JULIANA GAMBA
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO EM
DEFEITOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
JULIANA GAMBA
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO EM
DEFEITOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
JULIANA GAMBA
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO EM
DEFEITOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
ORIENTADORA:
Prof
a. Dra. Célia Harumi Tengan
FICHA CATALOGRÁFICA – BIBLAC
Gamba, Juliana
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO EM DEFEITOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA / Juliana Gamba – São Paulo, 2006.
113p., xviii
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Neurologia.
Título em inglês: Evaluation of Nitric Oxide Synthesis in Respiratory Chain Defects.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Débora Amado Scerni
JULIANA GAMBA
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE ÓXIDO NÍTRICO EM
DEFEITOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
BANCA EXAMINADORA
Titulares
Profa. Dra. Débora Amado Scerni Profa. Dra. Rosely Oliveira Godinho Prof. Dr. Carlos Torres Moraes
Suplente Profa. Dra. Maria Inês Bellíssimo
v
Dedico, com amor, esta tese
Aos meus pais, Silvia e Armando...
Que muito me deram e ensinaram ao longo destes anos.
Deram-me o milagre da vida, o primeiro sorriso, as primeiras palavras, os
primeiros gestos de carinho, a segurança do colo, a altivez do olhar. Deram-me a
compreensão, o apoio, o caráter, a oportunidade do estudo, o aprendizado.
Ensinaram-me a acreditar que tudo dará certo, a fazer tudo com alegria, a dar o
melhor de mim, a ajudar o próximo. Ensinaram-me a aceitar as limitações dos
outros, a receber as bênçãos com gratidão, a ter humildade. Ensinaram-me a
aprender com os erros, a não brigar com os problemas e sim resolvê-los, a
escolher as batalhas com sabedoria. Ensinaram-me que não importa quão boa
seja uma pessoa, ela vai ferir-nos de vez em quando e será preciso perdoá-la por
isso. Ensinaram-me que leva anos para se construir confiança e apenas alguns
segundos para destruí-la, e que podemos fazer coisas em um instante das quais
nos arrependeremos pelo resto da vida. Ensinaram-me que ou controlamos
nossos atos ou eles nos controlarão, e que ser flexível não significa ser fraco, pois
não importa quão delicada e frágil seja uma situação, sempre existem dois lados.
Ensinaram-me a construir todas as estradas no hoje, pois o futuro não é o lugar
para onde estamos indo, é o lugar que estamos construindo.
Ensinaram-me que a vida é dirigida de dentro para fora...
Mãe, pai... vocês são meu exemplo e, se um dia eu conseguir ser apenas metade
das pessoas que vocês são, serei a pessoa mais feliz do mundo...
e então, tudo terá valido a pena... Amo muito vocês.
À minha irmã Carolina...
Que sempre me faz lembrar que não importa o que temos na vida, mas sim quem
temos. Que as pessoas que amamos são tomadas de nós muito depressa, motivo
pelo qual devemos sempre deixá-las com palavras amorosas, pois pode ser a
vii
Agradeço à minha orientadora, Dra. Célia Harumi Tengan, pela oportunidade de
realizar este estudo em seu laboratório, por todos os ensinamentos e conversas
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que, quer pela amizade ou pela orientação, ou ambos, fizeram com que este sonho fosse realizado.
À Profa. Dra. Beatriz Hitomi Kiyomoto, pelas sugestões e conselhos, tão acolhidos, e pelo convívio sempre alegre.
Ao Prof. Dr. Durval Rosa Borges e Prof. Dr. Carlos Fisher de Toledo, da Disciplina de Gastroenterologia, pela oportunidade de realizar os experimentos de cultura celular em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Carlos Torres Moraes, da University of Miami – Miller School of Medicine, por ter tão gentilmente cedido algumas das linhagens celulares utilizadas neste estudo.
Ao Prof. Dr. Acary Souza Bulle Oliveira, Chefe do Setor de Doenças Neuromusculares, e Prof. Dr. Beny Schmidt, responsável pelas biópsias musculares e pela disponibilidade das amostras utilizadas neste estudo. A Profa. Dra. Maria da Graça Naffah Mazzacoratti, por permitir a utilização de
alguns equipamentos do Laboratório de Neurociências, e aos técnicos Sandra Regina Perosa e Eduardo Ferreira de Castro Neto, por serem tão solícitos nos momentos em que precisei de auxílio.
Ao Sr. Marco Aurélio Gonzaga, pela imprescindível ajuda nos trâmites burocráticos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudo e pelos auxílios financeiros recebidos para a realização deste trabalho.
ix
“Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor fosse feito... Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser, mas, graças a Deus, não somos o que éramos.”
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA...vi
AGRADECIMENTOS...vii
LISTA DE ABREVIATURAS...xiii
LISTA DE TABELAS...xv
LISTA DE FIGURAS...xvi
RESUMO...xvii
1. INTRODUÇÃO...1
2. OBJETIVOS...14
3. MATERIAIS...15
3.1. EQUIPAMENTOS...15
3.2. DROGAS E REAGENTES...16
3.2.1. Reagentes Utilizados Para Cultura de Células...18
3.3. AMOSTRAS...20
a. Linhagens Celulares Cíbridas Derivadas de Osteosarcoma...20
b. Fibroblastos...20
c. Músculo Esquelético...21
4. ASPECTOS ÉTICOS...24
5. MÉTODOS...25
5.1. MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES EM CULTURA...25
5.2. CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DAS ALTERAÇÕES NAS LINHAGENS CÍBRIDAS...26
xi
5.2.2. Amplificação por PCR...27
5.2.3. Digestão dos Produtos de PCR por RFLP...30
5.3. AVALIAÇÃO DO GRAU DE COMPROMETIMENTO OXIDATIVO DAS LINHAGENS DE FIBROBLASTOS EM CULTURA...30
5.4. QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NITRITOS POR ESPECTROFOTOMETRIA...31
5.4.1. Obtenção do Homogeneizado Celular...32
5.4.2. Quantificação de Proteína Total...33
5.5. QUANTIFICAÇÃO DE NO POR FLUORIMETRIA...33
5.5.1. Avaliação da Especificidade do DAF-FM diacetato...35
5.6. DETECÇÃO DE NO POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA...35
5.7. ANÁLISE DE PROTEÍNAS CONTENDO NITROTIROSINAS ATRAVÉS DE WESTERN BLOTTING...36
5.7.1. Obtenção do Homogeneizado Celular...37
5.7.2. Western Blotting...37
5.7.3. Determinação da Concentração Ideal de Anticorpos e da Quantidade de Proteína Total Utilizada...38
5.8. ANÁLISE DOS RESULTADOS...39
6. RESULTADOS...40
6.1. CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES...40
6.1.1. Confirmação da Presença das Alterações nas Linhagens Cíbridas...40
6.1.2. Avaliação do Grau de Comprometimento Oxidativo das Linhagens de Fibroblastos em Cultura...43
6.2.1. Quantificação da Produção de Nitritos por Espectrofotometria...45
6.2.2. Quantificação de NO por Fluorimetria...50
6.2.3. Detecção de NO por Microscopia de Fluorescência...55
6.3. ANÁLISE DE PROTEÍNAS CONTENDO NITROTIROSINAS ATRAVÉS DE WESTERN BLOTTING...60
7. DISCUSSÃO...64
8. CONCLUSÕES...76
9. REFERÊNCIAS...77
10. ANEXOS...112
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa...112
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP Adenosina difosfato ATP Adenosina trifosfato COX Citocromo c oxidase
DNAmt Ácido desoxirribonucléico mitocondrial DNAn Ácido desoxirribonucléico nuclear dNTP Deoxinucleosídeo trifosfato
DO Densidade óptica
EP Erro padrão
ERN Espécie reativa de nitrogênio ERO Espécie reativa de oxigênio
FADH2 Flavina adenina dinucleotídeo reduzido H2O2 Peróxido de hidrogênio
HOCl Ácido hipocloroso
kb Kilobase
kDa KiloDawtons
NADH Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo
NADPH Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato NO Óxido nítrico
