AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A
FLUCONAZOL E VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS
DE
Candida
spp. PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
SÃO PAULO
ii
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A
FLUCONAZOL E VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS
DE
Candida
spp. PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
São Paulo
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
iv
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A FLUCONAZOL E
VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS DE
Candida
spp. PELO MÉTODO
DE DISCO-DIFUSÃO
Presidente da banca:
Prof. Dr.: Arnaldo Lopes Colombo
________________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Sydney Hartz Alves
Profa. Dra. Mariceli Araújo Ribeiro
Dr. Patrício Godoy Martinez
SUPLENTE
v
Aos meus pais,
Antonio de Almeida Azevedo
e
Maria Aparecida Azevedo
que com todo amor e carinho me ensinaram
a cultivar valores importantes como os da
amizade, caráter, respeito e amor. Princípios
que dinheiro nenhum no mundo compram.
Amo vocês.
Ao meu irmão,
Victor Hugo de Almeida Azevedo,
por me mostrar exemplo de
caráter e determinação.
vi
Ao Xinho,
Sergio Bachini Pereira Júnior,
Por sempre me apoiar nos momentos em
que mais precisei e por me fazer feliz.
Meu carinho e amor.
À Natasha Bachini Pereira
Que sempre me incentivou a finalizar
vii
Ao meu irmão de coração,
Patrício Godoy Martinez,
Por sempre me estender a mão nos momentos mais
turbulentos da minha vida, por nunca me julgar pelos
meus erros, tendo sempre uma palavra sábia de
consolo para que eu pudesse me erguer. Amigo
como você é muito difícil encontrar.
viii
Agradecimentos
Por mais que esta caminhada seja árdua, aprendemos no final das
contas que na verdade o que nos faz grande não é a concretização desta
tese, e sim tudo que aprendemos com ela, principalmente as inúmeras
pessoas que contribuem para a realização de mais este sonho. Este espaço
é dedicado a vocês.
À
Deus
; por colocar pessoas tão especiais em minha vida e sempre me
dar força para concretizar mais esta etapa.
Ao
Prof. Dr.
Arnaldo Lopes Colombo
, pela orientação para o
aprimoramento dos longos passos destinados a realização deste trabalho, e
pela oportunidade do grande desenvolvimento profissional e pessoal que me
foi oferecida ao longo neste estudo.
À
Daniel Archimedes da Matta
que me deu a oportunidade de iniciar
minha jornada científica, sempre tendo paciência com minhas teimosias,
minha eterna amizade e admiração.
Á
Thomas Chagas
, que se mostrou uma pessoa amiga e pronta a
ajudar em todos os momentos que precisei. Sem você talvez esta tese
demoraria muito mais para sair. Minha eterna gratidão.
ix
À
Sarah
Gonçalves e Vagner
, que apesar do pouco tempo que nos
conhecemos, estiveram sempre me dando força e auxiliando no que fosse
necessário. Minha eterna amizade e gratidão.
À
Paty Girl
, amiga que apesar de não conviver mais diretamente com
sua alegria, mora em meu coração.
À
Edméa Helena
, que sempre teve uma palavra amiga para me ajudar
nos momentos difíceis, agradeço pela atenção e carinho.
A todos os amigos do LEMI que compartilharam comigo toda a
tragetória da minha tese e que de alguma forma me ajudaram a realizar este
sonho:
Thelma Alves,
Thaís Guimarães,
Vinicius Ponzio,
Leila Paula
,
Viviane Reis,
Cledja Amorim
,
Zelinda Nakagawa e Analy Sales.
Á
Miriam Amaral
e
André
por todo apoio oferecido durante a
elaboração desta tese.
Á
Maria
, por toda ajuda prestada nas horas em que precisei.
Á
Nilva Franco
, comadre que sempre me meu força para lutar pelos
meus sonhos.
