www.jped.com.br
ARTIGO
ORIGINAL
Erythrocyte
oxidative
stress
markers
in
children
with
sickle
cell
disease
夽
Priscila
Bacarin
Hermann
a,∗,
Mara
Albonei
Dudeque
Pianovski
b,
Railson
Henneberg
a,
Aguinaldo
José
Nascimento
ae
Maria
Suely
Soares
Leonart
aaDepartamentodeAnáliseClínica,LaboratórioClínico,UniversidadeFederaldoParaná(UFPR),Curitiba,PR,Brasil
bDepartamentodeHematologiaeOncologiaPediátrica,HospitaldeClínicas,UniversidadeFederaldoParaná(UFPR),Curitiba,
PR,Brasil
Recebidoem6dejulhode2015;aceitoem16deoutubrode2015
KEYWORDS
Oxidativestress; Sicklecelldisease; Children
Abstract
Objective: Todetermine eightparameters ofoxidative stress markersinerythrocytesfrom children with sickle cell disease and compare with the same parameters in erythrocytes fromhealthychildren,sinceoxidativestressplaysanimportantroleinthepathophysiologyof sicklecelldiseaseandbecausethisdiseaseisaseriouspublichealthprobleminmanycountries. Methods: Bloodsampleswereobtainedfrom45childrenwithsicklecelldisease(21malesand 24femaleswithameanageof9years;range:3---13years)and280bloodsampleswere obtai-nedfromchildrenwithouthemoglobinopathies(137malesand143femaleswithameanageof 10years;range:8---11years),asacontrolgroup.Allbloodsampleswereanalyzedfor methemo-globin,reducedglutathione,thiobarbituricacidreactivesubstances,percentageofhemolysis, reactiveoxygenspecies,andactivityoftheenzymesglucose6-phosphatedehydrogenase, supe-roxidedismutase,andcatalase.DatawereanalyzedusingStudent’st-testandwereexpressed asthemean±standarddeviation.Ap-valueof<0.05wasconsideredsignificant.
Results: Significantdifferenceswereobservedbetweenchildren withsicklecelldiseaseand the controlgroup for theparameters methemoglobin, thiobarbituricacidreactive substan-ces,hemolysis,glucose6-phosphatedehydrogenaseactivity,andreactiveoxygenspecies,with higherlevelsinthepatientsthaninthecontrols.
Conclusions: Oxidativestressparametersinchildren’serythrocytesweredeterminedusing sim-plelaboratorymethodswithsmallvolumesofblood;thesebiomarkerscanbeusefultoevaluate diseaseprogressionandoutcomesinpatients.
©2016SociedadeBrasileiradePediatria.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Thisisanopen accessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/ 4.0/).
DOIserefereaoartigo:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2015.10.004
夽 Comocitaresteartigo:HermannPB,PianovskiMA,HennebergR,NascimentoAJ,LeonartMS.Erythrocyteoxidativestressmarkersin
childrenwithsicklecelldisease.JPediatr(RioJ).2016;92:394---9.
∗Autorparacorrespondência.
E-mail:prihermann@hotmail.com(P.B.Hermann).
PALAVRAS-CHAVE
Estresseoxidativo; Doenc¸afalciforme; Crianc¸as
Marcadoresdeestresseoxidativoemeritrócitosdecrianc¸ascomdoenc¸afalciforme
Resumo
Objetivo: Determinarparâmetrosdeestresseoxidativoemeritrócitosdecrianc¸ascomdoenc¸a falciformeecompará-loscomosmesmosparâmetrosemeritrócitosdecrianc¸assaudáveis,pois oestresseoxidativodesempenhaumimportantepapelnafisiopatologiadadoenc¸afalciforme, consideradaumsérioproblemadesaúdepúblicaemmuitospaíses.
Métodos: Foramobtidasamostrasdesanguede45crianc¸ascomdoenc¸afalciforme(21meninos e24meninascommédiade9anos,variac¸ãode3a13)e280amostrasdesanguedecrianc¸as semhemoglobinopatias(137meninose143meninascommédiade10anos,variac¸ãode8a11), como grupocontrole.Emtodasasamostrasforamdeterminadosmeta-hemoglobina, glutati-onareduzida,substânciasreativasaoácidotiobarbitúrico,porcentagemdehemólise,espécies reativasdeoxigênioeatividadedasenzimasglucose6-fosfatodesidrogenase,superóxido dis-mutaseecatalase.OsdadosforamanalisadoscomotestetdeStudenteforamexpressoscomo média±desviopadrão.Umvalordep<0,05foiconsideradosignificativo.