NO2 Dióxido de nitrogênio NO2Cl Cloreto de nitril NO2- Nitrito
N2O3 Trióxido de nitrogênio NOS Óxido nítrico sintase
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial iNOS Óxido nítrico sintase induzida mtNOS Óxido nítrico sintase mitcondrial nNOS Óxido nítrico sintase neuronal O2- Ânion superóxido
OH- Radical hidroxila ONOO- Peroxinitrito pb Pares de bases
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de
Comprimento de Fragmentos de Restrição) RNA Ácido ribunucléico
RRF Ragged red fibers (Fibras Vermelhas Anfractuadas) SDH Succinato desidrogenase
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características principais dos controles utilizados no estudo...22
Tabela 2: Características principais dos pacientes utilizados no estudo...23
Tabela 3: Primers utilizados para a confirmação das alterações...29
Tabela 4: Regiões escolhidas para a confirmação da deleção...29
Tabela 5: Teste da galactose – contagem de fibroblastos em cultura...43
Tabela 6: Quantidade de nitritos/proteína encontrada nas células cíbridas...46
Tabela 7: Quantidade de nitritos/proteína encontrada em fibroblastos...48
Tabela 8: Análise fluorimétrica utilizando os marcadores DAF-FM e Hoechst dye em linhagens cíbridas derivadas de osteosarcoma...50
Tabela 9: Análise fluorimétrica utilizando os marcadores DAF-FM e Hoechst dye em fibroblastos...53
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Confirmação da deleção da amostra ∆16:10:40...41
Figura 2: Análise da quantidade de DNAmt mutado presente nas linhagens cíbridas...42
Figura 3: Avaliação do grau de comprometimento oxidativo das linhagens de fibroblastos em cultura...44
Figura 4: Quantidade de nitritos produzidos pelas linhagens cíbridas...47
Figura 5: Quantidade de nitritos produzidos pelos fibroblastos...49
Figura 6: Análise quantitativa da síntese de NO em linhagens cíbridas através do marcador DAF-FM...51
Figura 7: Análise quantitativa da síntese de NO em fibroblastos através do marcador DAF-FM...54
Figura 8: Detecção de NO em linhagens cíbridas por microscopia de fluorescência...56
Figura 9: Detecção de NO em fibroblastos: microscopia de fluorescência...57
Figura 10: Padrão de marcação do DAF...58
Figura 11: Efeito do L-NAME na linhagem 8344 A>G...59
Figura 12: Detecção de proteínas contendo nitrotirosinas em linhagens cíbridas através de Western Blotting...62
xvii
RESUMO
1. INTRODUÇÃO
As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas presentes em células eucarióticas cuja função principal é o fornecimento de energia às células através do sistema de fosforilação oxidativa, processo metabólico no qual a síntese de ATP (adenosina trifosfato) ocorre com a passagem de elétrons pelos complexos respiratórios. A mitocôndria fornece cerca de 90% da energia que as células necessitam para exercer suas funções, sendo considerada assim uma das organelas celulares mais importantes (Saraste, 1999; Wallace, 1997). Se a função da mitocôndria é alterada, a função celular, independentemente do tecido, pode ser comprometida acarretando alterações vitais na função do órgão (DiMauro & Schon, 2001; Nonaka, 1992).
A mitocôndria é formada por duas membranas: a membrana externa e a membrana interna, e dois compartimentos aquosos: o espaço intermembrana e a matriz (Pfanner et al., 2004). A cadeia respiratória mitocondrial é composta por quatro complexos enzimáticos localizados na membrana interna da mitocôndria, sendo estes: complexo I (NADH ubiquinona oxidoredutase), complexo II (succinato ubiquinona redutase), complexo III (ubiquinona citocromo c oxidoredutase), e complexo IV (citocromo c oxidase), além de mais dois transportadores móveis de elétrons: coenzima Q10 (ubiquinona) e citocromo c, que juntamente com o complexo V (ATP sintetase), responsável pela síntese de ATP, formam todo o sistema de fosforilação oxidativa (Saraste, 1999; Schägger & Pfeiffer, 2000).
2
ATP; NADH e FADH2, produzidos durante a glicólise e o ciclo de Krebs, doam elétrons para os Complexos I e II, respectivamente, iniciando a cadeia de transporte de elétrons. Conforme os complexos respiratórios doam os elétrons para o receptor seguinte, libera-se energia que é utilizada para o bombeamento de prótons para o espaço intermembrana. A alta concentração de prótons leva à criação de um gradiente eletroquímico, o qual é utilizado pela enzima ATP sintetase para a formação de ATP. Ao final da cadeia, os elétrons são transportados para o Complexo IV o qual transfere elétrons para o oxigênio molecular, que é o aceptor final (Saraste, 1999).
Do ponto de vista genético, a mitocôndria apresenta características únicas, pois possui seu próprio DNA, o DNA mitocondrial (DNAmt), localizado na matriz. Existem cerca de 10 cópias de DNAmt em cada mitocôndria e, portanto, centenas até milhares por célula (Schapira, 2002). O DNAmt humano é uma molécula circular dupla-fita de 16569 pares de bases (pb) que contém 37 genes codificando 13 subunidades da cadeia respiratória (polipeptídeos), 2 RNAs ribossômicos (12S e 16S) e 22 RNAs transportadores necessários para a síntese desses 13 polipeptídeos. A descoberta da seqüência de nucleotídeos do DNAmt humano foi precursora do descobrimento de diversas mutações causadoras de doenças mitocondriais (Anderson et al., 1981).
fosforilação oxidativa podem ser decorrentes de alterações no próprio DNAmt ou de alterações em genes nucleares que codificam polipeptídeos envolvidos ou não na cadeia respiratória (DiMauro & Schon, 1998; Herrmann, 2003; Leonard & Schapira, 2000; Schon, 2004; Zeviani et al., 1989).
Diferentemente do DNAn, onde a segregação dos cromossomos ocorre de forma tipicamente mendeliana, o genoma mitocondrial distribui-se aleatoriamente em múltiplas cópias para cada célula. Quando surge alguma alteração no DNAmt, esta geralmente apresenta-se primeiro nas moléculas de DNAmt de apenas uma mitocôndria. No momento da divisão da mitocôndria por fissão simples, as moléculas de DNAmt se duplicam, distribuem-se aleatoriamente entre as novas organelas, e as mitocôndrias distribuem-se aleatoriamente entre as células-filhas no processo de divisão celular. Em conseqüência, células, tecidos e, portanto, indivíduos inteiros, podem possuir duas populações de DNAmt: normal e mutante, em proporções variáveis, situação conhecida como heteroplasmia. Quando uma célula heteroplásmica se divide, suas células-filhas podem, por acaso, receber mitocôndrias que contêm apenas uma população pura de DNAmt normal ou uma população pura de DNAmt mutante, situação esta conhecida como homoplasmia, ou então receber mitocôndrias que contêm as duas populações de DNAmt (DiMauro & Schon, 2001; Wallace, 1997).
4
a mutação à progênie (DiMauro & Schon, 2001; Giles et al., 1980; Ozawa et al., 1988). Em 2002, foi relatado um caso de um único indivíduo com herança paterna do DNAmt. Este paciente apresentava deficiência nos complexos I e IV da cadeia respiratória, causada por uma mutação no DNAmt e, em seu músculo, a maioria do DNAmt havia sido herdada do pai (Schwartz & Vissing, 2002). No entanto, estudos seguintes não confirmaram qualquer evidência de contribuição paterna do genoma mitocondrial no músculo de muitos outros pacientes com miopatias causadas por mutações no DNAmt, indicando portanto, que a transmissão paterna de DNAmt é um fenômeno raro (Filosto et al., 2003; Schwartz & Vissing, 2004; Taylor et al., 2003).
para a variabilidade de expressão e distribuição desses defeitos em diferentes tecidos (Holt et al., 1990).
