Validação de Método Bioanalítico

Antes do desenvolvimento de um método bioanalítico, o patrocinador deve entender o analito de interesse, determinando as propriedades físico-químicas do fármaco, o metabolismo in vitro e in vivo e a ligação às proteínas e considerar aspectos de quaisquer métodos analíticos anteriores que possam ser aplicáveis (USFDA, 2018).

O objetivo do desenvolvimento do método bioanalítico é definir o desenho, as condições operacionais, as limitações e a adequação do método para a finalidade pretendida e garantir que o método seja otimizado para validação. O desenvolvimento do método envolve a otimização dos procedimentos e condições envolvidos na extração e detecção do analito.O desenvolvimento do método inclui a otimização dos seguintes parâmetros bioanalíticos para garantir que o método seja adequado para validação: Padrões de referência, Reagentes críticos, CCA, Amostras de CQs, Seletividade e especificidade, Sensibilidade, Precisão, Exatidão, Recuperação e Estabilidade do analito na matriz. A validação do método bioanalítico comprova que o método otimizado é adequado para a análise das amostras do estudo (USFDA, 2018).

O principal objetivo da validação do método é demonstrar a confiabilidade de um método para a determinação de concentração de um analito em uma matriz biológica específica (EMA, 2011).

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Métodos analíticos validados para a avaliação quantitativa de analitos e biomarcadores em uma determinada matriz biológica são críticos para a condução bem- sucedida de estudos biofarmacêuticos, não clínicos e de farmacologia clínica. Esses métodos validados fornecem dados críticos para apoiar a segurança e a eficácia de medicamentos e produtos biológicos. A validação do método analítico garante que os dados sejam confiáveis ao abordar certas questões-chave (USFDA, 2018)

Devido as diferenças significativas entre os analitos, diferentes tecnologias, como cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massas (MS) para pequenas moléculas e LBAs para macromoléculas, são frequentemente empregadas para determinar os níveis de drogas para avaliações PKs. A evolução de tecnologias analíticas divergentes para moléculas pequenas e macromoléculas convencionais, e o crescimento do interesse de marketing em terapias macromoleculares, levaram à discussão especificamente da validação de métodos bioanalíticos para macromoléculas (VISWANATHAN et al., 2007).

As validações de método para esses métodos divergentes devem considerar diferenças importantes, incluindo a base de medição, a modalidade de detecção e se uma amostra é medida diretamente na matriz ou extraída antes da análise. A base de medição da LC-MS é devida às propriedades químicas do analito, enquanto para os LBAs, a medição depende de uma interação de ligação biológica de alta afinidade entre o analito da macromolécula e outra(s) macromolécula(s) no poço de 1 ou mais anticorpos de captura/detecção. A detecção nos métodos de LC-MS é direta e tipicamente resulta em uma medida de resposta linear, onde concentrações mais altas de analito têm um aumento proporcional na resposta, já a resposta medida em LBAs é indireta e isso resulta em uma resposta medida não-linear, muitas vezes sigmoidal (VISWANATHAN et al., 2007). Devido às características do sistema de ensaio, o intervalo da curva padrão de calibração para um método de LC-MS é amplo, cobrindo muitas ordens de grandeza; em contraste, o intervalo de calibração para um LBA é tipicamente limitado a menos de duas ordens de grandeza, ou seja, há uma faixa dinâmica limitada das CCAs nos LBAs usados para estimar as concentrações terapêuticas do fármaco.As CCAs para moléculas grandes variam tipicamente de picogramas por mililitro a nanogramas por mililitro, enquanto as concentrações do fármaco sérico ou plasmático estão frequentemente nos microgramas por mililitro a miligramas por mililitro, o que pode influenciar a escolha da plataforma de ensaio.Assim, para que as amostras sejam quantificadas pela CCA, elas precisam ser precisamente diluídas às vezes por um milhão de vezes em uma sequência de etapas de diluição serial (AHENE et al., 2012).

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Essas diferenças de analito, combinadas com as tecnologias exclusivas usadas para medir a concentração do analito, fornecem uma forte justificativa do motivo pelo qual atenção deve ser dada à necessidade de empregar algumas diretrizes de validação do método específicas do analito (pequena versus macromolécula).

Um ponto importante de preocupação em discutir as validações de método para estas tecnologias divergentes centra-se em padrões e critérios de aceitação de CQ, isto é, o desvio aceitável de um valor nominal. A orientação atual recomenda a regra 15/20, onde o primeiro valor, neste caso 15%, é o critério de aceitação para todos os padrões e amostras de CQs, com exceção do limite inferior de quantificação (LIQ), onde critério de aceitação é aumentado para um desvio de 20%. Esta regra foi desenvolvida antes do uso rotineiro de LC- MS, onde métodos cromatográficos foram empregados. Quando a regra 15/20 foi proposta, a maioria das avaliações PKs que utilizavam LBAs mediam moléculas pequenas. No entanto, quase toda a análise de pequenas moléculas realizada hoje é por LC-MS (VISWANATHAN et al., 2007). Para medicamentos biológicos, a regra atualmente adotada é a de 20/25, para o critério de aceitação de todos os padrões e amostras de CQs, e do LIQ e limite superior de quantificação (LSQ), respectivamente.

Os métodos analíticos PKs para estabelecer a comparabilidade/BE do biossimilar em estudos clínicos e não clínicos para submissões regulatórias são frequentemente desenvolvidos para serem específicos do fármaco e são sempre validados para o uso pretendido (MARINI et al., 2014; MHLW/PMDA, 2014). A fase de desenvolvimento de um ensaio consiste em avaliar inicialmente a viabilidade da metodologia proposta seguida de um desenvolvimento extensivo do ensaio, a fim de estabelecer a sensibilidade, especificidade e seletividade do método, entre outros parâmetros, usado para quantificar o fármaco na matriz relevante. A fase de validação de um ensaio verifica todas as características estabelecidas. Métodos bem desenvolvidos garantem o sucesso da validação. Validações bem-sucedidas abrem caminho para análises produtivas de amostras em apoio a estudos regulatórios para o desenvolvimento de medicamentos (MARINI et al., 2014).

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