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*e-mail: cegvito@vm.uff.br
UM PANORAMA ATUAL DA QUÍMICA E DA FARMACOLOGIA DE NAFTOQUINONAS, COM ÊNFASE NA
β-LAPACHONA E DERIVADOS
Milton N. da Silva, Vítor F. Ferreira* e Maria Cecília B. V. de Souza
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, Outeiro de S. João Batista, s/n, 24020-150 Niterói - RJ
Recebido em 15/5/02; aceito em 18/11/02
AN OVERVIEW OF THE CHEMISTRY AND PHARMACOLOGY OF NAPHTHOQUINONES WITH EMPHASIS ON β-LAPACHONE AND DERIVATIVES. Naphthoquinones have been extensively studied due to their activity as topoisomerase inhibitors. These enzymes are critical to DNA replication in cells. In addition, naphthoquinones have been shown to induce what are known as “reactive oxygen species” that can cause damage to cells. β-Lapachone is a very important pyranaphthoquinone obtained from the heartwood of the lapacho tree, Tabebuia avellanedae Lorentz ex. Griseb. (Bignoniaceae), and other Tabebuia trees native to Central and South America and chemically from lapachol. β-Lapachone has a diversity of useful biological activities against various cancer cell lines such as human ovarian and prostate tumors and, at lower doses is a radiosensitizer of several human cancer cell lines. It gives rise to a variety of effects in vitro including the inhibition or activation of topoisomerase I an II in a distinct manner from that of other topoisomerase inhibitors. This review intend to discuss some details of the mechanisms of quinone-induced cell damage and death, and we also summarize results of the literature indicating that b-Lapachone may take part in quinone-elicited apoptosis despite the fact that its mechanism of action in vivo and its targets are still unknown. Keywords: beta-Lapachone; naphthoquinone; pyranaphthoquinone; apoptosis.
INTRODUÇÃO
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural1,2. Nos últimos anos
intensificou-se o interesintensificou-se nestas substâncias, não só devido à sua importância nos processos bioquímicos vitais, como também ao destaque cada vez maior que apresentam em variados estudos farmacológicos. Na natureza, estão envolvidas em etapas importantes do ciclo de vida de seres vivos, principalmente nos níveis da cadeia respiratória e da fotossíntese, como por exemplo as ubiquinonas (1a) e as plasto-quinonas (1b)3. As naftoquinonas, por exemplo as vitaminas do tipo
K (2), de irrestrita necessidade aos seres vivos4, possuem ação
contro-ladora da coagulação sanguínea.
De um modo geral, as quinonas naturais mais representativas são de vital importância para vegetais superiores, artrópodes, fun-gos, liquens, bactérias, algas e vírus. A distribuição dessas substân-cias nos variados organismos implica, possivelmente, em funções biológicas múltiplas, agindo de forma conspícua em seus diversos ciclos bioquímicos.
Em estudos farmacológicos as quinonas mostram variadas biodinamicidades, destacando-se, dentre muitas, as propriedades microbicidas, tripanossomicidas, viruscidas, antitumorais e inibidoras de sistemas celulares reparadores, processos nos quais atuam de di-ferentes formas. Como exemplo, destaca-se o estresse oxidativo que provocam, ao induzirem a formação deletéria endógena de espécies bioativas derivadas do oxigênio (1O
2,
.OH, O
2
.- e H 2O2)
5, como
ocor-re no Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Outra atividade marcante destas substâncias, descoberta um tanto recentemente, é a inibição do complexo das topoisomerases, ação que provoca o desencadeamento da apoptose celular (suicídio celu-lar). A interferência das quinonas na apoptose constitui-se hoje em
pesquisa interdisciplinar de fronteira na química medicinal, existin-do grande expectativa quanto à delineação de estratégias racionais visando o combate de neoplasias, principalmente as relacionadas ao câncer de próstata.
Com base na sua estrutura molecular, as quinonas são divididas em diferentes grupos, utilizando-se como critério o tipo de sistema aromático que sustenta o anel quinonoídica: benzoquinonas - um anel benzênico; naftoquinonas - um anel naftalênico; antraquinonas - um anel antracênico linear ou angular (Figura 1).
De modo muito peculiar, em decorrência de diferentes arranjos quinonoídicos (isomeria), com um mesmo tipo de anel pode-se ter, dependendo das disposições relativas das carbonilas, diferentes quinonas. Por exemplo, no arranjo de base naftalênica tem-se a for-ma isomérica 1,2 ou orto-quinonoídica, quando as carbonilas são vizinhas (4a, Figura 1), ou a 1,4, para-quinonoídica, com as carbonilas tendo entre si dois carbonos (4b). Outros arranjos
isoméricos são conhecidos, principalmente em sistemas policíclicos, nos quais os distanciamentos entre as carbonilas podem ser maiores. Estas formas isoméricas diferem muito em suas propriedades físi-cas, químicas e quanto à sua atuação biológica. Um exemplo típico é a orto-naftoquinona, β-lapachona 4a, do grupo das tabebuias, que é muito mais ativa contra o Trypanosoma cruzi que o seu isômero na-tural 4b, α-lapachona(Figura 1).
Numa observação mais apurada sobre a importância das quinonas, especialmente de benzoquinonas, naftoquinonas e antraquinonas, pode-se citar o grande número de drogas neste grupo que possuem aplicações práticas reconhecidas. Algumas, inclusive, chegaram à produção industrial, como por exemplo, as vitaminas K6, as
mitomi-cinas e as antraciclinas. Sob o ponto de vista estrutural, em grande parte destacam-se nestas substâncias anéis redox acoplados a diver-sos sistemas heterocíclicos, normalmente nas posições 2,3 ou 3,4 do sistema naftalênico. Estes anéis heterocíclicos podem ser dos tipos furânico, pirânico, pirrólico, etc. indicando sua importância na ex-pressão da bioatividade.
