4. RESULTADOS
4.2. Viabilidade celular de células embrionárias da retina infectadas com T gond
Em células embrionárias da retina infectadas com T. gondii observou-se que o tratamento com clozapina em todas as concentrações testadas aumentou significantemente a viabilidade destas células, quando comparadas às células infectadas sem tratamento (Figura 9). A concentração de 5µg/mL foi a que resultou em maior proteção (p<0,001). A clozapina na concentração de 10 µg/mL teve uma influência na viabilidade celular semelhante ao da sulfadiazina na concentração 10µg/mL (p<0,01) (Figura 9). O tratamento com haloperidol resultou em aumento significativo da viabilidade celular somente nas concentrações de 2,5µg/mL e 5µg/mL, com um resultado semelhante ao obtido com a sulfadiazina (p<0,05) (Figura 10). M V1 V2 C+ 0.01µg 0.1µg/mL 1µg/mL 5µg/mL 10µg/mL 30 60 90 120 * Haloperidol V ia b ilid a d e C e lu la r (% )
Figura 9: Curva de viabilidade celular de células embrionárias da retina infectadas
com T. gondii tratadas com sulfadiazina (10µg/mL) e clozapina nas concentrações 2,5
µg/mL, 5 µg/mL e 10µg/mL. M= meio; C+= sulfadiazina.(*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001).
Figura 10: Curva de viabilidade celular de células embrionárias da retina infectadas
com T. gondii tratadas com sulfadiazina (10µg/mL) e haloperidol nas concentrações 2,5
µg/mL, 5 µg/mL e 10µg/mL. M= meio; C+= sulfadiazina. (*: p<0,05). M C+ 2.5µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 50 100 150 200
*
***
**
Clozapina V iab il id ad e C el u lar ( % ) ** * M C+ 2.5µg/ml 5µg/mL 10µg/ml 50 75 100 125 150 Haloperidol**
V ia b ilid a d e C e lu la r ( % )4.3 Avaliação da infecção por T. gondii em células embrionárias da retina tratadas com os antipsicóticos clozapina e haloperidol
Houve diminuição significativa na taxa de replicação intracelular de parasitos (6,7±2,5 parasitos/célula) nas células embrionárias da retina infectadas com T. gondii e tratadas com clozapina na concentração de 5µg/mL, quando comparado com o grupo não-tratado (8,3±2,3 parasitos/célula). Este efeito não foi observado no índice global de infecção (Figuras 11 e 12), entretanto.
Figura 11: Efeito do tratamento com sulfadiazina (10µg/mL) e clozapina (5 µg/mL) sobre a infecção por T. gondii de células embrionárias da retina. A, número de parasitos por célula infectada, B, número total de parasitos pelo total de células infectadas. M= meio; C+= sulfadiazina.
Figura 12: Efeito do tratamento com sulfadiazina (10µg/mL) e clozapina (5 µg/mL) sobre a infecção por T. gondii de células embrionárias da retina. A, sem tratamento, B, tratamento com sulfadiazina, C, tratamento com clozapina. Nota-se a presença de parasitos dentro das células (ponta das setas).
Nas células embrionárias da retina infectadas e tratadas com haloperidol, na concentração de 5µg/mL, houve uma redução significativa tanto na taxa de replicação intracelular (6±2,6 parasitos/célula) quanto no índice global de infecção (604,5±4,9 parasitos), em comparação com o grupo não-tratado (8,3±2,3 parasitos/célula e 845±63,6 parasitos, respectivamente) (Figuras 13 e 14).
Figura 13: Efeito do tratamento com sulfadiazina (10µg/mL) e haloperidol (5 µg/mL) sobre a infecção por T. gondii de células embrionárias da retina. A, número de parasitos por célula infectada, B, número total de parasitos pelo total de células infectadas. M= meio; C+= sulfadiazina. (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001).
Figura 14: Efeito do tratamento com sulfadiazina (10µg/mL) e haloperidol (5 µg/mL) sobre a infecção por T. gondii de células embrionárias da retina. A, sem tratamento, B, tratamento com sulfadiazina, C, tratamento com clozapina. Nota-se a presença de parasitos dentro das células (ponta das setas).
5. DISCUSSÃO
Muitos antipsicóticos têm demonstrado atividade inibitória sobre a sobrevivência e proliferação de patógenos humanos. Em 1981, já se demonstrava que um composto tricíclico do grupo fenotiazina, azul de metileno, matava Plasmodium vivax, o agente causador da malária (Guttman e Ehrlich, 1891; Jones- Brando, Torrey et al., 2003). Em outros trabalhos mais recentes, estudos in vitro têm demonstrado atividade inibitória de fenotiazinas sobre o crescimento de Leishmania donovani (Pearson, Manian et al., 1984), Plasmodium falciparum (Kristiansen e Jepsen, 1985), vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (Jones-Brando, Buthod et al., 1997), T. gondii (Pezzella, Bouchot et al., 1997), Trypanossoma cruzi (Gutierrez- Correa, Fairlamb et al., 2001) e Mycobacterium tuberculosis (Viveiros e Amaral, 2001).
