UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS - DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
ANDRÉ DE MACÊDO MEDEIROS
MUDANÇAS ENDÓGENAS E SUPRAFISIOLÓGICAS NOS NÍVEIS DE ESTRÓGENO: EFEITOS SOBRE A AMNÉSIA INDUZIDA PELA
ESCOPOLAMINA EM RATAS INTACTAS
MUDANÇAS ENDÓGENAS E SUPRAFISIOLÓGICAS NOS NÍVEIS DE ESTRÓGENO: EFEITOS SOBRE A AMNÉSIA INDUZIDA PELA
ESCOPOLAMINA EM RATAS INTACTAS
ANDRÉ DE MACÊDO MEDEIROS
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Regina Helena da Silva
NATAL - RN JANEIRO 2014
“Ignorance more frequently begets confidence than does knowledge: it is those who know little, and not those who know much, who so positively assert that this or that problem will never be solved by science.”
Agradecimentos
Nossa, nem acredito! Realmente escrever esta parte da dissertação é como entrar numa máquina do tempo e reviver tudo o que passei. Todas as dificuldades, alegrias, puxões de orelha, conhecimento adquirido, amigos, lugares e momentos. Alguns inesquecíveis. Lembro-me de quando entrei para a vida científica e, especificamente, para a neurociência. O motivo veio de dentro de casa. Cresci vendo um ente da família se degenerar ano após ano numa cama, fazendo grunhidos, tentando falar, talvez pedindo ajuda para sair daquela situação.
Explico melhor. Dedico minha vida acadêmica e meu empenho em memória à minha tia, Maria, que eu não tive oportunidade de conversar, nem de aprender com suas histórias. Infelizmente, a doença de Alzheimer acabou desfazendo esse encontro. Aquilo me marcou porque a observava naquele estado e nada podia fazer. Ali eu já sabia que queria ajudar a desvendar os mistérios por trás das doenças. Tia, onde você estiver, eu estou dando o meu máximo.
É engraçado que alguém pudesse se desenvolver por essa área mesmo saindo de um berço tão religioso. Às vezes, tendo que discutir ciência em casa e bater de frente com algumas questões enraizadas. É complicado, é polêmico, mas com jeitinho as coisas vão fluindo. Uma vitória que eu consegui foi que meu ponto de vista fosse respeitado. Isso já é uma grande vitória. À minha família, hoje sou quem sou, em grande parte, devido a vocês. Saibam que em todos os lares existem suas imperfeições, mas é o amor que prevalece.
Os primeiros amigos que fiz nessa trajetória foram um presente. Isabella, Raí e Anderson, obrigado por construir e unir ciência e amizade de forma tão sólida e divertida. Vou carregar a amizade de vocês até o fim. Ao Hermany, por me apresentar ao LEME, minha escola diária tanto profissional como pessoal. Aos amigos Ezequiel e Priscila, pela afinidade, carinho, atenção, paciência e sensibilidade a que tiveram comigo ao longo desses anos. A todos os queridos amigos da família LEME que ajudam direta e indiretamente no meu crescimento. Ana, Aline, Fernanda, Luiz, Diana, Aldair, Clarissa, Ywlliane, Ramon, Ivon, Sarah, Vanessa, Gênedy, Thieza (espero que não tenha esquecido ninguém). Muito obrigado mesmo.
naquela época, a situação do nosso laboratório não era das melhores. Fiquei impossibilitado de pesquisar aquilo que eu tanto queria. Em conjunto com minha orientadora, Regina, bolamos um projeto alternativo com um modelo de amnésia. O sujeito experimental: fêmeas, é claro. Não porque sobravam fêmeas no biotério (o que era ótimo pra mim), mas porque eram pouco estudadas mundo afora. Ainda são, só que nos últimos anos o quadro melhorou bastante. Por que eram pouco estudadas? Talvez por ser trabalhoso explicar tantas variações comportamentais devido às suas oscilações hormonais.
O desafio foi aceito. Comecei exatamente no dia 19 de janeiro de 2009 meu primeiro experimento. Entre meses de aulas e provas na graduação, fui fazendo os experimentos sempre que podia nos meses de “férias”. Experimento I finalizado, vamos ao experimento II em julho de 2010. Ano especial pra mim. Ano em que pude me conhecer melhor. Experimento II finalizado em julho de 2011. Ano de conclusão de curso resumido em ansiedade, dúvidas, indecisões de que rumo tomar e o que fazer da vida. TCC apresentado, bem elogiado, enfim biomédico. Decido continuar minha trajetória pela busca do conhecimento. Passo no mestrado e continuo meus experimentos.
Experimento III finalizado em junho de 2012. Ainda faltava algo. Algo que só se resolveu recentemente, depois de meses de angústia, sentimento de frustração e desânimo. Agradeço durante esse período ao apoio e incentivo constantes do Dr. Ronaldo e Dr. Geison. Muito do que disseram me fez prosseguir.
Saio do mestrado diferente de quando entrei. Diferente não só porque hoje sei mais do que ontem, mas também porque penso diferente.
Agradeço minha construção como pesquisador aos meus mestres, conselheiros e espelhos: Dra. Regina Helena da Silva, Dra Alessandra Mussi Ribeiro e Dr. Geison Souza Izídio. Obrigado por cada palavra.
Por fim, agradeço ao objeto do meu estudo: minhas queridas ratinhas. Não seria capaz de provocar sofrimento a nenhum tipo de animal, mas sem eles a ciência não caminha.
Resumo
Estudos com animais experimentais têm sugerido que o estrógeno ajuda a reduzir déficits cognitivos aumentando o estado funcional do sistema colinérgico. Porém, a maioria dos modelos que pesquisam o envolvimento desse sistema sobre a memória não consideram as variações hormonais naturalmente presentes em animais intactos. Neste estudo, procuramos avaliar a ação endógena e suprafisiológica do estrógeno sobre os déficits produzidos pela escopolamina (ESC) sobre a memória aversiva de ratas em diferentes fases do ciclo estral em uma tarefa de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE). Foram utilizadas ratas Wistar, as quais passaram por sessões de treino e teste em 3 experimentos: (I) Ratas em diferentes fases do ciclo receberam ESC (1 mg/kg i.p) ou salina 20 minutos pré-treino; (II) Ratas em diestro (DIE) receberam o mesmo tratamento em (I) mais valerato de estradiol i.m (VE; 1 mg/kg) ou óleo de gergelim (VEH) 45 minutos pré-treino; (III) Ratas em DIE receberam o mesmo tratamento em (I), mais VE ou VEH pós-treino. A sessão de teste foi realizada 24 horas após a sessão de treino em todos os experimentos. Os principais resultados mostraram que: (1) ESC induziu amnésia, comportamento ansiolítico e aumento da atividade motora em todos os experimentos e (2) prejudicou a aquisição da tarefa apenas para os animais em DIE; (3) o VE preveniu o prejuízo na aquisição induzido pela ESC e (4) alterou o processo de consolidação da memória, comprometendo ainda mais a evocação da tarefa quando administrado pós-treino. Os resultados indicam que alterações nos níveis de estrógeno endógeno ou suprafisiológico influenciam processos mnemônicos, sugerindo-se um papel da modulação da transmissão colinérgica nesses efeitos.
Palavras-chave:
Abstract
Studies have suggested that estrogen prevents cognitive deficits improving the functional status of cholinergic transmission. However, most studies do not consider the hormonal changes naturally present in intact animals. In the present study we evaluated the effects of physiological and supraphysiological estrogen levels variations on the memory impairment induced by scopolamine (SCO) in female rats in the different phases of the estrous cycle. We used the plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT) in order to evaluate anxiety levels and motor activity concomitantly to the memory performance. In experiment 1, female Wistar rats in each estrous cycle phase received SCO (1 mg/kg) or saline (SAL) i.p. 20 minutes before the training session in the PMDAT. In experiment 2, rats in diestrous received estradiol valerate (EV; 1 mg/kg) or vehicle sesame oil (VEH) i.m., and SCO (1 mg/kg) or SAL i.p., 45 minutes and 20 minutes before the training, respectively. In experiment 3, rats in diestrous received SCO (1 mg/kg) or SAL i.p. 20 minutes before the training and EV (1 mg/kg) or VEH i.m. immediately after the training session. In all experiments, a test session was performed 24h later. The main results showed that: (1) SCO induced amnesia, anti-anxiety like behavior and activity arousal in all experiments; (2) this cholinergic antagonist impaired acquisition only for the animals in diestrus; (3) acute administration of EV prevented the acquisition impairment induced by SCO and (4) interfered with memory consolidation process. The results indicate that endogenous or supraphysiological variations in estrogen levels modulate some aspects of cognitive function, and suggest that these effects are possibly mediated by a modulation of the cholinergic system.