A química das quinonas, já há muito vem sendo descrita em vá-rios livros publicados7, em inúmeras e excelentes revisões, estando
assim bem documentada sua evolução ao longo do tempo. Neste artigo de divulgação, enfocaremos as mais importantes naftoquinonas naturais e sintéticas citadas nos últimos anos na lite-ratura científica, descrevendo-as separadamente nos itens que se se-guem. Em especial, serão discutidos os aspectos biológicos e sintéti-cos da β-lapachona (4a), uma substância que vem tendo destacada e acentuada atuação, tanto na química quanto na farmacologia.
As mitomicinas são quinonas de atividade antibiótica e antitu-moral, de uso clínico reconhecido, produzidas por culturas de al-guns fungos. A mitomicina C8 (5), a mais conhecida do grupo, foi
isolada de cultura de Streptomyces caespitosus (Figura 2) sendo uti-lizada na quimioterapia de certos tipos de tumores sólidos9,10. Em
trabalho recente, Alves e Oliveira revisaram os mais importantes as-pectos químicos e farmacológicos desta classe de substâncias11.
As antraciclinas representam uma classe de quinonas antibióticas proveniente de culturas de fungos Streptomyces. Os representantes mais conhecidos desta classe são a daunorubicina (7a) e a adriamicina (7b) (Figura 3) isoladas de S. peucenticus e S. coeruleorubidus, respectiva-mente. A daunorubicina (7a) também possui efeito terapêutico contra a leucemia humana12. Uma única citação descreve esta substância como
inibidora de Trypanosoma rhodiens13.Estudos sobre seu modo de
atu-ação antimicrobiano indicam que estão envolvidas na formatu-ação de um complexo com as bases purínicas e pirimidínicas provocando a inibi-ção da síntese do DNA. As substâncias 7a e 7b também são ativas
contra o sarcoma 180, o carcinoma ascítico de Ehrlich e outros tipos de carcinomas14. Outros estudos sobre o mecanismo de atuação
bioló-gica destacam a importância do grupo quinonoídico como o grupo farmacofórico imprescindível para a biorreatividade no nível das enzimas do tipo redutases, formando espécies reativas do oxigênio que induzem a apoptose15-18.
Atualmente, há um grande interesse pelo conhecimento da far-macologia e do modo de atuação destas substâncias, como pode ser demonstrado pelo número de crescente de publicações sobre o me-canismo de atuação da β-lapachona. O progresso quanto aos conhe-cimentos da bioquímica das atividades enzimáticas, além dos recen-tes avanços da química computacional, em muito pode contribuir para o esclarecimento em maior profundidade dos mecanismos de atividade de fármacos e, em conseqüência, para o planejamento de novas drogas comerciais. O contexto de previsibilidade que estes estudos trazem auxiliam na busca de agentes antineoplásicos basea-dos em planejamentos racionais19, resultando na obtenção de
subs-tâncias com maior seletividade e eficiência antineoplásica. A citotoxicidade das quinonas leva à especulação de que existe uma propriedade química intrínseca na unidade quinonoídica, asso-ciada com outros fatores estruturais, que são responsáveis pela in-tensidade das atividades antitumorais20. Uma possibilidade plausível
é a capacidade das quinonas se reduzirem pelas flavoenzimas celula-res21. Foi observado que muitas quinonas possuem um grupo de
saí-da que pode ser ativado por redução saí-das carbonilas quinonoídicas, gerando intermediários alquilantes22 (agentes antineoplásicos
bior-redutores). Atualmente, existem sólidas evidências de que este me-canismo de ação é o que mais se aproxima das ações farmaco-lógicas das mitomicinas e antraciclinas23.
A quimioterapia baseada num planejamento racional de fármacos tem, então, no sistema redox das quinonas um bom modelo para estudos teóricos. Um dos poucos estudos desta natureza foi realiza-do com um grupo de 65 quinonas naturais e sintéticas, onde procu-rou-se relacionar a atividade antimalárica com a energia livre de Gibbs de oxi-redução. De conclusivo, verificou-se que há, de fato, uma relação da expressão da atividade biológica com valores baixos de ∆G0 (menores que +8 Kcal)24,25.
NAFTOQUINONAS
Dentre as naftoquinonas naturais destaca-se o lapachol (8)que pode ser considerado um dos principais representantes do grupo de quinonas das tabebuias. É conhecido desde 185826 e desde então,
através dos séculos27, tem sido encontrado como constituinte de
vá-rias plantas das famílias Bignoniaceae, Verbenaceae e Proteaceae. Entretanto, sua ocorrência é maior na família Bignoniácea, particu-larmente no gênero Tabebuia (Tecoma), juntamente com outras quinonas heterocíclicas não menos importantes do grupo28. O lapachol
(8) é de fácil extração da serragem da madeira29 de várias espécies de
ipê, plantas do Brasil e da fronteira com a Argentina. Há no Brasil cerca de 46 tipos de madeiras comerciais conhecidas como “ipês” (Tabebuia sp). Atualmente são exportados pela empresa PVP Socie-dade Anônima (Parnaíba, Piauí30) ao custo de US$ 1.200/kg.
Outro-ra, o lapachol foi comercializado para utilização como coadjuvante no tratamento de certos tipos de câncer, sendo o medicamento fabri-cado pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEP), não mais disponível no mercado. Esta naftoquinona tam-bém já constou do catálogo da Aldrich Chemical Co., em edição antiga (1989). Curiosamente, também não consta de qualquer das últimas edições do Índice Merck.
Em se tratando de quinonas obtidas das tabebuias, não se pode-ria deixar de mencionar o pioneirismo dos estudos farmacológicos realizados no Brasil por O. G. de Lima (UFPe) na década de 60 e o Figura 2. Mitomicinas antitumorais que atuam por bioativação redutiva
do Prof. B. Gilbert (UFRJ), a partir da década de 70, do século pas-sado. Desde então, vários outros pesquisadores, como o Prof. A. V. Pinto, do NPPN-UFRJ, desenvolvem pesquisas com este grupo de naftoquinonas e seus derivados semi-sintéticos, em estudos farmaco-lógicos e químicos de diversos tipos. Mais recentemente, o grupo da Profa. M. O. F. Goulart (UFAl) dedica-se ao estudo eletroquímico destas quinonas.
