Variação das Sequências Ontogenéticas

As condições ambientais no estabelecimento do fenótipo ao longo da ontogenia influenciaram a quantidade de trajetórias ontogenéticas possíveis em diferentes janelas do desenvolvimento. Os peixes que se desenvolveram na condição com Temperatura Alta Sem Fluxo de água (Figura 33; Anexo H) e com Temperatura Alta Com Fluxo de água (Figura 34; Anexo H) apresentaram maior variação das sequências ontogenéticas em comparação com peixes mantidos nas condições com Temperatura Baixa Sem Fluxo (Figura 35; Anexo H) e com Temperatura Baixa Com Fluxo (Figura 36; Anexo H). Especificamente, as topologias das árvores consenso, normais e reversas, obtidas para as condições com Temperatura Alta apresentaram maior número de politomias, que resgatam a variação entre as árvores retidas na busca Heurística (Anexo H).

Quanto ao número de possíveis trajetórias, inferido a partir das diferentes topologias das árvores mais parcimoniosas, a condição com Temperatura Alta Sem Fluxo reteve 64 árvores com o menor número de passos (best score) correspondendo a 171 para as normais e 13829 árvores com o menor número de passos correspondendo a 176 para as reversas. Na condição com Temperatura Alta Com Fluxo, foram retidas 5182 árvores com o menor número de passos correspondendo a 146 para as normais, e 300 árvores com o menor número de passos igual a 162 para as reversas. Na condição com Temperatura Baixa Sem Fluxo de água, foram retidas 4253 árvores com menor número de passos igual a 176 para as normais e 12307 árvores com menor número de passos correspondendo a 174 para as reversas. Na condição com Temperatura Baixa Com Fluxo de água, foram retidas 2808 árvores com menor número de passos igual a 163 para as normais e 1792 árvores com menor número de passos igual a 163 para as reversas. Os estágios iniciais do desenvolvimento (21 a 33 DPE) apresentaram menor variação quando comparados aos estágios finais (após 33 DPE) em todas as condições de desenvolvimento (Figuras 33 a 36; Anexo H).

Figura 33 Árvores normal (a) e reversa (b) para a condição de desenvolvimento com Temperatura Alta Sem Fluxo de água.

Figura 34 Árvores normal (a) e reversa (b) para a condição de desenvolvimento com Temperatura Alta Com Fluxo de água.

Figura 35 Árvores consenso normal (a) e reversa (b) para a condição de desenvolvimento com

Temperatura Baixa Sem Fluxo de água.

Figura 36 Árvores consenso normal (a) e reversa (b) para a condição de desenvolvimento com Temperatura Baixa Com Fluxo de água.

Além da quantidade de variação nas sequências de desenvolvimento reveladas por Plasticidade, também foram observadas diferenças entre a ordem de ossificação das estruturas avaliadas e o padrão de ossificação em diferentes janelas ontogenéticas. Esses padrões foram acessados a partir das redes de reticulação obtidas utilizando árvores das condições de desenvolvimento com Temperatura Alta Com Fluxo (Figura 37), Temperatura Baixa Com Fluxo (Figura 38), Temperatura Alta Sem Fluxo (Figura 39) e Temperatura Baixa Sem Fluxo (Figura 40). As sequências ontogenéticas do desenvolvimento das estruturas ósseas foram acessadas a partir do mapeamento das mudanças de estados de caráter que, nesse caso, representam a condrificação ou ossificação de uma estrutura osteológica específica. Os traços indicam eventos de condrificação e ossificação das estruturas, os números e cores indicam os estágios de desenvolvimento e o número dos espécimes, e os espécimes hipotéticos estão sinalizados pela cor cinza.

As primeiras estruturas do pós-crânio que condrificaram e ossificaram em todas as condições de desenvolvimento foram os centros vertebrais e os arcos hemais e neurais, seguidos por algumas estruturas das nadadeiras peitoral e caudal, cleitro e hipurais, nessa ordem. Em comum, todas essas estruturas guardam relação com a locomoção desses peixes. Subsequentemente, os eventos de condrificação e ossificação se estabeleceram nas estruturas do aparelho de Weber e da nadadeira caudal, passando pelas nadadeiras dorsal e anal, e terminando nas nadadeiras peitoral e pélvica Foram observadas variações dessas sequências específicas entre cada condição de desenvolvimento.

Figura 37 Rede de reticulação das trajetórias ontogenéticas mapeadas a partir de uma das topologias

possíveis para peixes mantidos na condição com Temperatura Alta Com Fluxo de água. As linhas indicam mudanças no estado de caráter, os números representam o estágio e o espécime, e os hipotéticos estão representados pela letra H.

