UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE OCEANOGRAFIA
Produção e viabilidade de ovos de resistência do Cladocera Daphnia magna em cultivo extensivo
Acadêmico: Paulo Oscar Tagliari Graf
Itajaí
Junho de 2012
PAULO OSCAR TAGLIARI GRAF
Produção e viabilidade de ovos de resistência do Cladocera Daphnia magna em cultivo extensivo
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado para obtenção do grau de Oceanógrafo no Curso de Oceanografa da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI
Orientador: Prof. Dr. Charrid Resgalla Jr
Itajaí
Junho de 2012
iii Agradecimentos
Primeiramente, agradeço ao meu orientador Dr. Charrid Resgalla Jr., pelas oportunidades, confiança e incentivo que contribuíram para meu desenvolvimento pessoal e profissional, corroborando com todo seu conhecimento científico. Muito obrigado pelo apoio, conselhos, dedicação e as gargalhadas proporcionadas! Sentirei saudades!
Aos meus pais, Almir e Magali, pelo carinho, respeito e principalmente seu amor incondicional e apoio em todas as horas! Sou o que sou graças a vocês, amo muito vocês!!!
Ao pessoal do LAMA, sobretudo ao César, pela ajuda e fornecimento das matrizes e cepas da microalga.
A todos meus amigos de laboratório, em particular Dani, Rafa, Joca, Rafael, Fernada, Telma, Jessica e Claudi pela sempre companhia, pelos momentos descontraídos e constante aprendizado, sempre é bom contar com pessoas assim!
Aos meus colegas de curso, em especial ao Rafa meu “irmãozinho” e parceiro de chimarrão! A Barbaruga, pela sempre amizade, a Ju, Thiago, Vitão pela parceria e como não poderia esquecer a Dessa, sempre 22!!!
A todos os professores, que durante o período da faculdade sempre estiveram dispostos a conversar e passar seus ensinamentos.
A Mari, pelo carinho respeito e cumplicidade, obrigado pelo apoio!
Por fim a todos que direta ou indiretamente, de alguma forma contribuíram para a realização desta tese e apoio nesta caminhada, como também as Daphnias que sem elas nada disso seria possível! o meu obrigado!!!!
iv Resumo
O objetivo deste trabalho foi investigar a possibilidade de obtenção de efípios do Cladocera Daphnia magna, em escala comercial, para aplicação em ensaios ecotoxicológicos.
Para tal foram investigados os sistemas de cultivo em meios de cultivo com diferentes adições dos constituintes propostos na NBR/ABNT (2004), que resulta numa mudança na dureza total, indicando qual adição que determina as maiores densidades de organismos assim como as maiores produções de ovos de resistência. Da mesma forma, foram investigadas as técnicas de maior sucesso de suas taxas de eclosão assim como as melhores condições de estocagem de efípios. Por fim foi avaliada a sensibilidade de neonatos originários dos efípios frente a tóxicos de referência em comparação com a carta controle de juvenis provenientes de matrizes convencionais. Como resultado determinou que o sistema de cultivo favorável a obtenção de estágios dormentes de Daphnia magna, tanto na produção como na sua viabilidade. A técnica de estocagem mais eficiente para evitar a eclosão dos efípios e que não compromete a sua viabilidade foi à água destilada, com uma inversa relação entre número de efípios em relação ao volume de água, estocados no escuro e a temperatura ambiente. O melhor método de incubação para eclosão dos ovos de resistência foi obtido em meio de cultura padrão, sob luz constante em temperatura de 21°C e com tratamento prévio de hipoclorito de sódio. Ensaios de sensibilidade com organismos provenientes de estágios dormentes podem ser utilizados na avaliação da toxicidade aguda, porque a sensibilidade dos neonatos obtidos de efípios foi similar aos obtidos em regime de cultivo padrão.
Palavras Chave: Efípios, Ecotoxicologia, Viabilidade, Manutenção, Técnicas de Desencapsulação
v Lista de ilustrações
Figura 1: Fotos dos tanques de cultivo extensivo empregados para o cultivo da Daphnia magna. ... 18 Figura 2:Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) do pH dos cultivos extensivos de Cladocera. Estes valores foram ajustados em todas as manutenções. ... 27 Figura 3:Exemplo de um efípio predominante nos cultivos (translucido). ... 28 Figura 4: Variação da densidade (Org./15 litros) e a produção semanal estimada de Efípios para cada meio de cultivo ao longo do tempo de sua manutenção. Sendo: A - 100% do meio recomendado pela NBR/ABNT (2004);
B - 50% do meio recomendado pela NBR/ABNT (2004); C - 0% - água natural sem adição de meio, e 200% do meio recomendado pela NBR/ABNT (2004). ... 29 Figura 5: Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) da densidade de Cladocera em diferentes meios de cultivo para todo o período de manutenção . ... 31 Figura 6: Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) da produção dos efípios para cada método de cultivo ao longo de toda a manutenção. ... 32 Figura 7: Recipiente do tipo Eppendorf contendo os efípios em água destilada. ... 33 Figura 8: Porcentagem de eclosão obtida na incubação de 10 dias com fotoperíodo 12:12 sob uma temperatura de 24°C frente aos onze meios de estocagem. Sendo: 1 - estocagem em água destilada; 2 – Meio em pH 7,80; 3 – Meio em pH 6,30; 4 – Meio em pH 4,96; 5 – Meio em pH 9,11; 6 – Meio em pH 10,20; 7 - Meio de cultivo sem a adição as soluções que contem Ca e Mg; 8 – Meio com concentrações de Ca e Mg quatro vezes maior que a recomendada; 9 - Salinidade 1,1; 10 - Estocagem com o fito vivo (Scenedesmus subspicatus); 11 - Estocagem a seco (overnight acondicionada em eppendorf no escuro). A – Eclosão em meio com fitoplâncton; N – Eclosão em meio de cultivo e S – em meio com solução ultrasonificada do mesmo fitoplâncton. ... 34 Figura 9: Percentual de eclosão para efípios estocados em condições padrões e sob temperatura de 4°C (510) e após o ressecamento overnight, em condições de incubação com luz constante em temperatura de 21°C. ... 36 Figura 10: Porcentagens de eclosão obtidos em distintos meios de cultivo, para um total de 469 efípios estocados em condição padrão por um dia par os meios 50%, 100%, 200% e 100%(2010). Como também para um total de 225 efípios estocados nas mesmas condições em 37 dias . ... 37 Figura 11: Porcentagens de eclosão para um total de 210 efípios estocados em condição padrão por 81, 186 e 560 dias com ação do processo de desencapsulação com emprego do cloro 0,15% anterior a sua incubação. ... 38 Figura 12: Porcentagens de eclosão para um total de 150 efípios estocados em condição padrão por 81, 186 e 560 dias com ação do processo de desencapsulação com emprego do álcool 70% anterior a sua incubação. ... 39 Figura 13: Porcentagens de eclosão para um total de 223 efípios estocados em condição padrão submetidos à desencapsulação com emprego do cloro 2-2,5% anterior a sua incubação... 40 Figura 14: Porcentagens de eclosão para um total de 1600 efípios estocados em condição padrão submetidos à desencapsulação com emprego da acetona 5% e cloreto de lítio 5% anterior a sua incubação por um período de 30 minutos. ... 41 Figura 15: Porcentagens de eclosão para um total de 2758 efípios estocados em diferentes períodos em condição padrão com ou sem o processo de ressecamento anterior à desencapsulação com emprego de cloro 0,15% por um período de 30 minutos. ... 42 Figura 16: Valores médios das porcentagens de eclosão para um total de 2758 efípios estocados em condição padrão com ou sem o processo de ressecamento anterior à desencapsulação com emprego de cloro 0,15% por um período de 30 minutos, com seu erro padrão. ... 42 Figura 17: Valores médios e intervalo de confiança de 95% para a CE50 para o Dicromato de potássio de neonatos de Daphnia magna em diferentes tempos de eclosão e do valor médio de organismos cultivados em laboratório (Carta controle - Apêndice 1). ... 43
