The expression of p53 protein in patients with multiple myeloma

EKSPRESIJA PROTEINA

p53

KOD BOLESNIKA

SA MULTIPLIM MIJELOMOM

Olivera MARKOVIĆ1_{, Dragomir MARISAVQEVIĆ}1_{, Vesna ČEMERIKIĆ}2_,

Maja PERUNIČIĆ2_{, Milica ČOLOVIĆ}2

1_{Kliničko­bolnički centar „Bežanijska kosa”, Beograd;} 2_{Institut za hematologiju, Klinički centar Srbije, Beograd}

KRATAK SADRŽAJ

Uvod Muta­cije gena­ p53 su jedna­ o­d na­jčešćih stečenih genetskih a­b­era­cija­ i lo­š pro­gno­stički fa­kto­r ko­d b­o­lesnika­ s

ra­zličitim ma­lignim b­o­lestima­. Ko­d b­o­lesnika­ sa­ multiplim mijelo­mo­m (MM) muta­cije o­v­o­g gena­ su retke, a­ wiho­v­ utica­j na­ to­k i pro­gno­zu b­o­lesti nije ja­sa­n.

Ciq rada Ciq studije je b­io­ da­ se utv­rde učesta­lo­st i klinički zna­ča­j imuno­histo­hemijske ekspresije pro­teina­ p53kod

b­o­lesnika­ sa­ no­v­o­o­tkriv­enim multiplim mijelo­mo­m.

Metod rada U ispitiv­a­we je ukqučeno­ 58 b­o­lesnika­ sa­ no­v­o­o­tkriv­enim MM (26 žena­ i 32 muška­rca­), pro­sečne sta­ro­sti

o­d 62 go­dine. Dija­gno­za­ MM je po­sta­v­qena­ na­ o­sno­v­u sta­nda­rdnih kriterijuma­. Klinički sta­dijum b­o­lesti je o­dređen pre­ ma­ kla­sifika­ciji Durija­ i Sa­lmo­na­ (Durie – Salmon), histo­lo­ški gra­dus na­ o­sno­v­u mo­rfo­lo­ških o­so­b­ina­ do­mina­ntne po­pu­ la­cije pla­zmo­cita­, a­ histo­lo­ški sta­dijum na­ o­sno­v­u pro­centa­ pla­zmo­cita­ u ko­stno­j srži. Ekspresija­ p53 je ispitivana na

pa­ra­finskim isečcima­ ko­stne srži ko­rišćewem sta­nda­rdne imuno­histo­hemijske a­na­lize s a­ntitelo­m prema­ pro­teinu p53. Uzo­rci su se sma­tra­li po­zitiv­nim a­ko­ je za­b­eležena­ ja­sna­ po­zitiv­no­st jedra­ u v­iše o­d 5% pla­zmo­cita­.

Rezultati Nukleusna­ ekspresija­ pro­teina­ p53 utv­rđena­ je ko­d dev­et b­o­lesnika­ (15,52%). Imuno­histo­hemijska­ ekspresija­

proteina p53 nije b­ila­ u zna­ča­jno­j po­v­eza­no­sti sa­ kliničkim sta­dijumo­m b­o­lesti (I+II prema­ III), ko­ncentra­cijo­m β2­mikro­glo­­ b­ulina­ u serumu (≤6 mg/l prema­ >6 mg/l), histo­lo­škim gra­duso­m (I prema­ II+III), histo­lo­škim sta­dijumo­m (<20% prema­ 21­50% prema­ >50%) i stepeno­m o­steo­litičkih lezija­ (≤3 prema­ >3). Medija­na­ preživ­qa­v­a­wa­ b­o­lesnika­ s imuno­rea­ktiv­no­šću na­

protein p53 b­ila­ je 10 meseci, a­ ko­d b­o­lesnika­ s izo­sta­nko­m imuno­rea­ktiv­no­sti na­ p53 36 meseci. Međutim, o­v­a­ ra­zlika­ nije b­ila­ sta­tistički zna­ča­jna­ (p=0,2).

Zakqučak Učesta­lo­st imuno­histo­hemijske ekspresije pro­teina­ p53 ko­d ispita­nika­ sa­ no­v­o­o­tkriv­enim MM je rela­tiv­no­

ma­la­. Nije utv­rđena­ po­v­eza­no­st ekspresije o­v­o­g pro­teina­ s kliničkim i histo­lo­škim o­so­b­ina­ma­ b­o­lesti, niti sa­ v­reme­ no­m preživ­qa­v­a­wa­ b­o­lesnika­.