Embora relevantes, os estudos que demonstraram o efeito antipatogênico dos antipsicóticos ainda não tinham sido testados em linhagens celulares do sistema nervoso, logo a avaliação deste efeito em cultura de células embrionárias da retina, composta por células gliais e neuronais, é oportuno. Entre as vantagens do modelo utilizado neste trabalho estão a expressão de fenótipos de quase todos os neurotransmissores assim como todos os seus receptores celulares característicos. Outra vantagem pertinente ao estudo com T. gondii é a conhecida preferência deste parasito pela retina. Além disso, estudo com células embrionárias podem servir para elucidar mecanismos patogênicos da toxoplasmose congênita, na qual ocorre a passagem de taquizoítas pela placenta seguida de colonização deste tecido, resultando em fetos assintomáticos ao nascer que, entretanto, ao longo da vida podem apresentar sequelas incluindo retinocoroidite (induzindo grave prejuízo da visão), perda auditiva ou retardo mental (Stray-Pedersen, 1993).
Com relação à avaliação da atividade citotóxica dos antipsicóticos utilizados neste estudo, a clozapina não apresentou prejuízo da viabilidade celular em nenhuma das concentrações utilizadas. Em contrapartida, haloperidol apresentou redução significativa da viabilidade celular na concentração de 10µg/mL, consistente
com trabalhos anteriores nos quais drogas antipsicóticas típicas demonstram neurotoxicidade de modo dose-dependente (Silver, Yang et al., 1994; Gil-Ad, Shtaif et al., 2001).
O mecanismo de ação comum de drogas antipsicóticas é o antagonismo do receptor dopaminérgico D2 (Nord e Farde, 2011). Receptores D2 são classicamente descritos como inibidores da enzima adenilato ciclase, resultando na diminuição dos níveis de AMPc e consequentemente a diminuição da ativação da proteína quinase A (PKA) e sinalização de cálcio (Neve, Seamans et al., 2004). Entretanto, trabalhos recentes demonstram que a ativação de receptores D2 resulta na ativação da isoforma de fosfolipase C (PLC), PLC 1, causando mobilização dos estoques intracelulares de cálcio induzida por IP3 (inositol trifosfato) e, por sua vez, ativação de proteínas dependentes de cálcio (Hernandez-Lopez, Tkatch et al., 2000; Hu, Dong et al., 2005). Neste sentido, os antipsicóticos clozapina e haloperidol demonstram inibir a liberação de cálcio dependente de IP3 (Sczekan e Strumwasser, 1996).
O processo de invasão da célula pelo T. gondii inclui eventos que demonstram ser dependentes da sinalização por cálcio (Dobrowolski, Carruthers et al., 1997). As etapas iniciais da invasão, motilidade e ligação à célula hospedeira, podem ser inibidas por KT5926, um inibidor de proteínas quinase dependentes de cálcio (Dobrowolski, Carruthers et al., 1997). A mobilização de cálcio intracelular pelos ionóforos A23187 e ionomicina induzem a secreção de proteínas micronemais MIC2 e MIC4 (Carruthers e Sibley, 1999) e AMA1(Donahue, Carruthers et al., 2000). A replicação intracelular deste protozoário, por sua vez, também se mostrou suprimida por moduladores de cálcio (Song, Ahn et al., 2004).
Íons cálcio sequestrados no interior de organelas intracelulares são a principal fonte de cálcio liberado no citosol, e estão envolvidos em muitos eventos de sinalização. Existem quatro organelas intracelulares no T. gondii capazes de armazenar cálcio: retículo endoplasmático, núcleo, mitocôndria e acidocalcissoma, entre as quais o retículo endoplasmático e o acidocalcissoma são as mais prováveis
candidatas para liberação e estoque de cálcio sob estimulação específica (Moreno e Docampo, 2003).
Em células de mamíferos, o retículo sarcoplasmático é a principal fonte de cálcio que pode ser rapidamente mobilizada por uma variedade de estímulos. Dois tipos de canais liberadores de cálcio têm sido identificados nesta organela: receptor de IP3 e receptor de rianodina (Guse, 1999). Estudos sugerem que ambos receptores estão presentes em T. gondii e estão envolvidos no aumento de cálcio intracelular que promove a secreção de proteínas micronemais (Lovett, Marchesini et al., 2002; Lovett e Sibley, 2003).