vi Lista de tabelas
Tabela 1: Os quatro primeiros reagentes descritos na norma da NBR/ABNT (2004) para reconstituição da água do cultivo para D. magna, como também sua concentração utilizada no preparo das soluções estoque e o volume que foi diluído de cada solução para confecção dos diferentes meios de cultura, respeitando as condições de preparo que são apontadas na mesma norma. Análogo a adição é descrito os valores médios da dureza total em mg CaCO3/L para cada meio de cultivo incluindo a dureza natural. ... 19 Tabela 2: Percentuais de efeito observados nos ensaios em diferentes concentrações do meio de cultura para Daphnia magna e resultados dos Testes t (software STATISTICA® 7.0) foi verificado que não houve diferença estatística significativa entre os efeitos ( p > 0,05). Onde: 0% - sem adição de meio de cultura; 50% - metade da concentração do meio de cultura; 100% - concentração do meio de cultura normal; 200% - o dobro da concentração do meio de cultura e Normal – água de diluição (água utilizada para preparar as soluções teste NBR/ABNT (2004)). ... 25 Tabela 3: Percentuais de efeito observados nos ensaios em diferentes concentrações do meio de cultura para Daphnia magna e resultados da análise de variância (ANOVA - Monofatorial software EXCEL® 2007 ) com a probabilidade de 95%, foi verificado que não houve diferença estatística significativa entre os efeitos (Fobs = 0,72 e Fcrit = 3,48) Onde: 0% - sem adição de meio de cultura; 50% - metade da concentração do meio de cultura;
100% - concentração do meio de cultura normal; 200% - o dobro da concentração do meio de cultura e Normal – água de diluição (água utilizada para preparar as soluções teste NBR/ABNT (2004)). ... 26
vii Sumário
Agradecimentos ... iii
Resumo ... iv
Lista de tabelas ... vi
Objetivo geral ... 12
Objetivos específicos ... 12
Fundamentação teórica ... 13
Produção ... 13
Eclosão ... 14
Metodologia ... 17
Pré-cultivo ... 17
Cultivo ... 18
Estocagem e Eclosão ... 20
Meios de estocagem ... 21
Eclosão ... 21
Padrões morfológicos ... 23
Carta controle de sensibilidade. ... 23
Resultados e discussão ... 25
Adequação ao cultivo ... 25
Cultivo ... 27
Estocagem ... 32
Eclosão e Sensibilidade ... 35
Aplicações ... 44
Considerações finais ... 45
viii Recomendações ... 45 Referências ... 46 Apêndices ... 49
9 Introdução
O processo de urbanização trata de um fator positivo para melhoria da qualidade de vida. Infelizmente esse desenvolvimento é demasiado e comumente desordenado, associado ao crescente aumento populacional, gera fontes poluidoras originárias de uma utilização dos recursos naturais e determinando negativos impactos à sobrevivência, promovendo alterações no equilíbrio natural dos ecossistemas.
Em resposta á essas alterações antrópicas do ambiente, existem a necessidade de avaliar e quantificar a entrada de substâncias xenobióticas que normalmente é realizado pelo emprego de análises químicas. Apesar de apontarem as substancias responsáveis pela toxicidade presente nos ambientes são incapazes de avaliar os possíveis efeitos sinérgicos ou aditivos entre elas. Por esse motivo, a utilização de ensaios ecotoxicológicos é relevante na avaliação ambiental prevendo o seu grau de contaminação.
Os testes de toxicidade foram criados para avaliar e monitorar os efeitos adversos que coquetéis de substâncias ou efluentes pode causar na biota aquática (RESGALLA Jr., 2002).
Outro aspecto positivo na sua utilização é de serem rápidos baratos confiáveis e além de apresentarem uma padronização mundial que promove sua ampla difusão (RORIG 2005;
POLEZA et al., 2008). Dentre os organismos utilizados em bioensaios para água doce, Zagatto & Goldstein (1984) relatam que Daphnia magna é preconizada na utilização em monitoramentos ambientais, tanto na França como nos Estados Unidos da América. A U.S.
Environmental Protection Agency (USEPA) indica o emprego da mesma espécie na avaliação da toxicidade de compostos comumente aplicados na agricultura, tais como fertilizantes, fungicidas, inseticidas e pesticidas, aferindo o grau de periculosidade apresentado e o potencial de risco em sua utilização (NAKAGOME et al., 2006). Além disso, esse microcrustáceo possui um caráter de elencar rapidamente problemas no meio na utilização em testes toxicológicos como bioindicadores. Apesar de não ser uma espécie alóctona, seu cultivo é amplamente difundida em todo o mundo, de execução facilmente reproduzida pelas normas apresentadas na da NBR 12713 da Associação Brasileira de Normas Técnicas NBR/ABNT (2004).
Os ensaios apresentados na norma NBR/ABNT (2004), consistem em expor o organismo teste a compostos ou amostras ambientais, cujo resultado é o poder deletério
10 ocasionado pela substância ou a qualidade ambiental para a biota aquática. Leva-se em consideração ainda fatores relevantes quanto a manutenção desses organismos, pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de amônia e sulfetos. Estes fatores podem apresentar um caráter estressante para seu desenvolvimento, e, desta forma, devem respeitar as limitações dos organismos assegurando assim a eficácia do indicador.
O organismo modelo utilizado neste trabalho pertence à antiga ordem Cladocera do gênero Daphnia, sendo popularmente chamada de pulgas d‟água, devido principalmente a sua forma de locomoção. As espécies desse gênero fazem parte do zooplâncton límnico, de importância na cadeia alimentar aquática, representando o elo entre organismos autotróficos e consumidores (RUPPERT et al., 2005). Devido a este papel, efeitos observados nestes organismos inferem em plausíveis problemas aos níveis tróficos subseqüentes, destacando seu uso na avaliação de impacto de um tóxico assim como no estado de saúde do ambiente.
Estes organismos apresentam ainda uma particularidade de, quando sujeitos a condições naturais adversas a sua sobrevivência, tais como falta de alimento, competição, predação e temperatura, podem alterar a sua estratégia reprodutiva. Desta forma, quando em condições normais, a população de Cladocera é constituída somente por fêmeas diplóides que se reproduzem por partenogênese (reprodução assexuada com o desenvolvimento de um embrião sem que ocorra a sua fecundação) originando fêmeas idênticas a progenitora. Porém, em condições desfavoráveis, estas fêmeas diplóides produzem, assexuadamente, fêmeas e machos haplóides. Estes, sexuadamente, produzem ovos de resistências (Efípios), que podem permanecer no ambiente por longos períodos no sedimento e que eclodem, gerando novas fêmeas diplóides quando as condições ambientais favoráveis são restabelecidas (RUPPERT et al., 2005 e PAUWELS et al., 2007).