Sumário
Introdução 9
1.Memória 9
1.1.Aspectos Gerais 9
1.2.Modelos animais para o estudo de memórias associativas 10
2.Estrógeno: receptores e mecanismos de ação 12
3.Oscilações hormonais endógenas 14
4.Influência do estrógeno sobre tipos de memória 15
4.1.Memória espacial 15
4.2.Memória associativa 16
5. Estrógeno, memória e a transmissão colinérgica 16
5.1. O estrógeno e estruturas encefálicas relacionadas com a memória 17
5.2.Evidências da ação do estrógeno na transmissão colinérgica 18
5.3. Interação entre estrógeno, transmissão colinérgica e memória 19
6. Influência do estrógeno na emoção 21
7. Escopolamina 23
Justificativa 25
Objetivos 26
1. Geral 26
9
Introdução
1. Memória
1.1. Aspectos Gerais
O aprendizado e a memória são fenômenos comportamentais relacionados à plasticidade do sistema nervoso central (ROSENZWEIG, 1996). Enquanto o aprendizado pode ser definido como uma mudança no comportamento que resulta de uma experiência, a memória seria a capacidade de armazenar e evocar experiências aprendidas (LEVITAN & KACZMAREC, 1991). O fenômeno do aprendizado é visto como o processo pelo qual os sistemas celulares e moleculares cerebrais transformam uma informação nova em um “traço mnemônico”, que pode ser armazenado e recuperado (SCHMIDT, 1995).
Algumas classificações dos fenômenos mnemônicos têm sido propostas e múltiplos sistemas funcionais para formação de memórias têm sido descritos (BADDELEY & WARRINGTON, 1970; SQUIRE & ZOLA-MORGAN, 1988; SQUIRE et al., 1993; SQUIRE & KANDEL, 2000). Segundo a classificação de Baddeley & Warrington (1970), a memória pode ser classificada de acordo com sua duração. A memória de curto prazo, por exemplo, é uma forma de memória de capacidade limitada e de curta duração, e dela fariam parte elementos de um passado imediato, que não chegaram a deixar a consciência. Já a memória de longo prazo é mais estável e de longa duração, sendo constituída por elementos do passado que já se ausentaram da consciência, e que podem ser evocados por estímulos a eles relacionados. Memórias de longo prazo não seriam formadas instantaneamente, e sim consolidadas ao longo do tempo depois do processo de aprendizado (MCGAUGH, 1966).
Além disso, tanto o aprendizado quanto a memória podem ser classificados de acordo com o tipo de informação processada em: declarativa, que compreende o armazenamento de um conhecimento que pode ser conscientemente e intencionalmente recordado (informações sobre locais, pessoas, objetos, fatos, etc.) ou de procedimento, que se refere às habilidades motoras e perceptivas. A memória declarativa envolve principalmente regiões diencefálicas e do lobo temporal medial, incluindo o hipocampo, enquanto que a memória de procedimento está relacionada basicamente aos sistemas sensoriais e motores específicos utilizados no aprendizado de cada habilidade motora e/ou perceptiva, como por exemplo, os núcleos da base e o cerebelo (SQUIRE, 1992; GABRIELI, 1998).
10
paralelamente em diferentes regiões. Estudos utilizando lesões mostraram que a amígdala é especializada no processo de alerta e/ou informação aversiva, participando da memória para eventos com significado emocional.
Embora os mecanismos responsáveis pela formação da memória não sejam completamente conhecidos, acredita-se que a memória esteja associada com alterações plásticas neuronais. Dessa forma, estudos se concentram na descoberta dos mecanismos celulares e moleculares responsáveis por essas alterações (JODAR & KANETO, 1995). Alguns desses estudos têm mostrado que após uma situação de aprendizado, ocorre uma reativação neuronal dependente dessa experiência, corroborando a hipótese de que, após sua codificação, os traços de memória precisam ser repetidos em suas respectivas redes neurais até que a plasticidade sináptica possa efetivar a consolidação (PAVLIDES & WINSON, 1989; RIBEIRO et al., 2004).
Os processos que envolvem a formação da memória (aquisição, consolidação e evocação), assim como sua extinção, estão sujeitos à modulação por diversos fatores. O contexto emocional da situação a ser codificada, armazenada e posteriormente evocada é um dos fatores mais relevantes. De fato, inúmeros estudos demonstram que o conteúdo emocional das informações é diretamente proporcional à probabilidade de recordação das mesmas (LABAR & CABEZA, 2006; PHELPS, 2006). Dessa forma, embora as memórias declarativas com ou sem conteúdo emocional sejam formadas por meio do funcionamento do sistema do lobo temporal medial, as memórias que envolvem estímulos com valência emocional tendem a ser mais duradouras e vívidas (CHIRSTIANSON, 1989; PHELPS, 2006). Sugere-se que a modulação de estruturas desse sistema pela ativação da amígdala durante o processo de consolidação seria responsável por tal diferença (CAHILL & MCGAUGH, 1998; PHELPS, 2006).
1.2. Modelos animais para o estudo de memórias associativas
11
Nesse paradigma, ratos são colocados em um local diferente daquele no qual receberão o estímulo aversivo (choque elétrico nas patas) e recebem tal estimulação apenas ao se transferirem voluntariamente para o compartimento “aversivo”. A memória é avaliada pelo aumento da latência para transferência para o compartimento no qual o animal recebeu o choque em uma posterior reexposição. Nesse tipo de procedimento, o desempenho do animal permite a inferência de que ocorre uma memória de natureza declarativa para a situação específica (CAHILL & MCGAUGH, 1998).
Já o modelo de resposta de medo condicionada a um som ou contexto (LEDOUX, 2000), utiliza o condicionamento pavloviano. Ratos são submetidos a um pareamento de um estímulo condicionado (o som ou o contexto) com um choque elétrico aplicado às patas (estímulo incondicionado). Após certo número de pareamentos, passam a apresentar a resposta que normalmente apresentariam ao choque apenas com a apresentação do som ou do contexto. A resposta, denominada freezing
(congelamento) é caracterizada por ausência total de movimentos com exceção dos movimentos respiratórios e é uma reação de medo característica da espécie (BLANCHARD & BLANCHARD, 1972; CANTERAS et al., 2001).
O modelo do labirinto em cruz elevado convencional baseia-se na aversão natural de roedores a espaços abertos para a avaliação da resposta de medo espontânea (MONTGOMERY, 1955). Constitui-se num labirinto elevado constituído por dois braços abertos e dois braços circundados lateralmente por paredes, e validado fisiológica, farmacológica e comportamentalmente como modelo animal de ansiedade, sendo um dos modelos mais utilizados com esse fim (HANDLEY & MITHANY, 1984; PELLOW et al., 1985; PELLOW & FILE, 1986; FRUSSA-FILHO et al., 1999; CALZAVARA et al., 2005).
Outro paradigma demonstrado na literatura, a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE), permite a avaliação simultânea de aspectos mnemônicos e afetivos nos processos de aprendizagem e memória. Esse modelo é baseado na apresentação simultânea de uma exposição a um estímulo aversivo (a ser aprendido) e de uma situação naturalmente aversiva (para a qual a resposta de medo seria inata). Uma vez que os diferentes fenômenos são avaliados por parâmetros diferentes, identifica-se se os efeitos de diversos tipos de manipulações sobre a memória aversiva estariam envolvidos com os processos específicos de aquisição, consolidação ou evocação da memória ou se estariam mais diretamente relacionados com modificações no componente aversivo da situação, ou ainda na resposta de medo.
12
que mostraram que essa diminuição é inibida pela administração de drogas amnésicas e potencializada pela administração de substâncias que melhoram a memória (SILVA et al., 1997; 1999; 2000; 2002a; CLARO et al., 1999; SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; 2002; PATTI et al., 2006). Além disso, a análise do desempenho ao longo da sessão de treino permite a avaliação específica do processo de aquisição. Um decréscimo na exploração do braço aversivo do começo ao final da sessão de treino indica que a tarefa foi aprendida, e déficits de aquisição são indicados pela ausência de modificação na exploração do braço aversivo ao longo do treino (SILVA et al., 2004).