As doenças mitocondriais formam um grupo altamente heterogêneo de doenças humanas que podem resultar de mutações herdadas ou espontâneas do DNAmt ou DNAn e que, conseqüentemente, promovem um ou múltiplos defeitos no sistema de fosforilação oxidativa, afetando, predominantemente, o músculo esquelético e o sistema nervoso central, tecidos que possuem elevado consumo de oxigênio. As características clínicas são variáveis e incluem fraqueza muscular, oftalmoplegia externa progressiva, retinopatia pigmentosa, demência, ataxia, descontrole de movimentos, episódios de ataques generalizados, surdez, neuropatia periférica, e defeitos cardíacos, com desenvolvimento na infância ou na vida adulta (Bentlage et al., 1995; DiMauro et al., 1985; Petty et al., 1986).
6
Mutações no DNAmt e deficiência na fosforilação oxidativa também foram descritas no envelhecimento normal (Cortopassi & Arnheim, 1990; Pesce et al., 2001; Short et al., 2005; Tengan et al., 1997). A principal hipótese que explica estas mutações seria através de lesão oxidativa, pois a cadeia respiratória é uma fonte de radicais livres, principalmente de oxigênio (Cadenas & Davies, 2000; Genova et al., 2004). Acredita-se que durante o envelhecimento normal ocorra um aumento da geração de radicais livres na mitocôndria, levando à lesão oxidativa do DNAmt, que por sua vez leva a um déficit na cadeia respiratória, o que provocaria uma maior liberação de radicais livres, fechando um ciclo vicioso. Este ciclo explicaria o acúmulo exponencial de mutações no DNAmt com a idade (Gianni et al., 2004; Harman, 1972; Loeb et al., 2005; Ozawa, 1995), e a conseqüente morte celular (Yoneda et al., 1995).
danos oxidativos, e suas modificações podem levar à disfunção mitocondrial (Cadenas & Davies, 2000; Choksi et al., 2004). Assim, a mitocôndria é considerada a principal fonte de estresse oxidativo, mediado pelo aumento da produção de EROs, e pela redução da capacidade antioxidante (Cadenas & Davies, 2000; Gianni et al., 2004).
O óxido nítrico (NO) é outra fonte de radicais livres na mitocôndria, mas também pode ter papel regulatório na cadeia respiratória (Alvarez et al., 2003; Boveris et al., 2000; Brown, 1995; Cleeter et al., 1994; Giulivi et al., 1998; Sarkela et al., 2001; Schöpfer et al., 2000). O NO é uma molécula que participa de vários
processos fisiológicos importantes e é sintetizado a partir da L-arginina pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), na presença de NADPH e oxigênio (Boveris et al., 2000; López-Figueroa et al., 2000). Inicialmente foram identificadas três
isoformas de NOS: tipo I ou NOS neuronal (nNOS), tipo II ou NOS induzida (iNOS) e tipo III ou NOS endotelial (eNOS) (Nathan & Xie, 1994; Schmidt et al., 1991). A nNOS e a eNOS são expressas de maneira constitutiva e são reguladas pelo complexo cálcio/calmodulina e pela fosforilação, sintetizando NO de forma rápida e efêmera (Bredt & Snyder, 1990; Mayer et al., 1990; Schmidt et al., 1991). A iNOS é induzida durante processos de inflamação e independe de cálcio para a síntese de NO, síntese esta caracterizada por altos níveis de NO por um longo período (Schmidt et al., 1991).
localiza-8
se no sarcoplasma (Frandsen et al, 1996; Kobzik et al., 1994; Stamler & Meissner, 2001).
A descoberta de uma NOS com localização mitocondrial (Bates et al., 1995, 1996; Frandsen et al., 1996; Kobzik et al., 1995) fez surgir evidências de que a mitocôndria poderia conter sua própria NOS, a mtNOS. Em seguida, foi observado que em mitocôndrias isoladas de fígado de rato ocorria atividade de uma NOS (Ghafourifar & Richter, 1997), e que em diferentes preparados mitocondriais ocorria, de fato, produção de NO (Giulivi et al., 1998). A hipótese inicial da existência de uma mtNOS, responsável pela síntese de NO dentro da mitocôndria era então confirmada, mas a natureza desta mtNOS e sua relação com as outras isoformas de NOS ainda não estavam claras (Giulivi, et al., 1998; Tatoyan & Giulivi, 1998).
Se a mtNOS é uma enzima genuinamente mitocondrial, deveriam existir mecanismos regulatórios para o seu direcionamento à organela, mas não existe nenhum gene específico para a mtNOS (Alderton et al., 2001), o que torna as já conhecidas isoformas de NOS (nNOS, eNOS e iNOS) possíveis candidatas à mtNOS. Enquanto alguns estudos sugerem a eNOS (Bates et al, 1995, 1996; Kobzik et al., 1995), ou a iNOS (Tatoyan & Giulivi, 1998), dados mais recentes sugerem que um subtipo da nNOS (nNOS ) seria a principal candidata (Elfering et al., 2002; Kanai et al., 2001, 2003; Riobó et al., 2002). Em estudo realizado em
1997, observou-se que a NOS encontrada na mitocôndria dependia de cálcio para a síntese de NO, assim como a nNOS e a eNOS (Ghafourifar & Richter, 1997).
produzindo a iNOS (Alderton et al., 2001), e portanto, as funções da mtNOS provavelmente estão adaptadas às necessidades específicas do tecido em que se encontram (Riobó et al., 2002). O reconhecimento da atividade de uma mtNOS, assim como sua localização na membrana interna da mitocôndria, mostrou que a mitocôndria é de fato uma fonte de NO, cuja síntese pode afetar o metabolismo energético, o consumo de oxigênio, e a formação de EROs dentro da organela (Giulivi et al., 1998).
O NO apresenta diversas funções importantes e atua em vários sistemas de sinalização celular. As principais funções do NO estão relacionadas com os sistemas nervoso, imunológico e cardiovascular (Bredt & Snyder, 1990; Ignarro, 1989; Mayer et al., 1989; Moncada et al., 1988). No sistema nervoso, o NO atua como neurotransmissor mediando ações de vasodilatação cerebral, impulsos inibitórios, e até como neurotoxina, se houver produção excessiva (Bredt & Snyder, 1994; Dawson et al., 1992; Snyder, 1992). No músculo esquelético, o NO pode atuar no controle vascular, no metabolismo muscular (aumenta a captação de glicose, inibe a glicólise, inibe a respiração celular, inibindo a citocromo c oxidase) e na função contrátil (aumenta a abertura do canal de cálcio no retículo sarcoplasmático) (Reid, 1998; Stamler & Meissner, 2001).
10
respiratória, inibindo suas funções (Clementi et al., 1998; Poderoso et al., 1999; Riobó et al., 2001; Welter et al., 1996). De fato, o NO e as ERNs podem modular a produção de ATP e de radicais livres de oxigênio (Giulivi, 1998; Sarkela et al., 2001), além de promover danos ao próprio DNAmt (Grishko et al., 1999; Wilson et al., 1997). Assim, a ação inibitória do NO sobre os complexos da cadeia
respiratória e a conseqüente modulação da produção de ATP, sugerem que tanto o NO quanto as ERNs poderiam inibir a respiração mitocondrial, estimulando ou inibindo a morte celular (Beltran et al., 2004; Bringold et al., 2000).
MacMillan-Crow et al., 1996; Radi, 1998). Resíduos de triptofano também podem ser oxidados pelo ONOO- (Ischiropoulos & Al-Mehdi, 1995; Kato et al., 1997).