Resultados: Foramobservadasdiferenc¸assignificativasentreascrianc¸ascomdoenc¸afalciforme eogrupocontroleparaosparâmetrosmeta-hemoglobina,substânciasreativasaoácido tio-barbitúrico,porcentagemdehemólise, espéciesreativasde oxigênioe atividadedaenzima glucose6-fosfatodesidrogenase,comníveisaumentadosnospacientes.
Conclusões: Foi possível determinar parâmetros de estresse oxidativo em eritrócitos de crianc¸as,comtécnicaslaboratoriaissimplesepequenosvolumesdesangue.Esses biomarcado-respodemserúteisnaavaliac¸ãodaprogressãoedosresultadosdetratamentosdadoenc¸a. ©2016SociedadeBrasileiradePediatria.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Este ´eumartigo OpenAccesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4. 0/).
Introduc
¸ão
Adoenc¸afalciformeéumadasdoenc¸ashematológicasmais comunsdomundoeéumproblemadesaúdepúblicagrave emmuitospaíses,incluindooBrasil.1Hámaisde2milhões
debrasileiros portadores do genedadoenc¸a falciforme e estima-sequeessadoenc¸atenhaumaincidênciadeumem cada1.000 nascidosvivos.Em2001, umdecretodo Minis-tério da Saúde incluiu triagem de hemoglobinopatias nos programasdetriagempreexistentes.2
Adoenc¸afalciformefoicaracterizadacomoumadoenc¸a multissistêmica associada a episódios de doenc¸a aguda e dano progressivo em órgãos, que comec¸ana infância e é responsável principalmente por uma expectativa de vida reduzida nospacientesafetados.3 As taxasdemorbideze
mortalidadeaindasãoaltasempacientescomadoenc¸a fal-ciforme.NoBrasil,até25%dascrianc¸asafetadasfaleceram durante seus primeiros 5 anos de vida, porém o diagnós-tico precocee o tratamento podem reduziressas taxase melhorarsuaqualidadedevida.4
A hemoglobina falciforme resulta de uma substituic¸ão deácido glutâmico por valina na sextaposic¸ão dacadeia  globina.5 Avariac¸ão ostensivamentemínima é aorigem
dahemoglobinaSe é responsávelpelas alterac¸ões signifi-cativas na estabilidade e na solubilidade da molécula.6 A
tendência de a hemoglobina S desoxigenada se submeter a polimerizac¸ão está na base deinúmeras expressões das síndromesfalciformescomhemóliseintravascular.7A
hemo-globinaplasmáticalivrepodeiniciaraperoxidac¸ãolipídicae oheme,queprontamentesedissociadameta-hemoglobina, pode contribuir significativamente para o estresse oxidativo,8 que pode desempenhar umpapel significativo
na fisiopatologiadadisfunc¸ãomicrovascular relacionada à doenc¸a falciforme, na vaso-oclusão e nodesenvolvimento
delesões nos órgãos.9 Osbiomarcadores doestresse
oxi-dativo podem, portanto, ser potencialmente úteis, tanto paraidentificarpacientescomaltoriscodedanooxidativo quantoparaavaliarosefeitosdeterapiasantioxidantes.10
O objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros do estresse oxidativo em eritrócitos de crianc¸as com doenc¸a falciforme, incluindo percentuais de hemólise, meta-hemoglobina,glutationa reduzida,substâncias reati-vasaoácidotiobarbitúrico, atividadedaglucose-6-fosfato desidrogenase,espéciesreativasdeoxigênioe asenzimas antioxidantescatalaseesuperóxidodismutase.
Métodos
Substânciasquímicas
Ácido metafosfórico, 2-mercaptoetanol, pirogalol, hidro-cloreto de 2,2-azobis (2-amidinopropano) (AAPH), ácido etilendiaminotetracético (EDTA) e ácido 5,5-ditiobis 2-nitrobenzoico(DTNB)foramobtidosdaSigma-Aldrich(Saint Louis,MO,EUA).Fosfatosdesódioedepotássio,saponina, ácidotricloroacéticoe ácidotiobarbitúrico foram forneci-dos pela Vetec Ltda.(Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Citrato desódio,tris(hidroximetil)aminometanoemetanolforam obtidosdaMerck(Darmstadt,Alemanha).Aatividadeda G6-PDfoideterminadacomo PD410dosLaboratóriosRandox (Antrim,Reino Unido). Todosos solventes orgânicoseram dealtaqualidadeepassarampordupladestilac¸ãoe todas asoutrassubstânciasquímicaseramdegrauanalítico.
