FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E
IMUNO-HISTOQUÍMICA DO MIOCÁRDIO DE CÃES COM
LEISHMANIOSE VISCERAL
Fernando Azadinho Rosa
Médico Veterinário
ARAÇATUBA – SP
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIACÂMPUS DE ARAÇATUBA
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E
IMUNO-HISTOQUÍMICA DO MIOCÁRDIO DE CÃES COM
LEISHMANIOSE VISCERAL
Fernando Azadinho Rosa
Orientador: Profa. Adjunto Gisele Fabrino Machado
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária – Unesp, Campus de Araçatuba, como
parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Fisiopatologia Médica e Cirúrgica).
ARAÇATUBA – SP
Catalogação na Publicação(CIP)
Serviço de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP
Rosa, Fernando Azadinho
R788a Avaliação histopatológica e imuno-histoquimica do miocárdio de
Cães com Leishmaniose Visceral / Fernando Azadinho Rosa.
Araçatuba: [s.n], 2012
72f. il.; tab. + CD-ROM
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Medicina Veterinária, 2012
Orientador: Profa Adj. Gisele Fabrino Machado
1. Cães 2. Coração 3. Leishmania infantum (syn chagasi)
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
FERNANDO AZADINHO ROSA – nascido na cidade de Fernandópolis –
SP em 20 de fevereiro de 1985. Em 2003, ingressou no curso de Medicina
Veterinária na Faculdade de Medicina Veterinária – Universidade Estadual
Paulista (Unesp), Campus de Araçatuba. Entre junho de 2005 e maio de 2006 realizou projeto de iniciação científica no Departamento de Clínica, Cirurgia e
Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária – UNESP, Campus
de Araçatuba, sendo bolsista pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), sob orientação da Profª. Adjunto Mary Marcondes. Graduou-se como Médico Veterinário em dezembro de 2007 e em seguida participou do programa de Residência Médico-Veterinária na área de Clínica Médica, Cirurgia e Anestesiologia de Pequenos Animais, com ênfase em Clínica Médica, no período de fevereiro de 2008 a janeiro de 2010, na
Faculdade de Medicina Veterinária – UNESP, Campus de Araçatuba. Em
“Um homem que nunca muda de opinião, em vez de demonstrar a qualidade da sua opinião,
demonstra a pouca qualidade da sua mente.”
Marcel Achard
“Não há nada de nobre em sermos superiores ao próximo. A verdadeira nobreza consiste em sermos superiores ao
que éramos antes.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por guiar meus passos e iluminar meu caminho em todos os momentos de minha vida.
Aos meus pais João e Dozolina e à minha irmã Thaís, por todo amor, exemplo, apoio e confiança, não apenas durante mais essa etapa, mas durante toda a minha vida. Sem eles, eu jamais teria conseguido chegar até aqui.
À minha namorada Bianca por toda a compreensão, incentivo, companheirismo, apoio e paciência durante toda essa etapa. Uma pessoa muito especial que tem me ensinado muito ao longo desses anos de convivência, e que fez com que cada dia valesse a pena.
À minha coorientadora professora Mary Marcondes, pelos inúmeros e valiosos ensinamentos desde a iniciação científica, que fizeram com que eu me
interessasse pela pesquisa. Sou muito grato por ter me “acolhido” como
orientado no início dessa jornada, pelo apoio durante todas as etapas do mestrado, pelas inúmeras correções e discussões apesar da distância e por estar sempre presente quando alguma coisa dá errado.
À minha orientadora professora Gisele Fabrino Machado por ter me aceitado como orientado e por sua disposição para discutir os resultados e auxiliar na correção da dissertação quantas vezes fossem necessárias, mesmo estando envolvida em inúmeras bancas e atividades complementares.
Jaboticabal durante o período do mestrado.
À professora Rosemeri de Oliveira Vasconcelos pelo auxílio com as leituras das lâminas e pela enorme contribuição neste trabalho. Sou especialmente grato pela oportunidade de ter trabalhado com uma pessoa tão agradável, respeitável e coerente.
Às professoras Cáris Maroni Nunes e Daniela Bernadete Rozza pelas valiosas considerações durante o exame geral de qualificação, que em muito contribuíram para a finalização dessa dissertação.
Aos colegas de mestrado Eveline e João, e às bolsistas de iniciação científica Patrícia, Fernanda e Amanda, pela enorme colaboração e por tornarem todo nosso trabalho muito mais agradável. Vocês foram parte extremamente importante de todo o aprendizado durante esses anos. Muito obrigado!
À Pâmela pela ajuda, paciência e ensinamentos durante o processamento e leitura das lâminas de imuno-histoquímica.
Aos amigos da extinta república “Taberna”: Acácio, Alex, Caio, João e Sérgio,
pela convivência e bons momentos proporcionados. Agradeço também ao
Acácio por me “salvar” inúmeras vezes com papéis, documentos e busca de
assinatura de professores durante o período em que estive ausente.
Aos grandes amigos da república “Antro do HV” pela convivência nessa fase de
Aos queridos amigos do Serviço de Cardiologia da FCAV – Jaboticabal: Edna,
Evandro, Fábio, Fabrício, Pedro, Rafael, Roberto, Rodrigo e Tatiana pela amizade, convivência e pelos inúmeros ensinamentos.
Ao “Lori” e à “Chica”, funcionários dos serviços de patologia da FMVA e FCAV,
respectivamente, pela ajuda na confecção das lâminas de histopatologia.
Ao Breno e ao Luis Gustavo pelo auxílio com a realização dos exames complementares, e ao Guto pela paciência e ajuda na obtenção das fotomicrografias deste estudo.
Aos professores e funcionários do Hospital Veterinário da FMVA pela ajuda durante a execução do presente estudo.
À Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba – Unesp e ao programa de
Pós-graduação em Ciência Animal pela oportunidade.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de mestrado para a realização desse estudo.
1 INTRODUÇÃO...
2 REVISÃO DE LITERATURA...
3 MATERIAL E MÉTODO... 3.1 Local de realização da pesquisa... 3.2 Animais... 3.3 Exame parasitológico de linfonodo e medula óssea...
3.4 Pesquisa de anticorpos anti-Ehrlichia canis e antígenos de
Dirofilaria immitis...
3.5 Delineamento experimental... 3.6 Exame histopatológico do coração...
3.7 Técnica de imuno-histoquímica para pesquisa de Leishmania
sp... 3.8 Análise estatística...
4 RESULTADO... 4.1 Animais... 4.2 Alterações cardíacas macroscópicas... 4.3 Alterações histopatológicas do miocárdio...
4.4 Imuno-histoquímica para pesquisa de Leishmania sp...
5 DISCUSSÃO...
6 CONCLUSÃO...
LISTA DE ABREVIATURAS
AD – átrio direito
CAAF – Citologia aspirativa por agulha fina
DAB – Diaminobenzidina
DNA – ácido desoxirribonucleico
ELISA –“Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay”
FCAV – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
FMVA – Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba
HE – Hematoxilina e eosina
Kg – quilogramas
LV – Leishmaniose Visceral
mg – miligramas
MIF – Fator inibidor de macrófagos
Máx - Máximo Mín - Mínimo mL – mililitros
mM - Milimolar
PBS – Tampão fosfato salino
PCR – Reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
SAS –“Statistical Analysis System”
SIV – Septo interventricular
Th – linfócitos T auxiliares
TM – Tricrômico de Masson
TGF – Fator de transformação de crescimento
TNF – Fator de necrose tumoral
UNESP – Universidade Estadual Paulista
VD – Ventrículo direito
Tabela 1 - Distribuição quanto ao sexo, raça, faixa etária e peso de
30 cães naturalmente infectados por Leishmania sp.
Número absoluto e percentagem. (Araçatuba-SP, 2012)...
Tabela 2 - Intensidades de infiltrado inflamatório, necrose, granuloma e aumento de fibras colágenas observadas na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. Número absoluto e percentagem de animais. (Araçatuba-SP, 2012)...