Além das avaliações relacionadas ao aprendizado e à memória, de maneira similar ao labirinto em cruz elevado convencional, a exploração dos braços abertos pode ser utilizada para avaliar comportamentos relacionados ao medo inato, respondendo corretamente a modificações induzidas por drogas ansiolíticas ou ansiogênicas (SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; 2002; SILVA et al., 2002a). Um fator preponderante dentre os modelos abordados, é que a esquiva discriminativa é capaz de dissociar os efeitos de manipulações na memória aversiva e na resposta inata de medo (CARVALHO et al., 2006; KAMEDA et al., 2007; MELO et al., 2012; NIIGAKI et al., 2010).
2. Estrógeno: receptores e mecanismos de ação
Os estrógenos compreendem uma classe de hormônios esteróides, que incluem três membros biologicamente ativos: estronas, estradiol e estriol. Tais hormônios, em especial o estradiol, podem atuar no sistema nervoso central através de diferentes mecanismos, tais como modulação de neurotransmissores, plasticidade sináptica, aumento do fluxo sanguíneo cerebral, proteção contra apoptose, além de ações anti-inflamatórias e propriedades antioxidantes (CHOLERTON et al., 2002). No cérebro, os receptores de estrógeno estão localizados em várias estruturas, entre elas o hipocampo e a amígdala tanto de humanos (OSTERLUND et al., 2000a) quanto de roedores (MCEWEN & ALVES, 1999). Nas últimas décadas, vários estudos têm abordado o papel do estrógeno e de sua reposição em algumas doenças neurodegenerativas, principalmente a doença de Alzheimer (PANIDIS et al., 2001; ZEC & TRIVEDI, 2002).
13
tradução de novas proteínas as quais irão promover a resposta funcional da célula (GIGUERE, 2003; FALKENSTEIN et al., 2000; O'MALLEY & MEANS, 1974).
Esses receptores possuem duas isoformas, alfa e beta, as quais podem ser encontradas em populações tanto no núcleo quanto na membrana plasmática de vários tipos de células (RAZANDI et al., 1999). Os receptores de membrana não representam uma população estável, já que seguem uma via de inserção pós-sequestramento da molécula do estradiol (MYCEVYCH & DOMINGUEZ, 2009). Os receptores nucleares de estrógeno, receptor de estrógeno alfa (REα) e receptor de estrógeno beta (REβ), podem ser encontrados em todo o córtex cerebral, hipocampo, prosencéfalo basal e amígdala em ratos, camundongos, primatas não-humanos e humanos (MILNER et al., 2001, 2005; OSTERLUND et al., 2000; SHUGHRUE et al., 1997a, 1997b, 2000; SHUGHRUE & MERCHENTHALER, 2000).
REα e REβ são expressos nas subdivisões medial e central da amígdala e em projeções corticais e hipocampais dessa estrutura (OSTERLUND et al., 2000; SHUGHRUE et al., 1997b). Cahill e colaboradores demonstraram uma clara lateralização, relacionada ao sexo, do envolvimento da amígdala na memória emocional e indicaram que as teorias da neurobiologia da memória ligada a contextos emocionais devem levar em conta a influência do sexo (CAHILL et al., 2001). Coletivamente, os dados citados confirmam que ambos os REs, especialmente os REβ, são expressos em regiões do cérebro que são críticas para o aprendizado e a memória, proporcionando assim uma oportunidade para o estrógeno modular o funcionamento dessas áreas e os processos cognitivos ligados a elas. A hipótese de REα e REβ estarem localizados em sítios extranucleares possibilita uma série de potenciais mecanismos através dos quais estes receptores seriam capazes de regular a função da memória no hipocampo e na amígdala.
Além das ações genômicas clássicas, mecanismos não-genômicos também podem estar envolvidos com efeitos rápidos do hormônio em um curto período de tempo sobre os REs de membrana e, assim, induzir resultados benéficos à memória (GU et al., 1999; LEVIN, 2005; WALF & FRYE, 2008). É importante salientar que a ativação de diversas vias de sinalização intracelular é determinante para a formação de memórias (FITZPATRICK et al., 2002; KUROKI et al., 2000; MANNELLA & BRINTON, 2006; SAWAI et al., 2002).
14
transdução de sinal no hipocampo e na amígdala para modular os processos cognitivos associados com componentes afetivos.
Já se sabe que o estrógeno é classificado como um hormônio neuromodulador. Entretanto, recentemente, autores propuseram o estrógeno como neurotransmissor (BALTHAZART & BALL, 2006). Para ser considerada como tal, a substância em questão precisa ser sintetizada em neurônios pré-sinápticos e liberada em seu terminal, ligar-se a um receptor de membrana pós-sináptico e, posteriormente, ser degradada ou inativada. O estradiol mostrou atingir esse critério devido a algumas características: (1) a identificação da enzima aromatase (responsável por sua síntese a partir da testosterona) presente densamente em botões pré-sinápticos e na superfície de vesículas sinápticas, além de altas concentrações do hormônio no terminal; (2) a aromatase pode ser ativada rapidamente por fosforilação dependente de cálcio, além de ser modulada por outras vias de neurotransmissão como a glutamatérgica; (3) existem receptores membranares pós-sinápticos específicos para a molécula de estradiol, como os já supracitados REα e REβ e os novos candidatos, RE-X, RE46 e a GPR30 e, finalmente, (4) a eliminação ou inativação da atividade do estradiol pode ser mediada através do complexo de citocromos por metabolização oxidativa, conjugação, hidroxilação, glucoronização, sulfonação, metilação, e ainda por meio da COMT, a qual transforma catecolestrógenos em metoxiestrógenos, estes com baixíssimos níveis de atividade (BALTHAZART & BALL, 2006; BALTHAZART et al., 2006; CORNIL, 2009).
3. Oscilações hormonais endógenas
Na puberdade, em mulheres, os ovários começam a produzir os hormônios sexuais em resposta a sinais hormonais do cérebro. No início do ciclo menstrual, os níveis de estrógeno e progesterona são baixos. Com a maturação dos folículos ovarianos, o nível de estrógeno aumenta e atinge seu pico antes da ovulação, e, em seguida, diminui ao nível basal antes do próximo ciclo. Já o nível de progesterona começa a subir logo após a ovulação e permanecerá elevada durante a segunda metade do ciclo, diminuindo ao nível basal um pouco antes do próximo ciclo – a menos que ocorra a fertilização e implantação do óvulo fertilizado.
Em roedores de laboratório, como ratos (Rattus norvegicus) e camundongos
(Mus musculus), este ciclo é denominado ciclo estral e difere do ciclo menstrual pela
duração, e especialmente pela ausência da fase lútea e por não haver descamação da parede uterina (WISE, 2000). No entanto, as oscilações hormonais cíclicas são bastante semelhantes entre os ratos, camundongos e humanos, incluindo os picos de estradiol e progesterona antes da ovulação (MCCARTHY & BECKER, 2002).
15
o M. Os níveis hormonais mais baixos são encontrados ao decorrer das fases de M e D (BECKER et al., 2005; POMPILI et al., 2010).
Essa variação é acompanhada por alterações na morfologia e fisiologia do hipocampo e o estudo da modulação da memória pelo estrógeno pode desvendar tais alterações, por exemplo, na densidade da coluna dendrítica na sub-região CA1 do hipocampo, a qual é aproximadamente 30% maior durante o P quando comparada ao E (WOOLLEY et al., 1990; WOOLLEY & MCEWEN, 1992). Trabalhos posteriores demonstraram que outros aspectos da fisiologia do hipocampo flutuam de uma forma cíclica. Por exemplo, tanto a potenciação de longa duração (LTP – sigla em inglês para
long term potentiation) em CA1 (WARREN et al., 1995) quanto a neurogênese no giro
denteado (TANAPAT et al., 1999) estão aumentadas durante a fase de P em relação ao E.
