoll (90 e 45%). Após a maturação, os ovócitos foram transferidos para a placa de fecundação, sendo então realizada a FIV em meio FERT-TALP, nas mesmas condições da maturação. A dose inseminante utilizada foi de 1x106 _{espermatozóides/mL. Decorridas 18-24h da fecundação, os zigotos foram}

transferidos para as placas de cultivo. O meio de cultivo utilizado foi o SOFaa em gotas de 200 ml sob óleo mineral, em estufa a 39°C e 5% de CO_2. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 3 e o desenvolvimento embrionário no dia 8 após a inseminação.

Os dados deste experimento foram analisados pelo teste do c2 (Qui-quadrado), sendo comparados a taxa de clivagem e o número de embriões produzidos em cada tratamento.

Resultados e discussão

Os resultados das avaliações quanto à clivagem (dia 3) e ao desenvolvimento embrionário (dia 8) estão relacionados na Tabela 1.

Tabela 1. Efeito de diferentes fontes de FSH no meio de maturação ovocitária sobre as taxas de clivagem e de desenvolvimento in vitro de embriões bovinos até o estágio de blastocisto.

Tratam ento N º de ovócitos n Clivados n (% ) Blastocistos/clivados (D 8) n (% ) Blastocistos/ovócitos insem inados (D 8) n (% ) G rupo 1 (controle) 63 35 a (55,5% ) 13/35 (37,1% ) 13/63 (20,6% ) G rupo 2 (G onal® ) 145 70 a (48,2% ) 21/70 a (30% ) 21/145 a (14,4% ) G rupo 3 (Folltropin® ) 106 49 a (46,2% ) 19/49 a (38,7% ) 19/106 a (17,9% )

Não houve diferença significativa entre os tratamentos, com relação às taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário in vitro até o estágio de blastocisto.

Estes resultados estão de acordo com COELHO et al. (2002) e FIGUEIRÓ et al. (2004), que embora tenham utilizado diferentes fontes de hormônios do que as utilizadas no presente trabalho,

verificaram que os hormônios não são necessários para a maturação in vitro de ovócitos bovinos. A adição de gonadotrofinas não influenciou as taxas de clivagem e de blastocistos no sistema de produção in vitro utilizado neste experimento. Os dados preliminares sugerem que não é

necessária a sua adição no sistema para que a competência ovocitária seja atingida. O experimento encontra-se em fase de execução. Os resultados ainda não são conclusivos, necessitando de um maior número de repetições.

Referências bibliográficas

COELHO, L.A.; ESPER, C.R.; ALVAREZ, R.H.; VANTINI, R.; ALMEIDA, I.L. Produção in vitro de embriões bovinos: utilização de diferentes fontes de gonadotrofinas na maturação de oócitos. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 31, n. 3, p. 1117-1121, 2002.

FIGUEIRÓ, G.M.; LEIVAS, F.G.; RAUBER, L.P.; SÁ FILHO, M.I.; TEICHMANN, C.E.; MEZZALIRA, A., RUBIN, M.I.B.; SILVA. C.A.M. Produção in vitro de embriões bovinos com soro de égua ou vaca em estro com ou sem adição de LH/FSH. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 2, p. 479-484, 2004. SUSS, U.; WUTHRICH, K.; STRANZINGER, G. Chromosome configurations and time sequence of the first meiotic division in bovine oocytes matured in vitro. Biology of Reproduction, Madison, v.38, p. 871-880, 1988.

YANG, X.; KUBOTA, C.; SUZUKI, H. Control of oocyte maturation in cows - Biological factors. Theriogenology, New York, v. 49, p. 471-482, 1998.