Tabela 3 - Valores mínimo, máximo e mediana do número de
células parasitadas por Leishmania sp. na parede livre
de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2012)...
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Fotomicrografia de exame parasitológico direto por citologia aspirativa com agulha fina (CAAF) de medula óssea de cão proveniente de área endêmica para leishmaniose visceral, evidenciando a presença de
formas amastigotas de Leishmania sp. (setas). Panótico
Rápido®. Obj. 100x. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 2 - Imagens de algumas das principais alterações observadas ao exame físico geral dos 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (a) Animal com caquexia, onicogrifose (seta), blefarite, rarefação pilosa periocular, em pavilhão auricular e em plano nasal; (b) cão com onicogrifose (seta) e úlceras em região interdigital e face dorsal de membro torácico direito (cabeça de seta); (c) cão com secreção ocular mucopurulenta e deposição de crostas melicéricas (seta larga) em região periocular; (d) animal com úlceras e crostas hemorrágicas em pavilhões auriculares, áreas de alopecia e descamação cutânea evidente em região cefálica. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 3 - Percentagem das principais alterações clínicas observadas em 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 4 - Alterações cardíacas macroscópicas observadas em 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (a) dilatação ventricular direita (VD); (b) dilatação ventricular direita e hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo (VE); (c) presença de sufusões na superfície endocárdica dos ventrículos direito e esquerdo (setas). (Araçatuba – SP, 2012)...
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inflamatório de intensidade acentuada, nas objetivas de 10x (a) e 40x (b), com predomínio de linfócitos e macrófagos (detalhe). Observar a presença de infiltração
gordurosa (). Hematoxilina e eosina. (Araçatuba-SP,
2012)...
FIGURA 6 - Representação gráfica das intensidades de infiltrado inflamatório observadas no átrio direito (AD), ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e ventrículo esquerdo (VE) de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, expressas em percentagem. 0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 7 - Fotomicrografias de septo interventricular de cão naturalmente acometido por LV, evidenciando a
presença de granuloma do tipo lepromatoso (), nas
objetivas de 10x (a) e 40x (b), com predomínio de linfócitos e macrófagos (detalhe). Hematoxilina e eosina. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 8 -Fotomicrografias do miocárdio de cães naturalmente acometidos por LV. (a) Em ventrículo direito observa-se a ocorrência de necrose coagulativa de cardiomiócitos (setas) caracterizada por eosinofilia, perda das estriações transversais citoplasmáticas e presença de núcleos picnóticos. (b) Em átrio direito observa-se a presença de necrose em bandas de contração. Observar a presença de faixas transversais intensamente eosinofílicas no citoplasma (setas). Hematoxilina e eosina. Obj. 40x. (Araçatuba-SP, 2012)...
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FIGURA 9 - Representação gráfica das intensidades de necrose observadas no átrio direito (AD), ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e ventrículo esquerdo (VE) de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, expressas em percentagem. 0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 10 - Fotomicrografias de átrio direito de cão naturalmente acometido por LV. (a) Presença de necrose fibrinóide
() em artéria de pequeno calibre localizada na região
subepicárdica. Observar também a presença de infiltração gordurosa (setas). No detalhe, verificar a presença de debris celulares (seta larga). Obj.10x. (b) Notar a presença de hipertrofia da parede arterial, com
proliferação da camada íntima (), e presença de
alteração granular e eosinofílica (necrose) da parede vascular (seta). Obj. 40x. Hematoxilina e eosina. (Araçatuba-SP, 2012)...
FIGURA 11 - Fotomicrografias de átrio direito de cão naturalmente acometido por LV, evidenciando a ocorrência de aumento do colágeno intersticial (setas) associado à
presença de infiltrado () de células inflamatórias
(detalhe) e fragmentação de fibras musculares cardíacas, nas objetivas de 10x (a) e 20x (b).
Tricrômico de Masson. (Araçatuba – SP, 2012)...
FIGURA 12 - Fotomicrografias de coração de cães naturalmente acometidos por LV. (a) Fragmento de átrio direito, no qual observam-se formas amastigotas do parasita (setas), associadas a foco de infiltrado de células inflamatórias. Obj. 40x. (b) Fragmento de ventrículo direito, no qual observa-se a presença do parasita (seta) no interior de macrófagos (detalhe). Obj. 100x (em imersão). Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase. (Araçatuba-SP, 2012)...
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Apêndice A - Modelo de ficha de exame físico geral utilizada para avaliação clínica dos 30 cães com leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2012)...
Apêndice B - Intensidades de infiltrado inflamatório observadas na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada). (Araçatuba – SP, 2012)...
Apêndice C - Intensidades de necrose observadas na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada). (Araçatuba – SP, 2012)...
ApêndiceD - Intensidades de granulomas presentes na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada). (Araçatuba – SP, 2012)...
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Apêndice E - Intensidades de aumento do tecido conjuntivo observadas na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada). (Araçatuba – SP, 2012)...
Apêndice F - Resultados obtidos pela avaliação
imuno-histoquímica para detecção de Leishmania sp. no
coração de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE), apresentados na forma de número de macrófagos parasitados em 50 campos aleatórios, com objetiva de 40x. (Araçatuba – SP, 2012)...
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AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO MIOCÁRDIO DE CÃES COM LEISHMANIOSE VISCERAL
RESUMO - O acometimento cardíaco é raro em pacientes com leishmaniose visceral (LV). Porém, existem relatos demonstrando graus variáveis de comprometimento desse órgão em cães e seres humanos acometidos. O presente estudo teve por objetivos avaliar a ocorrência de alterações
histopatológicas e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (átrio direito,
ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo) de 30 cães naturalmente infectados. As principais alterações macroscópicas observadas foram dilatação ventricular direita em 53,3% (16/30) dos animais e hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo em 20% (6/30). Reação inflamatória caracterizada pela presença de infiltrado linfoplasmocitário em graus variados de intensidade foi observada em 90% (27/30) dos cães, necrose coagulativa de cardiomiócitos ou em bandas de contração em 80% (24/30), aumento de colágeno intersticial em 73,3% (22/30), granuloma em 23,3% (7/30), infiltração
gordurosa em 16,7% (5/30) e necrose fibrinóide em 10% (3/30) dos cães. A
presença de formas amastigotas no tecido cardíaco foi identificada por imuno-histoquímica em 66,7% (20/30) dos animais. Apesar da elevada prevalência de alterações histopatológicas e da presença de formas amastigotas de
Leishmania sp. no miocárdio, tais alterações foram discretas e insuficientes
para produzir manifestações clínicas nos cães com LV. Como os animais do presente estudo foram submetidos a eutanásia, permanece incerto se o envolvimento cardíaco teria sido mais severo se a doença tivesse seguido seu curso natural.
HISTOPATHOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL EVALUATION OF THE MYOCARDIUM FROM DOGS WITH VISCERAL LEISHMANIASIS
SUMMARY – Cardiac involvement is rare in patients with visceral leishmaniasis, however some studies have shown several degrees of heart impairment in dogs as well as in human beings. The present study aimed to evaluate the occurrence of histopathological lesions and the presence of
Leishmania sp. in the myocardium (right atrium, right ventricle, interventricular
septum and left ventricle) of 30 naturally infected dogs. The most frequent
macroscopic findings were right ventricular enlargment in 53.3% (16/30) and
concentric left ventricular hypertrophy in 20% (6/30) of the dogs. Inflammatory reaction characterized by the presence of lymphocytic infiltrate in different degrees of intensity was observed in 90% (27/30), coagulative necrosis of cardiomyocytes or contraction bands necrosis in 80% (24/30), increased interstitial collagen in 73.3% (22/30), lepromatous granuloma in 23.3% (7/30),
fat infiltration in 16.7% (5/30) and fibrinoid necrosis in 10% (3/30) of the dogs.