Esta diapausa é observada em Daphnia magna, sendo esses efípios de real relevância à sobrevivência destas espécies. Essa adaptação visa não só o escape de condições adversas como também sua dispersão no ambiente natural, possibilitando a difusão em diferentes ambientes devido a sua morfologia (presença de um espinho apical) que confere aderência em distintas superfícies. Além disto, podem prover proteção a ressecamentos, podendo suportar até a passagem por trato digestivo de peixes plactívoros, de pássaros e até mamíferos que se alimentem desses peixes (HAVEL & SHURIN, 2004; RUPPERT et al., 2005).
11 Outro ponto a ser destacado é a utilização destes organismos na aqüicultura, ofertados como alimento natural, imprescindível para estágios iniciais de desenvolvimento de espécies de interesse comercial, principalmente de peixes. O desenvolvimento de alimento vivo na aquicultura tem se mostrado vantajoso na substituição de dietas artificiais devido ao maior valor nutricional e por não comprometerem a qualidade da água de cultivo ocasionada pela decomposição da ração artificial ofertada em excesso (TAKAHASHI et al., 2010; LUNA- FIGUEIROA, 1999).
Por fim, os ensaios ecotoxicológicos, que utilizam organismos cultivados em laboratório, apresentam o problema de custos, tempo e mão de obra especializada. Entretanto, a existência da possibilidade da estocagem de organismos em estado de quiescência ou diapausa, como acontece com cistos de Artemia salina, seria uma prática de grande facilidade para as aplicações nos laboratórios e empresas de consultoria ambiental assim como na aquicultura, permitindo o seu mais diverso uso nas diferentes ciências ambientais.
12 Objetivo geral
Investigar a produção e a viabilidade de efípios do Cladocera Daphnia magna em condições de cultivo extensivo em laboratório para distintas aplicações.
Objetivos específicos
o Avaliar o processo de indução em diferentes meios de cultivo que melhor proporcione a produção de efípios do Cladocera Daphnia magna;
o Avaliar qual o melhor método de estocagem de efípios, bem como o período possível de estocagem;
o Identificar os fatores que determinam o sucesso de eclosão de efípios produzidos nos cultivos extensivos em laboratório;
o Identificar a influencia da dureza associado às distintas adições dos constituintes na água do cultivo na produção de ovos de resistência;
o Avaliar a eficiência de métodos de desencapsulação no sucesso da eclosão e viabilidade dos neonatos submetidos a estas técnicas; e
o Avaliar a sensibilidade de neonatos obtidos de efípios em ensaios com tóxicos de referência.
13 Fundamentação teórica
Produção
Na literatura, estudos relatam que os principais fatores que induzem a formação de ovos de inverno (Efípios) no Cladocera Daphnia magna são a temperatura, densidade populacional e alterações na luminosidade ou fotoperíodo (STROSS 1969a). Este mesmo autor destaca que a densidade de cultivo em laboratório é o fator determinante ao estimulo para a produção de efípios. Por outro lado, Young (1979), relata que a produção de efípios é uma estratégia relacionada com a sazonalidade, também associado a fatores abióticos como temperatura e a luminosidade, que interfere na fisiologia dos organismos, reduzindo ou aumentando sua capacidade reprodutiva. Em decorrência dessas alterações, obtêm-se ninhadas com machos e fêmeas haplóides e a formação de ovos de resistência como resultado da reprodução sexuada. Também tem sido destacado que este tipo de ninhada sob condições abióticas favoráveis foi observado no ambiente conforme o descrito por Stross (1969b) em lagos da Inglaterra no verão.
Este caráter facultativo também foi observado por Ricci (2001), para rotíferas, relatando que a produção em ambiente natural comumente se dá por meio de pulsos naturais e em condições favoráveis e que asseguram o seu sucesso reprodutivo. Fêmeas com ovos de resistência apresentam uma maior pigmentação sendo assim mais susceptíveis a predação (Boersma et al. 2000). Desta forma, o emprego desta estratégia tende a manter o acervo de efípios e assegurando a sobrevivência destes organismos no seu hábitat.
Ecologicamente, os neonatos originários de efípios são geneticamente diferentes dos seus progenitores, o que permite um aumentando da variabilidade genética populacional, permitindo a sua estabilidade em ambientes efêmeros e uma sustentação e manutenção genética da população (De Meester et al., 2006).
Diversos estudos visam descobrir outros fatores que possam estimular o surgimento de estados dormentes em organismos, tentando analisar os aspectos intrínsecos à biologia desses indivíduos. Considerando não apenas os fatores abióticos anteriormente abordados, Boersma et al. (2000) acreditam que as novas proles recebem informações maternais de condições desfavoráveis assim como de indicativos da existência de predadores naturais. Já para
14 Slusarczyk et al. (1995), o cultivo de Cladocera na presença de peixes predadores pode estimular a formação de ovos de inverno, formando neonatos haplóides na segunda ninhada em função da presença de substâncias químicas liberadas pelo predador.
Posteriormente Slusarczyk et al. (1999), realizou uma série de experimentos investigando do efeito de feromônios, tanto os alomônios (substâncias utilizados para a defesa das espécie para comunicação) como também os cairomônios (compostos produzidos pela presa cujos predadores são capazes de identificar) resultando num estímulo a produção de efípios. Estes estudos estão baseados na produção de ovos de resistência no ambiente natural, o que podem nortear estratégias para a sua produção em cultivo laboratorial extensivo.
Exemplos de cultivos destinados a este propósito podem ser citados os trabalhos de Rojas et al. (1999), na produção de ovos de resistência do Rotífero Brachionus calyciflorus pallas realizado em tanques de 30-40 litros com água da chuva filtrada e do Cladocera Moina micrura (ROJAS et al., 2001).
Para espécie em estudo, Stross (1969b), obteve os ovos de resistência de Daphnia magna providos de um regime de cultivo em um tanque com 3 metros de comprimento por 1,5 de largura e 1,5 de profundidade, onde não teve o controle dos parâmetros físico-químicos e também a não oferta de alimento.
Eclosão
Segundo Pauwels et al. (2007), a função principal de um ovo de resistência é estocar energia, atendendo as necessidades da prole por longos e severos períodos, resultando assim em elevados custos energéticos à produção, tanto em reservas como na formação da estrutura protetora. Esse conjunto de aparatos garante uma viabilidade em grande escala temporal (RICCI, 2001; ROJAS et al., 2001 ). Em cladóceros, essas estruturas adicionais têm o formato de cela que denota seu nome (efípio) (RUPPERT et al., 2005).
Essa segunda camada protetora em Daphnias resulta na sua proteção, como também torna o ovo de resistência temporariamente irreversível (BOESMA et al., 2000). Esse caráter refratário, não só impede o rápido desenvolvimento, mas garante a não quebra da dormência nas mesmas condições desfavoráveis a qual foi formada. Este período de dormência pode
15 variar de dias a décadas, conforme Hairston et al. (1995) expondo a ocorrência de ovos do copépoda Diaptomus sanguineus com até 332 anos estimados.
Destacando sua fisiologia, Arbačiauskas (2004), enfoca que fêmeas provindas de ovos de inverno apresentam uma variabilidade tanto em crescimento quanto na sua reprodução, sendo estas, atenuadas a partir da primeira ninhada. Outro ponto relatado pelo autor é à plasticidade fenótipa que consiste na prole alterar-se morfofisiologicamente para se adequar no ambiente, como quando sujeitos a elevadas densidades ou na falta de alimento, infere uma mudança em seu metabolismo, resultando em alteração no seu tamanho como também, em sua capacidade reprodutiva.