O principal interesse no lapachol (8) reside em sua capacidade de induzir o estresse oxidativo através da formação intracelular de espé-cies reativas do oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o
ânion-radical superóxido (O2- •) e o radical hidroxila (HO•). Estas es-pécies podem danificar alguns componentes celulares importantes, tanto de células normais como de malignas. Esta interferência xenobiótica altera o balanço natural de sinais que interferem na divisão celular em pontos específicos da evolução morfogênica natural (“checkpoint” ou ponto de checagem31). A alteração da normalidade pode induzir a
apoptose como alternativa, caso não se consiga eliminar por completo o estresse oxidativo32. Similar metodologia, no que diz respeito à
ge-ração de espécies reativas do oxigênio, se baseia a terapia fotodinâmica, onde estas espécies são geradas por interação de luz de comprimento de onda adequado com um fotossensibilizador e oxigênio, capazes de induzir a inviabilização de células33.
Apesar de possuir estágios de atuação biológica não muito co-nhecidos, o lapachol (8) deve atuar por diferentes mecanismos. É interessante observar que, em relação à quimioterapia, há um apa-rente antagonismo de atuação do lapachol (8), que age no fenômeno da apoptose sobre células do câncer, as quais, ao contrário, possuem crescimento desordenado34,35.
O lapachol (8) foi avaliado clinicamente nos tratamentos de car-cinoma36 de Walker-256 e do sarcoma de Yoshida37. Embora
promo-va a regressão definitipromo-va de neoplasias em aproximadamente 30% dos portadores destas patologias, além de agir como analgésico, os ensaios clínicos o desaprovam em decorrência de efeitos colaterais que, em muito, agravam o quadro clínico de pacientes com câncer: anemia, aumento do tempo de coagulação e problemas gastrin-testinais38. Recentemente, o 5-hidroxi-lapachol isolado de Tectona
grandis mostrou-se mais tóxico que o próprio lapachol (8), em teste de letalidade com Artemia salina (“brine shrimp”)39, suscitando a
possibilidade de uma boa tolerância por exigir doses menores para a ação farmacológica desejada.
Estudos realizados indicam que o estresse oxidativo induzido pelo lapachol (8) ocorre no nível da enzima P450 redutase. Neste processo as espécies reativas do oxigênio promovem a cisão do DNA40. Este tipo de mecanismo de ação é importante, pois alguns
microorganismos patogênicos são muito mais sensíveis ao estresse oxidativo que os humanos hospedeiros41.
Muitas outras atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol (8) e a seus derivados semi-sintéticos, tais como atividade antimicrobiana e antifúngica42; atividade cercaricida (prevenção da
penetração de cercárias Schistosoma mansoni na pele)43; ação
moluscicida (atividade contra caramujos Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni44); leishmanicida
[ação intracelular nas formas amastigotas de Leishmania (viannia) braziliensis]45,46; tripanossomicida47,48 (atividade contra o
Trypanosoma cruzi, que é o agente causador da doença de Chagas em sua fase tripomastigota); antimalárico (atividade contra eritrócitos parasitados por Plasmodium falciparum49); uso contra enteroviroses50;
antiinflamatória51; antineoplásica52 e antiulcerantes53. Há ainda
rela-tos da forte atividade anticonceptiva em ratas, que causou 100% de mortalidade fetal/embrião sem, contudo, causar aparente efeito tóxi-co aos animais54,55.
Na busca de agentes antimaláricos potenciais, tendo como pro-tótipo as vitaminas K e o próprio lapachol (8), foi feito um estudo
com diversos análogos sintéticos. A substância 9 foi uma das que apresentou melhor atividade em pacientes infectados por Plasmodium vivae, parasita causador da malária56. Uma das substâncias deste
gru-po, a atovacona 10, encontra-se no estágio de testes da fase clínica57.
Esta quinona é uma inibidora da enzima diidroorotato desidrogenase (EC 1.3.99.11) que catalisa a síntese do monofosfato de uridina nos parasitas58 (Figura 4).
Outros exemplos interessantes são as substâncias 11a-d, de sig-nificativa atividade contra o vírus HIV-1, agindo especificamente nas enzimas proteases (Figura 5)59.
NAFTOQUINONAS PIRÂNICAS
O lapachol (8, Figura 4) foi matéria prima para as sínteses de muitas outras substâncias de distintas biodinamicidades. As mais ativas foram os derivados contendo os anéis pirânicos e furânicos, por exemplo, a xiloidona 7a, a β-lapachona (4)60 e muitas outras
naftoquinonas, como a 1-aza-antraquinona 7b61 sintetizada
recente-mente. A quinona natural xiloidona (7a),deatividade antimicrobiana, pode ocorrer também como artefato de origem fotoquímica durante o isolamento do lapachol (8)62.
A β-lapachona (4a) tem sido encontrada como constituinte minoritário durante o isolamento de outras naftoquinonas63 do cerne
das árvores de ipês, como por exemplo Tabebuia avellanedae Lorentz ex. Griseb. (Bignoniaceae), nativa das AméricasCentral e do Sul. Tal qual o lapachol (8), esta orto-piranonaftoquinona mostra uma diversificada ação farmacológica64 envolvendo principalmente o
ci-clo redox.
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA VIA CICLO REDOX
Como mencionado anteriormente, o principal interesse nas quinonas advém da sua capacidade de induzir o estresse oxidativo nas células. Esse estresse pode também resultar da ação de muitos agentes ambientais tóxicos sobre seres vivos, como radiações gama e ultravioleta, ozônio e poluentes automotivos no ar, assim como de certas substâncias da cadeia alimentar e de derivados do tabagis-mo65,66. Além destes fatores ambientais, estima-se que 1 a 2% do
oxigênio consumido pelos mamíferos sejam convertidos a O2- • e H
2O2,
devido a falhas fisiológicas na mitocôndria permitindo que elétrons escapem sem que sejam transferidos pelo oxigênio67. Segundo Kubota
Figura 4. Xiloidonas (7a,b), lapachol (8) e congêneres
e outros autores, o desequilíbrio entre a formação e a remoção dos radicais livres no organismo, decorrente da diminuição dos antioxi-dantes endógenos ou do aumento da geração de espécies oxiantioxi-dantes, leva a um estado pró-oxidante que favorece a ocorrência de lesões oxidativas em macromoléculas e estruturas celulares que podem pro-vocar a morte celular68,69.