4. Influência do estrógeno sobre tipos de memória
4.1. Memória espacial
Existem na literatura inúmeros estudos, em humanos e roedores, abordando o papel dos hormônios sexuais sobre o comportamento e sobre processos cognitivos, como a aprendizagem e a memória. A maioria desses trabalhos mostra efeitos positivos sobre a memória, mesmo quando se há previamente prejuízos associados (GIBBS & AGGARWAL, 1998; TINKLER & VOYTKO, 2005). Em modelos animais, hormônios sexuais são capazes de influenciar a memória principalmente através de vias neuronais relacionadas com o hipocampo (MCEWEN, 2002). Particularmente, o estrógeno modula a aprendizagem e a memória avaliadas em tarefas hipocampo-dependentes (MCEWEN, 2002; ZEC & TRIVEDI, 2002), e este efeito está possivelmente associado com o aumento da liberação de acetilcolina no hipocampo (DUMAS et al, 2006, 2008).
Algumas pesquisas têm mostrado que o desempenho de roedores em tarefas espaciais dependentes do hipocampo varia ao longo do ciclo estral. Por exemplo, ratas na fase de proestro escolhem uma estratégia de lugar hipocampo-dependente, enquanto ratas em estro preferem estratégia de resposta estriado-dependente para resolver uma tarefa de labirinto em “T” (KOROL et al., 2004). Esse resultado é consistente com estudos envolvendo ratas ovariectomizadas e tratadas com estradiol, em tarefas similares de memória espacial (KOROL et al., 2002). O valerato de estradiol, um análogo do estradiol utilizado neste estudo, também demonstrou ter ações positivas na memória de curto e longo prazo (VAZQUEZ-PEREYRA et al., 1995).
16
oscilação natural de hormônios esteroides sexuais influencia a cognição hipocampo-dependente em mamíferos.
Outro foco de investigação do estrógeno sobre memória envolve o estudo da atividade de estruturas como hipocampo e amígdala, uma vez que os processos que abrangem memórias contextuais e de teor emocional dependem fundamentalmente dessas estruturas (CAHILL & MCGAUGH, 1998; LEDOUX, 2000).
4.2.Memória associativa
Tanto a amígdala quanto o hipocampo têm sido considerado importantes componentes do sistema límbico envolvidos com a memória associada a comportamentos afetivos (LEDOUX, 2000; WALKER et al., 2003). Manipulações nestas regiões com hormônios sexuais em ratos machos produzem robustas alterações em comportamentos relacionados a ansiedade/medo e depressão (BITRAN et al., 1999, 2000; EDINGER & FRYE, 2004, 2005; FRYE & WALF, 2002, 2004a, b; RHODES & FRYE, 2001; WALF & FRYE, 2003; WALF et al., 2005), sugerindo um papel dessas regiões do cérebro nos efeitos de hormônios esteroides sobre ansiedade e depressão.
Em modelos de memória associativa, o desempenho das funções cognitivas pode estar intimamente relacionado com outros fenômenos comportamentais. De fato, alguns estudos têm proposto que o medo e a memória não seriam apenas fenômenos relacionados, mas que a ansiedade (uma sensação subjetiva de medo) seria, na verdade, um passo necessário para que ocorresse a formação da memória (MATHEWS, 1990). Paralelamente, fatores de natureza cognitiva (como por exemplo, memórias de experiências anteriores) podem determinar a maneira e intensidade com que são expressas as respostas de medo (BLANCHARD & BLANCHARD, 1987), nas quais muitos modelos animais de memória se baseiam. Nesse sentido, a avaliação específica do efeito de diferentes manipulações sobre processos relacionados à memória em modelos animais pode estar seriamente prejudicada se a manipulação em questão apresentar qualquer ação sobre os níveis de ansiedade (medo) no momento dos testes experimentais (SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; 2002; SILVA et al., 2002a).
Como descrito acima (ver seção 1.2), um dos modelos utilizados atualmente no estudo de memória e sua relação com ansiedade, em roedores, é a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE). Esse paradigma possibilita fazer uma avaliação simultânea de aspectos mnemônicos e emocionais nos processos de aprendizagem e memória, identificando se os efeitos de diversos tipos de manipulações sobre a memória aversiva estariam envolvidos com os processos específicos de aquisição, consolidação ou evocação da memória, ou se estariam mais diretamente relacionados com modificações no componente aversivo da situação, ou ainda na resposta de medo (SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000; SILVA et al., 1999).
17
5.1. O estrógeno e estruturas encefálicas relacionadas com a memória
O entendimento de como o estrógeno modula a memória tem sido um grande desafio, uma vez que muitas áreas encefálicas estão envolvidas com sua formação. Uma das estruturas mais extensivamente estudadas na área de aprendizado e memória tem sido o hipocampo, e atualmente muitos estudos têm investigado os efeitos de vários hormônios sobre essa estrutura (SPENCER et al, 2008; WOOLLEY, 2007) assim como a importância desta região do cérebro nos diferentes tipos de memória.
Localizado bilateralmente no lobo temporal medial, o hipocampo é fundamental para vários tipos de memórias que envolvem informação espacial e contextual, e também é indispensável na consolidação de memórias – mas não para o armazenamento de longo prazo de tais memórias (EICHENBAUM, 1997, 2002; SQUIRE, 1992). Além disso, a vulnerabilidade do hipocampo ao envelhecimento e à doença de Alzheimer (DETOLEDO-MORRELL et al, 2007; DRISCOLL & SUTHERLAND, 2005) torna essa região do cérebro de particular interesse para o estudo da influência do estrógeno e da função cognitiva relacionada à idade.
O hipocampo é um dos alvos para o estrógeno no sistema nervoso central. Este hormônio, marcado radioativamente e injetado em ratas, mostrou uma alta concentração no hipocampo (PFAFF & KEINER, 1973). A administração de estrógeno aumenta a atividade hipocampal como evidenciado pela maior expressão para do gene imediato, c-fos (RUDICK & WOOLLEY, 2000). Além disso, o estrógeno também altera a plasticidade do hipocampo. Por exemplo, os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF – do inglês brain-derived neurotrophic factor) flutuam ao longo do
ciclo estral e estão aumentados em ratas ovariectomizadas após a administração de estrógeno (GIBBS, 1998, 1999). A densidade das espinhas dendríticas no hipocampo é maior em ratas naturalmente receptivas, ou em decorrência da reposição de estrógeno após a ovariectomia (GOULD et al., 1990; MACLUSKY et al., 2005; WOOLLEY et al., 1990; WOOLLEY & MCEWEN, 1993). Comportamentos que dependem da função hipocampal são sensíveis ao tratamento com estrógeno, de forma que sua administração já mostrou melhorar o desempenho em várias tarefas cognitivas dependentes do hipocampo (BOWMAN et al., 2002; FRICK et al., 2002; FRYE et al., 2005; FRYE & RHODES, 2002; GIBBS et al., 2004; LI et al., 2004; LUINE et al., 2003; PACKARD, 1998; RHODES & FRYE, 2004).
18
cérebro formem redes intricadas que inclui o hipocampo, cada uma tem funções distintas de memória separadas do hipocampo (EICHENBAUM, 2002; SQUIRE, 2004). A amígdala é uma região límbica que também é sensível ao tratamento com estrógeno. Em primeiro lugar, as células da amígdala mostram altas concentrações de estrógeno marcado radioativamente após injeção sistêmica em ratas (PFAFF & KEINER, 1973). Segundo, a administração de estrógeno aumentou a imunorreatividade para proteína c-fos na amígdala medial (GRECO et al., 2003a, b; INSEL, 1990). Terceiro, o número de sinapses dendríticas em neurônios da amígdala são aumentadas pelo tratamento com estrógeno (NISHIZUKA & ARAI, 1982), além do que a densidade de espinhas dendríticas na amígdala medial flutua ao longo do ciclo estral (RASIA-FILHO et al., 2004). Outra evidência importante é que o estrógeno altera as respostas comportamentais de roedores em tarefas afetivas que envolvem a amígdala. Efeitos semelhantes da injeção subcutânea e intra-amígdala de estrógeno em ratas ovariectomizadas são observados em modelos de medo e nocicepção, de tal forma que em ambos os modelos o hormônio tornou a resposta ao estresse, induzida após a exposição aguda ao odor de predador, mais efetiva (WALF & FRYE, 2003). Em outro estudo, a infusão de estrógeno intra-amígdala aumentou o número de entradas e o tempo gasto no centro do campo aberto e o tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (FRYE & WALF, 2004a). Estes dados sugerem que a amígdala também é um local do sistema nervoso central sensível ao estrógeno e que pode ser juntamente com o hipocampo, alvo para os efeitos moduladores desse hormônio sobre os processos cognitivos, especialmente aqueles relacionados a fatores emocionais.