The presence of amastigotes in the cardiac tissue was identified by
immunohistochemistry in 66.7% (20/30) of the dogs. Despite the high
prevalence of histopathological changes and the presence of amastigotes of
Leishmania sp. in the myocardium, such changes were mild and insufficient to
produce clinical signs in dogs with VL. Since the animals used in this study
were euthanized, it remains unclear whether cardiac involvement would have been more severe if disease had followed its natural course.
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose causada por protozoários
do gênero Leishmania que infectam o cão e uma ampla variedade de
vertebrados, incluindo o homem. Na espécie canina os mecanismos imunológicos ativados diante da infecção pelo parasita são essenciais para determinar a evolução da enfermidade, bem como sua manifestação clínica. Enquanto muitos cães podem se manter assintomáticos, uma parcela dos animais acometidos desenvolve sinais de comprometimento de vários órgãos.
Embora o envolvimento cardíaco seja considerado raro em pacientes com LV, existem relatos demonstrando graus variáveis de comprometimento desse órgão em cães e seres humanos acometidos. No entanto, a prevalência de desordens cardíacas nesses indivíduos, sua caracterização e etiopatogenia permanecem desconhecidas.
Tendo em vista os crescentes paradigmas éticos em que se encontra o meio científico, a busca por modelos animais tornou-se essencial. Diante da
infecção por Leishmania infantum (syn. chagasi), os cães desenvolvem
manifestações clínicas que em muito se assemelham às dos seres humanos acometidos. Dessa forma, a espécie canina consiste em excelente modelo para a pesquisa e caracterização do envolvimento cardíaco na LV.
Diante desses aspectos, o presente estudo teve por objetivos avaliar a
ocorrência de alterações histopatológicas e a presença de Leishmania sp. no
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2 REVISÃO DE LITERATURA
A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como Calazar, é uma
zoonose causada por protozoários da ordem Kinetoplastida, família
Trypanosomatidae e do gênero Leishmania, que infectam o cão e uma ampla
variedade de vertebrados, incluindo o homem, com larga distribuição nas regiões tropicais e subtropicais (BANETH et al., 2008; KONTOS; KOUTINAS,
1993). A Leishmania chagasi, principal agente etiológico da LV na América do
Sul, é um protozoário pertencente ao complexo Leishmania donovani, no qual
estão incluídas as três principais espécies causadoras da leishmaniose
visceral, L. chagasi, L. infantum, L. donovani (BADARO, 1996; SHERLOCK,
1996). Acredita-se que os protozoários das espécies L. chagasi e L. infantum
sejam geneticamente idênticos, razão pela qual podem ser referidos como
membros de uma mesma espécie e denominadas Leishmania infantum (syn.
chagasi) (BANETH et al., 2008).
Estima-se que a incidência anual de LV em seres humanos seja próxima a 500.000 casos (DESJEUX, 2004). Apenas no Brasil aproximadamente 3.500 casos de LV são relatados anualmente, dos quais estimam-se que cerca de 10% venham a óbito (DANTAS-TORRES, 2009). A LV canina foi previamente descrita em por quase toda a América do Sul, com exceção do Chile, Uruguai, Suriname e Guiana. Nos últimos anos, houve uma notável expansão da enfermidade nesse continente, e casos de LV passaram e ser descritos em áreas que até então eram consideradas livres da doença (KRAUSPENHAR et al., 2007; SALOMON et al., 2008).
Os vetores implicados na transmissão das leishmanioses são insetos denominados flebotomíneos. A espécie de maior importância nas Américas é a
Lutzomyia longipalpis, conhecida popularmente no Brasil como mosquito-palha,
parasita na pele promove uma resposta inflamatória local, levando à sua fagocitose por células do sistema fagocítico mononuclear, principalmente macrófagos. No interior dos macrófagos, as formas promastigotas perdem o flagelo, diferenciando-se em amastigotas, que se multiplicam por sucessivas divisões binárias. As células densamente parasitadas rompem-se, liberando as formas amastigotas, que serão fagocitadas por novos macrófagos. Ocorre, assim, a disseminação hematogênica e linfática do parasita. A infecção do vetor ocorre quando as fêmeas, durante o repasto sanguíneo em mamífero infectado, ingerem macrófagos parasitados (MICHALICK; GENARO, 2007).
Os cães são considerados os principais reservatórios domésticos e apresentam grande importância na manutenção do ciclo da doença, constituindo-se no principal elo na cadeia de transmissão da leishmaniose
visceral (DANTAS-TORRES, 2009).
Os sinais clínicos da leishmaniose visceral canina variam em decorrência dos mecanismos imunológicos ativados pelo hospedeiro, bem como dos órgãos acometidos, o que dificulta, muitas vezes, o diagnóstico clínico da doença. Geralmente animais infectados apresentam emagrecimento progressivo, atrofia muscular, anemia, linfoadenomegalia, hepatoesplenomegalia e lesões cutâneas. São frequentes as lesões renais e oftálmicas, no entanto, cães acometidos podem também apresentar alterações digestórias, locomotoras e neurológicas (BANETH; SOLANO-GALLEGO, 2012; BANETH et al., 2008; FEITOSA et al., 2000; MELO et al., 2009).
20
No ano de 1976, Ajello e Catarsini relataram um caso de LV em um cão que apresentava lesões granulomatosas palpáveis em vários músculos. Apesar de o animal se apresentar assintomático quanto ao comprometimento cardíaco, o estudo de necropsia revelou a presença de uma formação nodular na parede ventricular esquerdo. Finalmente, o estudo histopatológico de tecido muscular esquelético e cardíaco mostrou a presença de infiltrado inflamatório mononuclear, com a presença de reação granulomatosa e formas amastigotas de Leishmania sp. (AJELLO; CATARSINI, 1976).
Ao avaliarem corações de 16 seres humanos com LV, Morais et al. (1988) verificaram alterações histopatológicas que se caracterizaram pela presença de edema intersticial associado à infiltração focal de células inflamatórias e discreto foco de necrose de cardiomiócitos, porém sem a presença de formas amastigotas do parasita. O comprometimento cardíaco foi
pouco intenso, o que levou os autores a utilizarem o termo “miocárdio
reacional”.
Font et al. (1993) descreveram um paciente canino com pericardite e tamponamento cardíaco, em que a avaliação citológica do líquido pericárdico
identificou a presença de formas amastigotas de Leishmania sp.
Posteriormente, Torrent et al. (2005) relataram a ocorrência de comprometimento miocárdico em um cão adulto com leishmaniose visceral, sem sinais clínicos de envolvimento cardíaco. O cão foi submetido à eutanásia e por meio do exame histopatológico evidenciou-se miocardite severa, caracterizada por intensa infiltração inflamatória linfoplasmocitária, hemorragias focais e miocardite não-supurativa acentuada, principalmente em átrio direito, além de vasculite necrotisante generalizada. As alterações foram tão intensas que puderam ser visíveis macroscopicamente. Além de terem sido bem mais severas quando comparadas às alterações cardíacas observadas por Morais et. al (1988), o estudo permitiu identificar a presença do parasita no miocárdio atrial pela técnica de PCR (TORRENT et al., 2005).
linfo-histioplasmocitária, degeneração e necrose das fibras miocárdicas, acompanhada por imunomarcação antigênica para formas amastigotas de
Leishmania sp. Apesar das alterações histopatológicas e imuno-histoquímicas,
o paciente não apresentou sintomas de comprometimento da função cardíaca (FERRARI et al., 2006).
O acometimento cardíaco de outro cão assintomático com LV foi descrito por López-Peña et al. (2009). Embora o mesmo apresentasse edema de membros e face, os autores atribuíram tais alterações à hipoalbuminemia secundária à glomerulonefrite membranoproliferativa. Mesmo sem manifestar alterações clínicas de comprometimento cardíaco, foram observadas áreas pálidas no miocárdio associadas à presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário severo e, ocasionalmente, à degeneração e perda de cardiomiócitos. Apesar da ocorrência de alterações histopatológicas importantes no miocárdio, o número de macrófagos parasitados observados no coração foi muito baixo (LÓPEZ-PEÑA et al., 2009).