Amostrasdesangue
médiade9anos;faixa:3-13)noDepartamentode Hemato-pediatriadoHospital dasClínicasdaUniversidadeFederal doParaná(UFPR).Umgrupo decontroleconsistiaem 280 crianc¸assemhemoglobinopatias(137meninose143 meni-nascom médiade 10 anos;faixa: 8-11),participantes do projetodeextensãouniversitáriointitulado‘‘Incidênciade anemias e parasitosesem crianc¸as com idade escolarnas escolas municipais da região metropolitana de Curitiba ---Paraná---Brasil’’,daUFPR.Ousodesereshumanosfoi apro-vado pelo Comitê deÉtica em PesquisaEnvolvendo Seres HumanosdoHospitaldeClínicasdaUFPR.Foiobtidoo con-sentimentoinformadodospaisouresponsáveisdetodasas crianc¸as.Ascrianc¸ascomqualqueralterac¸ãohematológica foramexcluídas.
Foicoletadaumaamostradesanguevenosode5mLde cadapacienteemtubosrevestidosdeK3-EDTA.Foram sepa-radasalíquotas(200L)desanguetotalparadeterminac¸ão da atividade da G6-PD. Então, as amostras foram cen-trifugadas a 3.000g por 10 minutos. O plasma e a camadaleucoplaquetária(buffycoat)foramremovidospor aspirac¸ãoeoseritrócitosforamlavadoscomtampão fosfato--salino(PBS) (NaCl, 150mmol/L; NaH2PO4, 1,9mmol/L; e
Na2HPO4,8,1mmol/L)trêsvezes.Porfim,osglóbulos
ver-melhosforamsuspensosemsoluc¸ãoPBSeáguaparaobter suspensõescomhematócritosde10%e40%paraasoluc¸ão PBSe40%paraasoluc¸ãodeágua.Aconcentrac¸ãode hemo-globinafoimedida em todasassuspensões.Nem todasas análisesforammedidasemcadaamostradevidoaosvolumes limitadosdisponíveis.
Parâmetroshematológicos
O hemograma completo foi determinado com o contador eletrônicodecélulasPentra80(HoribaMedical,Japão).
Concentrac¸ãodemeta-hemoglobina
Aconcentrac¸ão de meta-hemoglobinafoi determinadade acordo com um método com base em Naoum et al.11
adaptado a pequenos volumes. As alíquotas (100L) de suspensões de eritrócitos a 10% foram hemolizadas com 100L de saponina a 1% e estabilizadas em 1.000L de 60mmol/Ldetampãodefosfato;então,aabsorbânciafoi determinadaa630nm(parametemoglobina)e540nm(para oxi-hemoglobina). A concentrac¸ão de metemoglobina foi expressaemtermospercentuaisemrelac¸ãoàconcentrac¸ão dehemoglobina.
Determinac¸ãodaglutationareduzida
Aconcentrac¸ão deglutationa reduzida(GSH) foi determi-nadaporummétodoanteriormentedescritoporBeutler,12
aoavaliarareduc¸ãodoácido5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) por compostos de sulfidrila a partir da formac¸ão deumproduto aniônicodecolorac¸ãoamarela cuja absor-bância foi medida em 412nm. Foramusadas alíquotasde 50L de suspensão de células vermelhas a 40% no PBS. Aconcentrac¸ãodeGSHfoiexpressaemmol/gHb.
Peroxidac¸ãolipídica
Aperoxidac¸ãolipídicademembranasdecélulasvermelhas foiavaliadacombaseemCesquinietal.13Foramadicionadas
alíquotas(600L)deumasuspensãodeglóbulosvermelhos a10% a250Ldeácido tricloroacéticoa25%e 600Lde ácidotiobarbitúricoa1%,fervidaspor15minutosa100◦C eresfriadaspor5minutosa0◦C.Então,aabsorbânciadas substânciasreativasaoácidotiobarbitúrico(TBARS) forma-dasfoilidaa532nmcomousode=156/(mmole.cm)eas concentrac¸õesforamexpressasemnmol/gHb.
Medic¸ãodahemólise
A hemólise da hemácia foi feita conforme descrito por Banerjeeetal.,14adaptadaamicroplacaspormeioda
mis-turadeumasuspensãodeglóbulosvermelhosa10%comPBS comquantidadesvariáveisdesoluc¸õesdeAAPH (obtiveram--se as concentrac¸ões finais de 50, 100 e 150mmol/L). A mistura da reac¸ão foi incubada por 3 horas a 37◦C, comagitac¸ão.Aextensãodahemólisefoideterminadapor espectrofotometriapormeiodamedic¸ãodaabsorbânciado hemolisadoa540nmemumleitordemicroplacas(Thermo Scientific,ThermoPlate,EUA).Glóbulosvermelhosemuma soluc¸ãode200mmol/LdeAAPHforamocontrolede100% dehemólise.