O alvo mais sensível do NO na mitocôndria é a enzima terminal da cadeia de transporte de elétrons, a citocromo c oxidase (COX) (Brown, 2000; Cassina et al., 2000). O NO regula a função mitocondrial através da ligação direta com a
COX. Esta ligação é sempre reversível, ocorre em competição com o oxigênio, e resulta em inibição da atividade da enzima (Brown & Cooper, 1994; Cleeter et al., 1994; Clementi et al., 1999; Schweizer & Richter, 1994). Concentrações nanomolares de NO inibem reversivelmente a COX em competição com o oxigênio, tanto em COX isolada (Giuffrè et al., 1996; Torres et al., 1995), quanto em mitocôndrias (Brown & Cooper, 1994; Cleeter et al., 1994; Schweizer & Richter, 1994), células e tecidos em cultura (Ghafourifar & Cadenas, 2005; Sarti et al., 1999). Altas concentrações de NO e seus derivados podem causar inibição
irreversível da cadeia respiratória aumentando a produção de radicais livres de oxigênio, que podem prejudicar a mitocôndria, levando à morte celular (Brown & Cooper, 1994; Brown, 2001; Cleeter et al., 1994; Clementi et al., 1998; Sarkela et al., 2001; Schweizer & Richter, 1994). Em estudo de mitocôndria isolada, foi
12
A respiração mitocondrial pode então ser inibida pelo NO através de duas maneiras: (a) o próprio NO causa uma inibição rápida, seletiva e potente, mas reversível da COX, e (b) as ERNs causam uma inibição lenta, não-seletiva, fraca, mas irreversível de muitos componentes mitocondriais (Cassina & Radi, 1996; Pearce et al., 2001; Torres et al., 1995). Assim, o NO pode ser considerado um regulador fisiológico da respiração celular (Brown, 1995; Brown, 2000; Poderoso et al., 1998).
O mecanismo pelo qual o NO inibe a captação de oxigênio pode ser entendido através da reação entre o NO (60-65% do total de NO produzido) e a COX, gerando nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) como principais produtos finais (Giulivi, 1998). A auto-oxidação do NO em soluções aquosas também leva à formação de NO2-, através de um mecanismo que pode envolver a formação intermediária de NO2 e N2O3 (Ignarro et al., 1993). O NO2- pode promover a nitração da tirosina através da formação do cloreto de nitril (NO2Cl) e do NO2•, após reação com ácido hipocloroso (HOCl) ou mieloperoxidase, mediadores inflamatórios, demonstrando que outras espécies reativas, além no ONOO-, também podem promover a nitração da tirosina (Eiserich et al., 1996; Eiserich et al., 1998; Van der Vliet et al., 1997).
Enquanto a nitração da tirosina é uma modificação irreversível que pode ser responsável por alguns dos efeitos tóxicos do NO (Blanchard-Fillion et al., 2001; Fukumoto et al., 2004; Hinson et al., 2000; Jeng et al., 2005; MacMillan-Crow et al., 1996), a nitrosação é uma modificação reversível que possui papel central na
2. OBJETIVOS
Verificar se a síntese de óxido nítrico está alterada em linhagens celulares com defeitos da cadeia respiratória.
3. MATERIAIS
3.1. EQUIPAMENTOS
• Agitador orbital (FANEM®)
• Balança analítica (Denver Instrument XE-100 e XL-3100)
• Banho-maria (Lab-Line Aquabath)
• Câmara de Neubauer (Optik Labor)
• Câmera fotográfica digital (SPOT Diagnostic Instruments, inc.)
• Câmera fotográfica (Polaroid GelCam H34-EL)
• Capela de exaustão (Nalgon)
• Cassete para revelação (Kodak BioMax)
• Centrífuga (CELM – COMBATE)
• Criostato (LEICA CM1850)
• Cuba para transferência (Bio-Rad)
• Cuba vertical Mini-Protean® II para eletroforese (Bio-Rad)
• Destilador (Barnstead FistreemTM II)
• Espectrofotômetro (Pharmacia LKB Ultrospec-3)
• Fluorímetro (Bio-Rad Versa FluorTM Fluorometer)
• Fluxo laminar (VECO)
• Fonte de fluorescência (OLYMPUS BH2-RFL-T3)
• Fontes Power Pac 300 (Bio-Rad)
16
• Microcentrífuga (Eppendorf Centrifuge 5415C)
• Microscópio invertido (OLYMPUS CK40)
• Microscópio de fluorescência convencional (OLYMPUS BX60)
• pHmetro (Denver Instrument Model 10)
• Termociclador (Gene Amp System 2400 – Perkin Elmer®)
• Transiluminador (Bio-Rad Mini-Transiluminator)
3.2. DROGAS E REAGENTES
• Acetato de sódio – NaC2H3O2 (FisherChemical – FISHER SCIENTIFIC)
• Ácido acético glacial (MERCK)
• Ácido clorídrico (MERCK)
• Ácido etilenodiaminotetracético – EDTA (Gibco BRL)
• Ácido etileno glicol-bis [ -aminoetil éter]-N,N,N’,N’-tetracético – EGTA (Sigma)
• Acrilamida (Gibco BRL)
• Agarose (Gibco BRL – Life Technologies)
• Água oxigenada – H2O2 (VETEC)
• Albumina bovina sérica – BSA (SIGMA)
• Álcool Etílico (MERCK)
• Álcool Metílico (MERCK)
• Amido black (Amersham Biosciences)
• Apa I (MBI Fermentas)
• Azul de bromofenol (Sigma)
• Bisacrilamida (Amersham Biosciences)
• Cloreto férrico hexahidratado – FeCl3 . 6H2O (VETEC)
• Cloreto de sódio (MERCK)
• Clorofórmio (MERCK)
• Coomassie brilliant blue (Gibco BRL)
• Deoxinucleotídeo trifosfato – dNTP (Amersham Pharmacia Biotech)
• Ditiotreitol – DTT (Invitrogen Life Technologies)
• Dodecil sulfato de sódio – SDS (Gibco BRL)
• Fenol (Amersham Biosciences)
• Fosfato de potássio monobásico – KH2PO4 (Vetec)
• Fosfato de sódio bibásico – Na2HPO4 (Vetec)
• Fosfato de sódio monobásico – NaH2PO4 (Vetec)
• Gene RulerTM 100bp DNA Ladder (Fermentas Life Science)
• Glicerol (Gibco BRL – Life Technologies)
• Glicina (Bio-Rad e Invitrogen Life Technologies)
• Kit Reagente Griess para determinação de nitrito (Molecular Probes)
• NanoOrange Kit (Molecular Probes)
• Nitrito de sódio – NaNO2 (LAFAN – Química Fina Ltda.)
• N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamino – TEMED (Gibco BRL)
• Persulfato de amônio – APS (Gibco BRL)
• Taq DNA-polimerase (Fermentas – Life Sciences)
• Tris (Fisher Scientific)
18
3.2.1. REAGENTES UTILIZADOS PARA CULTURA DE CÉLULAS
• Aminoácidos não-essenciais (Gibco BRL)
• Azul de tripan – Trypan Blue (Gibco BRL)
• Bicarbonato de sódio – NaHCO3 (Sigma)
• DAF-FM diacetato – 4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate (Molecular Probes)
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium – DMEM (Gibco BRL)
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium sem vermelho de fenol – DMEM (Cultilab)
• Fungizona e anfotericina B (Gibco BRL – Fungizone®Antimycotic)
• Galactose (Sigma)
• Hoechst dye- 33258 (Molecular Probes)
• L-glutamina (Gibco BRL)
• L-NAME – N -Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride – C7H15N5O4.HCl (Sigma)
• Minimum Essencial Medium – MEM (Gibco BRL)
• Penicilina (Gibco BRL)
• Piruvato de sódio (Gibco BRL)
• Placas para cultura de células (TPP)
• Polilisina 0.1% (Sigma)
• Soro de Bezerro – Calf Serum (Gibco BRL)
• Soro Fetal Bovino – FBS (Gibco BRL)
• Soro Fetal Bovino deionizado – dFBS (Gibco BRL)
• Tripsina-EDTA (Gibco BRL)
• TrypLETM Express Stable Trypsin Replacement Enzyme – tripsina-EDTA sem vermelho de fenol – Solução 1x (Gibco BRL)
• Vitaminas – Solução 100x (cloreto de colina 100mg/L, pantotenato de D-cálcio 100mg/L, ácido fólico 100mg/L, i-inositol 200mg/L, nicotinamida 100mg/L, hidrocloreto piridoxal 100mg/L, riboflavina 10mg/L, hidrocloreto de tiamina 100mg/L (Gibco BRL)
20
3.3. AMOSTRAS
Neste estudo foram utilizados três tipos de amostras:
a. Linhagens celulares cíbridas derivadas de osteosarcoma:
Células cíbridas são formadas a partir da fusão de citoplastos enucleados obtidos de células de pacientes com mutações no DNAmt com células que não possuem DNAmt (células 0), cultivadas seletivamente e subclonadas (Schon & DiMauro, 2001). Foram utilizadas linhagens cíbridas derivadas de osteosarcoma, contendo as seguintes alterações no DNAmt: mutação de ponto A>G no nucleotídeo 3243 (King et al., 1992), mutação de ponto A>G no nucleotídeo 8344 (Masucci et al., 1995), deleção de aproximadamente 7.5 kb (∆16:10:40, abrangendo os nucleotídeos 7982-15504), e 143B (selvagem) (Moraes et al., 1999). Estas linhagens celulares apresentam altas proporções de DNAmt mutante (>90%) e foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Carlos T. Moraes (University of Miami – Miller School of Medicine), com quem tivemos colaboração. A numeração
dos nucleotídeos do DNAmt foi utilizada de acordo com a seqüência de Anderson et al. (1981).