A todos aqueles que em algum momento passaram pela minha vida e
puderam contribuir para aquilo que sou hoje.
x
“Na nossa busca, devemos superar obstáculos,
superar provas. Isso nos assusta. Devemos
transitar pela escuridão com fé, crendo que uma
mão nos leva enquanto vamos tateando o
caminho. De repente, a luz se faz. Então,
reconhecemos que valeu a pena ser valentes e
atravessar um terreno desconhecido”.
xi
Dedicatória ... v
Agradecimentos ... viii
Listas ... xi
Resumo ... xvii
1
INTRODUÇÃO
... 11.1 Testes de susceptibilidade a antifúngicos: a padronização do método de diluição em caldo ... 2
1.1.1 EUCAST: a padronização européia para ensaios de microdiluição... 6
1.1.2 Sensititre Yeast-One: sistema colorimétrico para ensaios de diluição em caldo... 9
1.2 Testes de susceptibilidade a antifúngicos – avanços em métodos de ágar difusão... 13
1.2.1 Ensaios com E-test... 13
1.2.2 Ensaios com disco-difusão... 17
1.3 Resistência a amostras de Candida spp. no Brasil... 25
2
OBJETIVOS
... 293
MATERIAL E MÉTODOS
... 313.1 Seleção de microrganismos... 32
3.2 Identificação de leveduras... 32
3.2.1 Análise de micromorfologia das colônias... 33
3.2.2 Perfil bioquímico... 33
3.3 Teste de susceptibilidade a antifúngicos: disco-difusão (NCCLS M44-A) ... 35
3.3.1 Preparo do meio... 35
3.3.2 Preparo do inóculo ... 36
xii
3.3.5 Interpretação dos halos inibitórios: definição qualitativa de
susceptibilidade das leveduras ... 38
3.3.6 Interpretação dos halos inibitórios: definição quantitativa de susceptibilidade das leveduras aos antifúngicos ... 40
3.4 Análise dos dados... 41
4
RESULTADOS
...
424.1 Microrganismos... 43
4.2 Distribuição das amostras de Candida spp. avaliadas em ensaios de disco-difusão com fluconazol ... 43
4.3 Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com fluconazol utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028) ... 46
4.4 Apresentação dos resultados qualitativos do método de disco-difusão com discos de fluconazol ... 47
4.5 Análise de resultados quantitativos de susceptibilidade com discos de fluconazol gerados pelo software do sistema Biomic ... 51
4.5.1 Análise comparativa do perfil de susceptibilidade a fluconazol em amostras testadas em dois períodos diferentes ... 53
4.6 Distribuição das amostras de Candida spp. avaliadas em ensaios de disco-difusão com voriconazol ... 55
4.7 Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com voriconazol utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028) ... 56
4.8 Apresentação dos resultados qualitativos do método de disco-difusão com discos de voriconazol ... 58
4.9 Análise de resultados quantitativos de susceptibilidade com discos de voriconazol gerados pelo software do sistema Biomic ... 61
5
DISCUSSÃO
...
636
CONCLUSÕES
...
767
ANEXOS
78 8REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
...
81xiii
Listas de tabelas
Tabela 1. Distribuição de 4.625 isolados de Candida spp. identificados em diferentes culturas de materiais biológicos avaliados no período de 1998 a 2003...... 40 Tabela 2. Análise dos resultados da média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios para discos de fluconazol referentes a amostras testadas no
período de 1998 a 2003... 44 Tabela 3. Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de fluconazol
frente a 4.625 isolados de Candida spp. identificados em diferentes culturas de materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no
período de 1998 a 2003... 45 Tabela 4. Interpretação do perfil de susceptibilidade a fluconazol em categorias:
susceptível, SDD e resistente frente a amostras de Candida spp. obtidas no período de 1998 a 2003... 46 Tabela 5. Resultados quantitativos do perfil de susceptibilidade a fluconazol de 4.625
amostras de Candida spp.... 48 Tabela 6. Interpretação das categorias de susceptibilidade a fluconazol dos
organismos testados pelo método de disco-difusão em dois períodos: de 1998 a 2000 e 2001 a 2003... 50 Tabela 7. Distribuição de 2.793 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos avaliados no período de 2001 a 2003 ... 51 Tabela 8. Análise dos resultados de média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios (mm) para discos de voriconazol referentes a amostras testadas no período de 2001 a 2003 ... 54 Tabela 9. Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de voriconazol
frente a 2.793 isolados de Candida spp. identificados em diferentes culturas de materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no
período de 2001 a 2003... 55
Tabela 10. Comparação do perfil de susceptibilidade a 2.793 isolados de Candida
xiv
Figura 1. Distribuição das cinco principais espécies de Candida identificadas em diferentes fluídos biológicos ao longo do estudo ...