Nesta mesma linha, Pauwels et al. (2007), expõe que neonatos de Daphnia magna após sua eclosão possuem uma massa inicial menor, comparada à providos de reprodução partenogênica, em contra partida, seu metabolismo é mais acelerado, aferindo uma maior taxa de crescimento, contribuído pela maior reserva energética que esses ovos propiciam.
O principal gatilho para a eclosão ainda é tema de divergências. De acordo com a literatura, estímulos para a quebra da dormência são atribuídos a fatores exógenos como temperatura e fotoperíodo (STROSS, R.G. 1969a; STROSS, R.G. 1969b; ROJAS et al., 1999;
BOESMA, M. 2000; LESS et al., 2005; VANDEKERKHOVE et al., 2005; MUGRABE, 2007e PAUWELS et al., 2007). Por outro lado, Arbačiauskas (2004) relata que os efípios tendem a quebrar sua dormência, estimulados na presença de alimento, apoiado por e Pauwels et al. (2007), que cita a eclosão em ambiente natural associado a Blooms de algas.
Outros estudos expõem os fatores endógenos, que igualmente aferem efeitos, como o apresentado por Less et al. (2005), que aponta um efeito negativo na eclosão frente a feromônios de peixes. Por outro lado, De Meester & De Jager (1993) mencionam que após sua fase refratária, ovos de idades inferiores, apresentam melhores taxas de eclosão. Ricci (2001) destaca que a qualidade do efípio está intimamente relacionada com investimento maternal sendo análogas as condições de formação, como a quantidade e qualidade da dieta da sua progenitora. Desta forma Rojas et al. (2001) afirmam que as proles mais aptas fomentam o sucesso das futuras gerações, corroborando com o sucesso da eclosão não dependendo apenas dos fatores abióticos.
Por fim, devido ao caráter mais subjetivo de fatores bióticos, como também sua difícil execução, Vandekerkhove et al. (2005), enfoca a praticidade dos métodos de eclosão em
16 regime laboratorial, integrando efípios coletados de 29 lagos da Dinamarca, 34 na Holanda/Bélgica e 32 da Espanha, observando ocorrência de estágios dormente em 45 espécies de Cladocera. Dentro de uma gama de ensaios, visando apenas fatores exógenos, o autor aponta que as maiorias das espécies despertam com temperaturas entre 15-20°C por um período de 3-5 dias de encubação.
17 Metodologia
Pré-cultivo
Primeiramente, foi necessária a confecção do recipiente de cultivo, objetivando uma fácil manutenção, como também um rápido e eficaz expurgo de detritos orgânicos, tais como, algas mortas, ecdises e principalmente os efípios, que depois de formados, sedimentam. Desta forma, a retirada da água de fundo não só facilita a captação dos ovos de resistência, como também elimina os detritos em decomposição sedimentados, contribuído para a melhoria do cultivo.
Os cultivos do Cladocera Daphnia magna foram realizados no Laboratório de Ecotoxicologia da Universidade do Vale do Itajaí, UNIVALI, conforme protocolo descrito na NBR/ABNT (2004), ambos em água reconstituída (água de fonte natural adicionada as quatro primeiras soluções descritas na norma brasileira). As matrizes foram mantidas e acondicionadas em recipientes de vidro com 2,8 litros, sempre respeitando a densidade proposta na norma, consequentemente, estes cultivos forneceram os neonatos para inicio do cultivo extensivo e principalmente para a elaboração da carta controle de sensibilidade e possibilitando a posterior comparação aos neonatos providos de efípios.
Tendo em vista esses aspectos, optou-se na reutilização de bombonas de 20 litros, em função de seu formato, facilidade de aquisição e de baixo custo quando comparado a aquários de vidro. Optou-se pelas bombonas cujo formato fosse o mais cilíndrico possível, sempre de coloração azul que promove uma atenuação na luminosidade. Com ela, retirou-se o fundo rente a base, transformando-a em um funil, adaptando em sua boca uma luva de redução soldável de 60x25mm. Na sua saída, funde uma bucha de redução de 25x20mm, possibilitando a solda de um cano de 20 mm com comprimento de 7 cm. Na outra extremidade, um joelho 90° soldável e um novo cano de 16 cm ambos de 20 mm de diâmetro é soldado uma luva com rosca de 20 mm, permitindo na terminação final uma torneira, o que facilita o expurgo da água de fundo na coleta e manutenção. Por fim, para base deste tanque, fez o emprego de uma luva coletora de esgoto de 200 mm, cortada com 21 cm de comprimento juntamente com abertura de um espaço que possibilita a saída da torneira.
18 O produto final nada mais é do que um grande funil, com uma torneira na sua extremidade, que comporta dependendo de seus cortes, 18 litros (Figura 1). Porém, neste volume, a manutenção se torna mais difícil e delicada, obrigando o uso de 15 litros como o volume de melhor condição de manutenção. Outro ponto relevante a sua confecção, que devido o uso de adesivo plástico para PVC, o novo tanque deve ser bem lavado, deixando-o de molho com renovação de água, a fim de assegurar a completa remoção de resíduos de cola.
Apresentados na figura 1:
Figura 1: Fotos dos tanques de cultivo extensivo empregados para o cultivo da Daphnia magna.
Cultivo
Os cultivos extensivos (cujo objetivo foi à produção de ovos de resistência) foram realizados com distintos meios. O primeiro meio foi o uso da própria água reconstituída, denominada “100%”, que representou a adição das soluções nas concentrações propostas na
19 NBR/ABNT (2004). O segundo método foi à utilização da água da mesma fonte natural com metade da adição das soluções, chamado de “50%”. O terceiro método utilizou apenas da água desta fonte natural sem adição das soluções, denominado “0%”. Por fim, foi realizado o tratamento “200%”, que apresentou o dobro do volume das soluções na confecção da água reconstituída (Tabela 1).
A água do cultivo foi proveniente de uma nascente natural do bairro de Cabeçudas localizada no município de Itajaí-SC. Esta fonte natural fornece água aos moradores da região e apresenta parâmetros favoráveis a manutenção da Daphnia magna, como o oxigênio dissolvido, geralmente acima dos 8 mg/L, este, estando muito além do 1 mg/L, que é valor mínimo aceitável segundo a norma NBR/ABNT (2004). Com relação ao pH, o intervalo sempre esteve dentro da faixa aceitável, com uma amplitude de 7,0 a 8,0 conforme a NBR/ABNT (2004).
Com relação à dureza, a água proveniente da fonte, sempre apresentou baixos valores, não excedendo as 12 mg CaCO3/L de dureza total analisados no Spectroquant® (MERCK).
Desta forma, ocorre à necessidade reconstituí-la com adição de meios de cultura, conforme a NBR/ABNT (2004), que indica a utilização de quatro soluções em 100% para a correção da água de manutenção para estes organismos teste, apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1: Os quatro primeiros reagentes descritos na norma da NBR/ABNT (2004) para reconstituição da água do cultivo para D. magna, como também sua concentração utilizada no preparo das soluções estoque e o volume que foi diluído de cada solução para confecção dos diferentes meios de cultura, respeitando as condições de preparo que são apontadas na mesma norma. Análogo a adição é descrito os valores médios da dureza total (fonte natural somado a os constituintes se presentes) em mg CaCO3/L para cada meio de cultivo incluindo a dureza natural.