Kqučne reči: multipli mijelo­m; imuno­histo­hemija­; p53; b­io­lo­gija­; pro­gno­za­

UVOD

Gen p53 je jedan od kqučnih gena u složenoj mre­

ži signalnih puteva odgovornih za regulaciju ćelij­ skog ciklusa i apoptoze. Wegov genski proizvod, pro­ tein p53, kontroliše ćelijski ciklus (u G1iG2 fa­

zi) i apoptozu ćelija odgovarajući na nenormalne proliferacione signale i stres, ukqučujući ošte­ ćewe DNK [1]. Po svojoj strukturi je jedarni fosfo­ protein čiji se gen nalazi na kratkom kraku hromo­ zoma 17 [2]. U normalnim ćelijama koje nisu izlože­ ne stresu protein p53 se vezuje za MDM­2, JNKili

Pirh­2, koji promovišu wegovu degradaciju preko pu­

ta ubikvitin­proteozoma [3]. Posle izlagawa ćelije stresu ili oštećewa DNK različitim mehanizmima, dolazi do aktivacije gena p53, koji učestvuje u otkla­

wawu nastalog oštećewa ili dela DNK kada je ošte­ ćewe veliko [3]. Čiwenice da je p53 najčešće deleti­

ran ili mutiran gen u tumorima kod čoveka i da po­ rodice sa germinativnim mutacijama 53 imaju pove­ ćanu sklonost za malignitete u mlađem životnom do­ bu ukazuju na značajnu ulogu gena p53 u sprečavawu ma­

lignog preobražaja [3, 4]. Inaktivacija proteina p53

može biti posledica mutacije wegovog gena ili gu­ bitka alela mehanizmom insercije i delecije. Muta­ cije gena p53 utiču na interakciju proteina p53sa

DNK, odnosno narušavaju wegov strukturni integri­ tet, vodeći delimičnom ili potpunom gubitku wego­

ve funkcije [4]. Dosad je opisano 21.000 različitih mutacija gena p53 koje su zabeležene u različitim

tipovima tumora kod qudi, a oko 20% wih se nalazi u pet tzv. žarišnih (hotspot) kodona [4­6]. Mutaci­

je gena p53 vode ekspresiji izmewenog proteina p53

(90%) ili potpunom izostanku proteina (10%). Ia­ ko najčešće mutacije gena p53 vode potpunom gubit­

ku aktivnosti proteina, u više od 50% retkih muta­ cija ovog gena zadržava se značajna aktivnost prote­ ina [4]. Mutantni oblici proteina p53 predstavqaju

vrlo heterogenu grupu s različitim stepenom gubit­ ka aktivnosti, što može doprineti različitom kli­ ničkom ispoqavawu tumora, ali i teškoćama u utvr­ đivawu wihovog značaja u kliničkim studijama [4]. Do inaktivacije gena p53 može doći i inhibicijom

promotera gena p53, odnosno povećawem ekspresije

inhibitora proteina p53 [5]. Na primer, nagomila­

vawe onkoproteina MDM­2, koji pravi kompleks sa

proteinom p53, dovodi do gubitka aktivacione spo­

sobnosti proteina p53. Slično tome, vezivawe za vi­

rusne proteine može izazvati gubitak wegove aktiv­ nosti ili ubrzawe wegovog raspada. U nekim solid­ nim malignitetima opisana je i citoplazmatska lo­ kalizacija proteina p53, koja može doprineti gubit­

ku aktivnosti proteina p53 [5].

Mutacije gena p53beleže se kod više od 50% so­

lidnih tumora, a u nekima od wih (tumori pluća i dojke) su indikator loše prognoze bolesti_{[7, 8].}

U hematološkim malignitetima mutacije gena p53

su ređe, ali, kada postoje, pokazateq su loše prog­ noze, naročito kod bolesnika s akutnom mijeloid­ nom leukemijom, mijelodisplastičnim sindromima i agresivnim nehočkinskim (non­Hod­gkin) limfo­

mima [9]. Nastanak ovih mutacija je često povezan s recidivom ili pogoršawem hematoloških malig­ niteta, odnosno s agresivnijim tokom bolesti [9]. Mutacije gena p53 se retko otkrivaju i kod bolesni­

ka sa multiplim mijelomom (MM) [10­16], a wihov značaj u patogenezi i uticaj na tok bolesti nisu u potpunosti jasni.