5.2. Evidências da ação do estrógeno na transmissão colinérgica
19
tanto o aumento de ligação do glutamato ao receptor NMDA induzido pelo estradiol, quanto prejudica a memória operacional em ratas ovariectomizadas. Estudos posteriores mostraram que o estrógeno aumenta a liberação de acetilcolina estimulada pelo potássio no hipocampo (MARRIOTT & KOROL, 2003; GIBBS et. al., 2004), sugerindo que o aumento da estimulação colinérgica pode mediar alguns efeitos do estrógeno nessa região do cérebro. Além disso, outros trabalhos têm examinado o REα e o transportador de acetilcolina vesicular (VAChT) em CA1 e mostraram que VAChT está co-localizado com os REα nos terminais axonais e nas espinhas dendríticas (TOWART et al., 2003). Isto sugere que o estrógeno ligado a estes receptores pode afetar a liberação e a captação vesicular local da acetilcolina, além de influenciar a expressão do receptor NMDA e a função hipocampal.
Além disso, o estrógeno pode influenciar indiretamente a plasticidade hipocampal e neocortical através do aumento do sinal colinérgico nas projeções dos neurônios do prosencéfalo basal para o hipocampo e córtex (GIBBS & AGGARWAL, 1998; WU et. al., 1999). Dentre os diversos efeitos do estrógeno sobre estes neurônios, sabe-se que os níveis de mRNA da ChAT no prosencéfalo basal flutuam durante o ciclo estral e são aumentados em resposta à administração de estrógeno e progesterona após ovariectomia (GIBBS, 1996; GIBBS et al., 1994; LUINE, 1985). A atividade da ChAT no neocórtex, hipocampo e no prosencéfalo basal, mais a liberação de acetilcolina, também são reforçadas pelo estrógeno (FRICK et al., 2002a; GIBBS, 2000a; GIBBS et al., 1997). A relação desta modulação da função hipocampal e neocortical pelos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal é crítica para o envelhecimento, uma vez que alterações patológicas nestes neurônios estão associadas com a disfunção da memória na doença de Alzheimer (AULD et al., 2002; PAPPAS et al., 2000; PERRY et al., 1978; WHITEHOUSE et al., 1982). A neurotransmissão colinérgica hipocampal também mostrou modular a função da amígdala na escolha de informações emocionais relevantes, levando à seleção adaptativa do melhor estímulo que prediz um evento aversivo (CALANDREAU et. al., 2006). Ainda, parece que a transmissão colinérgica intacta na amígdala basolateral é necessária para a aquisição e/ou consolidação da memória (CARBALLO-MÁRQUEZ et al., 2009).
Outras investigações sugerem que a privação dos níveis de estrógeno pode causar a longo prazo uma diminuição do estado funcional dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal que se projetam para o córtex e hipocampo (GIBBS, 1998). Além disso, estudos mostraram que o estrógeno aumenta a liberação de acetilcolina estimulada por potássio no hipocampo (GIBBS et al., 1997) e que a administração aguda de estrógeno foi capaz de potencializar os efeitos de agonistas colinérgicos na aprendizagem de tarefas de esquiva, quando administrado diretamente no hipocampo (FARR et al., 2000). Todos estes resultados indicam que estrógeno pode mediar processos de memória através do sistema colinérgico.
20
A importância da interação entre o estrógeno e a função colinérgica também tem sido demonstrada no desempenho de animais em tarefas de aprendizagem e memória. A administração de estrógeno em ratas ovariectomizadas até 72 horas antes do teste neutralizou completamente os efeitos negativos da escopolamina (antagonista muscarínico) sobre a aprendizagem em tarefas de alternância (DOHANICH et al., 1994). A reposição do hormônio em ratas ovariectomizadas também aumentou a aquisição de tarefas de memória espacial e anulou parcialmente os efeitos anticolinérgicos da administração de escopolamina sobre o hipocampo (GIBBS, 1999). Em uma tarefa de labirinto radial, a administração crônica de estrógeno em ratas ovariectomizadas melhorou a memória operacional e impediu os efeitos amnésticos da escopolamina (FADER et al., 1999). Ainda nesse sentido, a administração de estrógeno atenuou os efeitos negativos da escopolamina e do lorazepam (ansiolítico benzodiazepínico) sobre a aquisição e retenção da memória na tarefa de esquiva passiva em múltiplos treinos e, curiosamente, essa ação parece ser específica para níveis séricos baixos ou intermediários, mas não altos, de estrógeno (GIBBS et al., 1998). Uma dose única suprafisiológica de estrógeno foi capaz de potencializar os efeitos de agonistas colinérgicos e glutamatérgicos no aprendizado de tarefas de esquiva quando administrada diretamente no hipocampo (FARR et al., 2000). Estudos em macacos rhesus também mostraram que os efeitos do estrógeno na atenção visuo-espacial parecem ser modulados por receptores colinérgicos muscarínicos (TINKLER & VOYTKO, 2005).
21
bastante diferente dependendo do tempo de vida natural do animal. Para os seres humanos, ela pode se estender por vários anos.
Após uma revisão prévia de dados epidemiológicos, clínicos e da literatura animal examinou-se a existência de um período crítico, isto é, uma melhor faixa de idade para os efeitos benéficos do estrógeno sobre a cognição ocorrer (RESNICK & HENDERSON, 2002; MAKI, 2006; SHERWIN, 2007). Estes estudos examinaram a capacidade de proteção do estrógeno em atenuar o comprometimento cognitivo relacionado com o processo de envelhecimento neuronal e com a perda gradual da transmissão colinérgica (como ocorre em casos de demência) ao avançar da idade em mulheres. Entretanto, a hipótese do período crítico não foi corroborada quando se analisou o efeito da terapia com estrógeno sobre o desempenho da memória sem que houvesse algum comprometimento na transmissão colinérgica, seja por causas naturais ou induzidas farmacologicamente, indicando que para se obter os efeitos benéficos do estrógeno em certas faixas etárias, o sistema colinérgico deve estar temporariamente comprometido. Estes achados podem ajudar a explicitar melhor a idéia de que os benefícios do estrógeno específicos à idade possam estar relacionados ao sistema colinérgico.
Dumas e colaboradores mostraram que 1 mg de estrógeno por dia foi eficaz em atenuar a ação de anticolinérgicos em testes de atenção e em testes de memória verbal e não verbal em mulheres (DUMAS et al., 2006). Também sugeriu-se que fatores adicionais podem desempenhar um papel na presença ou ausência da interação entre o estrógeno e a transmissão colinérgica incluindo a dose, idade, a genética, a história de queixas cognitivas e a morfologia do cérebro, os quais mostraram-se relacionados com o grau de responsividade cognitiva tanto para o tratamento com estrógeno, quanto para o desafio com drogas anticolinérgicas (KOZAUER et al., 2007; SAYKIN et al., 2006; WISHART et al., 2006).
Estudos anteriores têm mostrado que indivíduos idosos tendem a serem mais sensíveis ao bloqueio colinérgico do que indivíduos mais jovens (NEWHOUSE et al., 1988; SUNDERLAND et al., 1988), porém esses estudos foram realizados com amostras pequenas e não examinaram explicitamente a meia-idade em relação as mulheres mais velhas ou aquelas em terapia hormonal. Assim, a questão de saber se a idade interage com o estado hormonal para modular a sensibilidade colinérgica não está completamente solucionada e isso pode ser determinante para a integridade do sistema colinérgico.
6. Influência do estrógeno na emoção
22
ratas em tarefas cognitivas envolvendo contextos emocionais aversivos concomitantemente com os comportamentos de medo e ansiedade tem sido pobremente avaliado (FRYE E WALF, 2004a).
O estrógeno também tem sido associado a comportamentos de medo e ansiedade. Por exemplo, alterações nos níveis de estrógeno endógeno pode aumentar a susceptibilidade das mulheres aos transtornos de ansiedade. No entanto, em fêmeas de roedores, as diferenças em comportamentos de ansiedade em algumas tarefas comparadas a machos são ainda controversas (JOHNSTON & FILE, 1991; ZIMMERBERG & FARLEY, 1993). Além disso, as diferenças sexuais no comportamento de roedores são mais evidentes quando as alterações endógenas dos níveis de estrógeno durante o ciclo estral são consideradas (CONTRERAS et al., 2000; MARVAN et al., 1996).