b. Fibroblastos
c. Músculo esquelético
Foram utilizadas amostras de músculo deltóide de pacientes, obtidas a partir de biópsias realizadas exclusivamente para fins diagnósticos. Devido à dificuldade em se obter amostras de músculo normal, necessitamos usar as amostras que temos disponíveis em nosso serviço. Por essa razão, os controles foram obtidos a partir de amostras de pacientes que foram submetidos à biópsia muscular para fins diagnósticos, mas cujo resultado final não apresentava evidências clínicas ou laboratoriais de alteração mitocondrial (biópsia muscular sem proliferação mitocondrial ou deficiência da COX). Os controles que possuem quadro clínico de encefalopatia inespecífica não apresentavam critérios suficientes para se pensar em diagnóstico de doença mitocondrial e foram classificados como diagnóstico improvável de doença mitocondrial, segundo os critérios estabelecidos por Wolf & Smeitink (2002).
A confirmação do diagnóstico de doença mitocondrial foi realizada através do achado de alterações utilizando-se seguintes métodos: histoquímica para SDH e COX em músculo esquelético, análise do DNAmt por Southern blotting, pesquisa de mutações específicas do DNAmt por RFLP ou sequenciamento direto, e análise da expressão da subunidade de 39KDa do Complexo I e core 1 do Complexo III, por Western blot de proteínas de músculo esquelético (para verificação de deficiências dos Complexo I e III).
22
TABELA 1: Características Principais dos Controles Utilizados no Estudo
CONTROLES
Idade
(anos) Quadro Clínico AMOSTRAS
C1 40 normal fibroblasto
C2 1 encefalopatia inespecífica músculo
C3 3 encefalopatia inespecífica músculo
C4 48 miopatia inflamatória músculo
TABELA 2: Características Principais dos Pacientes Utilizados no Estudo PACIENTE Idade (anos) Quadro Clínico Alteração mt Doença
mt AMOSTRAS
P1 3 Síndrome de Leigh
diminuição da atividade COX
conf. F M
P2 <1 encefalopatia, cardiopatia
- suspeita clínica
F
P3 9 encefalopatia, neuropatia óptica, ataxia
- suspeita clínica
F M
P4 2 encefalopatia aumento de lactato no líquor
suspeita clínica
F M
P5 3 encefalopatia, tubulopatia renal
deficiência do complexo III
conf. F M
P6 41 miopatia RRF, acúmulo lipídico, diminuição
de SDH
conf. F M
P7 10 oftalmoplegia externa progressiva
RRF, mutação 4370 T>AT no
DNAmt
conf. M
P8 25 distonia mutação 14459 G>A no DNAmt
conf. M
P9 63 oftalmoplegia externa progressiva
RRF, deleções múltiplas no
DNAmt
conf. M
P10 38 oftalmoplegia externa progressiva
RRF, deleções múltiplas no
DNAmt
conf. M
P11 42 intolerância ao exercício
RRF, mutação 3243 A>G no
DNAmt
conf. M
P12 1 encefalopatia deficiência do Complexo I
conf. M
P13 28 miopatia RRF, acúmulo lipídico, diminuição
de SDH, deficiência do
Complexo I
conf. M
4. ASPECTOS ÉTICOS
Este trabalho teve seu projeto aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo sob número de processo 1580/03 (anexo 1).
5. MÉTODOS
Este estudo consistiu das seguintes etapas:
• Caracterização das linhagens celulares:
o Confirmação da presença das alterações nas linhagens cíbridas o Avaliação do grau de comprometimento oxidativo das linhagens de
fibroblastos em cultura
• Avaliação da produção de NO nas linhagens celulares:
o Quantificação da produção de nitritos por espectrofotometria o Quantificação de NO por fluorimetria
o Detecção de NO por microscopia de fluorescência
o Detecção de proteínas contendo nitrotirosinas por Western blotting
5.1. MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES EM CULTURA
26
fibroblastos 50 g/mL. A adição da uridina faz-se necessária para superar o bloqueio da síntese endógena de uracila celular, o que exige atividade da dihydroororate dehydrogenase, uma enzima relacionada à cadeia respiratória cuja
atividade pode ser reprimida pelo estado redox desfavorável presente em células com deficiência respiratória (King & Attardi, 1989).
5.2. CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DAS ALTERAÇÕES NAS LINHAGENS
CÍBRIDAS
As linhagens cíbridas derivadas de osteosarcoma foram mantidas em cultura até atingirem confluência. Após a utilização de tripsina-EDTA 0.05% para promover o descolamento das células das placas, as células foram lavadas duas vezes com solução 1 x PBS (Phosphate-Buffered Saline) e seu DNA total foi extraído.
5.2.1. Extração de DNA
volume de isopropanol e lavado com etanol 70%, e então, dissolvido em 20 a 100 µL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM e EDTA 0.1 mM, pH 8.0), dependendo do
tamanho do precipitado obtido.
5.2.2. Amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A partir do DNA extraído destas células foi feita a checagem das mutações presentes nas diferentes linhagens celulares cíbridas, inicialmente através da técnica de PCR.
A PCR baseia-se na amplificação enzimática de um fragmento de DNA que é flanqueado por dois “iniciadores” (primers), oligonucleotídeos curtos que se hibridizam com os filamentos opostos da seqüência alvo, desencadeando a síntese da seqüência de DNA complementar pela enzima DNA-polimerase (Kapsa et al., 1997). As reações de PCR foram feitas utilizando-se aproximadamente 10
ng de DNA, 20 nmoles de cada dNTP (A, T, C, G), 30 pmoles de cada primer (Tabela 3) e 2.5 unidades de Taq DNA-polimerase, e ocorreu em 25 ciclos sob as seguintes condições: 94oC durante um minuto (desnaturação), 50oC por um minuto (anelamento dos primers) e 72oC durante um minuto (extensão). Os produtos obtidos após a amplificação foram submetidos à digestão com endonucleases através da técnica Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), a seguir.
28
TABELA 3: Primers Utilizados Para a Confirmação das Alterações
PRIMER F (seqüência 5’-3’)
PRIMER B (seqüência 5’-3’)
Tamanho (pb)
Alteração Verificada
aggacaagagaaataaggcc tacgcaaaggccccaacgtt 293 3243 A>G delDNAmt cccctctaccccctctagagcc
cactgtaaagc
ggggcatttcactgtaaagaggt gtggg
99 8344 A>G
atcggcattatcctcctgct gttgtcctccgattcaggtt 681 delDNAmt ccgctaacattactgcaggcca
cctactc
gggcaatttctagatcaaataat aagaagg
1248 delDNAmt
cataaaatctagacaaaaaag gaaggaatcgaacc
cggatacagttcactttagctacc cccaagtg
9063 delDNAmt
TABELA 4: Regiões Escolhidas Para a Confirmação da Deleção
Fragmento
Amplificado Nucleotídeos
Tamanho (pb)
Localização do Fragmento
A 3130 - 3423 293 pb Totalmente fora da
região deletada B 15089 - 15770 681 pb Abrange parte da região
deletada
C 9008 - 10256 1248 pb Totalmente dentro da
região deletada
D 7433 - 16496 9063 pb Abrange toda a região
30
5.2.3. Digestão dos Produtos de PCR por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Sabendo que algumas mutações de ponto no genoma mitocondrial causam a perda ou o surgimento de um sítio de restrição, a digestão de um produto de PCR em uma região próxima da mutação por uma endonuclease, pode revelar a presença da população de DNAmt mutante (Wong & Boles, 2005).