CIQ RADA

Ciq rada je bio da se odrede učestalost imunohi­ stohemijske ekspresije proteina p53 i wegov klini­

čki značaj kod bolesnika sa novootkrivenim MM.

METOD RADA

Ispitivawem je obuhvaćeno 58 bolesnika sa novo­ otkrivenim MM, dijagnostikovanih i lečenih u In­ stitutu za hematologiju Kliničkog centra Srbije u Beogradu. Ispitivawe je obavqeno od januara 1997. do januara 2000. godine. Ispitanici su nadgledani najmawe 27 meseci, a najviše 63 meseca (studija je za­ kqučena aprila 2002. godine). Kod svih bolesnika su u lokalnoj anesteziji urađene aspiraciona punkci­ ja i trepanaciona biopsija grebena ilijačne kosti. Dijagnoza MM postavqena je na osnovu kriterijuma

ChronicLeukemia-MyelomaTaskForce [17]. Klasifika­

cija po kliničkim stadijumima izvršena je po siste­ mu Djurija i Salmona (Durie – Salmon) [18]. Analizi­

rani su sledeći parametri: starost, kompletna krv­ na slika sa leukocitnom formulom, funkcija bubre­ ga (urea, kreatinin), kalcijum, fosfor i ukupni pro­ teini u serumu, elektroforeza i imunoelektrofore­ za proteina, CRP, β2­mikroglobulin, proteini u 24­

časovnom urinu (kvalitativno i kvantitativno) i prisustvo litičnih lezija kostiju. Histološka kla­ sifikacija je urađena prema modelu koji su predloži­ li Sejler (Sailer) i saradnici [19] 1995. godine, pre­

ma kojem se klasifikacija obavqa na osnovu morfo­ loških osobina dominantne populacije plazmocita (gradus I – zreli, gradus II – intermedijarni, gradus III – plazmablastni mijelom). Prema stepenu infil­

tracije kostne srži, bolesnici su svrstani u tri gru­ pe (stadijum I – mawe od 20% plazmocita, stadijum II

– 20­50% plazmocita, stadijum III – više od 50% pla­

zmocita u kostnoj srži) prema modelu Bartla (Bar­ tl) i saradnika [20]. Proliferaciona aktivnost mi­

jelomskih ćelija ispitana je metodom imunohistohe­ mije uz korišćewe antitela prema Ki­67, prema mode­

lu Laja (Lai) i saradnika [21].

Svi bolesnici su lečeni konvencionalnom hemi­ oterapijom (32 bolesnika protokolom VAD, 14 bole­

snika protokolom VMCP, 11 bolesnika protokolom

VBMCP i jedan bolesnik kombinacijom prednizona

i melfalana). Ukupno preživqavawe je računato od trenutka postavqawa dijagnoze bolesti.

Metod imunohistohemije

Ekspresija proteina p53 ispitivana je na parafin­

skim isečcima kostne srži dobijenim trepanobiop­ sijom grebena ilijačne kosti, uz upotrebu trokara po Jamšidi (Jamshid­a) u lokalnoj anesteziji. Cilindri

kostne srži su fiksirani u B5 fiksativu, dekalci­

fikovani u petoprocentnom vodenom rastvoru mra­ vqe kiseline u trajawu od šest sati i kalupqeni u parafinu. Sečewem parafinskih blokova, sa longitu­ dinalno usmerenom kosti, dobijeni su isečci debqi­ ne 3 µm, koji su zatim deparafinisani ksilolom i

rehidrirani alkoholima. S obzirom na to da su pre­ parati fiksirani u B5, pre započiwawa postupka

precipitati živinog pigmenta otklawani su sa de­ parafinisanih isečaka Lugolovim rastvorom i na­ trijum­tiosulfatom. Za demaskirawe epitopa prime­ wen je mikrotalasni pretretman u 0,01 M citratnom puferu pH 6,0 (dva puta po pet minuta). Kao primar­

no antitelo korišćeno je komercijalno monoklon­ sko antitelo prema proteinu p53 (DAKO, M7001 klon DO­7). Za vizuelizaciju je korišćen LSAB­2 (DAKO LSAB­2 System, KO675), a kao hromogen upotrebqen je AEC (DAKO, K3464). Posle nanošewa hromogena pri­

mewivano je kontrastno bojewe hematoksilinom po Majeru (Mayer). Svi uzorci kostne srži su pregleda­

ni na uveličawu od 400 puta, koje su nezavisno ana­ lizirala dva autora. Ekspresija proteina p53 u mije­

lomskim ćelijama utvrđena je na osnovu procenta pla­ zmocita (određenog brojawem najmawe 500 plazmoci­ ta na više različitih vidnih poqa), koji su pokazi­ vali imunoreaktivnost s antitelom p53. Uzorci su

smatrani pozitivnim kada je u 5% ili više plazmo­ cita zabeležena jasna pozitivnost jedra [22]. Kao po­ zitivna kontrola korišćeni su parafinski isečci kolorektumskog karcinoma u kojem je utvrđen visok stepen ekspresije ovog proteina, a kao negativna kon­ trola uzorci na kojima je umesto primarnog antite­ la korišćen pufer.

