FONTE: A Autora (2022).
4.4.5 Avaliação da Voltametria de Pulso Diferencial como Técnica de Detecção
Para fins analíticos, uma técnica voltamétrica de pulso, voltametria de pulso diferencial (DPV), foi empregada para diminuir a influência da corrente capacitiva sobre as respostas voltamétricas.164 A resposta para as diferentes etapas de construção do sensor e para a detecção do analito, utilizando a técnica de DPV, foi comparada com aquela obtida por CV, considerando as condições previamente otimizadas. Voltamogramas representativas, para ambas as técnicas, são apresentados na Figura 81.
FIGURA 81 - VOLTAMOGRAMAS CÍCLICOS E DE PULSO DIFERENCIAL OBTIDOS NA AVALIAÇÃO DO PERFIL VOLTAMÉTRICO DA SONDA [Fe(CN)6]3-/4- PARA AS DIFERENTES ETAPAS DE CONSTRUÇÃO DO IMUNOSSENSOR (2,0 mmol L-1 DE [Fe(CN)6]3-/4- EM PBS); CV:
v = 50 mV s-1; DPV: POTENCIAL DE PRÉ-CONDICIONAMENTO DE -0,4 V POR 10 s, a = 150 mV, tp = 500 ms e v = 5 mV s-1
SPE-BC700 EDC/NHS RBD BSA Ab
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6
-20 -10 0 10 20
I / P A
E / V vs. Ag
A
SPE-BC700EDC/NHS RBD BSA Ab
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0
10 20 30
40
B
I / P A
E / V vs. Ag
FONTE: A Autora (2022).
LEGENDA: (A) Voltamogramas cíclicos;
(B) Voltamogramas de pulso diferencial.
Para DPV, os resultados foram similares ao comportamento observado para as medidas de CV: um aumento na magnitude da corrente de pico após a imobilização com EDC/NHS, seguido de diminuições sucessivas na intensidade de corrente de pico para as etapas seguintes de construção do dispositivo. Todavia, quando o sinal da detecção é comparado, uma supressão para 74 ± 1,8 % do sinal do BSA foi observada para DPV, enquanto uma resposta de 87 ± 3,8 % foi obtida para CV. Portanto, uma vez que a reposta é medida por supressão de sinal, a técnica de DPV foi considerada mais adequada para verificar as características analíticas da aplicação do imunossensor.
4.4.6 Estimativa dos Parâmetros de Analíticos para a Detecção de Anticorpos Contra o Vírus SARS-CoV-2 em Amostra de Soro Comercial
Para verificar a potencialidade de aplicação do imunossensor proposto na detecção de anticorpos contra o vírus SARS-CoV-2 em soro humano, verificou-se a resposta do dispositivo, utilizando as condições previamente otimizadas, para a incubação de amostras de soro comercial (soro negativo) e soro comercial fortificado (soro positivo). Os resultados obtidos são apresentados na Figura 82.
FIGURA 82 – RESPOSTAS OBTIDAS PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA SARS-CoV-2 EM SORO COMERCIAL E SORO COMERCIAL FORTIFICADO, UTILIZANDO VOLUME E TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO DE BSA DE 5 μL E 4 °C (2,0 mmol L-1 DE [Fe(CN)6]3-/4- EM PBS,
POTENCIAL DE PRÉ-CONDICIONAMENTO DE -0,4 V POR 10 s, a = 150 mV, tp = 500 ms e v = 5 mV s-1)
Soro (-) Soro (+) 74
76 78 80
% I
pa*
*
FONTE: A Autora (2022).
LEGENDA: médias que compartilham um símbolo são estatisticamente iguais.
Conforme pode ser observado na Figura 82, as respostas obtidas para as amostras negativa e positiva foram estatisticamente iguais (tcalculado = 2,17 < tcrítico(0,05;3) = 3,18). Ou seja, houve efeito de matriz, de modo que componentes não específicos presentes no soro interagiram com sítios não bloqueados do elemento de reconhecimento ou até mesmo com áreas não substituídas do próprio eletrodo base. Sendo assim, adaptações metodológicas tiveram que ser realizadas para inibir esse tipo de interação, possibilitando a diferenciação de sinais positivos e negativos a presença do analito.
Nesse sentido, optou-se por aumentar o volume de BSA gotejado no eletrodo para 7,5 μL, visando maior recobrimento da área sobre a qual o imunossensor estava sendo construído, seguido de incubação a 37 °C, sob atmosfera úmida, para favorecer a cinética da reação. Os resultados obtidos para as amostras negativa e positiva, empregando estas adaptações no procedimento, são apresentados na Figura 83.
FIGURA 83 – VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL E RESPOSTAS OBTIDAS PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA SARS-CoV-2 EM SORO COMERCIAL E SORO COMERCIAL FORTIFICADO, UTILIZANDO VOLUME E TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO DE
BSA DE 7,5 μL E 37 °C (2,0 mmol L-1 DE [Fe(CN)6]3-/4- EM PBS, POTENCIAL DE PRÉ- CONDICIONAMENTO DE -0,4 V POR 10 s, a = 150 mV, tp = 500 ms e v = 5 mV s-1)
BSA Soro (-) BSA Soro (+)
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0
5 10 15 20
I / P A
E / V vs. Ag
A
Soro (-) Soro (+) 50
60 70
% I
paB
FONTE: A Autora (2022).