Há relatos, ainda, de que as alterações nos níveis endógenos de estrógeno, ao longo do ciclo menstrual podem aumentar a suscetibilidade a transtornos de ansiedade e depressão – e na maioria dos casos, esses transtornos se apresentam em comorbidade. Essas oscilações também podem fazer com que mulheres tornem-se mais susceptíveis à manifestação de transtornos do humor, tais como o transtorno disfórico pré-menstrual e o transtorno de depressão pós-parto (BEBBINGTON et al., 1981; BLOCH et al., 2003; JENKINS, 1987; RUBINOW & SCHMIDT, 1995; WEISSMAN & KLERMAN, 1977). Dalton (1959) relatou que aproximadamente 50% das mulheres que foram admitidas em hospitais psiquiátricos por uma variedade de sintomas, estavam em seu período menstrual, e a incidência de suicídio foi maior nesta fase do ciclo. Alguns estudos relatam maior incidência de suicídio entre as mulheres durante a fase lútea comparada a fase folicular (BACA-GARCIA et al., 2000). Além disso, sintomas de depressão pós-parto geralmente ocorrem dentro da primeira semana após o pós-parto, período em que há um rápido declínio nos níveis de estrógeno após um longo período em que os níveis desses hormônios mantiveram-se elevados, durante a gestação (DEAN & KENDELL, 1981). Embora estes dados sugiram que mudanças nos níveis de estrógeno podem ser subjacentes ao aumento da susceptibilidade das mulheres a desenvolver transtornos afetivos, essas mudanças ocorrem concomitantemente com alterações nos níveis de progesterona, andrógenos, e seus metabólitos, que também podem alterar o humor (ROCA et al., 2003).
23
existem outros possíveis mecanismos pelos quais este hormônio pode influenciar o comportamento de ansiedade. A evidência de que o antagonismo aos REs na amígdala não altera o comportamento da ansiedade de ratas naturalmente receptivas sugere que o estrógeno, nesta estrutura, poderia agir através de outros substratos. Um dos alvos pode ser o sistema opióide, visto que o estrógeno indicou aumentar os níveis de mRNA de proencefalina no hipotálamo ventromedial de ratas (LAUBER et al., 1990; ROMANO et al., 1988) e de mRNA para pré-proencefalina na amígdala medial (SINCHAK et al., 2000), reforçando a receptividade sexual e diminuindo o comportamento de ansiedade dos roedores.
Outra possibilidade a considerar é que há uma convergência de ações rápidas através dos REs intracelulares e os efeitos mediados pela membrana no hipocampo e amígdala. Trabalhos in vivo e in vitro demonstram que o estrógeno pode agir nos REs
de membrana, potencializando seus efeitos através de REs nucleares, os quais requerem a ativação de proteínas quinase (KOW & PFAFF, 2004; VASUDEVAN et al., 2001). Dessa forma, é possível que alterações no comportamento de ansiedade mediadas pelo estrógeno envolvam a ligação deste aos receptores de membrana e a ativação da cascata de moléculas sinalizadoras na amígdala que dependem de uma interação com REs intracelulares no hipocampo.
7. Escopolamina
Existem evidências que déficits precisam estar previamente presentes para que os efeitos benéficos do estrogénio ocorram (GIBBS & AGGARWAL, 1998; TINKLER & VOYTKO, 2005). A este respeito, a escopolamina é um antagonista colinérgico não seletivo do receptor muscarínico usado para provocar alterações cognitivas em testes comportamentais (WALLENSTEIN & VAGO, 2001; SILVA et al., 1999). Wink e colaboradores descreveram que os processos de envelhecimento que afetam a integridade do hipocampo são semelhantes aos produzidos pela administração de escopolamina e a perda de estímulos colinérgicos é comparável à senescência (WINK et al., 2006). Além disso, a reposição de estrógeno em ratas ovariectomizadas melhora a aquisição da memória e completamente neutraliza os efeitos negativos da escopolamina sobre a aprendizagem em tarefas que avaliam memórias operacional e espacial (GIBBS, 1999; FADER et al., 1999).
24
Atualmente, em pesquisas na área da neuropsicofarmacologia, a escopolamina tem sido utilizada na indução de déficits cognitivos semelhantes àqueles associados à demência em humanos e animais (EBERT & KIRCH, 1998; FLOOD & CHERKIN, 1986). No entanto, as propriedades amnésticas da escopolamina já têm sido notadas desde o início do último século (GAUS, 1906; THOMPSON & COTTERILL, 1909).
O uso da escopolamina como um modelo farmacológico de amnésia se tornou muito popular após postulação da hipótese colinérgica na disfunção de memória durante o envelhecimento (BARTUS et al., 1982, FLOOD & CHERKIN, 1986). Esta hipótese de que o princípio do declínio das funções cognitivas está relacionado à idade foi predominantemente associada a um decréscimo na integridade da neurotransmissão colinérgica. Os primeiros experimentos que investigaram os efeitos centrais da escopolamina em animais foram descritos em 1950 (BOREN & NAVARRO, 1959; HEARST, 1959), com o objetivo de avaliar o papel do sistema colinérgico em tipos de comportamentos não específicos, como a taxa de resposta em tarefas operantes. Os estudos experimentais iniciais que avaliaram os efeitos da escopolamina sobre as funções cognitivas do homem foram publicados no início dos anos setenta (CROW & GROVE-WHITE, 1973; SAFER & ALLEN, 1971; DRACHMAN & LEAVITT, 1974). Posteriormente, estudos utilizaram a escopolamina para validar os modelos de teste da função cognitiva (ENNACEUR & MELIANI, 1992) e investigar o papel do sistema colinérgico na cognição (CHUDASAMA et al., 2004). Outros experimentos sustentaram a noção de que existem deficiências na cognição causadas pela escopolamina através de pesquisas envolvendo uma ampla variedade de tarefas cognitivo-comportamentais (HODGES JR. et al., 2009; CHINTOH et al., 2003; ESTAPÉ & STECKLER, 2002; FLOOD & CHERKIN, 1986; HUGHES et al., 2004; ISON & BOWEN, 2000; NOMURA et al., 1994; ROBINSON et al., 2004; SAMBETH et al., 2007), entretanto outros autores questionam tal modelo de comprometimento cognitivo, interpretando as ações negativas sobre o comportamento como decorrentes de interferências no aprendizado, memória operacional, de curto-prazo e, outros, ainda propõem que tais ações não são específicas à memória e sim a níveis atencionais e perceptuais (COLLERTON, 1986; HAN et al., 2000).
25
Justificativa
Muito do conhecimento existente sobre a influência de hormônios sobre a memória foi obtido por meio de modelos animais. Um dos métodos utilizados ao investigar os mecanismos envolvidos com a memória é induzir farmacologicamente quadros de déficit cognitivo através de administração prévia de escopolamina, um antagonista colinérgico muscarínico que provoca amnésia em modelos comportamentais (HODGES JR. et al., 2009). De fato, é relatado que a transmissão colinérgica é essencial durante os processos mnemônicos, e o estrógeno poderia estar regulando essa via de transmissão (DUMAS et al. 2006, 2008).
Alguns estudos demonstram que a prevalência da doença de Alzheimer é maior em mulheres do que em homens (LAUNER et al., 1999; ZANDI et al., 2002a). Embora não esteja claro se a redução significativa dos níveis hormonais durante a meia idade está associada a esta maior prevalência, vários estudos têm demonstrado a existência de diferenças sexuais a nível molecular (MIZUNO & GIESE, 2010), celular (BARKER & GALEA, 2008) e comportamental (JONASSON, 2005; RIBEIRO et al., 2010), incluindo o processo de envelhecimento cerebral (GIBBS, 1998). Assim, a perda de estrógeno, entre outros fatores, poderia desempenhar um papel na maior incidência de demência em mulheres, destacando a importância da realização de estudos pré-clínicos e clínicos em mulheres nessa faixa etária. No entanto, estudos em modelos animais são geralmente realizados com animais ovariectomizados, e não levam em conta as alterações hormonais naturalmente presentes em fêmeas gonadalmente intactas (FRICK, 2009). Uma vez bem conhecido que ao longo do ciclo estral há oscilações nos níveis de estrógeno, e que aspectos mnemônicos e emocionais do comportamento podem ser influenciados por essas variações hormonais, pode-se então levantar a hipótese de que nas diferentes fases do ciclo, o estrógeno poderia atuar modulando os efeitos amnésticos da escopolamina, e dessa forma, regular o desempenho dos animais durante a tarefa.