Utilizando os produtos de PCR das linhagens 3243 A>G e 8344 A>G, foi realizada a digestão dos fragmentos com as enzimas de restrição Apa I e Ban II (Amersham Pharmacia Biotech), respectivamente, a 37ºC por 2 horas. Os produtos da digestão foram analisados após eletroforese em géis de agarose 1% e poliacrilamida 20% (Figura 2).
5.3. AVALIAÇÃO DO GRAU DE COMPROMETIMENTO OXIDATIVO DAS
LINHAGENS DE FIBROBLASTOS EM CULTURA
Um método rápido para a detecção de defeitos severos da cadeia respiratória em fibroblastos mantidos em cultura, o teste da galactose, foi realizado em todas as amostras de fibroblastos deste estudo.
Os fibroblastos foram contados e plaqueados (2 x 105 células) em placas contendo 12 poços, primeiramente em meio de cultura completo, rico em glicose (DMEM com 4500 mg/L glicose), e deixados na incubadora por dois dias para que as células pudessem aderir corretamente ao fundo da placa e se adaptarem. Após este período iniciou-se o procedimento de seleção a partir da substituição do meio rico em glicose pelo meio DMEM sem glicose, com galactose 5.5 mM, suplementado com dFBS 15%, piruvato de sódio 100 mM, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 g/mL, e fungizona/anfotericina B 0.5 g/mL. A cada dois dias, durante um período de três semanas, as células foram removidas das placas utilizando tripsina-EDTA 0.05%. Após a inativação da tripsina com soro de bezerro, as células foram centrifugadas durante 4 minutos a 4000 rpm (rotações por minuto), ressuspensas em meio de cultura, coradas com azul de tripan para verificar a viabilidade celular, e contadas em câmara de Neubauer.
5.4. QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NITRITOS POR
ESPECTROFOTOMETRIA
32
tratando-se de um método indireto de detecção de NO (Archer, 1993, Verdon et al., 1995). Para o preparo do reagente Griess, foi feita uma mistura de
N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (componente A) com ácido sulfanílico (componente B), de acordo com as instruções do fabricante.
As células foram plaqueadas (1 x 105 células) em placas de 60 x 15 mm e mantidas em cultura em meio DMEM completo e rico em glicose até que estivessem próximas à confluência. Após três dias sem trocar o meio das placas (90% de confluência), 300 L desse meio foram removidos e colocados em contato com o reagente Griess durante 30 minutos para que a detecção de nitritos fosse realizada com o auxílio de um espectrofotômetro, a uma absorbância de 548 nm. A partir de leituras obtidas de amostras padrão com quantidades conhecidas de nitrito, obtivemos uma curva padrão que foi utilizada para estimar a concentração molar de nitritos das amostras. Foram feitas cinco medidas para cada amostra. Em seguida, as células foram rapidamente removidas das placas com a utilização de tripsina-EDTA 0.05%, e após a inativação da tripsina com soro de bezerro, as células foram centrifugadas por 4 minutos a 4000 rpm e lavadas com solução 1 x PBS. A partir do precipitado de células, foi preparado um homogeneizado celular e posterior quantificação de proteínas, para que pudéssemos corrigir a quantidade de nitritos detectada por placa de cultura pela quantidade de proteínas presentes nessa placa ( g nitritos/ g proteínas).
5.4.1. Obtenção do Homogeneizado Celular
pH 6.8, Glicerol 6% e DTT 50 mM. Estas foram fervidas por 2 minutos e, em seguida, centrifugadas por 10 minutos a 14000 rpm. O sobrenadante, onde estão localizadas as proteínas, foi transferido para ser quantificado.
5.4.2. Quantificação de Proteína Total
As proteínas foram quantificadas por fluorimetria, de acordo com as instruções do reagente NanoOrange. De maneira resumida, o procedimento de quantificação foi o seguinte: 1 L de proteína das amostras foi diluído em componente B junto com o reagente NanoOrange (componente A), diluído 500x. As proteínas foram desnaturadas a 93oC por 10 minutos e deixadas à temperatura ambiente por 20 minutos. A leitura foi realizada em fluorímetro, utilizando os filtros 480 nm (excitação) e 590 nm (emissão). A partir de leituras obtidas de amostras padrão de albumina bovina sérica (BSA) com quantidades conhecidas de proteína, obtivemos uma curva padrão, que foi utilizada para estimar a quantidade de proteína das amostras.
5.5. QUANTIFICAÇÃO DE NO POR FLUORIMETRIA
34
As células foram cultivadas em meio DMEM rico em glicose, sem o corante fenol-vermelho para que não houvesse interferência com a fluorescência, até atingirem confluência de 90%. Então foram tripsinizadas (TrypLE Express – solução 1x) e colocadas em tubos contendo soro de bezerro. Realizou-se a centrifugação por 2 minutos a 3000 rpm, o sobrenadante foi retirado e foi colocado meio DMEM sem fenol vermelho e sem FBS nos tubos. A solução estoque de DAF-FM diacetato 5 mM foi diluída em 1 x PBS, e realizou-se a incubação das células com 1 M do marcador e 1 g/mL de Hoechst dye a 37ºC por 10 minutos neste mesmo meio. Em seguida, as células foram centrifugadas por 5 minutos a 3000 rpm, o sobrenadante foi removido, e as células foram suspensas em solução 1 x PBS e deixadas à temperatura ambiente por 10 minutos, para completar a desesterificação dos diacetatos intracelulares. A quantificação foi realizada em fluorímetro utilizando-se filtros de excitação 495 nm e emissão 515 nm para o DAF-FM e de excitação 360 nm e emissão 460 nm para o Hoechst dye. A análise foi feita em amostras de células provenientes de três poços para cada tipo celular. A fluorescência obtida pelo DAF-FM foi corrigida quanto à quantidade de células, utilizando-se os resultados obtidos para Hoechst dye. Através da fluorimetria, obtivemos as densidades ópticas para as células marcadas com DAF-FM e com Hoechst dye. Assim, estabelecemos a razão DAF/Hoechst, que representa a quantidade de NO detectada por célula (NO/célula).
5.5.1. Avaliação da Especificidade do DAF-FM diacetato
Através de microscopia de fluorescência, foram testadas várias concentrações (0.1, 0.5, 1, 2, 5, 8 e 10 M) de DAF-FM diacetato em diferentes tempos de incubação (10, 20, 30, 45 e 60 minutos) até que chegássemos à concentração e tempo ideais nos quais as células estivessem marcadas, mas não apresentassem aspecto de saturação ou marcação inespecífica. A especificidade da marcação foi verificada através da quantificação de NO pelo DAF-FM utilizando-se o inibidor de NOS L-NAME. As células foram tratadas com L-NAME (300 mM) por 4 horas antes da incubação com DAF-FM diacetato. Todo o processo de incubação e quantificação do DAF-FM foi feito de acordo com o descrito anteriormente, porém o L-NAME foi mantido durante a incubação com o DAF-FM diacetato. Espera-se que a marcação específica diminua com o tratamento prévio com L-NAME.
5.6. DETECÇÃO DE NO POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
36
incubação com o marcador, as células foram lavadas com solução 1 x PBS e mantidas em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente, para completar a desesterificação dos diacetatos intracelulares. As lamínulas contendo as células já marcadas foram colocadas sobre lâminas para microscopia, utilizando solução de glicerol com PBS (1:1). Células tratadas previamente com L-NAME, semelhante ao descrito acima, foram utilizadas como controle negativo. As células foram fotografadas em fluorescência, utilizando microscópio de fluorescência convencional com câmera digital acoplada, com objetiva de 40x.