Reagentes e
Dureza da água Fórmula
Concentração das soluções
estoque
Cultivos/volume adicionado por litro em ml 200% 100% 50% 0%
Cloreto de cálcio CaCl2·2H2O 73,5 g/L 6,4 3,2 1,6 - Sulfato de magnésio MgSO4·7H2O 123,3 g/L 1,6 0,8 0,4 - Cloreto de potássio KCl 5,8 g/L 1,6 0,8 0,4 - Bicarbonato de sódio NaHCO3 64,8 g/L 1,6 0,8 0,4 - Média da dureza total em mg CaCO3/L - 175 87 44 12
Para os cultivos, optou-se em realizar métodos com diferentes adições dos constituintes do meio de cultura ambos com fraca aeração, com intuito de verificar a melhor a
20 técnica de produção. A manutenção dos cultivos extensivos foi realizada semanalmente, sempre verificando valor de pH, a coleta dos efípios e também a estimativa das densidades totais de Cladocera dentro dos tanques. As estimativas de densidade foram realizadas com o auxilio de uma concha plástica de 58 mL utilizado como subamostrador nos tanques. Sempre foram realizados cinco sub-amostragens. Após a contagem das mesmas era retirada uma média simples e extrapolada para todo o cultivo, resultando no número total estimado de indivíduos em cada tanque (para 15 litros). As renovações dos meios de cultura em cada tanque foram semanalmente e com a renovação de 60% de seu volume total. O aumento da densidade dentro dos tanques era proporcionada pela própria reprodução dos organismos e pela introdução de juvenis provenientes do cultivo de matrizes.
Por fim, para o método de coleta dos efípios foi padronizado com a retirada de 1 litro de água do fundo, removida por intermédio da torneira adaptada. Este litro de água foi filtrado em um funil que na extremidade apresenta uma malha de 75 μm, e a água, após essa primeira filtragem era descartada. Com o material retido na rede, constituído não só de efípios, mas também de ecdises, materiais em decomposição, e até as próprias Daphnias vivas, foram separados manualmente. Os efípios obtidos foram lavados com 500 mL de água destilada sobre a malha 25 μm com auxiliado de um pissete, e estocados em tubos do tipo eppendorf com água destilada e acondicionados no escuro, para evitar sua eclosão. A densidade de estocagem foi em média de 225 efípios por 1,5 mL de água destilada. Todos os cultivos da Daphnia magna foram alimentados com o fitoplâncton Scenedesmus subspicatus, ofertados conforme NBR/ABNT de (2004) para os cultivados em béqueres (matrizes). Entretanto, os cultivados nos tanques (extensivo), a alimentação foi padronizada de 2 litros de densidade entre 1,7 a 2,5 x106 cel mL-1 ofertada cinco vezes por semana por tratamento. O cultivo da alga foi realizado segundo NBR/ABNT (2004), porém, seu meio de cultivo (CHU) foi alterado para prover um maior crescimento. Fez-se necessário o acréscimo de 20% de suas soluções, como também em casos de necessidade de uma taxa de crescimento ainda maior, o acréscimo apenas da solução de micro nutrientes foi de até 3 vezes mais do proposto no meio.
Estocagem e Eclosão
Ensaios preliminares foram realizados para identificar o melhor método de estocagem e incubação para a eclosão dos efípios. Em etapa inicial os efípios tratados pertenceram ao
21 primeiro cultivo realizado, com 100% de meio de cultura de sua produção extensiva iniciado em abril de 2010.
Meios de estocagem
Técnicas destinaram investigar o melhor meio de estocagem dos efípios e que poderiam promover maiores taxas de eclosão. Testou-se a estocagem em água destilada (controle negativo), seguido pela estocagem com o próprio meio de cultura da NBR/ABNT (2004) em diferentes pH (4,96; 6,30; 7,8; 9,11 e 10,20) ajustados com soluções de ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH), assim como a estocagem em meio de cultura com alterações de seus constituintes, como ausência do meio de Ca e Mg e meio com concentrações 4 vezes superiores as recomendadas, ambos mantidos em temperatura ambiente (21°C).
Do mesmo modo foi verificado à influência da salinidade na estocagem destes efípios, em salinidade 1,1 (0,8 acima do meio de cultura NBR/ABNT (2004)), para sua confecção foi utilizado o meio descrito na norma com adição de uma salmoura. Testou-se também a estocagem dos efípios na presença do fitoplâncton Scenedesmus subspicatus, também verificando o sucesso da estocagem a seco, ambos tratamentos na temperatura ambiente (±21°C), por fim, verificou ainda a estocagem em refrigerador (4°C). Todos os efípios estocados de todos os tratamentos foram mantidos no escuro.
Eclosão
Os primeiros ensaios tiveram como base as informações obtidas na literatura, que afirmam promover um choque térmico a 4°C antes das condições de eclosão. Estas se constituíram em transferir os efípios que foram mantidos em refrigerador, para recipientes com meio de cultura, sendo incubados na temperatura de 20±1°C com fotoperíodo 12:12.
Outra técnica constou na incubação com adição de alimento, testando a presença do fitoplâncton fresco (Scenedesmus subspicatus), como a solução ultrasonificada do fitoplâncton da mesma espécie (processo a qual quebra a parede celular e promove a liberação
22 de seu constituintes como DNA no meio feito pelo período de 1 minuto sobre uma freqüência de 100 Hz), frente à incubação em meio de cultura padrão, realizada com padrões básicos de fotoperíodo (12:12) em temperatura de 24,0±0,5°C.
Testou-se ainda o sucesso da eclosão frente ressecamento overnight, que consiste em acondicionar os ovos de resistência sob um papel absorvente em temperatura ambiente (21,0±0,5°C) durante uma noite, após esse período, eles eram transferidos para o recipiente de incubação com o meio de cultivo, verificando sua eclosão incubados em padrões básicos de fotoperíodo de 12:12 na temperatura de 24,0±0,5. Este método de ressecamento foi aplicado quatro vezes, após sete dias de incubação para o mesmo lote. Por fim, foi testada a reidratação com água destilada nos mesmos eppendorf, realizada após o processo de ressecamento overnight durante o período de 7; 14; 21; 28 e 38 dias numa coleção de efípios anteriormente estocados no escuro na temperatura ambiente e em água destilada. A incubação destes dois últimos métodos se deu em regime de temperatura a 21,0±0,5°C sob luz constante.
Fundamentado pelos métodos anteriormente abordados, foi realizado o primeiro ensaio com efípios produzidos entre os cultivos (200%, 100%, 50% e 0%) apontando qual técnica gera efípios com melhores taxas de eclosão. Para esta avaliação utilizou-se a técnica de ressecamento overnight e incubação a 21°C com luz constante.
Por fim, foram realizados ensaios envolvendo solventes cujo objetivo foi remover parte da sela (carapaça) do efípio, que auxiliaria a sua abertura. Este processo necessita de uma lavagem logo após sua exposição ao solvente devido a potencial toxicidade do composto utilizado em água destilada por um período de 1 hora. Após este processo os efípios foram dispostos para eclosão em meio de cultura em luz constante sob uma temperatura de 21°C. Os solventes testados foram o Cloro comercial a 0,15%, Álcool a 70%, Acetona 5% e Cloreto de lítio a 5% ambos descritos por Antonino (2007), como solventes tanto na purificação ou solubilização para extração da quitina (material da sela do efípio). O tempo de exposição aos solventes foi de 15, 30 e 60 minutos para os dois primeiros solventes num primeiro ensaio, seguido pelo ensaio com todos os quatro solventes num tempo de 30 minutos. O Cloro comercial (2 - 2,5%) também foi testado em tempos de exposição de 10, 20, 30, 60 e 120 segundos, todos comparados com um controle (efípios sem tratamento químico) ambos os tratamentos foram incubados a 21°C sob luz constante.