Muitas pesquisas na área de doenças endêmicas, empregando triagens com quinonas, foram realizadas na busca de substâncias com atividade tripanossomicida. Estes estudos exploraram a capacidade das quinonas induzirem o estresse oxidativo conforme esboçado no Esquema 1, que apresenta resumidamente as etapas bioquímicas deste processo, concebidas por diversos autores nos últimos 30 anos1,70,71.
Neste esquema, sob ação enzimática, um substrato quinonoídico reduz-se com um elétron para formar o ânion semiquinona (Q•-),
catalisada pelas enzimas flavinas NADPH citocromo P-450 redutase (E.C. 1.6.2.3), NADPH citocromo b5 redutase (E.C. 1.6.2.2) ou NADPH ubiquinona oxidoredutase (E.C. 1.6.5.3). A cinética desta redução depende de vários fatores, incluindo o potencial de redução da quinona. Uma vez formada a espécie semiquinona Q•-, esta reduz o oxigênio molecular ao ânion-radical superóxido (O2- •) que, na pre-sença da enzima superóxido dismutase (SOD, E.C. 2,55,56), é trans-formado em H2O2. Este ânion-radical superóxido (O2
-•), por catálise
com metais de transição (reação de Fenton72), ou por reação com
H2O2 (reação de Harber-Weiss73), gera HO• no interior da célula. Embora o H2O2 não seja um radical livre, é uma substância bastante reativa, podendo promover também a oxidação de algumas biomo-léculas (Esquema 1). Em resumo, HO• e H
2O2 são as principais
espé-cies responsáveis pelo estresse oxidativo celular.
Fe(II) + H2O2 →Fe(III) + HO- + HO• (reação de Fenton) O2- + H
2O2 →O2 + HO
- + HO• (reação de Haber-Weiss)
Na tentativa de eliminar estas espécies oxidantes, as células de-sencadeiam mecanismos de desintoxicação, através dos agentes antioxidantes intracelulares. Uma perfeita eliminação e/ou conseqüente controle do estresse oxidativo vai depender, em muito, dos níveis dos agentes intracelulares antioxidantes, como α-tocoferol, vitamina C, enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GSH) e glutationa peroxidase (GPX). Em sistemas onde ocorre uma persistência do ciclo redox, ou então faltam mecanismos de proteção, há aumento intracelular dos oxidantes O2•- e H
2O2,
pro-movendo a danificação de componentes celulares vitais como as mem-branas, através da peroxidação dos lipídios e a diminuição da capaci-dade antioxidante celular. Desta forma, a espécie radicalar HO•, gera-da por uma reação tipo Fenton, em que H2O2 é reduzida por Fe+2 ou
Cu+1 (esta participação ainda é polêmica74) pode danificar o genoma.
Sua atuação leva a conseqüências adversas, por alteração do sinal da transcrição na expressão de genes, mutagenicidade e/ou por ativação de fatores responsáveis pela indução da apoptose. A formação, em meio biológico, do radical hidroxila mediada por metais, ainda cons-titui matéria controversa na literatura75.
Beckman e Ames estimam que a degradação do DNA por HO• pode levar à formação de, aproximadamente, 150.000 subprodutos por célula, resultantes de sua adição ao DNA seguida de clivagem em diversos pontos da cadeia. Calcula-se que o estresse oxidativo seja o responsável pela metade dos cânceres humanos76. A adição do
radical hidroxila (HO•) na dupla hélice do DNA é rapidíssima, que-brando-a em uma ou duas fitas. O ataque pelo radical à topologia da macromolécula ocorre nas bases nitrogenadas que são aceptoras de radicais ou se dá nas unidades de carboidratos, resultando em que-bra da ligação N-glicosídica.
Embora muito complexo, com etapas ainda desconhecidas, o ciclo redox continua sendo a ferramenta atual de que se valem os
farma-cologistas para obter conhecimentos sobre a ação citotóxica das naftoquinonas. No estudo do ciclo redox o T. cruzi tem sido o mode-lo experimental mais utilizado até o momento.
Em resumo, uma série de processos de importância crucial para as células, como a indução da apoptose e os danos provocados pelo estresse oxidativo estão entre os principais efeitos que as quinonas provocam em sistemas biológicos. Ao que parece, as espécies O2·- e H2O2 estão sendo consideradas como dois importantes sinais regula-dores de condições intracelulares. Acredita-se que o aumento de suas concentrações (condições mais oxidantes) favoreça a apoptose.
APOPTOSE VIA INIBIÇÃO DAS TOPOISOMERASES I E II
As enzimas nucleares topoisomerases I (EC# 5.99.1.2) e II (EC# 5.99.1.3) são críticas para o funcionamento normal de qualquer cé-lula. São elas que mantêm a integridade do DNA, reparando-o quan-do danificaquan-do. Nos organismos mais simples, quanquan-do em ação repa-radora, as topoisomerase I ligam-se a uma ou duas fitas do DNA, mas introduzem um só corte numa das fitas do DNA. Organismos superiores possuem, além da topoisomerase I, a topoisomerase II, que se complexam com duas fitas do DNA e induzem dois cortes durante o processo de reparação. As enzimas topos I e II têm funções recíprocas reversas, ou seja, uma é expressa quando a outra é inibi-da77. Ambas cortam o DNA por ataque a pontos de unidade tirosínica,
na ligação fosfodiéster do DNA e são críticas para o bom funciona-mento celular. Qualquer alteração no balanço entre estas enzimas é suficiente para induzir a apoptose. Ressalte-se que micromoléculas, como a actinomicina-D, a daunomicina e a adriamicina, também atu-am diretatu-amente no DNA, mas por intercalação entre nucleotídios vicinais da fita do DNA, via interações de van der Waals e iônicas. Deste modo, a intercalação interfe nas funções normais do DNA, bloqueando as polimerases e interferindo na síntese de proteínas78.
conferindo se é realmente idêntico ao antigo. Se por acaso a avalia-ção não for favorável, o processo de divisão é colocado em modo inercial à espera do reparo. Se o dano no cromossomo for muito grande, sem possibilidades de reparo a contento, a célula, na tentati-va de se presertentati-var, interrompe o seu ciclo vital cometendo suicídio. Acredita-se que esta seja uma estratégia de proteção dos organis-mos, que assim evitam passar o dano para uma nova geração de cé-lulas.