Statistička analiza podataka

Za statističku analizu podataka korišćen je pro­ gramski paket SPSS, verzija 8. Povezanost imunohi­

stohemijske ekspresije proteina p53 sa kliničkim,

biohemijskim i patohistološkim parametrima bo­ lesti ispitivana je Spirmanovim (Spearman) koefi­

cijentom korelacije ranga i χ2_{­testom. Uticaj prisu­}

stva imunoekspresije proteina p53 na preživqava­

we bolesnika procewivan je Kaplan­Majerovim (Ka­ plain-Meier) metodom (log­rank test).

REZULTATI

Kliničke odlike ispitivanih bolesnika prika­ zane su u tabeli 1. Imunohistohemijska reaktivnost uzoraka na antitelo p53 utvrđena je kod devet od 58

bolesnika, ili 15,52% ispitanika (Slika 1). Prime­ nom Spirmanovog koeficijenta korelacije ranga i χ2_{­testa nije utvrđena povezanost imunohistohemij­}

SLIKA 1. Iseča­k ko­stne srži b­o­lesnika­ sa­ multiplim mijelo­­ mo­m ko­ji po­ka­zuje imuno­rea­ktiv­no­st pla­zma­­ćelija­ s a­ntitelo­m p53 (uv­eliča­we ×400).

FIGURE 1. _{Section of paraffin-embedded bone marrow specimen in} myeloma patient showing the immunoreactivity of plasma cells with anti-p53 antibody (magnification, ×400).

GRAFIKON 1. Vero­v­a­tno­ća­ preživ­qa­v­a­wa­ b­o­lesnika­ s imuno­­ rea­ktiv­no­šću p53 u 5% i v­iše pla­zmo­cita­ (isprekida­na­ linija­) i b­o­lesnika­ s imuno­rea­ktiv­no­šću p53 u do­ 5% pla­zmo­cita­ (pu­ na­ linija­).

GRAPH 1. _{Probability of survival in patients with p53 immunoreactivity} in ≥5% of plasma cells (broken line), compared to patients with p53 im-munoreactivity in <5% of plasma cells (full line) (log-rank test). TABELA 1. Kliničke o­dlike b­o­lesnika­ sa­ multiplim mijelo­mo­m.

TABLE 1. Clinical features of patients with multiple myeloma on pres-entation.

Odlike

Variables

Broj bolesnika Numb

er of pa

tien

ts

Sredwa vrednos

t

M

ean v

alue

Medi

jana

M

edian

Ops

eg

R

ange

Sta­ro­st (go­dine)

Age (years) 58 61.74 63 38­80

Ukupni pro­teini (g/l)

Total proteins (g/l) 58 91.98 90 55­147

Alb­umini (g/l)

Albumins (g/l) 58 34.76 35.05 17.16­46.32 Hemo­glo­b­in (g/l)

Hemoglobin (g/l) 58 96.57 92.50 48­165

Tro­mb­o­citi (×109_/l)

Platelets (×109_/l) 58 226.79 221 27­690 CRP (mg/l)

CRP (mg/l) 38 16.14 9.50 0.00­95

β2­mikro­glo­b­ulin (mg/l)

β2-microglobulin (mg/l) 25 7.12 3.87 1.28­20.7 Krea­tinin (µmol/l)

Creatinine (µmol/l) 58 186.14 118.65 56­896

Ka­lcijum (mmol/l)

Calcium (mmol/l) 58 2.53 2.39 2.00­3.90

Pro­teinurija­ (g/24 h)

Urinary proteins (g/24 h) 57 1.79 1.20 0.10­6.70

Bro­j o­steo­litičkih lezija­

Number of osteolytic lesions 58 3.43 3 0.00­8

Pla­zmo­citi u ko­stno­j srži (%)

Plasma cells in bone marrow (%) 58 48.61 44 12­95

zmocita) je bila 10 meseci, a kod bolesnika s izostan­ kom imunoreaktivnosti na ovo antitelo (do 5% pla­ zmocita) 36 meseci, ali ova razlika nije bila stati­ stički značajna (Grafikon 1).