41 Figura 2. Avaliação da reprodutibilidade na leitura dos diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com discos de fluconazol utilizando a cepa-controle ATCC 90028 (C. albicans) ... 42 Figura 3. Avaliação da reprodutibilidade na leitura dos diâmetros dos halos
xv
A Aprovado
aids “Acquired Immunodeficiency Syndrome” ATCC “American Type Culture Collection”
o
C Graus Celcius
C Meio de assimilação de carbono CIM Concentração inibitória mínima
CIM50 CIM de antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos isolados
CIM90 CIM de antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos isolados
CQ Controle de qualidade et al. E outros
EUA Estados Unidos da América
EUCAST European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing FDA “Food and Drug Administration”
g Gramas
g/L Gramas por litro
HAART Terapia anti-retroviral de alta potência
h Hora (s)
µg Micrograma
µL Microlitro
LEMI Laboratório Especial de Micologia MHA Mueller-Hinton ágar
mm Milimetro
mL Mililitro
MOPS Ácido morfolinopropanosulfônico NaCl Cloreto de sódio
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
nm Nanômetro
No Número
P Proposta
pH Potencial hidrogeniônico
R Resistente
xvi
S-DD Susceptibilidade-dose dependente
SENTRY Programa Internacional de Vigilância das Infecções da Corrente Sanguínea
spp. Espécies
T Tentativa
UFC Unidade formadora de colônia
x Vezes
≤ Menor do que ou igual a
≥ Maior do que ou igual a
% Por cento
5-FC 5-Fluorocitosina
xvii
Introdução: Em 2004, o NCCLS padronizou a técnica de disco-difusão para ensaios com fluconazol. Este teste permite a análise de grande número de amostras com custo reduzido, resultado rápido e de fácil interpretação, não exigindo equipamento especial, sendo assim de grande utilidade em estudos de vigilância de resistência a fluconazol e voriconazol. Objetivos: 1) Avaliar a distribuição de espécies de Candida identificadas em diferentes materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados. 2) Descrever o perfil de susceptibilidade pelo método de disco-difusão para as diferentes amostras de Candida
spp. frente a fluconazol e voriconazol. 3) Avaliar a prevalência de isolados de Candida
spp. resistentes a fluconazol. Material e Métodos: Foram incluídas todas as amostras de
Candida spp. isoladas de diversos materiais biológicos, provenientes de dois hospitais
terciários da cidade de São Paulo, entre janeiro de 1998 a dezembro de 2003. Após triagem de Candida albicans, utilizando-se meio cromogênico CHROMagar- Candida, os isolados de Candida não-albicans foram identificados por análise do perfil bioquímico pelo método comercial ID-32C, complementados por análise de microcultivo. O perfil de susceptibilidade das amostras frente a fluconazol e voriconazol foi realizado pelo método de disco-difusão, de acordo com a normatização do documento do NCCLS M44-A (2004). A determinação dos diâmetros dos halos inibitórios foi realizada utilizando de um sistema automatizado de leitura de placas para análise das imagens - BIOMIC. Resultados: Avaliou-se 4.625 isolados clínicos de Candida spp., incluindo 2.393 cepas de C. albicans
(51,7%), 658 de C. tropicalis (14,2%), 503 de C. glabrata (11%), 495 de C. parapsilosis
(10,8%), 292 de C. rugosa (6,3%), 195 de C. guilliermondii (4,2%), 53 de C. krusei (1,1%) e 36 de Candida spp. Na análise dos resultados qualitativos de susceptibilidade a fluconazol as amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram diâmetro dos halos inibitórios maiores, resultado este que sugere alta susceptibilidade destas cepas a fluconazol. Para os isolados de C. glabrata, C. krusei e C. rugosa os halos obtidos apresentaram menores diâmetros, dado compatível com susceptibilidade reduzida destas espécies a fluconazol. Em relação a voriconazol, os isolados de C. albicans, C.