Nas células cancerosas não existem os pontos de checagem G1, G2 e M e isto evita sua apoptose mesmo tendo ocorrido um acúmulo de danos genéticos. Uma estratégia de combate às células cancero-sas seria o uso de substâncias que induzissem a formação de pontos artificiais de checagem no processo da divisão celular. Se assim ocor-rer, haverá a indução da morte das células malignas. Nestas condi-ções, qualquer agente (ou inibidor) que afete nas neoplasias o com-plexo topoisomerase-DNA poderia induzir este processo letal. Como as células cancerígenas crescem e se multiplicam com rapidez, esta-rão mais sensíveis aos inibidores da topoisomerase I que as células normais. Portanto, estas enzimas são alvos especiais na nova quimio-terapia antitumoral.
As substâncias que atuam nas topoisomerases podem ser dividi-das em duas classes: 1) estabilizadoras do complexo topoisomerase-DNA e 2) inibidoras catalíticas da topoisomerase79. Já existem
vári-as substâncivári-as que pertencem às duvári-as categorivári-as. Os inibidores dvári-as topoisomerases I e II pelo mecanismo 1 são mais numerosos, como por exemplo o alcalóide quinolínico camptotecina (12), isolado de Camptotheca acuminata, e seu análogo sintético, a topotecan (13)80,
drogas em fase de ensaios clínicos, dentre outras (Figura 6). Os inibidores da topoisomerase estabilizam o complexo enzima-DNA após o estágio do corte e antes do enzima-DNA ser recomposto. Por-tanto, o DNA e a enzima não podem prosseguir com suas funções normais. Esta nova abordagem na quimioterapia do câncer ainda re-quer mais subsídios que permitam delinear estratégias, de modo a fazer com que células malignas percam a habilidade de se reparar, induzindo a apoptose81. Um problema desta quimioterapia e, de um
modo geral, de todas até hoje conhecidas, é a possibilidade das célu-las cancerosas se tornarem resistentes aos inibidores de topoiso-merase, via um mecanismo conhecido como resistência a múltiplas substâncias (“multi-drug resistance” ou MDR), aspecto bioquímico complexo e ainda em estudo.
Para um efeito citotóxico sinergístico ambas as enzimas topoisomerases devem ser inibidas82. Nos humanos são conhecidos
três tipos de topoisomerases – I, IIα e IIβ – produzidas por três tipos de cromossomos.A IIα está presente em todos os seres eucarióticos, enquanto que apenas os vertebrados possuem a IIβ. Esta última é o homólogo superior da IIα, com pequenas diferenças, sendo expres-sa quando IIα é inibida. Parece que IIβ é um tipo de “back-up” de IIα para a célula, e está mais associada à diferenciação celular do que à proliferação. Atualmente o etoposídeo (15a) é a substância inibidora mais promissora com este mecanismo de ação (Figura 7).
Várias substâncias estão relatadas na literatura como tendo atividade inibidora da topoisomerase II: a β-lapachona (4a) (detalhes adian-te), a elipticina (15b) e diversos derivados, e as quinonas saintopina (16a) e eleuterina (16b), mostradas na Figura 7.
A inibição da topoisomerase II é mais desafiadora, pois foge um pouco ao modelo clássico no qual um ligante interage com um re-ceptor. Na inibição da topo II há uma interação simultânea com dois receptores83. Esta inibição pode ocorrer por uma interação da região
aromática dos agentes com as bases do DNA ou de regiões mais polares com outros sítios da topoisomerase. É fato que uma simples intercalação ao DNA não explica de todo a inibição do complexo topoisomerase-DNA. De forma simplificada, a Figura 8 mostra a formação dos complexos topoisomerases I e II com o DNA84,
segui-da segui-da interação com um inibidor que congela o complexo DNA-Topoisomerase levando à sua fragmentação e, conseqüentemente, à morte celular. A ordem cronológica destes eventos ainda é desco-nhecida, como já foi destacado anteriormente. Os inibidores não agem na formação do complexo topoisomerase-DNA, ao contrário, eles
Figura 6. Substâncias inibidoras da enzima topoisomerase I
Figura 7. Substâncias com exclusiva atividade inibidora da topoisomerase II
não deixam as topoisomerases reconectarem-se ao DNA e desfaze-rem o complexo. Eles atuam tal qual uma cola que mantém a topoiso-merase ligada ao DNA. Outros fatores celulares percebem o dano e sinalizam a deflagração da apoptose.
Uma segunda classe, não menos importante, de inibidores da topoisomerase corresponde a inibidores catalíticos, que não agem so-bre o complexo topo-DNA, mas sim na atividade catalítica das enzimas85. Entre os mais estudados encontram-se as
bis-2,6-dioxopiperazinas (ICRF-159, 17a e ICRF-193, 17b)86,87, que inibem a
enzima topoisomerase II por bloqueio do sítio catalítico (Figura 9).
A β-Lapachona (4a) exibe in vitro variados tipos de atividade contra diferentes linhagens de células, principalmente células malignas hu-manas dos cânceres de pulmão, mama, colo-retal, próstata, melanoma e leucemia88,89. Apesar do amplo espectro de bioatividades, os
meca-nismos de atuação da β-lapachona (4a) em modelos experimentais ainda não estão bem delineados. O que se sabe decorre de estudos abordando a atuação tripanossomicida. Neste modelo, além do estresse oxidativo também se observam vias biorredutivas alquilantes sobre ácidos nucléicos e/ou proteínas90,91. Outras atividades farmacológicas
foram atribuídas a esta quinona, podendo-se destacar as atividades antibacteriana e antifúngica92, cercaricida e antipsoriática (IC
50 0,7 µM
contra queratinocite HaCaT humana)93.
