A maioria dos lipídios consiste em ácidos graxos de alto valor com diversas aplicações comerciais. Os ácidos graxos nas microalgas correspondem à maior fração de lipídios e, em algumas espécies, os ácidos poliinsaturados (PUFA's) representam entre 25 e 60% dos lipídios totais (BROWN et al., 1997). Considerando o potencial de síntese de compostos a partir de microalgas, este trabalho trata de um estudo para avaliar qualitativamente os ácidos graxos produzidos pela diatomácea S.
Objetivos
Geral
Específicos
Aplicações dos cultivos microalgais
Apesar de ser uma atividade consolidada em alguns países, a produção comercial de microalgas no Brasil é realizada apenas por empresas que produzem biomassa e a utilizam para alimentar organismos como camarões e moluscos marinhos, por exemplo. A principal finalidade de aplicação desses organismos é como fonte primária de alimento para larvas, juvenis e até adultos de peixes, moluscos e crustáceos, bem como na dieta do zooplâncton utilizada na alimentação de peixes e crustáceos (GOMES, 1986). A seleção de espécies de microalgas utilizadas como alimento na larvicultura é um fator chave para o sucesso da produtividade.
O cultivo de microalgas no Brasil tornou-se popular devido ao seu uso em atividades de aquicultura, embora ainda seja praticado com um pequeno número de espécies, pois há necessidade de um conhecimento mais detalhado da biologia das espécies utilizadas. deve ter propriedades como crescimento rápido, volume celular adequado e composição química que atendam às necessidades nutricionais do animal de criação.
Divisões e classes das microalgas
Classe Bacillariophyceae
A principal forma de reprodução entre as diatomáceas é a reprodução assexuada por divisão celular, onde uma célula se divide em duas. Quando ocorre a divisão celular, os retalhos da célula-mãe serão sempre os epítecos (retalho maior) das células-filhas que produzirão o novo penhor (retalho menor). Quando os indivíduos da espécie atingem uma redução de cerca de 30% do seu tamanho original, pode ocorrer a reprodução sexuada.
Na reprodução sexuada, após a fecundação do gametângio feminino pelo macho, o auxósporo resultante, ou zigoto, desenvolve-se até atingir o tamanho característico da espécie. Em termos de distribuição, é uma espécie cosmopolita nas zonas costeiras de todo o mundo, exceto nos mares polares. Estas microalgas do gênero Skeletonema são consideradas uma das diatomáceas mais abundantes no fitoplâncton marinho. É considerada uma espécie cosmopolita, pois foi comprovado que ocorre em áreas costeiras de todo o mundo, exceto nos mares polares.
O gênero Skeletonema foi estabelecido por Greville (1865) apud (MARINS, 2007), com descrição de Skeletonema barbadensis através da análise de ocorrência de espécies extintas em Barbados. Em 1873, Cleve registrou a presença de uma espécie em material do Mar de Java, reconhecendo semelhanças com Skeletonema barbadensis, e transferiu a espécie para o gênero Skeletonema Greville, com o nome de Skeletonema costatum (Greville) Cleve.
Condições de cultivo
A aeração em uma cultura é importante não só para a adição de CO2, mas também para promover a movimentação do meio, garantindo as mesmas condições de crescimento para as células. Esse fornecimento de CO2 também promove o equilíbrio do pH, pois quando o CO2 do centro é retirado há aumento do pH. Os meios de cultura utilizados para o cultivo de microalgas marinhas podem ser divididos em três classes dependendo da composição química: definidos, semidefinidos e indefinidos. Os meios definidos são preparados com água destilada ou deionizada, à qual são adicionados sais constituintes da água do mar e sais nutrientes. A composição do meio é então totalmente verificada. Devido ao seu alto custo, não é muito utilizado em atividades comerciais, exceto em aplicações que produzem produtos finais de alto valor agregado.
Os meios semidefinidos utilizam como matriz a água do mar, que é enriquecida com nutrientes inorgânicos e orgânicos de composição conhecida, como é o caso do meio f/2 utilizado neste estudo. Os indeterminados utilizam como matriz a água do mar, que deixa de ser uma solução quimicamente definida, e é enriquecida com uma mistura de substâncias orgânicas e inorgânicas indefinidas; os extratos de solo são um exemplo deste tipo de poços médios (LOURENÇO, 2006). Foi através de diversos estudos laboratoriais que se pôde determinar a importância dos elementos químicos para o crescimento das espécies.