Atividadedaglucose-6-fosfatodesidrogenase (G6-PD)
Alíquotas(200L)desanguetotalantesdoisolamentode eritrócitosforamlavadascomPBSde2mLtrêsvezes.A ativi-dadedaG6-PDfoideterminadacomoanalisadorautomático CobasMira(Roche,Mannheim,Alemanha)comokit comer-cialPD410(Randox,Antrim,ReinoUnido)conformedescrito nomanualdofabricante.
Atividadedasuperóxidodismutase
Aatividadeenzimáticatevecomobaseummétodoadaptado apartirdaauto-oxidac¸ãodepirogaloldeBeutler.12Alíquotas
de200Ldeglóbulosvermelhosembaladasforam hemoli-sadascom300Ldeáguadeionizada friae foipreparado umextratodeclorofórmioeetanol.Amisturafoi centrifu-gadaa2300gpor10min.Quantidadesvariáveisdoextrato sobrenadantelímpido(0,20,40,60,80,100e300L)foram adicionadasaumasoluc¸ãodetris-hidrocloreto(tris-HCl)e água. Após 10min, 20L de uma soluc¸ão de pirogalol a 1mmol/L foramadicionados a cada tubo e a absorbância foiaferidaa412nmem umamicroplaca.Aquantidadede extrato necessária para inibir a auto-oxidac¸ão do piroga-lol em 50% é usada paradeterminar o nível de atividade enzimática.
Atividadedacatalase
A atividade enzimática foi determinada por meio de um métodoadaptadodeBeutler,12 apartirdamedidadataxa
Tabela1 Valoreshematológicosemcrianc¸assaudáveis(grupodecontrole)eempacientescomdoenc¸afalciforme
Grupodecontrole CV Pacientes CV p
n=280 n=45
GV(106/mm3)a 4,8
±0,3 7,0 3,2±0,9 29,2 <0,001
Hemoglobina(g/dL)a 13,5±0,9 6,6 8,9±1,9 21,5 <0,001
Hematócrito(%)a 39,4
±2,7 6,7 26,7±5,6 20,9 <0,001
VCM(fl)a 82,3±3,9 4,8 86,3±11,8 13,7 <0,05
HCM(pg) 28,2±1,6 5,5 28,9±4,64 16,1 >0,05
CHCM(g/dL)a 34,3±1,2 3,6 33,5±2,1 6,2 <0,01
GB(103/mm3)a 6,6±1,4 21,2 13,8±6,1 44,3 <0,001
PLA(103/mm3)a 292,4±58,3 19,9 458,5±199,0 43,4 <0,001
GV,glóbulosvermelhos;VCM,volumecorpuscularmédio;HCM,hemoglobinacorpuscularmédia;CHCM,concentrac¸ãodehemoglobina corpuscularmédia;GB,glóbulosbrancos;PLA,plaquetas;CV,coeficientedevariac¸ãodePearson(%).Osdadossãoapresentadoscomo média±desviopadrão.
a Diferenc¸aestatisticamentesignificativa(testetdeStudent).
suspensãode glóbulosvermelhosa 40%foramadicionadas a450Ldeumasoluc¸ãohemolisantede-mercaptoetanol (0,7mmol/L) eEDTA(0,27mol/L).Essasoluc¸ãofoi diluída em PBSnaproporc¸ão1:100 e10Ldasoluc¸ão finalforam adicionados a 990Lda soluc¸ão de peróxido de hidrogê-nio.Adiminuic¸ãodaabsorbânciadosistemafoiaferidapor 10min.