parapsilosis, C. glabrata e C. tropicalis apresentaram diâmetros dos halos inibitórios
maiores. Para as amostras de C. krusei e C. rugosa, os halos apresentaram menor diâmetro em relação as espécies mais susceptíveis. Na análise dos resultados quantitativos de susceptibilidade a fluconazol as taxas de SDD/R para os isolados avaliados foram de 2,0 e 5,8%, respectivamente, sendo visto maior porcentagem de SDD/R com C. glabrata, C. krusei e C. rugosa. Com exceção das amostras de C. rugosa, todas as amostras testadas com voriconazol apresentaram valores de CIM90 ≤ 0,5µg/mL. Conclusão: 1. Em nosso estudo, das 4.625 espécies de Candida testadas, C. albicans foi a espécie prevalente em todos os fluídos biológicos avaliados. 2. Entre as leveduras de
Candida não-albicans, as espécies mais freqüentes foram C. tropicalis, C. glabrata e C.
parapsilosis em ambos os períodos avaliados. 3. Susceptibilidade dose-dependente (SDD)
Azevedo, Ana Carolina de Almeida
Avaliação do perfil de susceptibilidade a fluconazol e voriconazol frente a isolados de Candida spp. pelo método de disco-difusão. / Ana
Carolina de Almeida Azevedo. – São Paulo, 2005. xvii 94f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of the fluconazole and voriconazole susceptibility profile of yeasts clinical isolates for disk diffusion method.
1. Disco-difusão. 2. Candida spp. 3. Fluconazol . 4. Voriconazol. 5. Resistência
a fluconazol.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Testes de susceptibilidade a antifúngicos: a padronização do método de diluição em caldo
O desenvolvimento de métodos de susceptibilidade a antifúngicos
tem sua história vinculada aos avanços obtidos na quimioterapia
antibacteriana. Assim sendo, a utilização de testes de susceptibilidade in vitro
envolvendo princípios das metodologias conhecidas como difusão em ágar e
diluição em caldo foi inicialmente realizado por Flemming, durante a
investigação do potencial terapêutico da penicilina. Rapidamente, com o
advento de novos antimicrobianos, bem como o reconhecimento de bactérias
resistentes à penicilina, inúmeros laboratórios de microbiologia passaram a
realizar testes de susceptibilidade a antimicrobianos (Sherris, 1989).
A quimioterapia de doenças fúngicas apresentava, até um
passado recente, grande disparidade em relação à terapêutica antibacteriana.
Até o advento dos antifúngicos azólicos na década de 70, apenas a
anfotericina-B e a 5-fluorocitosina (5-FC) encontravam-se disponíveis para o
tratamento de micoses sistêmicas. Atualmente, no Brasil, são encontrados
comercialmente diversas drogas antifúngicas para uso sistêmico, incluíndo
anfotericina-B desoxicolato e formulações lipídicas, fluconazol, itraconazol,
cetoconazol, 5-FC e recentemente, voriconazol e caspofungina (Dismukes,
2001; Groll et al., 2002; Colombo et al., 2003; Datry, Bart Delabesse, 2005).