DISKUSIJA

Ćelije sa nedostatkom aktivnosti p53 nemaju spo­

sobnost zaustavqawa ćelijskog ciklusa u fazi G1 po­

sle oštećewa DNK, što dovodi do izostanka otklawa­ wa genetski oštećene ćelije mehanizmom programi­ rane ćelijske smrti (apoptozom) [1]. Gubitak funkci­ je proteina p53 najčešće je posledica “missense” muta­

cije gena p53, zatim “nonsense” mutacije gena ili dele­

cije regiona 17p13 [3]. Učestalost i distribucija me­

sta mutacija se razlikuju između maligniteta koja po­ tiču od različitih vrsta tkiva. Mutacije gena p53 mo­

gu biti locirane na različitim mestima, ali su naj­ češće između aminokiselinskih rezidua 130 i 290. Različiti mutirani oblici ovog gena imaju i razli­ čita biološka i biohemijska svojstva, zbog čega bo­ lesnici s različitim mutiranim oblicima protei­

nap53 imaju i različitu prognozu [4].

Mutacije gena p53 se otkrivaju različitim moleku­

larnim tehnikama (PCR, FISH, Southernblotting), ali i

tehnikom imunohistohemije, kojom se prisustvo mu­ tacija određuje indirektno. Naime, zbog kratkog po­ luživota (6­20 minuta) „divqi” tip proteina p53

se ne akumulira u normalnim tkivima u količina­ ma koje se mogu otkriti imunohistohemijskim meto­ dom. Mutirani oblici proteina imaju duži poluži­ vot od „divqeg” tipa, što dovodi do nakupqawa veli­ ke količine ovog proteina u malignim ćelijama, ko­ ji na taj način postaje detektabilan imunohistohe­ mijskim metodom [3]. Međutim, imunoreaktivnost na antitelo p53 nije u apsolutnoj korelaciji sa pri­

sustvom mutacija gena p53 zbog toga što tzv. nonsense

mutacije ovog gena dovode do sinteze izmewenog pro­ lesnika, vrednošću ukupnih proteina, albumina, he­

moglobina, CRP, β2­mikroglobulina, kreatinina i

kalcijuma u serumu, brojem trombocita i odgovorom na terapiju. Imunohistohemijska ekspresija protei­

nap53 nije bila statistički značajno povezana ni sa

kliničkim stadijumom bolesti (I+II prema III), histo­

loškim gradusom (I prema II+III), histološkim stadi­

jumom (I prema II prema III) i brojem osteolitičkih

lezija (≤3 prema >3).

Medijana preživqavawa bolesnika sa jedarnom imunoreaktivnošću na antitelo p53 (5% i više pla­

Време (месеци) / Time (months)

Ве

ро

ва

тн

оћ

а

пр

еж

ив

љ

ав

ањ

а (% б

ол

ес

ни

ка

)

Cu

m

ul

at

ive p

er

ce

nt

s

ur

vi

vi

ng

(%

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

p=0.2

p53 негативан

p53-negative

teina koji gubi imunoreaktivnost s antitelom p53.

Takođe, ekspresija ovog proteina može biti reguli­ sana i drugim mehanizmima, nezavisnim od genskih mutacija [4].

U ovoj studiji ekspresija jedra proteina p53 zabe­

ležena je kod 15,52% bolesnika sa novootkrivenim mijelomom. Mala učestalost ekspresije p53 (do 10%

bolesnika) [10, 11, 13­16] ili čak izostanak mutacije gena p53 [13] opisani su u studijama koje su koristi­

le molekularne tehnike dokazivawa mutacija (uglav­ nom PCR), iz čega je izveden zakqučak da mutacije

ovog gena nisu od većeg značaja za patogenezu MM. Za­ nimqivo je da znatno veću učestalost mutacija gena

p53 (16,6­39% bolesnika) opisuju autori studija u ko­

jima je primewivana imunohistohemijska tehnika ko­ jom se mutacije gena p53 otkrivaju indirektno [12,