Espéciesreativasdeoxigêniointracelular
Espéciesreativasdeoxigênioforamdeterminadasdeacordo com um método com base em López-Revuelta et al.,15
adaptado a pequenosvolumes de amostras desangue em microplacas.Eritrócitos(995L deumasuspensão dePBS a 10% v/v) foram incubados com 5L de diclorodihidro-fluoresceína diacetato (DCFDA, 10mol/L) a 37◦C por 30 minutos. Essa suspensão foi diluída em 9,0mL de PBS e 37,5Ldessasoluc¸ãoforam,então,adicionadosa112,5L de PBS em placas de 96 poc¸os. As espécies reativas de oxigênio foramdeterminadas por meiodeum fluorímetro GloMax®-MultiMicroplateMultimodeReader(Promega Cor-poration,EUA).Nessascondic¸ões,oDCFDAfoihidrolisado a 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH
2),que, então, foi
disponibilizado para oxidac¸ão pelas espécies reativas de oxigênio(ERO)paraproduzir2,7-diclorofluoresceína(DCF). A fluorescência foi determinada a 530nm após excitac¸ão a495nm. Aformac¸ão deespéciesreativasdeoxigênio foi expressacomounidadesdefluorescência(UF)/gHb.
Análiseestatística
Foi feita com o software Statistica 8.0 (StatSoft, EUA). Nãofoiidentificado valor atípico.O testede Kolmogorov--Smirnov foi usado para avaliar a normalidade e todos os parâmetros foramdistribuídos normalmente. Os dados foramexpressoscomomédia±desviopadrãoecomparados entregrupos que usamo testetdeStudent;umvalor de p<0,05foiconsideradosignificativo.
Resultados
Osdadosprovenientesdehemogramasde crianc¸as saudá-veisepacientescomdoenc¸afalciformeestãoilustradosna
tabela1.Foramobservadasasdiferenc¸asestatisticamente significativasparatodososparâmetros,excetoparaa hemo-globinacorpuscularmédia(HCM)(p<0,05).
Osdadosprovenientesdeparâmetrosdeestresse oxida-tivoestãoilustradosnatabela2,quecomparaospacientes comdoenc¸afalciformee crianc¸as saudáveis.Foram obser-vadas as diferenc¸as estatisticamente significativas para meta-hemoglobina, TBARS,percentual dehemólise, ativi-dadedaG6-PDeespéciesreativasdeoxigênio(p<0,05).
Discussão
Oseritrócitos normais sofrem estresse oxidativo devido à produc¸ão de espécies reativas de oxigênio que resultam do metabolismo de oxigênio. Contudo, isso é restaurado deformaeficientepelossistemasantioxidantesaltamente poderosos da célula, sem qualquer efeito problemático. Oestresseoxidativoocorrecomoresultadodeum desequi-líbrioentreaproduc¸ãodeespéciesreativasdeoxigênio e asdefesasantioxidantes.16
Na doenc¸a falciforme, o estresse oxidativo poderá ser resultado deníveis elevados de meta-hemoglobinaS, que é menos estável do que a meta-hemoglobina A e leva à hemólise intravascular,17 à lesão de isquemia-reperfusão,
àinflamac¸ãocrônicaeaumamaiorauto-oxidac¸ãoda hemo-globinafalciforme.18,19 Muitosantioxidantespotenciaissão
de interesse com relac¸ão à doenc¸a falciforme20 e vários
estudosdemonstraram aumentos significativos em marca-doresdeestresseecomportamentosdiferentesemsistemas dedefesaantioxidanteempacientescomdoenc¸afalciforme quandocomparadoscomindivíduossaudáveis.21
Nossosresultadosparaasamostrasdesangueconfirmam váriascaracterísticas dadoenc¸afalciforme jáconhecidas, comoaanemiahemolítica,21comprovadaporbaixosníveis
dehemoglobina,7eoaumentonosníveisdosglóbulos
bran-cosedasplaquetas.6
Conforme demonstrado anteriormente,8 os níveis de
meta-hemoglobinaaumentamemindivíduos comadoenc¸a falciforme. Existe uma transferência de elétrons na interac¸ãodeligac¸ãoentreohemeeooxigênio(O2)na
hemo-globina oxigenada. Quando a hemoglobina está desoxi-genada, o ferro heme normalmente continua no estado ferroso.20 Nessa troca, quando ocorre a auto-oxidac¸ão da
Tabela2 Parâmetrosdeestresseoxidativoemcrianc¸asnormais(grupodecontrole)eempacientescomdoenc¸afalciforme
Grupodecontrole Pacientes p
n=100 n=45
METHb(%)a 2,2
±0,4 4,5±1,1 <0,001
GSH(mol/gHb) 6,4±1,4 6,6±2,3 >0,05
TBARS(nmol/gHb)a 24,6
±5,8 41,5±20,1 <0,001
HEMO0a,b 1,1±0,4 4,7±1,7 <0,001
HEMO50a,b 25,0±7,9 49,2±19,4 <0,001
HEMO100a,b 55,5±10,2 80,7±13,6 <0,001
HEMO150a,b 80,1±7,5 92,6±5,1 <0,001
G6-PD(U/gHb)a 6,2±1,1 13,2±3,3 <0,001
SOD(U/gHb) 1,846,1±457,2 1,832,4±647,1 >0,05
CAT(U/gHb) 2,6105
±6,6104 2,9105
±8,5104 >0,05
ERO(UF/gHb)a 1.468,0±296,2 2.427,5±1110,3 <0,001
METHb,meta-hemoglobina; GSH,glutationareduzida;TBARS,substânciasreativasaoácidotiobarbitúrico; HEMO,hemólise;G6-PD, glucose6-fosfatodesidrogenase;SOD,superóxidodismutase;CAT,catalase;ERO,espéciesreativasdeoxigênio.Osdadossãoapresentados comomédia±desviopadrão.