Vários conjuntos experimentais de algas cultivadas em meios com composição química controlada, mudanças sutis nas concentrações dos elementos, um a um, com espécies diferentes, permitiram que muitos autores definissem a importância relativa de cada elemento para diferentes espécies. Os elementos químicos necessários em concentrações da ordem de centenas ou milhares de µg.g-1 de massa seca são considerados macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg, Si, Fe), necessários em níveis mais elevados. Baixas concentrações são chamadas de micronutrientes (Mn, Cu, Zn, Mo, V, B, Co, Ca, Na, Se, Ni).
Crescimento microalgal
Representação esquemática da taxa de crescimento de algas em cultura (linha contínua) e concentração de nutrientes (linha tracejada em função do tempo).
Lipídios
Lipídios microalgas
Nas microalgas, os ácidos graxos correspondem à maior fração lipídica e os PUFAs podem representar de 25 a 60% do total de lipídios em algumas espécies (BROWN, 1991). A biossíntese de triacilglicerídeos em microalgas consiste em três etapas principais: a formação da acetil coenzima A (acetil-CoA) no citoplasma, o alongamento e dessaturação das cadeias de carbono dos ácidos graxos e a formação de triacilgliceróis, a dessaturação é caracterizada pela introdução de ' uma ligação dupla na cadeia de carbono e alongamento, através da introdução de dois novos átomos de carbono (HUANG et al., 2009). Atualmente há interesse na composição de ácidos graxos e no metabolismo associado de microalgas marinhas para a produção de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (PUFAs), ácidos docosahexaenóicos (DHA, 22:6n-3) e ácidos eicosapentaenóicos (EPA, 20: 6n-3) 5n-3), que nestas combinações são reconhecidas por terem diversas aplicações farmacêuticas (TONON et al., 2002).
As informações sobre ácidos graxos são particularmente importantes em estudos sobre o valor nutricional das microalgas, como: O conteúdo de ácidos graxos varia sistematicamente entre grupos taxonômicos; Além disso, diferenças também são observadas, inclusive entre espécies da mesma classe (BROWN et al., 1997). Alguns dos fatores que influenciam a variação do conteúdo e da composição de lipídios e ácidos graxos são: luz, temperatura e diferentes concentrações de nitrogênio, fósforo e CO2.
Carvalho & Malcata (2005) utilizaram uma combinação de intensidade luminosa e concentração de CO2 para estimular a produção de ácidos graxos poliinsaturados a partir da microalga Pavlova luteri. Estes são alguns exemplos da possibilidade de aumentar o teor de ácidos graxos controlando as condições de cultivo.
Obtenção e manutenção da cepa
Cultivos
Determinações analíticas
A determinação da biomassa foi realizada retirando alíquotas da inoculação das culturas a cada 24 horas para análise de densidade celular (número de células x104/ml). A determinação da clorofila a foi realizada “in vivo”; Alíquotas de 5 ml foram coletadas assepticamente das culturas na câmara de fluxo, periodicamente e aproximadamente no mesmo horário, inclusive no tempo zero dos experimentos, armazenadas em frascos de vidro e coletadas imediatamente. utilizando uma cubeta de cristal cilíndrica e em seguida adicionando 0,5 ml de formaldeído a 4% e em seguida contando as células. Foi colocado 1 ml na câmara de contagem de vigas de Sedwick, contando-se no mínimo 200 células (GUILLARD, 2005) e o número de quadrados em que foram divididas, sob microscópio óptico com aumento de 100x.
Por fim, foi calculado um número médio de células por quadrado da câmara e convertidos os valores de densidade celular por mililitro. Utilizando valores de densidade celular das três repetições, foram determinados os valores médios e calculados os desvios padrão. Os resultados das contagens de cada amostra em cada bioensaio foram plotados como o número de células por mililitro (células/ml) em função do tempo em dias, e foram obtidas as curvas de crescimento da cepa Skeletonema costatum nas diferentes culturas.
Uma vez traçadas as curvas, observou-se o início da fase estacionária onde a operação foi interrompida para centrifugação. As culturas foram centrifugadas por 10 minutos a 4000rpm para separar a biomassa do meio de cultivo, a biomassa úmida foi acumulada durante a centrifugação e ao final as três repetições de cada tratamento foram armazenadas em frascos de 50ml e congeladas até transferência para o liofilizador, após esse processo, os tubos com a biomassa liofilizada foram mantidos no freezer até a análise dos ácidos graxos.