21­25]. Pruneri (Pruneri) i saradnici [25] su utvrdi­

li imunoreaktivnost na antitelo p53 kod čak 39,6%

ispitanika, dok su u istoj grupi bolesnika mutaci­ je PCR tehnikom dokazane kod svega 8,8% wih. Razli­

ke u učestalosti mutacija gena p53 uslovqene kori­

šćenom tehnikom otkrivawa pripisuju se nepotpu­ noj analizi svih regiona gena p53PCR tehnikom, od­

nosno lažno pozitivnoj imunohistohemijskoj anali­ zi kao posledici povećane količine proteina p53u

normalnim tkivima sa brzom proliferacijom (ak­ tivirani T­limfociti) ili vezivawa za neke pro­

teine koji ga inaktiviraju, ali produžavaju wegov život [9]. S obzirom na to da nema optimalnog meto­ da za procenu aktivnosti proteina p53, kombinova­

na primena različitih metoda otkrivawa, ali i ana­ liza transkripcione aktivnosti gena p53 određiva­

wem aktivnosti gena koje aktivira gen p53 (MDM­2, p21), mogla bi doprineti donošewu pouzdanijih za­

kqučaka o značaju gubitka aktivnosti ovog gena u po­ jedinim malignim oboqewima.

Za razliku od bolesnika sa multiplim mijelomom, mutacije gena p53 se češće otkrivaju u plazmocitnoj

leukemiji (20­40% bolesnika) [26]. Pretpostavqa se da su ove mutacije, kao „kasni događaj” u malignoj tran­ sformaciji plazmocita, možda odgovorne za prelazak u agresivniji oblik bolesti, tj. leukemijsku fazu.

U literaturi je malo podataka o uticaju mutacija gena p53 na kliničke odlike i tok bolesti. U našoj

studiji nije zabeležena značajna povezanost imuno­ histohemijske ekspresije proteina p53 sa kliničkim

i histološkim parametrima bolesti, što je u skla­ du s rezultatima studije Pajdaša (Payd­aş) i saradni­

ka [23]. S druge strane, Kanavaros (Kanavaros) i sarad­

nici [24] su utvrdili da je povećana ekspresija pro­ teina p53 povezana sa visokim proliferacionim po­

tencijalom malignih ćelija, plazmoblastnom morfo­ logijom i visokim stepenom infiltracije kostne sr­ ži. U literaturi postoje podaci da mutacije p53 ima­

ju uticaj na razvoj rezistencije malignih ćelija na citotoksične lekove kod različitih vrsta solidnih i hematoloških maligniteta, što je u vezi sa wego­ vim značajem u očuvawu integriteta genoma i kquč­ noj ulozi u apoptozi. Međutim, postoji malo podata­ ka o povezanosti mutacija gena p53 sa rezistencijom

mijelomskih ćelija na ove lekove. U pojedinim studi­ jama je utvrđena povezanost delecije gena p53 sa re­

zistencijom bolesti na terapiju [27, 28]. Međutim,

u našoj studiji, kao ni u studiji Pajdaša i saradni­ ka [23], nije utvrđena razlika u odgovoru na terapiju u odnosu na imunoekspresiju na antitelo p53. Opreč­

ni podaci o značaju p53 za rezistenciju na terapiju

mogu se protumačiti kako različitim genetskim i negenetskim mehanizmima inaktivacije genap53, ta­

ko i složenošću još nedovoqno razjašwenih meha­ nizama rezistencije na lekove [29].

U nekoliko studija je utvrđeno da su delecije gena

p53 nezavisan prognostički faktor u MM bez obzi­

ra na to da li se primewuje konvencionalna hemio­ terapija ili visokodozna hemioterapija s autologom transplantacijom kostne srži [28, 30]. Kraće preži­ vqavawe bolesnika sa mijelomom i nukleusnom imu­ noekspresijom proteina p53 utvrdili su Pruneri i

saradnici [25] 2003. i Kumar (Kumar) i saradnici

[12] 2004. godine, zakqučujući da je imunohistohemij­ ska ekspresija proteina p53 pokazateq agresivnijeg

toka bolesti. Iako su naši bolesnici sa ekspresi­ jom jedra proteina p53 živeli u proseku tri i po pu­

ta kraće nego bolesnici s izostankom imunoekspre­ sije ovog proteina (10 prema 36 meseci), ova razlika nije dostigla nivo statističke značajnosti.

ZAKQUČAK

Iako ova studija nije sa sigurnošću utvrdila kli­ nički značaj imunohistohemijske ekspresije protei­

nap53 u multiplom mijelomu, nadamo se da će buduća

ispitivawa na većem broju ispitanika i praćewe prisustva mutacija u različitim fazama bolesti do­ neti pouzdanije zakqučke o ulozi mutacija gena p53

u ovoj bolesti.