aDiferenc¸aestatisticamentesignificativa(testetdeStudent).
b Percentuaisdehemólisecomacréscimode0-150mmol/Ldesoluc¸õesdeAAPH.
comoferrohemenoestadoférrico.8Asalterac¸õesnafunc¸ão
ou na estrutura dos eritrócitos podem levar a um fluxo maior de meta-hemoglobina, que pode levar ao estresse oxidativo.15
O aumento do estresse oxidativo intra e extraeritro-citário induz a peroxidac¸ão lipídica e a instabilidade da membrana.14AsTBARSsãoumdosbiomarcadoresexistentes
eessaavaliac¸ãoéumaquantificac¸ãoindiretadosprocessos deperoxidac¸ãolipídica,oquefaz dissoumbomindicador de estímulos pró-oxidantes. Deacordo com osresultados registradosanteriormente,19,20,22 observamosníveis
signifi-cativamentemaiselevados deTBARSem pacientescoma doenc¸afalciformedoquenoscontroles.
Oseritrócitosfalciformesrígidosedeformadostêmuma vidaútilreduzidaesãosubmetidosahemólisetanto intra-vascular quanto extravascular.23 Observamos percentuais
maiselevados dehemóliseemeritrócitosdecrianc¸ascom a doenc¸a falciforme do que no grupo de controle, tanto emsuspensõesdebasedeeritrócitosquantoemsuspensões incubadascomumagenteoxidante.
AG6-PDéumaenzimaimportanterelacionadaàdefesa antioxidante em eritrócitos.20 Observamos uma atividade
mais elevada dessa enzima em pacientes com a doenc¸a falciformedoquenogrupodecontrole.Foiregistrado ante-riormente que os eritrócitos de pacientes com a doenc¸a falciforme apresentam um percentual cada vez maiorde reticulócitos,ao passoquea atividadedaG6-PDnos reti-culócitosénormal,mascaiexponencialmenteconformeas célulasvermelhasenvelhecem.24
As células falciformes geram espontaneamente cerca de duas vezes mais espécies reativas de oxigênio do que os glóbulos vermelhos normais.25 Em conformidade
comosachadosdeGeorgeetal.,26tambémdemonstramos
níveiselevadosdeespéciesreativasdeoxigênioem eritró-citosfalciformes.
A glutationa reduzida (GSH) está presente em altas concentrac¸õesem eritrócitos e atua sozinhaou por meio da glutationa peroxidase como principal fonte redutora para manter a integridade da célula.17 As medic¸ões de
GSH e de sua formaoxidada glutationa dissulfeto (GSSG)
foramconsideradasindicadoresúteisdeestresseoxidativo invivo.27Amaiorpartedosestudosemadultoscomdoenc¸a
falciforme relatou alguns déficits na síntese endógena de GSH, provavelmente devido a seu consumo por meio do aumento na produc¸ão de oxidantes.26,28 Embora Rusanova
etal.22tenhamapresentadoaltosníveisdeGSHem
pacien-tespediátricoscomdoenc¸afalciforme,nopresenteestudo nãoencontramosdiferenc¸anosníveisdeGSHentrecrianc¸as comdoenc¸afalciformeeogrupodecontrole.