Figura 38 Rede de reticulação das trajetórias ontogenéticas mapeadas a partir de uma das topologias

possíveis para peixes mantidos na condição com Temperatura Baixa Com Fluxo de água. As linhas indicam mudanças no estado de caráter, os números representam o estágio e o espécime, e os hipotéticos estão representados pela letra H.

Figura 39Rede de reticulação das trajetórias ontogenéticas mapeadas a partir de uma das topologias possíveis para peixes mantidos na condição com Temperatura Alta Sem Fluxo de água. As linhas indicam mudanças no estado de caráter, os números representam o estágio e o espécime, e os hipotéticos estão representados pela letra H.

Figura 40Rede de reticulação das trajetórias ontogenéticas mapeadas a partir de uma das topologias possíveis para peixes mantidos na condição com Temperatura Baixa Sem Fluxo de água. As linhas indicam mudanças no estado de caráter, os números representam o estágio e o espécime, e os hipotéticos estão representados pela letra H.

4.4 Expressão Gênica

Análises preliminares da expressão de BMP4 em peixes provenientes de diferentes condições de desenvolvimento sugeriram que os sinais ambientais de temperatura e fluxo de água afetaram os níveis de expressão gênica da proteína morfogenética óssea 4 que está associada à ossificação. Especificamente, os níveis de expressão diferiram em cada uma das condições de desenvolvimento nos estágios investigados (Figura 41, Tabela 14).

Figura 41 Gráfico da amplificação do gene de interesse BMP4 e do endógeno controle GAPDH em indivíduos mantidos em diferentes condições de desenvolvimento. Threshold=1,495.

Os níveis de expressão do gene CX43 (Conexina 43), relacionado à ossificação e ao estresse mecânico, também diferiram entre peixes oriundos de diferentes condições de desenvolvimento nos estágios analisados (Figura 42, Tabela 14).

Delta Rn por ciclo

Número do ciclo

D

el

ta R

Figura 42 Gráfico da amplificação do gene de interesse CX43 e do endógeno controle GAPDH para as condições de desenvolvimento. Threshold=1,495.

Tabela 14 Médias dos Cts (Threshold Cycles) para cada uma das condições de desenvolvimento para os genes BMP4, CX43 e GAPDH em peixes com 21, 33 e 48 dias pós-eclosão (DPE). Os traços representam valores que foram eliminados da análise preliminar em decorrência da não amplificação.

Condições de Desenvolvimento

21 DPE 33 DPE 48 DPE

B M P 4 CX4 3 G AP DH B M P 4 CX4 3 G AP DH B M P 4 CX4 3 G AP DH

Temperatura Alta Sem Fluxo 26,41 24,91 - 24.60 27,42 20,89 22,35 25,65 23,69

Temperatura Alta Com Fluxo 27,91 24,94 - 23,25 24,76 - - - -

Temperatura Baixa Sem Fluxo 24,79 23,44 - 26,59 - 24,02 22,81 22,74 -

Temperatura Baixa Com Fluxo 25,81 - - 25,13 - - 18,08 24,96 -

Os níveis de expressão de BMP4 diferiram entre estágios e entre condições de desenvolvimento: peixes mantidos na condição com Temperatura Alta Com Fluxo de água apresentaram o menor nível de expressão de BMP4 com 21 DPE e o maior nível de expressão com 33 DPE (Tabela 15, Figura 43); peixes provenientes da condição com Temperatura Alta Sem Fluxo de água apresentaram um padrão de expressão gênica

Delta Rn por ciclo

Número do ciclo

D

el

ta R

similar aos anteriores, porém menos acentuado, seguido dos peixes da condição com Temperatura Baixa Com Fluxo de água. Já os peixes que se desenvolveram na Temperatura Baixa Sem fluxo de água apresentaram níveis mais altos de expressão de BMP4 com 21 DPE, e esses níveis diminuíram nos indivíduos com 33 DPE (Tabela 15, Figura 43).

Tabela 15 Níveis de expressão gênica de BMP4 para cada uma das condições de desenvolvimento com 21 e 33 Dias Pós-Eclosão (DPE) calculados a partir do método Delta-Delta Ct.

Condições de Desenvolvimento

21 DPE 33 DPE

ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt

Temperatura Alta Sem Fluxo 3,34 1,11 0,46 1,53 -1,26 2,40

Temperatura Alta Com Fluxo 4,84 2,61 0,16 0,18 -2,61 6,11

Temperatura Baixa Sem Fluxo 1,73 -0,51 1,42 3,52 0,73 0,60

Temperatura Baixa Com Fluxo 2,74 0,51 0,70 2,06 -0,73 1,66

Figura 43 Comparação dos níveis de expressão de BMP4, obtidos a partir do método Delta-Delta Ct, para cada condição de desenvolvimento em indivíduos nos estágios 21 e 33 Dias pós-eclosão (DPE).