23 Em função dos resultados obtidos de todos os procedimentos anteriormente desempenhados, realizou-se o ensaio final com efípios obtidos em cultura extensiva de 200%
de meio, estocagem em distintos tempos em água destilada no escuro sob temperatura ambiente, frente à exposição em cloro a 0,15% por 30 minutos. Neste ensaio avaliou-se a influência do ressecamento overnight e incubação padrão nas taxas de eclosão.
Padrões morfológicos
Testes paralelos visaram à existência de padrões morfológicos de qualidade dos efípios e que podem apresentar melhores taxas de eclosão. Foram determinadas quatro classes de efípios: Translúcidos e de fácil visualização de seus núcleos com tamanhos entre 1,30 a 1,45 mm; com pigmentação escura e de difícil visualização dos núcleos e tamanho similar ao anterior; de tamanho pequeno inferior a 1,1mm e os que não apresentam bem definida a sela protetora, fruto de uma incompleta formação. Ambos incubados em padrões básicos de fotoperíodo de 12:12 e temperatura de 24°C com ou sem adição do alimento fresco (Scenedesmus subspicatus).
Carta controle de sensibilidade.
Durante todo o processo de cultivo extensivo, paralelamente se manteve cultivos nas condições descritas pela norma brasileira (matrizes). Estes, além de prover os neonatos inicias ao cultivo extensivo, forneceram os neonatos para ensaios de toxicidade, seguindo sempre o mesmo protocolo, realizados em água de diluição com a utilização de neonatos nascidos a partir da terceira ninhada até completarem no máximo 60 dias. Para isso, a cada 20 dias, foram iniciadas novas culturas provendo a renovação das matrizes e permanecendo dentro a idade limite. Os neonatos utilizados no teste foram de 2 a 26 horas de vida, não sendo alimentados antes do ensaio. Nestes testes, foram expostos 20 neonatos por concentração da substância química sempre em duplicata num recipiente contendo 40 mL da solução teste e incubação em 21°C com fotoperíodo 16:8, verificando sua toxicidade aguda em 48 horas de
24 exposição pelo efeito deletério apresentado. Realizados com no mínimo cinco diluições, a substância de referência elencada foi o Dicromato de potássio (K2Cr2O7) verificando o parâmetro de toxicidade CE50 (Concentração Efetiva Mediana) calculado pelo método Trimmed Spearman-Karber (TSK 1.5).
Assim como para os neonatos obtidos em cultivo das matrizes, os organismos provenientes dos efípios igualmente foram empregados nos ensaios de toxicidade com o tóxico de referência. Para tal, juvenis eclodidos do tratamento com hipoclorito de sódio a 0,15% provenientes do cultivo 200%, empregando os organismos com tempo de eclosão de 3 a 4 dias e de 5 a 6 dias foram utilizados nos ensaios. Sua sensibilidade foi analisada em base dos valores de CE50 para o Dicromato de potássio.
25 Resultados e discussão
Adequação ao cultivo
Inicialmente, foram testados a possibilidade de toxicidade de utilização do meio de cultura abaixo e acima das concentrações recomendadas pela NBR/ABNT (2004). Para tal foram utilizados neonatos provenientes das matrizes em ensaios agudos para quatro diferentes condições de cultivo em triplicata. Estes ensaios foram realizados em paralelo aos testes de sensibilidade com o tóxico de referência, onde todos os meios empregados nos cultivos foram de baixa toxicidade e com valores similares ou abaixo dos resultados do controle. Onde na Tabela 2, foi verificado que não houve diferença estatística significativa entre os efeitos ( p >
0,05) e na Tabela 3, também foi verificado que não houve diferença estatística significativa entre os efeitos (Fobs = 0,72 e Fcrit = 3,48).
Com os resultados obtidos dos testes estatísticos, ambas as adições de meio de cultivo não aferem em efeitos a sobrevivência do organismo padrão (abaixo de 10% de acordo com NBR/ABNT (2004)). Como também não foi observado diferenças significativas nos efeitos de ambos os meios observados em ensaios agudos conforme a mesma norma.
Tabela 2: Percentuais de efeito observados nos ensaios em diferentes concentrações do meio de cultura para Daphnia magna e resultados dos Testes t (software STATISTICA® 7.0). Onde: 0% - sem adição de meio de cultura; 50% - metade da concentração do meio de cultura; 100% - concentração do meio de cultura normal;
200% - o dobro da concentração do meio de cultura e Normal – água de diluição (água utilizada para preparar as soluções testeNBR/ABNT (2004)).
Teste t Média do controle Média dos cultivos t-value df P
Controle vs. 100% 1,25 0,42 2,00 4,00 0,11612
Controle vs. 50% 1,25 0,83 0,50 4,00 0,64333
Controle vs. 0% 1,25 1,67 -1,00 4,00 0,37390
Controle vs. 200% 1,25 1,25 0,00 4,00 1,00000
26 Tabela 3: Percentuais de efeito observados nos ensaios em diferentes concentrações do meio de cultura para Daphnia magna e resultados da análise de variância (ANOVA - Monofatorial software EXCEL® 2007 ) com a probabilidade de 95%, Onde: 0% - sem adição de meio de cultura; 50% - metade da concentração do meio de cultura; 100% - concentração do meio de cultura normal; 200% - o dobro da concentração do meio de cultura e Normal – água de diluição (água utilizada para preparar as soluções testeNBR/ABNT (2004)).
Outro ponto essencial a cultura, foi à necessidade de cultivo da microalga (Scenedesmus subspicatus) que foi desenvolvido de forma extensiva para assegurar a oferta aos Cladóceras. O acréscimo nos seus constituintes do meio CHU se fez necessário à produção, visto que esta adição promove um crescimento 20% a mais em sua cultura, sempre realizada sobre aeração e luz constante. Entretanto, esta adição de constituintes provoca uma redução do pH do meio CHU. Este caráter acidificado, com valor de pH em torno de 6,5 não interfere no desenvolvimento da cultura de alga, porém, para o cultivo do organismo proposto, este intervalo não é propicio a espécie, consequentemente, uma adição de alimento acima de 2 litros nos cultivos (2 litros representa 13% do volume total), poderá aferir uma oscilação neste parâmetro, podendo resultar numa cenário desfavorável a manutenção.
Anova: fator único RESUMO
Grupo Contagem Soma Média Variância
Normal 3 3,75 1,25 0,00
100% 3 1,25 0,42 0,52
50% 3 2,5 0,83 2,08
0% 3 5 1,67 0,52
200% 3 3,75 1,25 1,56
ANOVA
Fonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico
Entre grupos 2,71 4 0,68 0,72 0,60 3,48
Dentro dos grupos 9,38 10 0,94
Total 12,08 14
27
Cultivo
Com relação aos parâmetros físico-químicos, o oxigênio dissolvido, devido a fraca aeração associado à renovação semanal de 60% do meio de cultivo, sempre se manteve acima de 7 mg/L, este resultado, estando além do mínimo exigido pelo organismo (1 mg/L). A variação do pH nos cultivos também foi um fator favorável a sua manutenção, se mantendo praticamente em todas as leituras dentro dos limites indicados na norma (7 - 8) (Fig. 2), que corrobora com o método de adição de alimento não sofrendo influência.
Figura 2:Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) do pH dos cultivos extensivos de Cladocera. Estes valores foram ajustados em todas as manutenções.