Asuperóxidodismutasepodeconverterosuperóxidoem peróxidodehidrogênioeacatalasepoderemovero peró-xido de hidrogênio excedente.16 Segundo Silva et al.,20 o
aumentonagerac¸ãodepró-oxidantesemdoenc¸afalciforme resultaemumadeficiênciadeantioxidantes.Contudo, exis-temalgumasdiscrepânciasentreestudossobresuperóxido dismutase e níveisde catalasenessadoenc¸a,alguns estu-dos observam o aumento daatividade e outrosobservam adiminuic¸ãodosníveis.29Umaumentonaatividadedessas
enzimaspossivelmenteconstitui ummecanismodedefesa emrespostaaoaumentodoestresseoxidativo19oupodeser
consequênciadeumaumentonoconteúdodereticulócitos emamostrasdesanguedepacientescomdoenc¸afalciforme. Contudo, uma diminuic¸ão nos níveis das enzimas estava relacionadaàgravidadedadoenc¸anospacientes.20,22Esses
achados aparentementecontraditórios podemdever-seàs diferenc¸as na extensão do estresse oxidativo, da gravi-dade dadoenc¸a,dopolimorfismoenzimáticoe docofator enzimático.29 Nossos resultados não mostraram diferenc¸a
entreasatividadesdessasenzimasemcrianc¸ascomdoenc¸a falciforme e em crianc¸as saudáveis, de acordo com Cho et al.,30 com relac¸ão à catalase. Esses resultados podem
dever-seà grande variabilidade individualencontrada nos pacientes.
envolveaobservac¸ãodediferentesparâmetrosassociados abiomarcadorespró-oxidanteseantioxidantes.27 Contudo,
o uso de um biomarcador isolado e a medic¸ão de antio-xidantes individuais provavelmente não são índices úteis de estado oxidativo. O equilíbrio oxidante-antioxidante envolvereac¸õesbioquímicasqueexigemaavaliac¸ãode mui-tosresultados.26
Este estudoavaliou oitomarcadoresdeestresse oxida-tivo,incluindoparâmetrospró-oxidanteseantioxidantes.Os resultadosindicamapresenc¸adeumestadohiperoxidativo em crianc¸as com doenc¸a falciforme, que pode ser obser-vado por seus níveis elevados de metemoglobina, TBARS, hemólise,espéciesreativasdeoxigênioeatividadeda G6-PD.Foram usadas técnicassimples paradeterminar esses parâmetroscompequenosvolumesdesangue.Os parâme-tros que apareceram alterados em crianc¸as com doenc¸a falciformepodemserúteisemavaliac¸õesdeprogressãoda doenc¸aetratamentos.
Conflitos
de
interesse
Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.
Referências
1.Felix AA, Souza HM, Ribeiro SB. Epidemiologic and social aspects of sickle cell disease. Rev Bras Hematol Hemoter. 2010;32:203---8.
2.RamalhoAS,MagnaLA,dePaiva-e-SilvaRB.Government Direc-tiveMS# 822/01: uniqueaspects ofhemoglobinopathies for publichealthinBrazil.CadSaúdePública.2003;19:1195---9. 3.ThompsonBW,MillerST,RogersZR,ReesRC,WareRE,Waclawiw
MA, et al. The pediatric hydroxyurea phase III clinical trial (BABYHUG):challengesofstudydesign.PediatrBloodCancer. 2010;54:250---5.
4.Sabarense AP, Lima GO, Silva LM, Viana MB. Characteriza-tionofmortalityinchildrenwithsicklecelldiseasediagnosed through the Newborn Screening Program. J Pediatr (Rio J). 2015;91:242---7.
5.Aslan M, Freeman BA. Redox-dependent impairment of vas-cular function in sickle cell disease. Free Radic Biol Med. 2007;43:1469---83.
6.Wang WC. Sickle cell anemia and other sickling syndromes. In:Greer JP, FoersterJ,Lukens JN, RodgersGM,Paraskevas F,GladerB,editors. Wintrobes’sclinicalhematology. 11ed. Baltimore:LippincottWilliams&WilkinsPublishers;1999. p. 1293---311.
7.SteinbergMH.Managementofsicklecelldisease.NEnglJMed. 1999;340:1021---30.
8.HansonMS,PiknovaB, KeszlerA,DiersAR, WangX,Gladwin MT,et al. Methaemalbumin formationin sickle cell disease: effectonoxidative proteinmodificationandHO-1induction. BrJHaematol.2011;154:502---11.
9.MorrisCR,SuhJH,HagarW,LarkinS,BlandDA,SteinbergMH, etal.Erythrocyteglutaminedepletion,alteredredox environ-ment,andpulmonaryhypertensioninsicklecelldisease.Blood. 2008;111:402---10.
10.ReesDC,GibsonJS.Biomarkersinsicklecelldisease.BrJ Hae-matol.2012;156:433---45.
11.NaoumPC,RadispielJ,MoraesMS.Spectrometricmeasurement ofmethemoglobinwithoutinterferenceofchemicalor enzyma-ticreagents.RevBrasHematolHemoter.2004;26:19---22. 12.Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical
methods.3ed.NewYork:Grune&Stratton;1984.