26
Objetivos
1. Geral
Avaliar os efeitos das variações hormonais ao longo do ciclo estral sobre o aprendizado e memória de ratas intactas e a possível participação do sistema colinérgico nesses efeitos, usando a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado.
2. Específicos
2.1.Verificar a indução do efeito amnéstico característico da escopolamina durante as diferentes fases do ciclo estral;
2.2.Investigar a ação de níveis suprafisiológicos de estrógeno sobre os efeitos mnemônicos da escopolamina;
2.3.Avaliar concomitantemente os níveis de ansiedade e a atividade motora dos animais durante a tarefa de memória, visando identificar possíveis interações desses fatores com o desempenho do animal na tarefa.
27
ESTROGEN LEVELS MODIFY SCOPOLAMINE-INDUCED AMNESIA IN GONADALLY INTACT RATS
André de Macêdo Medeiros1; Geison Souza Izídio2; Diego Silveira Sousa1; Priscila Tavares
Macedo1; Anatildes Feitosa Silva1; Victor Kenji Medeiros Shiramizu3; Alicia Cabral1;
Alessandra Mussi Ribeiro1; Regina Helena Silva1*
1Memory Studies Laboratory, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brazil 2Behavioral Genetics Laboratory, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brazil 3Behavioral Endocrinology Laboratory, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
*Corresponding author: Regina H. Silva Memory Studies Laboratory
Department of Physiology
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Av. Salgado Filho, s/n - Caixa Postal 1511 - CEP 59078-970 - Natal, RN, Brazil fax: (55) 84 3211 9206 e-mail: reginahsilva@gmail.com
List of abbreviations:
PMDAT – Plus-maze discriminative avoidance task SCO – Scopolamine
EV – Estradiol valerate SAL – Saline
VEH – Vehicle sesame oil MET – Metestrus
DIE – Diestrus PRO – Proestrus EST – Estrus
%TAV – Percentage of time in aversive arm %TOA – Percentage of time in open arm NO – Nitric oxide
ER – Estrogen receptor ER – Estrogen receptor
WHI – Women`s Health Initiative NAV – Non-aversive arm
AV – Aversive arm OA – Open arm
28
Abstract:
Previous studies suggested that estrogen plays a role in cognitive function by modulating the cholinergic transmission. However, most of the studies dealing with this subject have been conducted using ovariectomized rats. In the present study we evaluated the effects of physiological and supra-physiological variation of estrogen levels on scopolamine-induced amnesia in gonadally intact female rats. We used the plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT) in order to evaluate anxiety levels and motor activity concomitantly to the memory performance. In experiment 1, female Wistar rats in each estrous cycle phase received scopolamine (1 mg/kg) or saline i.p. 20 minutes before the training session in the PMDAT. In experiment 2, rats in diestrus received estradiol valerate (1 mg/kg) or sesame oil i.m., and scopolamine (1 mg/kg) or saline i.p., 45 minutes and 20 minutes before the training, respectively. In experiment 3, rats in diestrus received scopolamine (1 mg/kg) or saline i.p. 20 minutes before the training, and estradiol valerate (1 mg/kg) or sesame oil i.m. immediately after the training session. In all experiments, a test session was performed 24h later. The main results showed that: (1) scopolamine impaired retrieval and induced anxiolytic and hiperlocomotor effects in all experiments; (2) this cholinergic antagonist impaired acquisition only in animals in diestrus; (3) acute administration of estradiol valerate prevented the learning impairment induced by scopolamine and (4) interfered with memory consolidation process. The results suggest that endogenous variations in estrogen levels across the estrous cycle modulate some aspects of memory mediated by the cholinergic system. Indeed, specifically in diestrus, a stage with low estrogen levels, the impairment produced by scopolamine on the acquisition was counteracted by exogenous administration of the hormone, whereas the posttraining treatment potentiated the negative effects of scopolamine during the consolidation phase of memory.
Keywords:
29
1. Introduction
In the last decades, numerous studies have addressed the role of estrogen and its replacement in some neurodegenerative disorders, mainly Alzheimer's disease (PANIDIS et al., 2001; ZEC & TRIVEDI, 2002). Estrogen has been shown to reduce cognitive impairments through different mechanisms, such as modulation of neurotransmitters, synaptic plasticity, increase of cerebral blood flow, protection against apoptosis, anti-inflammatory actions and antioxidant properties (for review, see CHOLERTON et al., 2002). In the brain, the estrogen receptors are located in several structures, including the hippocampus and the amygdala of both humans (OSTERLUND et al., 2000a) and rodents (MCEWEN & ALVES, 1999).
Estrogens are a group of steroid hormones that includes three biologically significant compounds: estrone, estradiol and estriol. Estradiol valerate (EV), an analogue of estradiol, was shown to improve some types of memory (HOSSEINI et al., 2010; VÁZQUEZ-PEREYRA et al., 1995). Besides their classical genomic actions, estrogens also activate non-genomic mechanisms through intracellular signaling pathways that are critical for memory processes (FITZPATRICK et al., 2002; KUROKI et al., 2000; MANNELLA & BRINTON, 2006; SAWAI et al., 2002). These mechanisms are probably involved with the short-term beneficial effects of estradiol on memory acquisition (LEVIN, 2005; WALF & FRYE, 2008). This rapid effect of the hormone on memory can be achieved during a two-hour time window (LUINE et al., 2003; PACKARD, 1998).
Many cellular and behavioral acute effects appear to require physiological concentrations of estrogen higher than normal (CORNIL, 2009). Behavioral studies have also revealed that rapid changes in estrogen bioavailability, resulting from a single injection of a high dose of estradiol, modify the expression of some behaviors (sexual behavior and pain threshold) within less than 1 hour. These data indicate that the action of estrogen in the brain can occur in different time ranges (short to long-term), possibly combining non-genomic and genomic actions (BALTHAZART et al., 2006).
30
2006, 2008). Other investigations have suggested that a long-term deprivation of estrogen decreases the functional status of the basal forebrain cholinergic projections to the cortex and hippocampus (GIBBS, 1998). Further, both the activity of choline acetyltransferase and the release of acetylcholine in the neocortex, hippocampus and basal forebrain are enhanced by estrogen (GIBBS, 2000a; MARRIOTT & KOROL, 2003). Lastly, studies showed that estrogen increases the acetylcholine release stimulated by potassium in the hippocampus (GIBBS et al., 1997) and potentiates the effects of cholinergic agonists in avoidance tasks when administered directly into the hippocampus (FARR et al., 2000). All these findings indicate that estrogen may mediate memory processes through modulation of the cholinergic system.
It has been suggested that a previous impairment has to be present for the estrogen’s beneficial effects to occur (GIBBS & AGGARWAL, 1998; TINKLER & VOYTKO, 2005). In this respect, scopolamine (SCO) is a muscarinic receptor antagonist that classically induces cognitive impairments in behavioral tests (SILVA et al., 1999; WALLENSTEIN & VAGO, 2001). Wink and coworkers described that the loss of cholinergic stimuli produced by the administration of SCO is comparable to the one underlying the aging processes (WINK et al., 2006). Furthermore, the replacement with estrogen in ovariectomized rats enhances memory acquisition and counteracts the negative effects of SCO on working and spatial memory tasks (FADER et al., 1999; GIBBS, 1999). In this respect, studies in animal models are usually conducted with ovariectomized animals, and do not take into account the natural hormonal changes in gonadally intact females (FRICK, 2009).
31
The aim of the present study was to investigate the effects of physiological and supra-physiological variations of estrogen levels on SCO-induced amnesia in gonadally intact female rats. We used the plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT; SILVA et al., 1999; SILVA & FRUSSA-FILHO, 2000) in order to evaluate anxiety levels and motor activity concomitantly to the learning and memory performances.