5.7. ANÁLISE DE PROTEÍNAS CONTENDO NITROTIROSINAS ATRAVÉS DE
WESTERN BLOTTING
A presença de nitrotirosinas é um indicador estável da produção de NO, e sua detecção pode servir como uma importante referência de danos aos tecidos (Inoue et al., 2002).
Este método permite a detecção de proteínas através de procedimentos imunológicos, nos quais se utiliza um anticorpo específico para a proteína de interesse e um anticorpo secundário (conjugado à peroxidase) que se liga ao anticorpo primário. A proteína específica é então detectada por auto-radiografia através da emissão do sinal, após a reação de quimioluminescência com a peroxidase (Towbin et al., 1979).
H2O2 0.3% e acetato de sódio 20mM pH 5.6, durante 24 horas em temperatura ambiente (Haqqani et al., 2002).
5.7.1. Obtenção do homogeneizado celular
As linhagens celulares cíbridas e os fibroblastos foram mantidos em cultura, utilizando o meio DMEM rico em glicose (Gibco BRL) até atingirem confluência. Em seguida, foram tripsinizadas (tripsina-EDTA 0.05%), centrifugadas por 4 minutos a 4000 rpm e lavadas com solução 1 x PBS, para obtenção do precipitado celular. As biópsias de músculo foram cortadas em fatias de, aproximadamente, 10 m e colocadas em tubos de 1.5 mL.
As amostras, precipitados de fibroblastos e de células cíbridas, e fatias de músculo, foram homogeneizadas e quantificadas para extração de proteína total, conforme descrito anteriormente.
5.7.2. Western Blotting
O gel de corrida era constituído de acrilamida 12%, Tris 0.37 M pH 8.8, SDS 0.1%, persulfato de amônio 0.1% e TEMED. O stacking gel constituiu-se de acrilamida 5%, tris 0.12 M pH 6.8, SDS 0.1%, persulfato de amônio 0.1% e TEMED. As proteínas foram separadas a 60 V por 30 minutos, e depois por 80 V durante, aproximadamente 3 horas.
38
pH 7.6 com TweenTM-20 0.1%) por 1 hora em temperatura ambiente ou overnight a 4oC.
A membrana foi incubada com o anticorpo primário diluído em uma solução TBS-T com 1% de leite, durante 1 hora, em temperatura ambiente com leve agitação. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (conjugado à peroxidase) por 1 hora, em temperatura ambiente com leve agitação. A detecção do sinal foi realizada utilizando-se os reagentes de detecção do Sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech), seguida da obtenção de autoradiografias. Posteriormente, a membrana foi corada com solução de amido black (amido black IOB 0.1% – naphthol blue black ou buffalo black NBR, metanol
5%, ácido acético 10%) durante 5 minutos.
5.7.3. Determinação da Concentração Ideal de Anticorpos e da Quantidade
de Proteína Total Utilizada
Diferentes concentrações de anticorpos foram testadas até que atingíssemos as concentrações ideais: 1 g/mL para anti-nitrotirosina, 0.5 g/mL para anti-SDH-Fp, e 2 g/mL para anti-porina (todos da Molecular Probes), sendo estes os anticorpos primários utilizados no estudo. Os anticorpos anti-SDH-Fp e anti-porina serviram como marcadores para as membranas contendo proteínas obtidas das linhagens cíbridas, indicando se havia a presença de proteínas nas membranas já incubadas com o anticorpo anti-nitrotirosina. A coloração com amido black foi realizada para as membranas contendo proteínas obtidas das
Os anticorpos secundários, anti-mouse e anti-rabbit (Sistema ECL– Amersham Pharmacia Biotech), foram utilizados na diluição 1:10000.
Para determinarmos a quantidade ideal de proteína a ser utilizada para o estudo, foi realizado um teste utilizando uma amostra controle com diferentes quantidades de proteínas (10, 20, 30, e 60 g). Dessa maneira, foi determinado que a quantidade ideal de proteínas fosse de 30 g para proteínas extraídas de fibroblastos, 10 g para proteínas obtidas de biópsias de músculo, e 20 g para proteínas extraídas das células cíbridas derivadas de osteosarcoma.
5.8. ANÁLISE DOS RESULTADOS
6. RESULTADOS
6.1. CARACTERIZAÇÃO DAS LINHAGENS CELULARES
6.1.1. Confirmação da Presença das Alterações nas Linhagens Cíbridas
Através da realização de quatro reações de PCR, foi possível confirmar a presença da deleção na amostra ∆16:10:40. Em amostras normais, os fragmentos A, B e C devem possuir, respectivamente, 293, 681 e 1248 pb, e o fragmento D (9063 pb) não deve ser amplificado. Para a amostra ∆16:10:40, o esperado era que apenas os fragmentos A e D fossem amplificados, pois os primers estão localizados em regiões situadas fora da porção de DNAmt deletada. Além disso, a amplificação do fragmento D da amostra em questão foi o experimento que realmente confirmou a extensão da deleção. Este fragmento abrange desde o nucleotídeo 7433 até o 16496. Como a amostra possui uma porção deletada interna ao fragmento (7982-15504), esperávamos obter uma banda de aproximadamente 1540 pb. A ausência de amplificação dos fragmentos B e C, confirma que não há DNAmt normal e que a linhagem é homoplásmica para a deleção. A eletroforese em gel de agarose 1% confirmou o padrão de bandas esperado (Figura 1).
41
Figura 1.Confirmação da Deleção da Amostra ∆16:10:40
Figura 2. Análise da Quantidade de DNAmt Mutado Presente nas Linhagens
Cíbridas
Esquemas (acima) demonstram o padrão de bandas esperado após digestão com Apa I e Ban II. No gel de agarose 1% (abaixo à esquerda), as setas indicam as
43
6.1.2. Avaliação do Grau de Comprometimento Oxidativo das Linhagens de
Fibroblastos em Cultura
Com o teste da galactose, verificamos que apenas o paciente P1 possui deficiência severa da cadeia respiratória. Assim que colocados em seleção, os fibroblastos começaram a morrer rapidamente, indicando que as células deste paciente não conseguem sobreviver dependendo apenas do metabolismo oxidativo para a produção de ATP (Tabela 5, Figura 3). Todas as outras linhagens testadas apresentaram crescimento exponencial com 20 dias de observação.
TABELA 5: Teste da Galactose – Contagem de Fibroblastos em Cultura
Contagem celular (x105)
AMOSTRA
Plaqueamento
(2 x 105 células) Seleção
1º. dia 2º. dia 3º. dia 4º. dia 5º. dia
C1 DMEM com
glicose DMEM com glicose DMEM com galactose 0.96 0.66 1.63 0.7 4.07 1.36 18 2.1 41.5 3.21
P1 DMEM com
Figura 3. Avaliação do Grau de Comprometimento Oxidativo das Linhagens
de Fibroblastos em Cultura
45
6.2. AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO NAS LINHAGENS CELULARES
6.2.1. Quantificação da Produção de Nitritos por Espectrofotometria
A análise das linhagens cíbridas mostrou um aumento estatisticamente significante na produção de nitritos em todas as linhagens, 8344 A>G (média=1.82µg nitritos/µg proteínas), 3243 A>G (média=14.62µg nitritos/µg proteínas) e ∆16:10:40 (média=21.66 µg nitritos/µg proteínas), quando comparadas com a linhagem controle 143B (média=0.79 µg nitritos/µg proteínas) (Tabela 6, Figura 4).
TABELA 6: Quantidade de Nitritos (NO2-)/proteína encontrada nas células cíbridas.