Em estudo recente que avaliou a ocorrência de alterações cardíacas em
22 cães naturalmente infectados por L. chagasi provenientes de área endêmica
para LV situada na região Nordeste do Brasil, os autores observaram a ocorrência de infiltrado linfoplasmocitário perivascular e intermuscular, em intensidade leve a moderada. Em alguns casos, também foram observadas a presença de infiltração gordurosa, necrose de cardiomiócitos e fragmentação de fibras musculares. Entretanto, pela técnica de imuno-histoquímica identificou-se a presença do parasita no miocárdio de apenas 8,3% (1/12) dos cães avaliados (ALVES et al., 2010).
Na tentativa de elucidar a etiopatogenia das alterações cardíacas
decorrentes da infecção por Leishmania sp., a presença do parasita no coração
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ZABALA et al., 2005). Ainda, estudos que pesquisaram a presença do parasita pela técnica de imuno-histoquímica em um maior número de pacientes naturalmente acometidos por LV, não identificaram o mesmo (MORAIS et al., 1988), ou o fizeram em um baixo número de animais (ALVES et al., 2010). Portanto, ainda não está claro se a fisiopatogenia da lesão cardiovascular é por ação direta do parasita, por um mecanismo imunomediado, ou se representa uma reatividade inespecífica do miocárdio. Além do mais, a prevalência e caracterização das desordens cardíacas presentes nos animais infectados permanecem desconhecidas.
A doença de Chagas é uma enfermidade parasitária causada pelo
Trypanosoma cruzi, agente etiológico que também pertence à família
Trypanosomatidae. Vinte e cinco a 30% dos seres humanos infectados
desenvolvem cardiomiopatia de cinco a 30 anos após a infecção primária. Embora a etiopatogenia da cardiomiopatia chagásica não seja completamente conhecida, acredita-se que a mesma seja multifatorial (DE SOUZA et al.,
2004). A persistência do T. cruzi (TARLETON, 2001; TARLETON, 2003;
ZHANG; TARLETON, 1999), ocorrência de dano imunomediado (CUNHA-NETO et al., 1996; ENGMAN; LEON, 2002; LEON et al., 2001; PONTES-DE-CARVALHO et al., 2001) e presença de alterações microvasculares (ROSSI, 1990; ROSSI et al., 2003) têm sido propostas como as principais causas do dano cardíaco.
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 Local de realização da pesquisa
Patologia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
O estudo esteve de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FMVA, UNESP, Campus de Araçatuba, de acordo com o Processo 02447/2011.
3.2 Animais
Foram utilizados 30 cães com idade superior a seis meses, independente do sexo e da raça, naturalmente acometidos por LV, encaminhados ao Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da
Universidade Estadual Paulista – UNESP – Câmpus de Araçatuba, no período
de março de 2010 a agosto de 2011. Todos os cães eram provenientes do
município de Araçatuba – SP, área endêmica para a LV e não-endêmica para
Doença de Chagas (CVE, 2005; UMEZAWA et al., 2009). O diagnóstico de LV foi fundamentado nos resultados de exame parasitológico direto, realizado a partir de citologia aspirativa de linfonodos e/ou medula óssea. Cães com diagnóstico pregresso de cardiopatias, presença de anticorpos séricos
anti-Ehrlichia canis ou antígenos séricos de Dirofilaria immitis foram excluídos do
estudo.
3.3 Exame parasitológico de linfonodo e medula óssea
O diagnóstico de LV foi fundamentado nos exames de citologia aspirativa por agulha fina (CAAF) de linfonodo e/ou medula óssea, para
pesquisa de formas amastigotas de Leishmania sp. Os esfregaços foram
24
corante Panótico Rápido® (Laborclin, São Paulo, Brasil) e observados ao
microscópio óptico, em imersão, com objetiva de 100x.
3.4 Pesquisa de anticorpos anti-Ehrlichia canis e antígenos de Dirofilaria immitis.
A presença de anticorpos anti-Ehrlichia canis e antígenos de Dirofilaria
immitis no soro dos animais foi pesquisada pela técnica de ELISA, utilizando-se
o kit SNAP® 4DX® test (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, USA), de
acordo com as instruções do fabricante.
3.5 Delineamento experimental
Os animais foram submetidos a exame físico geral de acordo com Feitosa (2008), seguido de exame físico específico do sistema cardiovascular segundo Camacho e Mucha (2008), e os dados obtidos foram tabulados em fichas desenvolvidas para esse propósito (Apêndice A).
Com o consentimento esclarecido de seus proprietários, os cães foram tranquilizados com acepromazina na dose de 0,05 mg/kg, pela via intramuscular. Decorridos 15 minutos, os animais foram anestesiados com tiopental sódico na dose de 25 mg/kg, pela via intravenosa, e submetidos à eutanásia com uma ampola de 10mL de cloreto de potássio, de acordo com o Decreto n°. 51.838 do Ministério da Saúde do Brasil, de 14 de março de 1963, o qual estabelece que animais domésticos portadores de leishmaniose devem ser submetidos à eutanásia. O método empregado baseou-se nas recomendações da Resolução nº. 714, de 20 de junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária.
Em seguida, os cães foram submetidos a exame de necropsia pela técnica empregada rotineiramente no Serviço de Patologia da Faculdade de
do cadáver, evisceração e exame detalhado das alterações macroscópicas presentes nos órgãos, dando-se especial atenção ao coração.
Para o exame interno do coração foi realizada uma incisão única no sentido transversal do órgão realizada aproximadamente na altura das cordoalhas tendíneas das válvulas atrioventriculares, obtendo assim o acesso ao endocárdio dos ventrículos direito e esquerdo. Foram colhidos fragmentos das seguintes regiões do coração: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV). A fim de melhor avaliar as características das fibras musculares cardíacas, todos os fragmentos coletados foram cortados de forma longitudinal e transversal ao sentido das fibras. Os fragmentos foram fixados em formol a 10% tamponado com fosfatos, pH 7,6. Após fixação durante 24 horas, os fragmentos foram desidratados em soluções de concentrações decrescentes de álcool, diafinizados em xilol e incluídos em parafina, para posterior realização das técnicas de histopatologia e imuno-histoquímica.
3.6 Exame histopatológico do coração
Cortes histológicos de miocárdio de 5m de espessura foram corados
com hematoxilina e eosina (HE) e Tricrômico de Masson (TM) (BEHMER et al., 1976), e analisados em microscopia óptica com objetivas de 4x, 10x e 40x, em toda a sua extensão.
Nos cortes histológicos corados por HE, avaliaram-se os aspectos morfológicos do tecido cardíaco, dando-se atenção especial às alterações tais como diferenças no tamanho e na forma das fibras, presença de fibras degeneradas, presença de infiltrado inflamatório e fibrose endomisial. Para avaliar a matriz de colágeno os cortes histológicos foram avaliados pela coloração TM, pesquisando-se a presença de fibrose miocárdica.
26
intersticiais foram graduados em escores que variaram de 0 a 3, sendo 0 para a ausência de lesões, 1 para a presença de lesões discretas (pequenos focos nas áreas estudadas), 2 para a presença de lesões moderadas (lesões maiores, multifocais ou focalmente extensas) e, finalmente, 3 para as lesões acentuadas (envolvendo grande parte das áreas avaliadas, muitas vezes com coalescência entre elas).