Utilizando esta abordagem, obtiveram-se médias estatisticamente diferentes para as amostras (tcalculado = 9,80 < tcrítico(0,05;2) = 4,30). Ou seja, foi possível diferenciar as respostas de amostras de soro negativas e positivas a presença do anticorpo IgG contra a proteína RBD do vírus SARS-CoV-2. Isto mostra que a utilização do biochar na imobilização de biomoléculas foi bem-sucedida quanto a determinação do analito em uma matriz complexa.
Na sequência, a resposta de amostras de soro fortificadas com diferentes concentrações do analito foi avaliada e comparada a resposta obtida para uma amostra de soro não fortificada (soro negativo). Voltamogramas de pulso diferencial representativos para cada condição analisada são apresentados na Figura 84.
FIGURA 84 – VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL PARA A DETECÇÃO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ANTICORPOS CONTRA SARS-CoV-2 EM SORO COMERCIAL FORTIFICADO (2,0 mmol L-1 DE [Fe(CN)6]3-/4- EM PBS, POTENCIAL DE PRÉ-
CONDICIONAMENTO DE -0,4 V POR 10 s, a = 150 mV, tp = 500 ms e v = 5 mV s-1) BSA
Soro (-) 0,010 Pg mL-1 0,050 Pg mL-1 0,10 Pg mL-1 0,50 Pg mL-1 1,0 Pg mL-1 10 Pg mL-1
-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0
5 10 15 20 25
I / P A
E / V vs. Ag
FONTE: A Autora (2022).
Conforme pode ser observado nos voltamogramas, uma diferenciação quantitativa entre a resposta para as diferentes concentrações não pode ser estabelecida. Comportamentos similares já foram descritos para outros imunossensores, sendo relacionados com a complexidade da matriz das amostras, visto que diversos concomitantes estão presentes, afetando a interação entre os anticorpos específicos e a camada de reconhecimento.184,185
Mesmo que o perfil de resposta do imunossensor não permita a quantificação do analito, o dispositivo baseado em um valor de corte ainda pode ser aplicado com sucesso para diagnósticos qualitativos. Nesse sentido, calculou-se o intervalo de confiança da resposta negativa e seu limite inferior foi utilizado como valor de corte, conforme pode ser visualizado na Figura 85.
FIGURA 85 – COMPARATIVO DAS RESPOSTAS OBTIDA PARA A AMOSTRA DE SORO NEGATIVO E PARA A DETECÇÃO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ANTICORPOS CONTRA SARS-CoV-2 EM SORO COMERCIAL FORTIFICADO (2,0 mmol L-1 DE [Fe(CN)6]3-/4- EM
PBS, POTENCIAL DE PRÉ-CONDICIONAMENTO DE -0,4 V POR 10 s, a = 150 mV, tp = 500 ms v = 5 mV s-1) E REPRESENTAÇÃO DO VALOR DE CORTE ESTABELECIDO PARA A DETECÇÃO
QUALITATIVA DO ANALITO
(-) 0,010 0,050 0,10 0,50 1,0 10 60
70 80 90
%I
paC
Ab/ Pg mL
-1VALOR DE CORTE
FONTE: A Autora (2022).
Sendo assim, considerando o valor de corte, se a diminuição da resposta do Ab, em comparação a do BSA, é acima de 82,3 %, a amostra é negativa. Por outro lado, se essa diminuição é abaixo de 82,3 %, a amostra é considerada positiva para a presença de anticorpos específicos contra a proteína RBD do SARS-CoV-2. Portanto, o dispositivo pode ser utilizado para fins qualitativos, por exemplo, para indicar se o sistema imune ainda é capaz de responder a presença do vírus SARS-CoV-2, ou até mesmo se doses adicionais de vacinas são necessárias para reforçar a capacidade humoral de combater o patógeno.
Em seguida, a seletividade foi avaliada por meio da submissão do imunossensor a amostras de soro fortificadas com anticorpos específicos contra SARS-CoV-2 (Ab-RBD), anticorpos específicos contra febre amarela (Ab-FA) e uma mistura dos dois. As respostas foram comparadas com aquela obtida para uma amostra de soro negativo, e os resultados são apresentados na Figura 86.
FIGURA 86 – AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE DO IMUNOSSENSOR: MÉDIA DE %Ipa PARA AMOSTRAS DE SORO NEGATIVO E AMOSTRAS DE SORO FORTIFICADAS COM ANTICORPOS
ESPECÍFICOS CONTRA SARS-CoV-2 (Ab-RBD), ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA FEBRE AMARELA (Ab-FA) E UMA MISTURA DE AMBOS. A LINHA TRACEJADA INDICA O VALOR DE
CORTE.