A β-lapachona (4a) também age como inibidora das topoiso-merases I94 e II95. A incubação direta desta substância com a
topoisomerase I, antes da adição de DNA como substrato, aumenta drasticamente o efeito inibitório, sugerindo a interação direta da β -lapachona com a topoisomerase I. Também foi verificado que esta ação depende da presença de NQO1-redutase. Este modo de atuação difere em relação ao de outras substâncias inibidoras das topoiso-merases, como por exemplo96 a camptotecina (12)97 e o topotecan
(13). Entretanto, a atuação inibitória da β-lapachona (4a) sobre sis-temas reparadores parece não ser o seu único modo de atuação, uma vez que fungos que não expressam topoisomerase I também são ini-bidos por esta quinona. Ao que parece, a β-lapachona (4a) é um xenobiótico de atuação crítica sobre mais de um alvo intracelular, que não só a topoisomerase I. Uma outra hipótese alternativa seria o ataque pela β-lapachona (4a) a pontos específicos do ciclo catalítico que expressa a ação da topoisomerase I como, por exemplo, a pontos de checagem G1 e S, por ação outra que não a de uma simples inter-calação. Recentemente, foi relatado que a β-lapachona (4a) e a camptotecina (12) induzem a apoptose de células malignas epiteliais, de glioma humano, e de pigmentos retinais humanos. As duas dro-gas atuam sobre a topoisomerase I, mas por vias diferentes98. A β
-lapachona (4a) também induz a apoptose de células do câncer de mama dos tipos MCF-799 e T47D100.
Há um forte interesse voltado ao uso comercial da β-lapachona (4a), que pode ser demonstrado pelas diversas patentes concedidas ao longo dos últimos anos envolvendo esta quinona, provavelmente como garantias de uso comercial futuro. Também há muitas patentes relacionadas às sínteses de alguns derivados naftoquinônicos com estruturas similares101.
Deve-se frisar que a ação indutora da β-lapachona (4a) no pro-cesso de apoptose tem despertado algumas controvérsias102. Alguns
acreditam que esta quinona não atue sobre o complexo topoisomerase-DNA do modo como vinha sendo proposto por muitos autores. Kuo e colaboradores103, por exemplo, mostraram que a β-lapachona (4a)
promove a elevação dos níveis de H2O2 e O2
•- (estresse oxidativo) em
células de leucemia HL-60 induzindo, por conseqüência, a apoptose em estágios posteriores. De fato, a favor disto está o antagonismo entre a atividade da β-lapachona (4a) e a da vitamina C (antioxidante), que não ocorre nas presenças de outros inibidores de topo I e II, ou seja, enquanto a β-lapachona gera radicais livres, a vitamina C os captura. Entretanto, estes autores não descartam totalmente a possi-bilidade de uma atuação paralela e direta da β-lapachona sobre as enzimas topos I e II. O mesmo grupo demonstrou104 que a indução
da apoptose pode estar relacionada com o aumento dos níveis de H2O2 celular catalisado por NAD(P)H/quinona oxidorredutase. No estudo realizado, foi observado um aumento significativo deste agente oxidante em células de leucemia HL-60 incubadas com 1 mM de β -lapachona. Portanto, não se deve descartar de todo a importância do ciclo redox na apoptose, tendo em vista sua dependência da enzima NAD(P)H/quinona oxirredutase (NQO1), que reduz a função quinona, via transferência de dois elétrons. Mais recentemente, o mesmo grupo também mostrou que a β-lapachona age em células de osteocarcinoma humano (U2-OS) por necrose celular independente do estresse oxidativo, e não por apoptose, indicando que o seu meca-nismo de atuação está relacionado também com o tipo de célula cancerígena105.
Boothman e colaboradores mostraram evidências que indicam a participação da enzima NQO1 no processo de ativação da β-lapachona (4a) na apoptose, aumentando a citotoxicidade106. A NQO1 é
ex-pressa em maior grau em vários tipos de tumores, incluindo os de mama, pulmão e do colo-retal, do que em tecidos normais. Esta ob-servação pode se constituir em uma nova estratégia para a quimio-terapia de alguns tipos de câncer, por exemplo o de próstata107.
Outras atividades importantes também estão relatadas na litera-tura para a β-lapachona. Vanni e colaboradores108 mostraram que ela
induz danos aos cromossomos de células do ovário de hamster chi-neses (CHO), sugerindo uma interação com a enzima poli(ADP-ribose)polimerase (PARP). Em estudos recentes, Anderson et al. mos-traram que esta quinona tem considerável atividade anticancerígena (IC50: 4-8 µM) em células de mieloma múltipla (malignância hemato-lógica incurável) por apoptose, e que esta atividade está relacionada com a clivagem das enzimas PARP e Caspase-3109. Boothman
obte-ve resultados que evidenciam uma ação primordial, mas não inde-pendente, de Ca2+ extracelular na indução da apoptose em processo
dependente de NQO1 e tendo a β-lapachona (4a) como substrato110.
Em estudo recente, Liu demonstrou que a β-lapachona (4a) inibe a enzima NO-sintase, o que pode abrir novos caminhos para o desen-volvimento de antiinflamatórios de última geração111. Aggarwal e
colaboradores examinaram a ação da β-lapachona (4a) sobre o fator de necrose tumoral (TNF) e sugeriram que a indução da apoptose talvez ocorra pela redução de grupos sulfidrilas do TNF112, pois
agen-tes redutores (ex. N-acetilcisteína) revertem o efeito da β-lapachona. Recentemente, vários pesquisadores relataram que a β-lapachona (4a) também atua fortemente na indução da apoptose por interferência no complexo topoisomerase IIα-DNA. Em concentrações menores que 8 µM, esta substância induziu a morte celular com características de apoptose de células malignas da próstata, o que sugere que esta seja uma substância promissora para a quimioterapia desta doença113. Em
um estudo sobre a indução da topoisomerase II114, com tipos de
célu-las sensíveis e resistentes a quimoterápicos, observou-se que esta substância é também citotóxica frente a diferentes células tumorais apresentando, inclusive, atividade sobre células resistentes à camptotecina (12). Este estudo revelou que o envenenamento da topoisomerase IIα pela β-lapachona (4a) é independente do ATP e Figura 9. Dioxopiperazinas que bloqueiam o sítio catalítico da enzima
envolve a formação de complexos que podem ser clivados reversi-velmente.