3.7 Técnica de Imuno-histoquímica para pesquisa de Leishmania sp.
Para a pesquisa de formas amastigotas de Leishmania sp. no tecido
cardíaco foi utilizado o método descrito por Tafuri et al. (2004) modificado (MOREIRA et al., 2010). Os cortes histológicos foram mantidos em estufa a 60ºC durante uma hora, posteriormente desparafinados em xilol e hidratados em soluções com concentrações decrescentes de álcool. Entre cada uma das etapas descritas a seguir os cortes foram submetidos à lavagem com água destilada e solução tampão fosfato (PBS), pH 7,6. A recuperação antigênica foi realizada sob calor úmido e pressão em câmara de pressão para recuperação antigênica Pascal (DAKO) com solução tampão citrato de sódio (10mM, pH 6,0), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Os cortes histológicos foram incubados em solução de álcool metílico e peróxido de hidrogênio (30 volumes) a 8%, durante 20 minutos à temperatura ambiente e em câmara escura, para bloqueio da peroxidase endógena. Em seguida foi adicionado
“Protein Block®” (DAKO, cód. X0909) e os cortes foram incubados por 20
minutos em câmara úmida à temperatura ambiente, para bloqueio das proteínas inespecíficas. Soro de cão positivo para LV, proveniente de
Araçatuba – SP, área endêmica para a enfermidade, foi usado na diluição de
1:1000, como fonte de anticorpo primário, com 18 horas de incubação a 4ºC, em câmara úmida. Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com
anticorpo secundário biotinalado (Kit LSAB® DAKO, cód. K0690-1) durante 30
PBS, os cortes foram incubados com o substrato Estreptavidina Peroxidase (Kit
LSAB® DAKO, cód. K0690-1) por 30 minutos, à temperatura ambiente, e na
sequência foram revelados com o cromógeno diaminobenzidina (DAB, DAKO, cód. S-3022-2) por três minutos, à temperatura ambiente e em câmara úmida. Em seguida foram lavados em água destilada e contra-corados com Hematoxilina de Harris, por 2 minutos. Em seguida, os cortes histológicos foram lavados em água corrente, desidratados em soluções de concentrações crescentes de álcool e banhados em xilol, para finalmente serem montados
com Entellan® (MERCK, cód. HX888585).
Como controle positivo da reação utilizaram-se fragmentos de baço e linfonodos de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, enquanto o controle negativo foi feito a partir da adição de PBS em substituição ao anticorpo primário. As células marcadas foram contadas utilizando-se objetiva de 40x (resolução final de 400x), em 50 campos aleatórios para cada área do coração estudada.
3.8 Análise estatística
As intensidades de ocorrência de infiltrado inflamatório, granuloma, necrose de cardiomiócitos, aumento de fibras colágenas intersticiais e o
número de células parasitadas por formas amastigotas de Leishmania sp.
foram submetidos ao teste de Spearman para avaliar possíveis correlações. Em seguida, as mesmas variáveis foram avaliadas pelo teste de Friedman para verificar se houve diferença entre a gravidade das lesões nas diferentes regiões cardíacas estudadas (VE, VD, SIV e AD).
As análises foram realizadas utilizando-se o programa computacional
“Statistical Analysis System” (SAS 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA), e os
28
4 RESULTADO
4.1 Animais
Foram avaliados 67 cães naturalmente acometidos por LV, com diagnóstico firmado por exame parasitológico direto de linfonodo e/ou medula óssea (Figura 1). Após a realização de exame sorológico para pesquisa de
anticorpos anti-Ehrlichia canis e antígenos de Dirofilaria immitis, 37 animais
foram excluídos do experimento, por apresentarem anticorpos séricos
anti-Ehrlichia canis.
FIGURA 1 - Fotomicrografia de exame parasitológico direto por citologia aspirativa com agulha fina (CAAF) de medula óssea de cão proveniente de área endêmica para leishmaniose visceral, evidenciando a presença de formas amastigotas de Leishmania sp. (setas). Panótico Rápido®. Obj.
Os 30 cães selecionados possuíam idade entre seis meses e 12 anos (média e mediana de três anos) e peso entre três e 30 quilos (média de nove quilos), sendo 56,7% (17/30) fêmeas e 43,3% (13/30) machos. Quatro cães eram da raça Poodle, dois da raça Pitbull, dois da raça Teckel e os outros 22 não possuíam raça definida. As principais características da população avaliada encontram-se na Tabela 1.
Todos os animais apresentavam sintomas da doença, tais como onicogrifose, perda de peso, linfoadenomegalia, palidez de mucosas, presença de lesões cutâneas e alterações oftálmicas (Figura 2). No entanto, nenhum animal apresentava alterações clínicas que pudessem sugerir comprometimento cardíaco, tais como cansaço fácil, tosse, dispnéia, síncope, edema de membros, ascite, pulso jugular patológico, arritmias ou sopro cardíaco. As principais alterações clínicas observadas nos cães avaliados e suas respectivas percentagens estão apresentadas na Figura 3.
Tabela 1 - Distribuição quanto ao sexo, raça, faixa etária e peso de 30 cães
naturalmente infectados por Leishmania sp. Número absoluto e
percentagem. (Araçatuba-SP, 2012)
Variável Categoria Número Percentagem
Sexo Fêmea Macho 17 13 56,7% 43,3%
Raça
Sem raça definida Poodle Pitbull Teckel 22 4 2 2 73,3% 13,3% 6,7% 6,7% Faixa etária
6 meses a 1 ano 1 a 3 anos 3 a 6 anos > 6 anos
3 20 5 2 10,0% 66,7% 16,7% 6,7% Peso
< 10 Kg 10 a 20 Kg
> 20 Kg
30
FIGURA 2 - Imagens de algumas das principais alterações observadas ao exame físico geral dos 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (a) Animal com caquexia, onicogrifose (seta), blefarite, rarefação pilosa periocular, em pavilhão auricular e em plano nasal; (b) cão com onicogrifose (seta) e úlceras em região interdigital e face dorsal de membro torácico direito (cabeça de seta); (c) cão com secreção ocular mucopurulenta e deposição de crostas melicéricas (seta larga) em região periocular; (d) animal com úlceras e crostas hemorrágicas em pavilhões auriculares, áreas de alopecia e descamação cutânea evidente em região cefálica. (Araçatuba-SP, 2012).
a
b
FIGURA 3 - Percentagem das principais alterações clínicas observadas em 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2012).
4.2 Alterações cardíacas macroscópicas
As alterações macroscópicas do coração caracterizaram-se por dilatação ventricular direita, observada em 53,3% (16/30) dos cães, hipertrofia ventricular esquerda do tipo concêntrica em 20% (6/30), presença de áreas pálidas na superfície epicárdica em 10% (3/30) e presença de sufusões no endocárdio dos ventrículos esquerdo e direito em 3,3% (1/30) dos animais (Figura 4).
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0% Atrofia musc. temporal
Secreção nasal Desidratação Palidez de mucosas
Secreção ocular Lesões cutâneas Linfadenomegalia Emagrecimento Onicogrifose
10,0% 16,7%
36,7% 36,7%
63,3% 70,0%
73,3% 73,3%
80,0%
32
FIGURA 4 - Alterações cardíacas macroscópicas observadas em 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (a) dilatação ventricular direita (VD); (b) dilatação ventricular direita e hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo (VE); (c) presença de sufusões na superfície endocárdica dos ventrículos direito e
esquerdo (setas). Araçatuba – SP, 2012.
4.3 Alterações histopatológicas do miocárdio
Foram avaliados quatro fragmentos (AD, VD, SIV e VE) do miocárdio de cada animal, totalizando 120 cortes histológicos. As alterações observadas em cada região estudada e as respectivas percentagens encontram-se apresentadas na Tabela 2. Os resultados individuais das intensidades de infiltrado inflamatório, granuloma, necrose de cardiomiócitos e aumento de fibras colágenas observados nas quatro áreas do coração são apresentados nos Apêndices B a E.
a
c
b
VD
VD
VE
VD
Tabela 2 – Intensidades de infiltrado inflamatório, necrose, granuloma e
aumento de fibras colágenas observadas na parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. Número absoluto e percentagem de animais. (Araçatuba-SP, 2012)
Variável Categoria N AD % N VD % N SIV % N VE %
Infiltrado Inflamatório
0 4 13,3 8 26,7 7 23,3 8 26,7
1 14 46,7 19 63,3 20 66,7 21 70,0
2 8 26,7 3 10,0 3 10,0 1 3,3
3 4 13,3 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Necrose
0 14 46,7 11 36,7 18 60,0 22 73,3
1 7 23,3 13 43,3 11 36,7 7 23,3
2 8 26,7 5 16,7 1 3,3 1 3,3
3 1 3,3 1 3,3 0 0,0 0 0,0
Granuloma
0 27 90,0 28 93,3 27 90,0 27 90,0
1 3 10,0 1 3,3 3 10,0 3 10,0
2 0 0,0 1 3,3 0 0,0 0 0,0
Tecido Conjuntivo
0 9 30,0 19 63,3 20 66,7 22 73,3
1 8 26,7 10 33,3 10 33,3 7 23,3
2 13 43,3 1 3,3 0 0,0 1 3,3
(0) = ausente, (1) = discreta, (2) = moderada, (3) = acentuada.