Extração lipídica e análise do perfil de ácidos graxos
Avaliação do crescimento
Curvas de Crescimento
Entre as culturas não aeradas, a máxima densidade celular alcançada foi no tratamento com 50% de nitrogênio e 30 ‰ de salinidade tanto para o valor "in vivo" de clorofila a. No tratamento de aeração, 100% de nitrogênio (formulação padrão de meio f/2) e salinidade de 30‰ foi o tratamento com maior densidade celular de todos. O autor relata agrupamentos estatísticos distintos entre os tratamentos realizados que apresentaram maior eficiência de crescimento nos 3 tratamentos a temperatura de 20°C e salinidade de 20‰ apesar de possuírem concentrações de nitrogênio diferentes, no T4 do presente estudo a relação N:P é de 12:1, pois esta proporção na formulação do meio padrão f/2 é de 24:1 e neste tratamento apenas 50% do nitrogênio prescrito foi colocado no meio f/2 e o valor máximo de densidade foi de 58x104 células/ml em T4 e 153x104 células/ ml em T5 com relação N:P de 24:1, indicando que, mesmo entre culturas sem aeração, a concentração de nitrogênio no meio não afetou o crescimento da cepa, e o tratamento com concentração do elemento nitrogênio foi aquele com maior densidade celular.
Taxa de crescimento celular baseada em dados de clorofila a e densidade celular após tratamento com 75% de nitrogênio (nitrato) em relação ao controle e salinidade 30. Taxa de crescimento celular baseada em dados de clorofila a e densidade celular após tratamento com 50% de nitrogênio (nitrato) em relação a controle e salinidade 30. Taxa de crescimento celular baseada em dados de clorofila a e densidade celular no tratamento de salinidade 30, com concentração padrão de nitrogênio.
Taxa de crescimento celular baseada em dados de clorofila a e densidade celular em tratamento de salinidade 25 com concentração padrão de nitrogênio. Taxa de crescimento celular de dados de clorofila a e densidade celular de tratamento de concentração padrão de nitrogênio (nitrato) com salinidade média 30 f/2 e aeração.
Avaliação qualitativa dos ácidos graxos
Perfil dos ácidos graxos
Embora os dados gerados pela análise de cromatografia gasosa apresentassem valores preliminares com baixa consistência devido à baixa biomassa, os perfis de ácidos graxos da diatomácea Skeletonema costatum nos tratamentos T1, T2, T3 e T4 apresentaram qualitativamente o mesmo perfil de ácidos graxos. identificado como T5. O perfil de ácidos graxos neste trabalho está de acordo com os resultados de Berge (1995), Renaud (1999), Žukova (1994) e Brown (1997), em todos esses trabalhos a abundância relativa de ácidos graxos é diferente, mas foram mais representativos em todos os ácidos. foram palmítico, palmitoleico e EPA. Sob condições de cultivo semelhantes (temperatura, fotoperíodo e tempo de cultivo), mas utilizando meio Conway e salinidade de 33 psu em todas as culturas, Campos et al. (2010) encontraram esses mesmos ácidos graxos nesta espécie, entre outras, mas com valores diferentes. , o que mais chama a atenção é o baixíssimo percentual de EPA identificado por este autor, representando apenas 1,7% do total de ácidos graxos.
O ácido graxo palmítico é um dos ácidos graxos saturados mais comumente encontrados em animais e plantas. A origem do nome comum ácido palmítico se deve ao fato de ser o AGS com maior quantidade de óleo de palma. Neste estudo, o EPA foi encontrado em proporção relevante entre os ácidos graxos poliinsaturados durante o cultivo com aeração, assim como os ácidos EPA e DHA. Os ácidos graxos DHA e EPA são importantes no crescimento e sobrevivência dos moluscos (TRIDER & CASTELL, 1980).
A proporção entre os ácidos graxos EPA e DHA (DHA: EPA aproximadamente 1:2 respectivamente) é mais importante do que os níveis absolutos dos dois ácidos graxos de acordo com Leonardos; Lucas (1999). Renaud (1999) e Brown (1997) analisaram outros compostos além dos ácidos graxos nesta espécie, confirmando seu potencial como fonte de nutrição para organismos cultiváveis. A microalga Skeletonema costatum tem potencial para produzir ácidos graxos nobres como FA palmítico e EPA, que são considerados ácidos graxos essenciais que possuem aplicações terapêuticas na dieta humana;
Efeito das fontes de carbono no crescimento e na composição bioquímica das microalgas Chaetoceros muelleri e Thalassiosira fluviatilis, com ênfase no teor de ácidos graxos insaturados.