A combinação da β-lapachona (4a) com outras substâncias que atuam em diferentes mecanismos celulares pode ser uma boa alter-nativa quimioterápica. Pardee e colaboradores115 relataram que a β
-lapachona combinada com o taxol, base do fármaco antineoplásico Taxotere de uso clínico, constitui-se em uma associação muito
efe-tiva contra tumores humanos do ovário e da próstata, implantados em ratos imunossuprimidos, sugerindo uma possível quimioterapia em humanos baseada na combinação destas duas drogas. Recente-mente, Kumi-Diaka mostrou que o tratamento combinado da β -lapachona com a isoflavona genisteina (metabólito obtido da soja) é mais potente para matar células de câncer de próstata PC3 e LNCaP que ambas isoladamente. Como a β-lapachona atua nos pontos de checagem G1 e G2 no ciclo celular, enquanto a genisteina atua nos ponto G2 e M,a combinação das duas é mais eficiente, mostrando que esta terapia de combinação é mais efetiva para a quimioterapia do câncer de próstata116.
ATIVIDADE ANTIVIRAL
Na área da virologia, é sabido que a β-lapachona (4a) e o topotecan (13) inibem seletivamente a replicação do vírus HIV-1, atuando na inibição da enzima LTR117. Da mesma forma, 4a é um
potente inibidor da enzima transcriptase reversa dos vírus mielo-blastose aviária (AMV) e leucemia murina de Rauscher (RLV). Tam-bém inibe a α-polimerase do DNA. A ação inibitória sobre estas enzimas revelou-se específica se comparada com a de outros inibidores conhecidos118.
EFEITO DE RÁDIO-SENSIBILIZAÇÃO
Até pouco tempo atrás, era consenso entre os terapeutas que os processos clínicos por radioterapia destruíam os tumores por necrose, mas agora se sabe que as células morrem em geral por apoptose. Desta forma, pode-se pensar no uso de substâncias indutoras de apoptose como co-adjuvantes no tratamento do câncer por energia ionizante. Este efeito potencializador da radiação pode diminuir o tempo de exposição durante a terapia, levando a menores efeitos nocivos sobre células normais do corpo humano. Ao que parece, tanto a radiação quanto os inibidores do complexo DNA-topoisomerase provocam danos ao DNA das células cancerosas, por ativação do gene humano p53, que desencadeia a cascata de eventos que levam estas células à apoptose.
Neste sentido, há uma atividade surpreendente da β-lapachona (4a) - sua ação sinergística em processos de apoptose provocada por radioterapia. Na década de 80, foi descoberto que 4a potencializava a ação rádio-sensibilizadora de alguns derivados pirimidínicos halogenados, aumentando em muito a letalidade das células do car-cinoma de laringe quando irradiadas119. Mais recentemente, foi
des-crito que a β-lapachona (4a), em baixas concentrações, também é rádio-sensibilizadora em vários tipos de células de câncer humano (pulmão, mama, pele e colo-retal). Assim, este efeito de amplificar os efeitos da radiação ionizante terapêutica sugere a utilização desta substância na radioterapia de tumores120,121, assim como de outros
inibidores da topoisomerase122 de características similares123, como a
camptotecina (12) e o etoposídeo (13).
A presença de vários inibidores de topoisomerase I, na concen-tração 4 µM, aumenta significativamente a porcentagem de eficiência da radiação sobre células rádio-resistentes de melanoma humano (U1-Mel): camptotecina, 12, 54%; topotecan, 13, 92%; β-lapachona, 4a, 79%; 3-alil-β-lapachona, (14), 89%, esta na concentração de 10 µM. A topotecan (13), 9-amino-camptotecina e a 3-alil-β-lapachona (14),
por terem menor toxicidade sobre células, em estudos in vitro, e por serem potencializadoras mais eficientes da radiação letal, são candidatas a ensaios clínicos futuros.
MODIFICAÇÕES NA CARBONILA DA β-LAPACHONA (4a)
Burton e colaboradores124 relataram a síntese de monoarilimino
o-quinonas derivadas da β-lapachona, na expectativa de modificar o sistema redox. Os derivados fenilimina (18a) e p-metilfenilimina (18b) mostraram-se de citotoxicidade e seletividade alvissareiras quando testados in vitro (National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA), contra 55 linhagens de células de câncer (Figura 9). Em testes preliminares in vivo, no protocolo “hollow fibre”125 do NCI, sobre
12 linhagens de células tumorais humanas, as substâncias 18a e 18b causaram a morte celular total, um resultado bem superior ao da β -lapachona (4a), inativa no mesmo protocolo. Anteriormente, este tipo de modificação da unidade naftoquinônica, com transformação de uma carbonila cetônica numa função imina, já havia sido explorada em quinonas heterocíclicas, onde 19a mostrou possuir atividade in vitro contra certos tipos de tumores sólidos (Figura 10)126. Pinto e
colaboradores descobriram que a reação da β-lapachona (4a) com excesso de anilina leva à fenazina 18f, provavelmente passando pelo intermediário imina 18a. Esta nova fenazina foi nove vezes mais ativa que o cristal violeta contra a forma infecciosa tripomastigota de T. cruzi127. Outros derivados heterocíclicos da β-lapachona (4a),
como os de estrutura geral 19b, apresentam maior atividade tripa-nossomicida in vitro que as naftoquinonas correspondentes, com destaque para os que contêm o anel imidazólico (Figura 10)128.