LITERATURA

1. VogelsteinB,KinzlerKW.p53functionanddysfunction.Cell12; 70:523-5.

2. MartinACR,FacchianoAM,CuffAL,etal.Integratingmutation dataandstructuralanalysisofthep53tumour-suppressorprotein. HumanMutation2002;1:14-64.

3. PalmeroI,PetersG.Perturbationofcellcycleregulatorsinhuman cancer.CancerSurv16;27:351-67.

4. SoussiT,KatoS,LevyP,IshiokaC.ReassessmentoftheTP53muta-tiondatabaseinhumandiseasebydataminingwithalibraryof TP53missensemutations.HumMutat2005;25:6-17.

5. HamrounD,KatoS,IshiocaC,ClaustersM,BeroudC,SoussiT. TheUMDTP53databaseandwebsite:updateandrevisions.Hum Mutat2006;27(1):14-20.

6. SoussiT,LozanoG.p53mutationheterogeneityincancer.Biochem-icalandBiophysicalResearchCommunications2005;331:34-42. 7. HorioY,TakahashiT,KuroishiT,etal.Prognosticsignificanceof

p53mutationsand3pdeletionsinprimaryresectednon-smallcell lungcancer.CancerRes13;53:1-6.

. ThorlaciusS,BorresenAL,EufjordJE.Somaticp53mutationsin humanbreastcarcinomasinanIcelandicpopulation:Aprognos-ticfactor.CancerRes13;53:1637-40.

. ImamuraJ,MiyoshiI,KoefflerHP.p53inHematologicmalignan-cies.Blood14;4():2412-21.

10. OllikainenH,SyrjanenS,KoskelaK,etal.p53genemutationsare rareinpatientsbutcommoninpatient-originatingcelllinesinmul-tiplemyeloma.ScandJClinLabInvest17;57(4):21-. 11. NeriA,BaldiniL,TreccaL,etal.p53genemutationsinmultiple

myelomaareassociatedwithadvancedformsofmalignancy.Blood 13;1(1):12-35.

indicesexpressionofp53andmultidrugresistancegenesinmulti-plemyelomapatients.AnalQuantCytolHistol2004;26(5):271-7. 13. CorradiniP,InghiramiG,AstolfiM,etal.Inactivationoftumor

suppressorgenes,p53andRb1inplasmacelldyscrasias.Leuke-mia14;(5):75-67.

14. PreudhommeC,FaconT,ZandeckiM,etal.Rareoccurrenceofp53 genemutationsinmultiplemyeloma.BrJHaematol12;1(3): 440-3.

15. OwenRG,DavisSA,RandersonJ,etal.p53genemutationsinmul-tiplemyeloma.MolPathol17;50(1):1-20.

16. YasugaY,HirosawaS,YamamotoK,etal.N-rasandp53genemuta-tionsareveryrareeventsinmultiplemyeloma.IntJHematol15; 62(2):1-7.

17. ChronicLeukemiaandMyelomaTaskForceoftheNationalCan-cerInstitute.Proposedguidelinesforprotocolstudies.Plasmacell myeloma.CancerChemotherRep173;4:145-5.

1. DurieBG,SalmonSE.Aclinicalstagingsystemformultiplemye-loma.Cancer175;36:42-54.

1. SailerM,VykoupilKF,PeestD,etal.Prognosticrelevanceofa histologicclassificationsystemappliedinbonemarrowbiopsies frompatientswithmultiplemyeloma:Ahistopathologicalevalua-tionofbiopsiesfrom153untreatedpatients.EurJHaematol15; 54:137-46.

20. BartlR,FrischB,Fateh-MoghadamA,etal.Histologicclassifica- tionandstagingofmultiplemyeloma.Aretrospectiveandprospec-tivestudyof674cases.AmJClinPathol17;7:342-55. 21.

LaiMD,MedeirosQ,WilsonCS,etal.Expressionofthecell-cycle-relatedproteinsE2F-1,p53,mdm-2,p21waf-1_,andKi-67 inmulti-plemyeloma:correlationwithcyclin-D1immunoreactivity.Mod Pathol1;11(7):642-7.

22. ElghetanyTM,AlterB.p53Proteinoverexpressioninbonemarow biopsiesofpatientswithShwaahman-DiamondSyndromehasa prevalencesimilartothatofpatientswithrefractoryanemia.Arch PatholLabMed2002;126:452-5.