A secreção de proteínas micronemais não depende somente da liberação de cálcio pela ativação de receptores, mas também do cálcio extracelular, uma vez que o tratamento de T. gondii com quelante de cálcio extracelular EGTA resultou na inibição de liberação de proteínas micronemais (Lovett, Marchesini et al., 2002). Isto pode ser devido a entrada capacitiva, na qual a liberação de cálcio de organelas intracelulares é reforçada pela subsequente entrada de cálcio de fora da célula (Putney, 1990). Então, este fluxo adicional de cálcio seria importante para a ativação da secreção micronemal (Lovett, Marchesini et al., 2002).
No presente estudo, houve diminuição significativa na taxa de replicação intracelular de T. gondii nas células embrionárias da retina tratadas com clozapina ou haloperidol, na concentração de 5µg/mL, porém somente o tratamento com haloperidol reduziu de modo significativo o índice global de infecção. Estes dados estão em concordância com estudo anterior, no qual a concentração inibitória média (ID50) da proliferação deste protozoário por haloperidol foi 5,6 µg/mL e de clozapina foi de 5,8 µg/mL (Jones-Brando, Torrey et al., 2003).
Dada a similaridade entre as vias de transdução de sinal dos processos de invasão, replicação intracelular e egresso por T. gondii, os resultados aqui apresentados sugerem que o tratamento com clozapina e haloperidol poderiam estar modulando a concentração intracelular de cálcio deste parasito, seja através da entrada passiva de cálcio do citosol celular para o vacúolo parasitóforo (Pingret, Millot et al., 1996) ou por meio da atuação de mensageiros intracelulares com IP3
sobre possíveis receptores presente neste protozoário e, desta forma, causando a inibição da replicação intracelular.
Adicionalmente, no presente estudo, observou-se que o tratamento com clozapina e haloperidol de células embrionárias da retina infectadas com T. gondii resultou em um efeito protetor da viabilidade celular, quando comparadas às células infectadas sem tratamento. O efeito neuroprotetor de clozapina já foi demonstrado em estudos anteriores, nos quais este efeito demonstrou ser resultante da habilidade deste antipsicótico atípico em inibir a ativação microglial e subseqüente liberação de mediadores inflamatórios incluindo ROS (Espécies Reativas ao Oxigênio), NO (óxido nítrico) e TNF-α (Fator de Necrose Tumoral alfa) (Magliaro e Saldanha, 2009; Hu, Zhou et al., 2012). O tratamento com haloperidol também inibe a ativação microglial e a resultante produção de NO e IL-6 (interleucina 6) (Kato, Monji et al., 2007).
A ativação glial garante a proteção contra injúrias cerebrais, incluindo infecções, através da produção de NO, TNF-α, IFN-γ (interferon gama) e outros metabólitos. Porém esses mediadores pró-inflamatórios podem causar sérios danos celulares e teciduais (Chao, Hu et al., 1992; Chao, Hu et al., 1995),no sistema nervoso central (Giovannoni, Heales et al., 1998).
Estudos in vitro com T. gondii demonstram que a prevenção da degeneração neuronal é dependente da inibição da produção de NO e outros mediadores inflamatórios(Rozenfeld, Martinez et al., 2003; Rozenfeld, Martinez et al., 2005) Isto sugere que o tratamento com os antipsicóticos no presente estudo pode estar contribuindo para prevenção da degeneração neuronal induzida pela infecção parasitária.
Os resultados apresentados neste estudo reafirmam a importância terapêutica de antipsicóticos na inibição da infecção por T. gondii, porém devem ser interpretados com cautela mediante a possibilidade de que a atividade de drogas eficazes contra a replicação deste parasito in vitro possa ser diferente da atividade in vivo. Um exemplo disto é a habilidade de ácido valpróico em inibir a proliferação de taquizoítos em cultura celular (Jones-Brando, Torrey et al., 2003; Strobl, Cassell et
al., 2007), que não é reproduzida em estudo in vivo (Goodwin, Strobl et al., 2008). Desta forma, é crucial a avaliação destes antipsicóticos em modelos animais.
6. CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS
Células embrionárias da retina tratadas com clozapina não apresentaram alteração significativa da viabilidade celular, enquanto que o tratamento com haloperidol apresentou neurotoxicidade com tendência dose- dependente.
O tratamento com clozapina e haloperidol de células embrionárias da retina infectadas com T. gondii resultou em menor prejuízo da viabilidade destas células, o que sugere uma possível prevenção de degeneração neuronal induzida por estes antipsicóticos.
A replicação intracelular de T. gondii, em células embrionárias da retina tratadas com clozapina e haloperidol, foi significantemente reduzida, possivelmente pela modulação da concentração intracelular de cálcio deste parasito.
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