Reação inflamatória caracterizada por infiltrado do tipo linfoplasmocitário foi observada em 90% (27/30) dos cães, com um perfil celular predominante de linfócitos, seguidos por plasmócitos, e com a presença de poucos macrófagos em algumas das áreas avaliadas (Figura 5). Quando presentes no tecido cardíaco, as células inflamatórias apresentaram-se em intensidade discreta em 61,7% (74/120), moderada em 12,5% (15/120) e acentuada em 3,3% (4/120) dos fragmentos avaliados (Figura 6).
34
predominante, com raras exceções em áreas nas quais essas células se apresentavam de maneira focal, focalmente extensa ou difusa no tecido cardíaco. A região de AD foi a que apresentou infiltrado inflamatório em maior intensidade, porém essa diferença foi significativa apenas quando comparado ao VE (p=0,031).
Foram observados granulomas com características do tipo lepromatoso (Figura 7) no coração de 23,3% (7/30) dos cães avaliados. Os granulomas eram compostos predominantemente por macrófagos e alguns linfócitos, sem predileção por nenhuma das áreas estudadas (p=0,100), no entanto sua ocorrência estava correlacionada com a presença de células parasitadas por
Leishmania sp no AD (p=0,046) e SIV (p=0,022).
FIGURA 5- Fotomicrografias de átrio direito de cão naturalmente acometido por LV, mostrando a presença de infiltrado inflamatório de intensidade acentuada, nas objetivas de 10x (a) e 40x (b), com predomínio de linfócitos e macrófagos (detalhe). Observar a presença de
infiltração gordurosa (). Hematoxilina e
eosina. (Araçatuba-SP, 2012).
a
36
FIGURA 6 - Representação gráfica das intensidades de infiltrado inflamatório observadas no átrio direito (AD), ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e ventrículo esquerdo (VE) de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, expressas em percentagem. 0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada. (Araçatuba-SP, 2012).
A ocorrência de infiltração gordurosa no miocárdio foi observada em 16,7% (5/30) dos cães, apenas em AD ou VD. Verificou-se a presença de necrose fibrinóide em pequenas artérias do coração de 10% (3/30) dos cães (Figura 10). Por meio da avaliação dos prontuários desses três animais que apresentaram esse padrão de necrose na parede vascular, foi possível constatar que todos apresentavam azotemia e síndrome urêmico, e um deles possuía hipertensão arterial sistêmica. A avaliação histopatológica dos rins dos três cães identificou a presença de glomerulonefrite. Por fim, a ocorrência de vasculite esteve presente em apenas 3,3% (1/30).
13,3% 46,7% 26,7% 13,3% 0% 20% 40% 60% 80% 100%
0 1 2 3
Infiltrado inflamatório
AD
26,7% 63,3% 10,0% 0,0% 0% 20% 40% 60% 80% 100%0 1 2 3
Infiltrado inflamatório
VD
23,3% 66,7% 10,0% 0,0% 0% 20% 40% 60% 80% 100%0 1 2 3
Infiltrado inflamatório
SIV
26,7% 70,0% 3,3% 0,0% 0% 20% 40% 60% 80% 100%0 1 2 3
FIGURA 7 - Fotomicrografias de septo interventricular de cão naturalmente acometido por LV, evidenciando a presença de granuloma do
tipo lepromatoso (), nas objetivas de 10x
(a) e 40x (b), com predomínio de linfócitos e macrófagos (detalhe). Hematoxilina e eosina. (Araçatuba-SP, 2012).
a
38
FIGURA 8 - Fotomicrografias do miocárdio de cães
naturalmente acometidos por LV. (a) Em ventrículo direito observa-se a ocorrência de necrose coagulativa de cardiomiócitos (setas) caracterizada por eosinofilia, perda
das estriações transversais citoplasmáticas e presença de núcleos
picnóticos. (b) Em átrio direito observa-se a presença de necrose em bandas de contração. Observar a presença de faixas transversais intensamente eosinofílicas no citoplasma (setas). Hematoxilina e eosina. Obj. 40x. (Araçatuba-SP, 2012).
a
FIGURA 9 - Representação gráfica das intensidades de necrose observadas no átrio direito (AD), ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e ventrículo esquerdo (VE) de cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral, expressas em percentagem. 0 = ausente, 1 = discreta, 2 = moderada, 3 = acentuada. (Araçatuba-SP, 2012).
A ocorrência de aumento de colágeno intersticial (Figura 11), caracterizado por fibras colágenas jovens e maduras, associadas a graus variáveis de fragmentação de fibras musculares cardíacas, foi observada em 73,3% (22/30) dos cães, sendo mais severa em AD quando comparada às demais áreas estudadas (p=0,0008). Entretanto, essa alteração esteve presente apenas em intensidade discreta em 29,2% (35/120) dos fragmentos, e moderada em 12,5% (15/120), enquanto a ocorrência de áreas de intensa substituição por tecido fibroso não foi observada.
47%
23% 27%
3% 0% 20% 40% 60% 80% 100%
0 1 2 3
Necrose - AD
37% 43%
17% 3% 0% 20% 40% 60% 80% 100%
0 1 2 3
Necrose - VD
60%
37%
3% 0%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
0 1 2 3
Necrose - SIV
73%
23%
3% 0%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
0 1 2 3
40
FIGURA 10 - Fotomicrografias de átrio direito de cão naturalmente acometido por LV. (a)
Presença de necrose fibrinóide () em
artéria de pequeno calibre localizada na região subepicárdica. Observar também a presença de infiltração gordurosa (setas). No detalhe, verificar a presença de debris celulares (seta larga). Obj.10x. (b) Notar a presença de hipertrofia da parede arterial,
com proliferação da camada íntima (), e
presença de alteração granular e eosinofílica (necrose) da parede vascular (seta). Obj. 40x. Hematoxilina e eosina. (Araçatuba-SP, 2012).
a
b
FIGURA 11 - Fotomicrografias de átrio direito de cão naturalmente acometido por LV, evidenciando a ocorrência de aumento do colágeno intersticial (setas) associado
à presença de infiltrado () de células
inflamatórias (detalhe) e fragmentação de fibras musculares cardíacas, nas objetivas de 10x (a) e 20x (b). Tricrômico
de Masson. (Araçatuba – SP, 2012).
a
b
42
4.4 Imuno-histoquímica para pesquisa de Leishmania sp
Formas amastigotas de Leishmania sp. foram observadas no miocárdio
de 66,7% (20/30) dos cães em pelo menos uma das áreas estudadas (Figura 12). Os parasitas foram observados no citoplasma de macrófagos e, com raras exceções, no meio extracelular. Verificou-se uma correlação entre o número de células parasitadas e a intensidade do infiltrado inflamatório, tanto no AD (p=0,039) como no VD (p=0,018). Os valores mínimo, máximo e mediana do número de células parasitadas encontram-se listados na Tabela 3.
Os resultados individuais do número de macrófagos parasitados, obtidos
pela avaliação imuno-histoquímica para detecção de Leishmania sp. nas quatro
áreas do miocárdio, encontram-se apresentados no Apêndice F.