2. Methods
2.1.Animals
Three-month-old female Wistar rats (250-300g) were housed with free access to food and water, in a number of 4 or 5, under controlled conditions of temperature (23-24°C) and a 12 h light/12 h dark cycle (lights on 06:30 am). The rats were handled according to the Brazilian law for the use of animals in scientific research (Law Number 11.794) and all procedures described were approved by the local ethical committee (CEUA/UFRN nº 036/2010). Prior to the procedures all the animals were gently handled for 10 min/day during 3 days.
2.2.Drugs
Scopolamine hidrobromide (SCO, Sigma, USA) was diluted in saline solution and given i.p. at 1 mg/kg. This dose choice was based on previous studies showing scopolamine-induced impairment in rodent memory models (BARBOSA et al., 2010; CLARO et al., 2006), including in the task used here (CLARO et al., 1999; SILVA et al., 1999). Estradiol valerate (EV, Sigma, USA) was dissolved with absolute ethanol and sesame oil and left overnight for evaporation. Afterwards, the compound was diluted to the correct concentration with sesame oil and given i.m. at 1 mg/kg. Estradiol levels are considered supra-physiological at doses above 0.5 mg/ml in rodents (CORNIL et al., 2006). Saline solution (SAL) (0.9% NaCl) or vehicle sesame oil (VEH) in a volume of 1 ml/kg were administered to controls for SCO or EV treatments, respectively.
32
Before the beginning of the experiments, the estrous cycle was monitored by the analysis of vaginal smears under a light microscopy for three complete cycles of 4-5 days. Vaginal secretions were collected by the gentle introduction of plastic pipettes with distillated water in a volume of 0.1 ml. Only animals with regular cycling were included in the experiments (approximately 95%). The four stages of estrous cycle were determined according to the following characteristics: estrus (EST) - predominance of cornified cells; proestrus (PRO) - predominance of epithelial nucleated cells; diestrus (DIE) - predominance of leucocytes and metestrus (MET) - similar proportion of nucleated cells, leucocytes and cornified cells (MARCONDES et al., 2001; POMPILI et al., 2010).
2.4.Plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT)
The apparatus employed was a modified elevated plus-maze, made of wood, containing two enclosed arms (50 × 15 × 40 cm), an aversive (AV) and a non-aversive (NAV), opposite to two open arms (OA; 50 × 15 cm). The task consisted of two sessions: training and testing, each lasting 10 minutes. In the training session, each rat was placed in the center of the apparatus with body orientation toward the intersection between the open arms. Every time the animal entered with the four paws into the aversive enclosed arm, aversive stimuli were turned on until the animal left the arm. The aversive stimuli were a 100-W light and an 80 dB noise produced by a lamp and speakers placed over the aversive enclosed arm. In the test session, the animals were again placed in the apparatus, but without presentation of the aversive stimulation (Fig. 1). All behavior experiments were performed between 1:00 and 5:00 p.m. The sessions were recorded with a digital camera placed over the apparatus and the behavioral quantification was performed by a video-tracking software (Anymaze®, Stoelting, USA).
33
(first block) and extinction in the test session. Anxiety-like behavior was evaluated by the percent time spent in open arms [%TOA = time in OA/(time in OA + NAV + AV) x 100] and motor activity was evaluated by total distance travelled (m) in the whole apparatus in both sessions. The analysis of the habituation index [distance in training session/distance in test session (TR/TE)] was used to evaluate the habituation to the apparatus (nonassociative learning).
Figure 1. Schematic diagram of the behavioral task and experiments I, II and III. VEH, oil vehicle; SAL,
saline; SCO, scopolamine; EV, estradiol valerate; OA, open arms; AV, aversive enclosed arm; NAV, non-aversive enclosed arm.
2.5.Experimental Procedure
A summary of the behavioral task and experimental procedure can be seen in Figure
1.
2.5.1. Experiment I: Influence of estrous cycle on the scopolamine-induced
memory deficit
Female rats in each phase of the estrous cycle (n = 9-13 per phase) received 1 mg/kg SCO or SAL (0.9% NaCl) 20 minutes before the training session in the PMDAT. The test session was performed 24h later, without pharmacological treatment.
2.5.2. Experiment II: Effects of pre-training estrogen on the scopolamine-induced
34
In this experiment, all animals were in DIE phase. Forty-five minutes before the training in the PMDAT, the animals received a pre-treatment with 1 mg/kg EV or VEH. Twenty-five minutes later, the animals received the same treatment described in experiment I. The experimental groups (n = 8-9) were: VEH/SAL, VEH/SCO, EV/SAL and EV/SCO. The training was performed after 20 minutes, and the test session was conducted 24h later.
2.5.3. Experiment III: Effects of posttraining estrogen on the scopolamine-induced
memory deficit
In experiment III, all animals were in DIE phase. Female rats received the same treatment as describe in experiment I. Immediately after the training session, 1 mg/kg EV or VEH were administered. The experimental groups (n = 7-8) were: SAL/VEH, SCO/VEH, SAL/EV and SCO/EV. The test session was performed 24h later.
2.6.Determination of estradiol levels
Female rats were euthanized to assess bioavailability of estradiol at different time points of the experimental protocol. All animals were in DIE phase. Control group received treatment with VEH (n = 5) and experimental groups received treatment with 1 mg/kg EV. Blood samples were collected by decapitation in tubes containing EDTA immediately (control group) and 45 minutes (n = 8), 6 hours (n = 8) or 24 hours (n = 9) after the hormone injection (experimental group).
35
assayed in the same RIA. Data from estradiol concentration were adjusted by the dilution factor and expressed in pg/ml.
2.7.Statistical analysis
All data were checked for normality using the Kolmogorov-Smirnov test. Multivariate analyses of variance (two-way ANOVA) for the treatment x cycle phase (experiment I), pre-treatment x treatment (experiment II) and post-treatment x treatment (experiment III) were applied to %TAV, %TOA, as well as distance traveled in the apparatus in each behavioral session. Moreover, one-way ANOVA was performed to analyze estrogen levels at different time points after administration. Duncan’s post hoc was run for group comparisons.
The %TAV throughout the sessions was compared by ANOVA with repeated measures (three-way ANOVA) for time blocks x phase x treatment (experiment I), time blocks x pre-treatment x treatment (experiments II) and time blocks x post-treatment x treatment (experiment III). In experiment I, further analysis was performed using two-way ANOVA (time blocks x treatment for each cycle phase). We used Bonferroni’s for post hoc analysis.
Comparisons from habituation index were performed using Kruskal-Wallis one-way analysis of variance, followed by Mann-Whitney's U-test. All results were considered significant at p ≤ 0.05.
3. Results
3.1.Experiment I: Influence of estrous cycle on the scopolamine-induced memory
deficit
3.1.1. Learning and Memory
36
blocks was performed to each cycle phase, revealing significant within-subject time effects in: MET [F(2,38) = 21.39; p < 0.001], DIE [F(2,40) = 4.15; p = 0.023], PRO [F(2,40) = 3.53; p = 0.038] and EST [F(2,38) = 3.41; p = 0.046]. Bonferroni’s post hoc showed that %TAV was significantly decreased in the second or in the third blocks when compared to the initial block for both treatments (SAL or SCO) in MET, PRO and EST phases. An interaction between time and treatment [F(2,40) = 3.55; p = 0.038] was detected only for the DIE phase, indicating a learning deficit induced by SCO treatment in this cycle phase (Fig. 2C).
In the test session, two-way ANOVA for %TAV during the whole session revealed a significant effect of treatment [F(1,78) = 20.53; p < 0.001]. Duncan’s post hoc showed a significant increase in %TAV for SCO compared to SAL animals in MET, PRO and EST phases, but not in DIE (Fig. 2B). When %TAV was analyzed in time blocks, three-way ANOVA indicated significant within-subject time effect [F(2,156) = 3.06; p = 0.05], interaction (time block x phase x treatment) [F(6,156) = 2.16; p = 0.049] and a between-subject treatment effect [F(1,78) = 14.59; p < 0.001]. Bonferroni’s post hoc revealed a marginally significant increase in the third block compared to the initial block between groups. The fact that no significant difference for treatment was found in %TAV during the whole session in DIE is due to increased values of SAL animals in this phase, which can be explained by the gradual increase of %TAV across blocks in this group (Fig. 2D).