AMOSTRA
g NO2-/
g proteína
média +/-
erro padrão p
0.61 0.61
143G 0.73 0.68 +/- 0.03
0.78 0.69
9.08 11.75
3243 A>G 10.41 10.54 +/- 0.53 <0.0001 9.75
11.75 2.12 2.00
8344 A>G 2.73 2.63 +/- 0.47 0.0033 4.42
1.88 18.85 21.73
∆16:10:40 15 19.61 +/- 1.26 <0.0001 21.73
47
Figura 4. Quantidade de Nitritos Produzidos pelas Linhagens Cíbridas
TABELA 7. Quantidade de Nitritos (NO2-)/Proteína Encontrada em Fibroblastos
AMOSTRA
g NO2-/
g proteína (x10-3)
média +/-
erro padrão (x10-3) p
1.09 1.61
C1 3.14 1.66 +/- 0.38
1.28 1.18 0.34 0.28
P1 0.52 0.42 +/- 0.06 0.0122
0.61 0.34 0.35 0.21
P2 0.35 0.30 +/- 0.04 0.0074
0.21 0.38 0.71 0.90
P3 0.80 0.83 +/- 0.04 0.0615
0.90 0.84 0.26 0.39
P4 0.38 0.39 +/- 0.07 0.0112
0.65 0.28 0.53 0.94
P5 0.41 0.57 +/- 0.10 0.0241
0.55 0.43 0.80 0.90
P6 1.05 0.91 +/- 0.04 0.0841
49
Figura 5. Quantidade de Nitritos Produzidos pelos Fibroblastos
6.2.2. Quantificação de NO por Fluorimetria
A análise das linhagens cíbridas mostrou que a média de DAF/Hoechst dye para a linhagem controle foi de 0.54. A comparação dos resultados obtidos das linhagens contendo mutantes de DNAmt mostrou um aumento para a linhagem 8344 A>G (média 0.89, erro padrão 0.062) e uma diminuição nas linhagens 3243 A>G (média 0.09, erro padrão 0.019) e ∆16:10:40 (média 0.10, erro padrão 0.023). Todas as alterações observadas foram estatisticamente significantes (Tabela 8, Figura 6).
TABELA 8: Análise Fluorimétrica Utilizando os Marcadores DAF-FM e Hoechst dye em Linhagens Cíbridas Derivadas de Osteosarcoma
AMOSTRA
DO de DAF
DO de HOESCHST DYE
DO DAF/DO HOECHST
(média +/- EP) p
33 88 0.38
143B 43 61 0.70 (0.54+/-0.092)
34 62 0.55
12 242 0.05
3243 A>G 45 455 0.10 (0.09+/-0.019) 0.008
31 279 0.11
44 44 1.00
8344 A>G 32 37 0.86 (0.89+/-0.062) 0.037
42 53 0.79
7 59 0.12
∆16:10:40 3 57 0.05 (0.10+/-0.023) 0.009
11 92 0.12
51
Figura 6. Análise Quantitativa da Síntese de NO em Linhagens Cíbridas
Através do Marcador DAF-FM
53
TABELA 9: Análise Fluorimétrica Utilizando os Marcadores DAF-FM e Hoechst dye em Fibroblastos
AMOSTRA
DO de DAF
DO de HOECHST DYE
DO DAF/DO HOECHST
(média +/- EP) p
40 31 1.29
C1 25 25 1.00 (1.07+/-0.113)
34 37 0.92
26 41 0.63
P1 30 47 0.64 (0.68+/-0.045) 0.032
27 35 0.77
40 31 1.29
C1 25 25 1.00 (1.07+/-0.113)
34 37 0.92
43 61 0.70
P2 36 52 0.69 (0.58+/-0.122) 0.041
5 15 0.33
27 22 1.23
C1 38 27 1.41 (1.27+/-0.072)
41 35 1.17
54 59 0.92
P3 50 47 1.06 (0.99+/-0.041) 0.026
46 47 0.98
40 31 1.29
C1 25 25 1.00 (1.07+/-0.113)
34 37 0.92
13 23 0.56
P4 17 27 0.63 (0.55+/-0.052) 0.013
14 31 0.45
27 22 1.23
C1 38 27 1.41 (1.27+/-0.072)
41 35 1.17
48 45 1.07
P5 40 39 1.03 (1.06+/-0.015) 0.046
40 37 1.08
25 30 0.83
C1 34 15 2.27 (1.48+/-0.419)
23 17 1.35
29 30 0.97
P6 16 27 0.59 (0.91+/-0.169) 0.271
Figura 7.Análise Quantitativa da Síntese de NO em Fibroblastos
Através do Marcador DAF-FM
55
6.2.3. Detecção de NO por Microscopia de Fluorescência
A análise com o DAF-FM através de microscopia mostrou marcação na região citoplasmática de todas as linhagens celulares estudadas.
A comparação das linhagens cíbridas com a amostra controle mostrou uma marcação mais intensa para a linhagem 8344 A>G, o que confirma os nossos resultados da análise quantitativa pelo fluorímetro (Figura 8). O padrão de marcação do DAF nas amostras cíbridas mostrou-se diferente do observado no controle 143B. A marcação do controle localizou-se em região citoplasmática, apresentando aspecto granular, com presença de vários pontos marcados mais intensamente, enquanto o núcleo permaneceu negativo. A marcação da amostra 8344 A>G, obedeceu a um padrão totalmente distinto, com citoplasma com marcação intensa e homogênea, o que impossibilitou a visualização do núcleo não marcado, e presença de pontos aglomerados com marcação mais intensa (Figura 10). Após incubação das linhagens 143B e 8344 A>G com DAF + L-NAME, verificamos que esta marcação era específica (Figura 11), pois houve uma redução da marcação com a inibição da NOS pelo L-NAME.
Figura 8. Detecção de NO em Linhagens Cíbridas por Microscopia de
Fluorescência
57
Figura 9. Detecção de NO em Fibroblastos: Microscopia de Fluorescência
6.3. ANÁLISE DE PROTEÍNAS CONTENDO NITROTIROSINAS ATRAVÉS DE
WESTERN BLOTTING
61
TABELA 10: Detecção de Proteínas Contendo Nitro-tirosinas
AMOSTRAS TIPO
ANTI-NITROTIROSINA
ANTI-PORINA
ANTI-SDH AMIDOBLACK
Ctrl positivo albumina + - - +
143B lin. cíbrida - + + -
3243 A>G lin. cíbrida - + + -
8344 A>G lin. cíbrida - + + -
∆16:10:40 lin. cíbrida - + + -
C1 F - NR NR +
P1 F - NR NR +
P2 F - NR NR +
P3 F - NR NR +
P4 F - NR NR +
P5 F - NR NR +
P6 F - NR NR +
C2 M - NR NR +
C3 M - NR NR +
C4 M - NR NR +
C5 M - NR NR +
P7 M - NR NR +
P8 M - NR NR +
P9 M - NR NR +
P10 M - NR NR +
P13 M - NR NR +
P11 M - NR NR +
P1 M - NR NR +
P12 M - NR NR +
P6 M - NR NR +
P3 M - NR NR +
P5 M - NR NR +
P4 M - NR NR +
Figura 12. Detecção de Proteínas Contendo Nitrotirosinas em Linhagens
Cíbridas Através de Western Blotting
Western blotting de proteínas extraídas das linhagens cíbridas derivadas de
63
Figura 13. Detecção de Proteínas Contendo Nitrotirosinas em Fibroblastos e
Músculo Esquelético Através de Western Blotting
64
7. DISCUSSÃO
de ONOO- inativam os quatro complexos respiratórios e a ATPase em mitocôndrias extraídas de coração de mamífero (Radi et al., 1994), com um perfil de inativação similar ao observado durante exposição de células intactas ao NO (Stadler et al., 1991).
Linhagens de células cíbridas são consideradas modelos de sistemas para a investigação molecular e bioquímica de uma mutação no genoma mitocondrial, devido ao fato de possuírem o mesmo background nuclear e de diferirem apenas por uma única mutação de ponto (King & Attardi, 1989). A utilização de amostras cíbridas neste estudo, possibilitou a observação dos efeitos na síntese de NO causados por mutações presentes no DNAmt destas células.