Ainda associado à manutenção, as estimativas de densidades fornecem indicativos sobre a saúde do cultivo, fato observado pela sustentação das densidades. A produção do estágio de dormência, associado às maiores densidades, parece promover a geração de ovos de resistência com padrão morfotípico de aparência translucida de completa formação e de fácil visualização dos núcleos (Fig. 3), sendo estes predominantes nos cultivos extensivos.
6,50 7,00 7,50 8,00 8,50
pH 200% pH 100% pH 50% pH 0%
Intervalo de valores do pH
valores de pH médios e disvio padão para cada cultivo
28 Figura 3:Exemplo de um efípio de Daphnia magna de 1,366 mm predominante nos cultivos (translucido).
A produção de efípios ocasiona a mortalidade de seus progenitores. Devido a esta dinâmica, o aumento de sua produção resulta no aumento mortalidade dos progenitores levando a uma redução da densidade nos cultivos, exigindo, consequentemente, a adição de novos juvenis provenientes dos cultivos de matrizes para a manutenção dos cultivos extensivos.
Para cada cultivo além do espaço e alimento, a água de cultivo também será um fator limitante na capacidade de suporte da população, já que diversos processos biológicos, tais como ecdise e restos metabólicos tendem a comprometer a qualidade da água, favorecendo, de certa forma a produção dos estágios dormentes. Como a adição dos neonatos foi similar, além do espaço e alimento serem os mesmos para todos os tratamentos de cultivo extensivo, a constituição do meio foi o fator que determinou a produção e suporte destas populações.
A manutenção empregada semanalmente visou não só a melhoria das condições no cultivo, mas também proporcionou o melhor método de obtenção de Efípios. Com estes diferentes meios de cultivo pode-se observar que o método apresenta a maior produção, a densidade e o tempo de formação de Efípios foi o com o dobro de adição dos constituintes o 200% (Fig. 4).
29 Figura 4: Variação da densidade (Org./15 litros) e a produção semanal estimada de Efípios para cada meio de cultivo ao longo do tempo de sua manutenção e execução. Sendo: A - 100% do meio recomendado pela
NBR/ABNT (2004); B - 50% do meio recomendado pela NBR/ABNT (2004); C - 0% - água natural sem adição de meio, e 200% do meio recomendado pela NBR/ABNT (2004).
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
1 13 27 41 53 66 76 89 105 119 136 147 160 174 196 210 224 235 257 277 291 308 322 336
Número de efípios produzidos
Densidade do cultivo
Dias de cultivo 100%
Densidade Número de efípios
A
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
1 13 27 41 53 66 76 89 105 119 136 147 160 174 196 210 224 235 257 277 291 308 322 336
Número de efípios produzidos
Densidade do cultivo
Dias de cultivo 50%
Densidade Número de efípios
B
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
1 13 27 41 53 66 76 89 105 119 136 147 160 174 196 210 224 235 257 277 291 308 322 336
Número de efípios produzidos
Densidade do cultivo
Dias de cultivo 0%
Densidade Número de efípios
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
1 13 27 41 53 66 76 89 105 119 136 147 160 174 196 210 224 235 257 277 291 308 322 336
Número de efípios produzidos
Densidade do cultivo
Dias de cultivo 200%
Densidade Número de efípios
C
D
30 Em primeiro lugar, foi observada à presença de cianobactéria filamentosa durante o período de 48 a 76 dias de cultivo nos tratamentos 100%, 50% e 0%. Estas formas filamentosas acarretaram na colmatação do aparelho filtrador dos organismos e morte com a redução da densidade dos cultivos. Outro ponto relevante ocorreu entre os dias 251 a 269 de cultivo quando houve problemas de produção de fitoplâncton, diminuindo a oferta de alimento para os cultivos extensivos resultando em nova mortalidade. Por fim, entre os dias 322 a 336 de cultivo houve problemas de manutenção da temperatura de cultivo (picos de até 32°C) ocasionando uma nova onda de mortalidade.
Analisando os gráficos da figura 4 destaca-se a semelhança no comportamento das flutuações da produção de efípios e do padrão da densidade, principalmente para os tratamentos de 100% e 200%. Por outro lado, no tratamento de 50% apesar de similaridade na densidade o padrão de produção se difere, indicando uma produção em pulsos e instável. Por fim, no tratamento de 0% destaca-se o curto período de manutenção, assim como a baixa produção de efípios devido às condições não favoráveis de sua manutenção.
Nos cultivos é evidente que a adição dos constituintes foi necessária para sustentação de maiores densidades, mesmo na adição de apenas 50% dos constituintes já resulta na sustentação de quase o dobro do número de organismos em comparação com água natural (0%). Notou-se a semelhança na média dos tratamentos 50% e 100% recomendado pela norma técnica, nestes casos a adição distinta dos constituintes em média não altera o padrão da comunidade. Entretanto, no tratamento com o dobro dos constituintes (200%) foi observado um expressivo aumento nas médias que sustenta as maiores densidades que consequentemente favorecem em uma maior produção de estágios dormentes (Fig. 5).
31 Figura 5: Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) da densidade de Cladocera em diferentes meios de cultivo para todo o período de manutenção .
Da mesma forma que nos valores de densidade, a produção de Efípios média (Fig. 6) evidenciou que para a obtenção de uma maior produção é indispensável à adição dos constituintes, visto que com acrescimento de apenas metade dos constituintes (50%) já resulta numa ampliação três vezes mais na produção em relação a água natural (0%). No panorama geral, fica claro que o cultivo que obteve a maior média na densidade obteve a maior média de produção. Quando comparamos os dados de densidades e de produção nos cultivos 100% e 50%, que apesar de ambos apresentarem densidades similares, a produção no cultivo de 100%
foi expressivamente superior. Portanto, a adição dos constituintes foi essencial para elevar a produção média, sendo que o tratamento com o dobro dos constituintes eleva em cerca de 30% na produção.
0 2500 5000 7500 10000 12500 15000
200% 100% 50% 0%
Densidade média estimada nos cultivos
cultivos
32 Figura 6: Valores médios (ponto) e desvio padrão (linha) da produção dos efípios para cada método de cultivo ao longo de toda a manutenção.
A dureza recomendada da água de cultivo de D. magna, segundo NBR/ABNT (2004) é de 175 a 225 mg CaCO3/L, que segundo a Tabela 1, só foi alcançada com a adição do dobro dos constituintes (200%) do meio de cultivo. Provavelmente este seria o limitante nos cultivos em termos de densidade e de produção de Efípios.
Estocagem
Inicialmente, foi testada a estocagem na temperatura ambiente em três volumes (1,5;
7,0 e 20,0 mL) ambos em meio de cultivo, seguindo o proposto por Boersma et al. 2000 de realizar esta estocagem sempre no escuro para evitar possíveis eclosões. Neste primeiro momento, foram observadas eclosões mesmo no escuro para os tratamentos de maior volume (7,0 e 20,0 mL). O resultado deste ensaio indicou que a estocagem em maiores volume pode provocar uma indesejada eclosão, sugerindo que a relação número de Efípios/volume de estocagem deve ser mantida o mais alta possível. Assim os Efípios passaram a ser estocados em tubos do tipo Eppendorf de 1,5 mL (Fig. 7).
310
218
146 0 52
200 400 600 800 1000
200% 100% 50% 0%
Média estimada do número produzido por semana de efípios
Cultivos
33 Figura 7: Recipiente do tipo Eppendorf contendo os efípios em água destilada.
Além da escolha da cubagem, o meio a qual os efípios foram submetidos está intimamente relacionados com sua viabilidade. Desta forma, distintos meios de estocagem foram empregados a fim de elencar o melhor meio que resulta nas melhores taxas de eclosão.