Tabela 3 – Valores mínimo, máximo e mediana do número de células
parasitadas por Leishmania sp. na parede livre de átrio direito
(AD), parede livre de ventrículo direito (VD), septo interventricular (SIV) e parede livre de ventrículo esquerdo (VE) do miocárdio de 30 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. (Araçatuba-SP, 2012)
Estatística AD VD SIV VE
Mediana 5,5 3,5 1 1,5
FIGURA 12 - Fotomicrografias de coração de cães naturalmente acometidos por LV. (a) Em átrio direito observam-se formas amastigotas do parasita (setas), associadas a foco de infiltrado de células inflamatórias. Obj. 40x. (b) Em ventrículo direito observa-se a presença do parasita (seta) no interior de macrófagos (detalhe). Obj. 100x (em imersão). Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase. (Araçatuba-SP, 2012).
a
44
5 DISCUSSÃO
Por meio de uma abordagem observacional transversal (HULLEY et al, 2008), o presente estudo avaliou a ocorrência de alterações histopatológicas e
a presença de Leishmania sp. no miocárdio de cães acometidos por LV. Os
resultados obtidos indicam que em cães naturalmente acometidos pela enfermidade pode ocorrer lesão de cardiomiócitos. Nas literaturas médica e veterinária, além de serem raros os estudos que avaliaram o coração de pacientes com LV, a grande maioria consiste no relato de casos individuais (FERRARI et al., 2006; FONT et al., 1993; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; MOFREDJ et al., 2002; PUERTO-ALONSO et al., 2006; TORRENT et al., 2005; ZABALA et al., 2005), sendo poucos os ensaios realizados em um número maior de indivíduos (ALVES et al., 2010; MORAIS et al., 1988).
Embora a literatura descreva o acometimento cardíaco como um evento raro em cães e seres humanos com LV (ALVES et al., 2010; FERRARI et al., 2006; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; PUERTO-ALONSO et al., 2006), foi possível verificar uma alta prevalência desse tipo de manifestação na população avaliada. É provável que tal discrepância se deva ao fato de muitos pacientes com LV se apresentarem assintomáticos quanto ao comprometimento do sistema cardiovascular, o que faz com que tais alterações sejam subestimadas.
A especificidade diagnóstica da avaliação histopatológica do miocárdio é muito limitada, uma vez que as células musculares cardíacas respondem à agressão com um espectro limitado de reações (VLEET; FERRANS, 2009). Quando se estudam alterações presentes no miocárdio, é imprescindível que tal informação seja cuidadosamente considerada, uma vez que alguns tipos de lesões podem estar associadas à presença de enfermidades concomitantes, e não são causadas diretamente pela presença de um único agente etiológico. Por esse motivo, e levando-se em consideração o fato de que a área onde foi realizado o presente estudo é endêmica para erliquiose canina, todos os
do experimento. Assim como o Trypanosoma cruzi, a E. canis apresenta
potencial de produzir miocardite em cães (DINIZ et al., 2008).
Os 30 cães avaliados no presente estudo apresentaram média de idade de três anos, caracterizando uma população predominantemente jovem. Em sua maioria, os relatos que descreveram o acometimento cardíaco de cães com LV o fizeram em cães adultos a idosos (FERRARI et al., 2006; FONT et al., 1993; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; SILVA et al., 2009), sendo raros os casos descritos em cães mais jovens (TORRENT et al., 2005; ZABALA et al., 2005). Em um desses relatos, foi demonstrada a ocorrência de vasculite generalizada e miocardite severa em uma cadela da raça Bulldog, com apenas três anos de idade, que não apresentava sinais clínicos sugestivos de comprometimento cardiovascular (TORRENT et al., 2005).
A ocorrência de miocardite severa associada à presença de inúmeras
formas amastigotas de Leishmania sp. no miocárdio também foi descrita em
um cão da raça Boxer com apenas quatro meses de idade, que apresentava dispnéia aguda e sinais de insuficiência cardíaca direita e esquerda, com edema pulmonar e efusões pleural e peritoneal (ZABALA et al., 2005). Ao avaliar uma população predominantemente jovem, o presente estudo demonstrou a ocorrência de um grande espectro de alterações histopatológicas no miocárdio, além de identificar a presença de formas amastigotas de
Leishmania sp. Sendo assim, não é possível estabelecer se a intensidade da
lesão cardíaca observada teria sido mais severa caso fosse avaliada uma população com idade mais avançada, assim como permanece incerto se o desenvolvimento de sinais clínicos relacionados à disfunção cardíaca pode sofrer alguma influência da idade do animal ou do tempo decorrido da infecção.
46
Nas literaturas médica e veterinária estão descritos casos de envolvimento pericárdico (FONT, et al., 1993; MOFREDJ et al., 2002) e de alterações macroscópicas compatíveis com infarto do miocárdio (FERRARI et al., 2006), apesar de tais alterações não terem sido observadas no presente estudo.
Não foi possível determinar a causa da dilatação ventricular direita, observada em 53,3% dos cães avaliados. Uma possível explicação seria o envolvimento pulmonar concomitante, frequentemente presente em cães com LV (ALVES et al., 2010; DUARTE et al, 1986; GONÇALVES et al., 2003;
MARSHALL et al., 2000), levando a um quadro de cor pulmonale. Entretanto,
dos 16 cães em que se observou dilatação de VD, apenas cinco apresentavam sinais clínicos sugestivos de broncopneumopatias, tais como a presença de estertores pulmonares e secreção nasal mucopurulenta.
A hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo foi previamente relatada em cães naturalmente acometidos por LV (CORTADELLAS et al., 2006; ZABALA et al., 2005). Em estudo realizado por Cortadellas et al. (2006), esse tipo de hipertrofia constituiu a manifestação mais comum da hipertensão arterial sistêmica em cães com doença glomerular devido à leishmaniose visceral. Na presença de hipertensão arterial sistêmica a hipertrofia concêntrica do VE representa uma resposta adaptativa à sobrecarga de pressão (aumento da pós-carga), podendo levar à disfunção miocárdica, dilatação cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva e morte (SCHOEN; MITCHELL, 2010). Outra causa potencial de hipertrofia ventricular esquerda e insuficiência cardíaca congestiva é a anemia crônica (IBERNON et al., 2011; NAITO et al., 2009), manifestação comumente observada em cães e seres humanos com LV.
Apesar da elevada prevalência de infiltrado inflamatório, necrose de cardiomiócitos, proliferação de tecido conjuntivo e presença de formas
amastigotas de Leishmania sp. no miocárdio, tais alterações foram discretas e
insuficientes para produzir manifestações clínicas de comprometimento cardíaco nos cães com LV, corroborando estudos que avaliaram um maior número de cães (ALVES et al., 2010) e seres humanos (MORAIS et al., 1988) acometidos pela enfermidade. No entanto, esses achados diferem do envolvimento cardíaco severo que foi previamente relatado por outros autores (FONT et al., 1993; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; ZABALA et al., 2005).
A ocorrência de infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário no miocárdio de cães naturalmente acometidos por LV também foi descrita em estudos prévios (ALVES et al., 2010; FERRARI et al., 2006; FONT et al., 1993; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; TORRENT et al., 2005; ZABALA et al., 2005). No entanto, a intensidade da inflamação não havia sido associada com a presença do parasita, fato que foi observado no presente estudo.
A área em que se observou a presença de infiltrado linfoplasmocitário em maior intensidade foi o átrio direito, concordando com o relato de Torrent et al. (2005), que observaram a presença de miocardite e vasculite em um cão com LV. Outros autores que estudaram o coração de cães com LV não descreveram a avaliação de espécimes obtidos a partir de diferentes regiões do coração (ALVES et al., 2010; FERRARI et al., 2006; FONT et al., 1993; LÓPEZ-PEÑA et al., 2009; ZABALA et al., 200;). Esse tipo de infiltrado inflamatório também é observado no miocárdio de cães e seres humanos com cardiomiopatia chagásica crônica (PAVARINI et al., 2009; ROSSI, 1998).