23. PaydaşS,ŞahinB,SeyrekE,ZorludemirS.p53proteinexpression inmultiplemyeloma.AnnMedSci17;6:15-17.

24. KanavarosP,StefanakiK,VlachonikolisJ,etal.Immunohistochem-icalexpressionofthep53,p21/waf-1,Rb,p16andKi-67proteinsin multiplemyeloma.AnticancerRes2000;20(6):461-25.

25. PruneriG,CarboniN,BaldiniL,etal.Cellcycleregulatorsinmul-tiplemyeloma:prognosticimplicationofp53nuclearaccumulation. HumPathol2003;34(1):41-7.

26. HallekM,BergsagelPl,AndersonKC.Multiplemyeloma:Increas-ingevidenceforamultisteptransformationprocess.Blood1; 1(1):3-21.

27. ElnenaeiMo,Gruszka-WestwoodAM,A’HerntR,etal.Geneabnor-malitiesinmultiplemyeloma;therelevanceofTP53,MDM2,and CDKN2A.Haematologica2003;(5):52-37.

2. ChangH,QiC,YiQL,ReeceD,StewartAK.p53genedeletionby fluorescenceinsituhybridisationisanadverseprognosticfactor forpatientswithmultiplemyelomafollowingautologousstemcell transplantation.Blood2005;105(1):35-60.

2. LiuS,BishopRW,DasmahapatraB,WangY.Pharmacogenomicof thep53tumorsuppressoranditsroleincancerchemoresistance. DrugDevRes2004;62:254-72.

30. DrachJ,AckermannJ,FritzE,etal.Presenceofap53genedele-tioninpatientswithmultiplemyelomapredictsforshortsurvival afterconventional-dosechemotherapy.Blood1;2(3):02-.

Introduction Although mutations of p53 are one of the most often acquired genetic changes in malignant tumors, these mutations are rare events in patients with newly diagnosed multiple myeloma (MM). Moreover, there are a few literature data about clinical significance of p53 overexpression in mul-tiple myeloma.

Objective The aim of our study was to evaluate the clinical significance of p53 immunoexpression in multiple myeloma. Method A total of 58 patients with newly diagnosed MM (26 females and 32 males, mean age 62 years) were enrolled in the study. The diagnosis of MM was made according to criteria of Chronic Leukemia-Myeloma Task Force. Clinical staging was done according to Durie and Salmon classification (4 patients had disease stage I, 15 patients stage II and 39 patients stage III). The histological grade and histological stage were determined according to predominant plasma cell morphology and vol-ume of myeloma infiltration, respectively. Standard immuno-histochemical analysis with p53 antibody in B5-fixed and par-affin-embedded bone marrow specimens was used to eval-uate the expression of p53 in myeloma cells. The specimens were considered positive when ≥5% of plasma cells exhibited clear nuclear positivity.

Results Out of 58 patients, p53 expression was detected in 9 (15.52%). No significant correlation was found between p53

expression and clinical stage (I+II vs. III), ß2-microglobulin level (≤6 mg/L vs. >6mg/L), histological grade (I vs. II+III), histologi-cal stage (<20% vs. 21-50% vs. >50%) and the extent of osteo-lytic lesions (≤3 vs. >3 lesions). Median survival of patients with p53 immunoreactivity in =>5% of plasma cells was 10 months, whilst median survival of patients with p53 immunoreactivi-ty in <5% of plasma cells was 36 months. However, such differ-ence was not significant (p=0.2).

Conclusion The frequency of p53 immunoexpression in our group of newly diagnosed MM was relatively low. Although p53 immunoexpression was not associated with clinical and histological features of more aggressive disease, or with short-er survival, furthshort-er investigations of largshort-er group of patients will lead to final conclusions.

Key words: multiple myeloma; p53; immunohistochemistry; clinical significance; prognosis

Olivera MARKOVIĆ

Kliničko-bolnički centar „Bežanijska kosa” Auto put bb, 11080 Zemun

Tel.: 011 559 896 Faks: 011 699 937 E-mail: dragano@ptt.yu

THE EXPRESSION OF p53 PROTEIN IN PATIENTS WITH MULTIPLE MYELOMA

Olivera MARKOVIĆ1_{, Dragomir MARISAVLJEVIĆ}1_{, Vesna ČEMERIKIĆ}2_{, Maja PERUNIČIĆ}2_{, Milica ČOLOVIĆ}2 1_{Medical Training Center “Bežanijska kosa”, Belgrade;} 2_{Institute of Hematology, Clinical Center of Serbia, Belgrade}