Para tal, testaram-se onze variáveis para um mesmo lote sempre em triplicata com 10 efípios num período de 18 dias (Fig. 8).
34 Figura 8: Porcentagem de eclosão de efípios obtida na incubação de 10 dias com fotoperíodo 12:12 sob uma temperatura de 24°C frente aos onze meios de estocagem. Sendo: 1 - estocagem em água destilada; 2 – Meio em pH 7,80; 3 – Meio em pH 6,30; 4 – Meio em pH 4,96; 5 – Meio em pH 9,11; 6 – Meio em pH 10,20; 7 - Meio de cultivo sem a adição as soluções que contem Ca e Mg; 8 – Meio com concentrações de Ca e Mg quatro vezes maior que a recomendada; 9 - Salinidade 1,1; 10 - Estocagem com o fito vivo (Scenedesmus subspicatus); 11 - Estocagem a seco (overnight acondicionada em eppendorf no escuro). A – Eclosão em meio com fitoplâncton; N – Eclosão em meio de cultivo e S – em meio com solução ultrasonificada do mesmo fitoplâncton.
As maiores taxas de eclosão foram obtidas em água destilada como meio de estocagem, para ambos os tratamentos (A, N e S), este meio particularmente representa uma condição negativa a eclosão durante sua estocagem porque não apresenta nenhum constituinte necessário a manutenção da vida, corroborando a não eclosão durante processo de estocagem.
Por outro lado, o emprego deste meio é de fácil execução e replicabilidade, em conseqüência sendo o meio empregado para as demais manutenções (estocagem padrão).
Outros meios que obtiverem resultados positivos foram o tratamento sem adição de Ca e Mg, logo, o meio de estocagem sem os principais constituintes tende a ficar similar ao controle negativo (água destilada). Por outro lado a estocagem com o fito provavelmente está relacionada com a exaustão de nutrientes da solução. Em suma, podemos relatar que meios com relevante presença dos constituintes Ca e Mg denota a não viabilidade de estocagem dos estágios dormentes do organismo modelo.
Visto que a estocagem de 18 dias após o processo de ressecamento overnight foi positiva para condição normal de incubação, este mesmo tratamento foi testado em um maior
0%
20%
40%
60%
80%
100%
A N S A N S A N S A N S A N S A N S A N S A N S A N S A N S A N S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Porcentagemde eclosão
Método de eclosão empregado nos nos meios de estocagem
35 período a fim de ser utilizado como facilitador de aplicações como é o caso dos cistos de Artemia salina 5‰. Entretanto, o resultado desta estocagem a seco de 120 e 258 dias não foi favorável não obtendo eclosões sobre incubação padrão (em meio) para um total de 780 Efípios obtidos. Consequentemente, o processo de ressecamento anterior à estocagem foi descartado dos ensaios. Vale ressaltar também que não foi aferida a umidade após o processo de ressecamento overnight para os mesmos efípios estocados.
Eclosão e Sensibilidade
Para os ensaios de eclosão foram utilizados Efípios estocados em água destilada e em pequeno volume. Baseado na literatura, os primeiros ensaios de incubação foram empregados a temperatura como o agente indutor, (STROSS 1969b; WEIDER LJ, 1997;
VANDEKERKHOVE, J. et al. 2005 e PAUWELS, K. et al. 2007). Segundo estes autores, a estocagem destes estágios dormentes sob um regime de temperatura a 4°C além de não promover eclosões durante o período de estocagem, é um dos gatilhos naturais a eclosão de efípios no ambiente. Entretanto, ensaios realizados resultaram na inviabilidade dos efípios estocados em meio padrão por 6, 7, 11, 17 e 510 dias, colocados para eclodir em luz constante e 21°C com.
Na mesma linha de fatores citados, Boersma et al. (2000) afirma que a presença de alimento durante o período de incubação reflete num estimulo positivo a eclosão do efípio.
Em um primeiro ensaio, foi testada a presença ou não do fitoplâncton fresco (Scenedesmus subspicatus), para efípios estocados por 26 dias. Este ensaio resultou em uma similaridade de eclosão com 15% para ambos os tratamentos. Em seguida, analisou também a presença da solução ultrasonificada de fitoplâncton (Fig. 8). Esta solução não apresentou uma melhora na eclosão.
Quanto aos padrões morfológicos dos Efípios foram avaliadas as taxas de eclosão para ovos de resistência estocados em água destilada e em baixo volume sob uma temperatura ambiente (±21°C) por 1, 3, 7, 12, 22 e 29 dias e incubados em condições padrão de 587 efípios (340 translúcidos, 139 escuros, 78 pequenos e 30 de incompleta formação). Os resultados apresentaram uma média 6% de eclosão nos translúcidos, e nos escuros e pequenos apenas uma eclosão foi observada para cada classe, enquanto que os de incompleta formação
36 não apresentaram nascimentos. Estes resultados indicam que a classe predominante foi a que obteve melhores resultados, indicando a necessidade de técnicas de cultivo apropriadas, com a produção de Efípios que reflitam ao investimento maternal como descrito por Ricci (2001).
Segundo proposto em Vandekerkhove, J. et al. (2005) foi empregada as técnicas de resfriamento para eclosão e de ressecamento overnight anterior a sua incubação em condições padrões tendo o resultado apresentado na figura 9.
Figura 9: Percentual de eclosão para efípios estocados em condições padrões e sob temperatura de 4°C (510) e após o ressecamento overnight, em condições de incubação com luz constante em temperatura de 21°C.
Analisando os resultados obtidos sob estocagem padrão, fica evidenciado um aumento no percentual de eclosão em consequência do aumento do tempo de estocagem, este resultado corrobora com De Meester & De Jager (1993), que estágios dormentes necessitam de um tempo refratário antes de apresentarem viabilidade de nascimento. Uma estocagem por 6 meses foi capaz de promover uma melhora na sua taxa, possivelmente este padrão indica uma provável sazonalidade, tendo em vista que ambos os efípios foram produzidos em similares condições (meio de cultura, volume, alimentação, temperatura, manutenção e estocagem).
Esta melhora em particular pode ser também o reflexo do processo de ressecamento anteriormente aplicado, contribuindo positivamente para sua eclosão. Entretanto, ensaios posteriores realizados com a mesma técnica não apresentaram resultados positivos descartando emprego destas metodologias.
0 20 40 60 80 100
1 8 29 57 127 162 510 (4°C)
Porcentagem de eclosão
Tempo de estocagem sobre condições padrão em dias
37 Foram avaliadas as taxas de eclosão, em condições padrões de Efípios originados dos diferentes meios de cultura extensivos (Fig. 10).
Figura 10: Porcentagens de eclosão obtidos em distintos meios de cultivo, para um total de 469 efípios estocados em condição padrão por um dia par os meios 50%, 100%, 200% e 100%(2010). Como também para um total de 225 efípios estocados nas mesmas condições em 37 dias .
Estes resultados apontam que os meios de cultivo empregados foram análogos à qualidade do efípio formado, onde o cultivo que gerou maior média de produção (200%) também é o que produz efípios de melhor viabilidade.
Similar as técnicas aplicadas para cisto em Artemia salina, foi aplicado o método de desencapsulação, com o inicialmente com uso do cloro comercial (Hipoclorito de sódio a 0,15%) e álcool 70% em diferentes tempos de exposição posterior ao ressecamento overnight (Figs. 11 e 12).
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
50% 100% 200% 100% (2010) 0% (37 dias)
Porcentagem de eclosão
meios de cultivo