13.CesquiniM,TorsoniMA,Stoppa GR,Ogo SH.t-BOOH-induced oxidativedamageinsickleredbloodcellsandtheroleof flavo-noids.BiomedPharmacother.2003;57:124---9.
14.BanerjeeA,KunwarA,MishraB,PriyadarsiniKI.Concentration dependent antioxidant/pro-oxidant activity ofcurcumin stu-diesfromAAPHinducedhemolysisofRBCs.ChemBiolInteract. 2008;174:134---9.
15.López-Revuelta A, Sánchez-Gallego JI, Hernández-Hernández A, Sánchez-Yagüe J, Llanillo M. Membrane cholesterol con-tentsinfluencetheprotectiveeffectsofquercetinandrutinin erythrocytesdamagedbyoxidativestress.ChemBiolInteract. 2006;161:79---91.
16.BandyopadhyayU,DasD,BanerjeeRK.Reactiveoxygenspecies: oxidativedamageandpathogenesis.CurrSci.1999;77:658---66. 17.vanZwieten R,Verhoeven AJ,Roos D.Inborndefectsinthe antioxidantsystemsofhumanredbloodcells.FreeRadicBiol Med.2014;67:377---86.
18.DasguptaT,FabryME,KaulDK.Antisickling propertyoffetal hemoglobinenhancesnitricoxidebioavailabilityand ameliora-tesorganoxidativestressintransgenic-knockoutsicklemice. AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol.2010;298:R394---402. 19.GiziA,PapassotiriouI,ApostolakouF,LazaropoulouC,
Papas-tamatakiM,KanavakiI,etal.Assessmentofoxidativestressin patientswithsicklecelldisease:theglutathionesystemandthe oxidant---antioxidantstatus.BloodCellsMolDis.2011;46:220---5. 20.SilvaDG,BeliniJuniorE,deAlmeidaEA,Bonini-DomingosCR. Oxidativestress insickle cell disease: anoverviewof eryth-rocyteredoxmetabolismandcurrentantioxidanttherapeutic strategies.FreeRadicBiolMed.2013;65:1101---9.
21.BeliniJuniorE,daSilvaDG,TorresLDS,deAlmeidaEA,Cancado RD,ChiattoneC,etal.Oxidativestressandantioxidantcapacity insicklecellanaemiapatientsreceivingdifferenttreatments and medicationsfor differentperiodsoftime.Ann Hematol. 2012;91:479---89.
22.Rusanova I, EscamesG, CossioG, de BoraceRG, Moreno B, ChahbouneM,etal.Oxidativestressstatus,clinicaloutcome, and-globingeneclusterhaplotypesinpediatricpatientswith sicklecelldisease.EurJHaematol.2010;85:529---37.
23.BanerjeeT,KuypersFA.Reactiveoxygenspeciesand phospha-tidylserine externalization in murine sickle red cells. Br J Haematol.2004;124:391---402.
24.McGannPT,WareRE.Hydroxyureaforsicklecellanemia:what have we learnedand what questions still remain?CurrOpin Hematol.2011;18:158---65.
25.GladerB.Hereditaryhemolyticanemiasduetoenzyme disor-ders. In: Greer JP, Foerster J, Lukens JN, Rodgers GM, ParaskevasF,GladerB,editors.Wintrobes’s clinical hemato-logy.11ed.Baltimore:LippincottWilliams&WilkinsPublishers; 1999.p.1115---40.
26.George A,Pushkaran S, KonstantinidisDG,KoochakiS,Malik P, Mohandas N, et al. Erythrocyte NADPH oxidase activity modulated byRac GTPases,PKC, and plasmacytokines con-tributes to oxidative stress in sickle cell disease. Blood. 2013;121:2099---107.
27.MagalhãesSM.Oxidativestatusinsicklecellanemia.RevBras HematolHemoter.2011;33:177---8.
28.FatimaM,KesharwaniRK,MisraK,Rizvi SI.Protectiveeffect oftheaflavinonerythrocytes subjectedtoinvitrooxidative stress.BiochemResInt.2013;2013:649759.
29.Daak AA, Ghebremeskel K, Mariniello K, Attallah B, Clough P, Elbashir MI. Docosahexaenoic and eicosapentaenoic acid supplementation does not exacerbate oxidative stress or intravascular haemolysis in homozygous sickle cell patients. ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids.2013;89:305---11. 30.ChoCS,KatoGJ,YangSH,BaeSW,LeeJS,GladwinMT,etal.