Mais recentemente, foi estudada a formação seletiva de deriva-dos imínicos. A hidrazona 18c da β-lapachona (4a) pode ser obtida seletivamente, em 97% de rendimento129. A oxima 18d também foi
obtida com a mesma regiosseletividade130. É interessante notar que a
regiosseletividade na formação destes produtos, por ataque seletivo de nucleófilos à carbonila da posição 6 do sistema orto -naftopi-ranodiona, também ocorre na reação de diazotização da β-lapachona (4a) com tosilidrazina formando o diazocomposto 18e131. Embora sejam de fácil síntese, até o momento não se tem muitos relatos so-bre possíveis atividades farmacológicas para as substâncias 18c-18e. A maior reatividade da carbonila quinonoídica da posição C-6 não está ainda devidamente explicada. Dois fatores podem contribuir para esta maior reatividade: impedimento estérico na posição 5, causado pelo grupo CH2 vizinho e menor reatividade de C-5 devido à conju-gação da liconju-gação dupla com um oxigênio em posição beta.
Um resultado bem interessante foi obtido por Frydman e cola-boradores132, que relataram a reação da β-lapachona (4a), e de outras
orto-naftoquinonas similares com 2-mercaptoetanol (Esquema 2). Os produtos finais foram obtidos por tratamento posterior com BF3.Et2O, mas os intermediários só foram observados por RMN de
1H. Na nossa opinião, mesmo a elucidação destas estruturas não foi
de todo convincente apesar deste trabalho, inequivocamente, mos-trar que a β-lapachona (4a) tem uma forte afinidade por sítios sulfidrílicos, comuns em superfícies de macromoléculas biológicas. Recentemente, Oliveira-Brett e colaboradores133, seguindo esta
li-nha de pensamento, mostraram que na redução eletroquímica da β -lapachona na presença dsDNA e ssDNA não houve danos direta-mente no DNA, indicando que a sua atuação é direta nas DNA toposisomerases. A fim de verificar a participação dos resíduos de L-cisteína das toposisomerases no processo de interação β -lapachona-toposisomerases, foi estudada a voltametria cíclica conjunta da β -lapachona (e o derivado 3-sulfônico) com a L-cisteína e o 2-mercaptoetanol. Os resultados indicaram efeitos dependentes da con-centração, indicando uma possível adição tipo 1,2 e 1,4 do grupo tiol na β-lapachona, reforçando a hipótese de Frydman (Esquema 2).
Recentemente, salvicina (29), uma naftoquinona de estrutura diterpenóide134, constituinte da planta chinesa Salvia prionitis,
apre-sentou forte atividade anticancerígena in vitro e in vivo contra tumores humanos sólidos (Figura 11)135. A salvicina (29) tem a mesma
potên-cia do etoposídeo (15), agindo contra três tipos de leucemia, além de ser citotóxica frente a células malignas multi-resistentes. Esta ativida-de foi associada à indução da apoptose, por ação na topoisomerase II136. Apesar de não haver ainda uma comparação direta entre os
efei-tos de 29 com os da β-lapachona (4), uma atuação biológica muito semelhante de ambas constitui-se em uma boa hipótese.
CONCLUSÃO
Este trabalho teve por objetivo apresentar aos leitores da área da química uma visão geral sobre as potencialidades de substâncias de estruturas naftoquinonoídicas, em estudos químicos e farmacológicos. Foram enfatizados aspectos relativos ao lapachol (8) e à β-lapachona (4a).
As características das quinonas mostradas neste trabalho indica-ram o quanto ainda existe de potencial nestas substâncias como te-mas de estudos químicos sintéticos e farmacológicos. Não mais do
que um século foi necessário para que químicos e farmacólogos fos-sem fascinados pela variedade de propriedades destas substâncias. Hoje o ponto máximo destas substâncias encontra-se nos efeitos indutores da apoptose e os desafios que suas propriedades farmaco-lógicas despertam.
É muito significativa a sua propriedade de indução da apoptose, por agirem sobres as enzimas topoisomerases I e II. Até o momento, a bioquímica da indução não está de todo esclarecida. Entretanto, podemos destacar algumas observações para ponderações: 1) a ini-bição direta da topoisomerase pela β-lapachona (4a), mesmo antes da adição de DNA como substrato (aumento drástico da inibição); 2) a interação com a topoisomerase I é dependente do sistema enzimático NQO1-redutase; 3) atuação no complexo topo II/DNA, de forma contraposta à camptotecina; 4) promoção da elevação dos níveis intracelulares de H2O2 e O2-; 5) inibição, por agentes antioxidantes, da ação da β-lapachona (4a) sobre enzimas redutoras; 6) modifica-ções estruturais na unidade orto-quinonoídica (ciclo redox) interfe-rem em sua atividade; 7) a β-lapachona possui ação sinergística tan-to na radioterapia quantan-to em associação com o taxol.
Com as informações disponíveis na literatura pode-se apontar para uma ação de indução da apoptose através da inibição do com-plexo topoisomerase-DNA. A possibilidade de uma ação direta da β-lapachona (4a) no ciclo catalítico das enzimas da topoisomerase I e II, assim como a geração endógena de O2- • e H
2O2 , são sinais
deci-sivos que desencadeiam a apoptose. De todo modo, não se deve con-siderar a toxicidade elevada desta quinona como um fator limitante ao uso clínico. Novas expectativas colocam-se nos estudos futuros da relação atividade biológica versus estrutura química, uma área de atuação aberta à química medicinal, que pode levar à solução de problemas de toxicidade. As naftoquinonas, de fato, constituem-se em um desafio.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer as valiosas sugestões e corre-ções dos Profs. A. V. Pinto (NPPN-UFRJ), a quem dedicamos este trabalho, e C. Freitas (IB-UFF). V. F. Ferreira e M. C. B. V. de Souza agradecem ao CNPq pelas bolsas de produtividade e ao apoio finan-ceiro do CNPq, CAPES e FAPERJ. M. N. da Silva agradece à CA-PES pela bolsa de doutorado concedida ao Programa de Pós-Gradu-ação em Química Orgânica da UFF.
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