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correlação entre a severidade da reação granulomatosa e o número de células parasitadas no AD (p=0,046) e SIV (p=0,022), confirmando estudos anteriores que também verificaram essa correlação ao avaliarem órgãos linfóides (MOREIRA et al, 2010; SANTANA et al.; 2008). De acordo com Santana et al. (2008), a presença de granulomas no baço de cães com LV parece refletir a ocorrência de inflamação crônica em resposta à infecção não controlada, em vez de indicar proteção contra a enfermidade. Essa teoria pode ser apoiada pela atividade antimicrobicida exercida por algumas citocinas (CORRÊA et al., 2007) e pela resposta predominantemente Th2 verificada nos granulomas do tipo lepromatoso (ACKERMANN, 2009), resultando na inibição da capacidade de destruição do parasita pelos macrófagos, em virtude do mecanismo imunológico ativado.
A ocorrência de necrose de cardiomiócitos foi previamente descrita em casos isolados de cães com LV (FERRARI et al., 2006; ZABALA et al., 2005). Em um estudo que avaliou a ocorrência de alterações cardíacas em 22 cães com LV, relatou-se a presença de necrose em intensidade leve, porém sem especificar a prevalência da lesão na população avaliada. No presente estudo, embora a alteração tenha se mostrado frequente (80% dos cães), o achado não difere dos resultados dos estudos previamente citados, uma vez que a mesma manifestou-se principalmente em intensidades discreta ou moderada, não tendo sido observadas áreas extensas de necrose. Uma possível justificativa para a elevada prevalência de necrose de cardiomiócitos observada no presente estudo consiste no fato de terem sido avaliados fragmentos de quatro diferentes áreas do coração, aumentando o tamanho da amostra de tecido cardíaco.
Porém, um segundo padrão de necrose de cardiomiócitos, a necrose em bandas de contração, que não havia sido descrita anteriormente em cães com LV, foi observada em 29,1% das áreas que apresentaram necrose. Apesar de pouco descrito na espécie canina, esse padrão de necrose pode estar associado à hipóxia do miocárdio, conforme observado em cinco cães que foram submetidos à parada cardíaca anóxica por pinçamento transversal da aorta ascendente (DIAS et al., 2002).
A necrose fibrinóide de artérias do miocárdio, verificada em 10% dos cães, é um tipo especial de necrose que está associada à lesão endotelial e pode ocorrer nas paredes de pequenas artérias e arteríolas musculares. A lesão caracteriza-se pela entrada e acúmulo de proteínas séricas, seguidas pela polimerização da fibrina na parede vascular, formando um colar intensamente eosinofílico que encobre a estrutura celular subjacente (KUMAR et al., 2010; VLEET; FERRANS, 2009). Essa lesão é decorrente de danos nas camadas íntima e média, como ocorre nas vasculites imunomediadas (MYERS; MCGAVIN, 2009), mas também é frequentemente observada em cães com síndrome urêmico e naqueles com hipertensão arterial sistêmica (VLEET; FERRANS, 2009).
O presente estudo foi o primeiro a relatar a ocorrência desse tipo de necrose na parede de vasos sanguíneos do miocárdio de cães com LV. É provável que tenha ocorrido em consequência do dano vascular associado à deposição de imunocomplexos circulantes, os quais causam danos em vários órgãos (BARBIÉRI, 2006; CIARAMELLA; CORONA, 2003; KONTOS; KOUTINAS, 1993). Além disso, os três cães apresentavam glomerulonefrite e síndrome urêmico, e um deles possuía hipertensão arterial sistêmica, o que
poderia justificar a ocorrência de necrose fibrinóide.
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apenas um animal. O significado clínico dessa alteração ainda é bastante controverso e tem sido motivo de erros de diagnóstico em seres humanos (BASSO; THIENE, 2005; IOZZO, 2011). Estudos de necropsia indicaram que a infiltração gordurosa pode ser ocasionalmente observada em corações de seres humanos normais, principalmente quando associada ao envelhecimento, caquexia ou obesidade (BASSO; THIENE, 2005).
A ocorrência de infiltração gordurosa também tem sido descrita em cães com cardiomiopatia chagásica crônica (ANDRADE et al., 1997; CALIARI et al., 2002). Sua participação no processo infamatório decorrente dessa enfermidade, e possivelmente também da LV, é digna de novos estudos, uma vez que os adipócitos são capazes de produzir TNF, MIF e TGF, que são mediadores envolvidos em fenômenos como a migração leucocitária e a fibrogênese (FRÜHBECK et al., 2001).
Em apenas um animal verificou-se vasculite no AD, associada a uma área focalmente extensa de deposição de colágeno. A ocorrência de vasculite necrotizante sistêmica foi previamente relatada em cães com LV (PUMAROLA et al., 1991; TORRENT et al., 2005). Embora a vasculite possa estar relacionada à ação direta do parasita (CABALLERO-GRANADO et al., 1998), acredita-se que o dano vascular em cães com LV seja consequente a uma lesão imunomediada (PUMAROLA et al., 1991; TORRENT et al., 2005).
a presença de células inflamatórias pode ser justificada pelo papel que essas células exercem na fibrogênese, por meio da liberação de citocinas e fatores de crescimento, durante a fase de reparo por cicatrização do tecido cardíaco (ROSSI, 1998).
Apesar de bastante comuns, as alterações histopatológicas como presença de infiltrado inflamatório, necrose de cardiomiócitos e aumento do colágeno intersticial apresentaram-se predominantemente em intensidade discreta a moderada, e foram insuficientes para produzir sinais clínicos decorrentes de comprometimento da função cardíaca. No entanto, a importância de exames complementares tais como eletrocardiografia computadorizada de repouso ou ambulatorial (sistema Holter) e a avaliação de biomarcadores cardíacos em cães naturalmente acometidos por LV não foi avaliada, e permanece incerto se o dano cardíaco observado pelo estudo histopatológico poderia ter sido identificado por tais exames subsidiários.
Embora a carga parasitária de Leishmania sp. no tecido cardíaco tenha
sido baixa, exceto em um animal em que foram observadas inúmeras formas amastigotas do parasitas no átrio direito, 66,7% dos cães apresentavam o parasita em pelo menos uma das áreas avaliadas. Esses resultados diferem dos achados de Alves et al. (2010), que observaram a ocorrência do parasita no miocárdio em apenas um entre 12 cães com LV, e também do estudo realizado por Morais et al. (1988), que avaliaram o miocárdio de 16 seres humanos com LV e não identificaram a presença do parasita, ambos pela técnica de imuno-histoquímica. No presente estudo, a existência de correlação entre o número de células parasitadas e a intensidade do infiltrado inflamatório, tanto no AD (p=0,039) como no VD (p=0,018), sugere a participação direta do parasita na patogenia da inflamação cardíaca
Lesões semelhantes são observadas na cardiomiopatia chagásica (PAVARINI et al., 2009; ROSSI, 1998), embora existam ainda discordâncias
quanto a sua patogênese, isto é, se a presença do Trypanosoma cruzi em
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ou se o parasita induz a uma reação imunomediada (CUNHA-NETO et al., 1996; ENGMAN; LEON, 2002; LEON et al., 2001; PONTES-DE-CARVALHO et al., 2001).
6 CONCLUSÃO
Fundamentando-se nos resultados obtidos nas condições do presente estudo, pôde-se concluir que:
Alterações histopatológicas como presença de infiltrado inflamatório do
tipo linfoplasmocitário, necrose de cardiomiócitos e aumento do colágeno intersticial apresentam elevada prevalência em cães com leishmaniose visceral.
Apesar de comuns, as alterações histopatológicas observadas
apresentaram-se predominantemente em intensidade discreta a moderada, e foram insuficientes para produzir sinais clínicos decorrentes de comprometimento da função cardíaca.
A imunodetecção de Leishmania sp. no miocárdio de 66,7% dos cães
avaliados, associada à correlação observada entre o número de células parasitadas e a intensidade de células inflamatórias, sugere uma ação direta do parasita na resposta inflamatória presente nesse órgão.
A existência de correlação entre o número de células parasitadas por
Leishmania sp. e o número de granulomas observados no miocárdio de