Além do lançamento de voriconazol e caspofungina, outras três drogas
encontram-se em fase avançada de investigação clínica: ravuconazol,
posaconazol e micafungina (Arikan, Rex, 2002; Ostrosky-Zeichner, 2003;
Se por um lado, temos hoje maior número de opções de drogas
antifúngicas, por outro, há crescente preocupação com o aumento da
resistência a estas drogas. Estudos de vigilância de resistência a antifúngicos
no mundo todo mostram a emergência de leveduras de Candida não-albicans
como causa de infecções superficiais e invasivas, sendo que muitas destas
espécies apresentam menor susceptibilidade a anfotericina-B e/ou azólicos
(Pfaller et al., 2002; Krcmery, Barnes, 2002; Colombo, 2003a; Hajjeh et al.,
2004; Almirante et al., 2005).
Diante deste fato, aumentou o interesse da comunidade científica
no aperfeiçoamento de testes de susceptibilidade para auxiliar na escolha mais
adequada na terapêutica antifúngica como também, da indústria farmacêutica
para utilizar essa ferramenta no desenvolvimento de novas drogas (Rex et al.,
2001; Pfaller et al., 2002; Bedout et al., 2003).
No final da década de 80, como parte da estratégia para obter um
método de alta reprodutibilidade, o National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) conduziu vários estudos multicêntricos para definir as
condições ideais de realização de ensaios de diluição em caldo. Neste sentido, as
variáveis que foram objeto de padronização incluíram a definição do método e
preparação de inóculo, a composição e o pH do meio a ser utilizado, a
temperatura, o tempo de incubação e determinação dos critérios de leitura do
teste (NCCLS, 1992; Pfaller, Rinaldi, 1993; Rex et al., 1993).
Pfaller et al. (1988) realizaram estudo com o objetivo de
padronizar o inóculo a ser utilizado no ensaio, comparando a técnica de
espectrofotometria com três outros testes. A partir dos resultados obtidos,
concluíram que a espectrofotometria foi a metodologia com melhor
reprodutibilidade e fácil execução para o teste de susceptibilidade a
crescimento mais rápido quando incubadas à 35oC do que à 30oC (Pfaller et al.,
1990).
Fromtling et al. (1993) desenvolveram trabalho multicêntrico
envolvendo 13 laboratórios diferentes para otimizar a correlação
interlaboratorial dos resultados do método de microdiluição em caldo, testando
três classes de drogas antifúngicas frente a 100 isolados de Candida spp..
Foram comparados dois tamanhos de inóculo (5x104 e 2-5x103 UFC/mL) e dois
tempos de leitura (24h e 48h de incubação). Houve maior reprodutibilidade nos
ensaios que utilizaram menor concentração do inóculo (2-5x103 UFC/mL) e
leitura de 48h, mostrando assim melhor correlação interlaboratorial dos
resultados obtidos.
Estes trabalhos foram fundamentais para a padronização do teste
de susceptibilidade a antifúngicos pelo NCCLS que ocorreu após 15 anos de
trabalhos colaborativos possibilitando a publicação de normas e técnicas
envolvendo os documentos M27-P (proposta - 1992), M27-T (tentativa - 1995),
M27-A (aprovado - 1997) e, mais recentemente a versão M27A-2 (2002)
(NCCLS, 1992; NCCLS, 1995; NCCLS, 1997; Rex et al., 2001; NCCLS, 2002).
Estes documentos fundamentaram a metodologia de diluição em
caldo (macrodiluição ou microdiluição em caldo como técnica equivalente)
como padrão ouro para testes de susceptibilidade a antifúngicos. Desta forma,
o NCCLS estabeleceu a utilização do meio de cultura RPMI -1640 com
L-glutamina, sem bicarbonato e tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico
(MOPS) com pH 7,0; o tamanho do inóculo de 0,5 à 2,5 X 103 UFC/mL utilizando
espectrofotometria, a temperatura de incubação de 35°C com períodos variando
de 48h para isolados de Candida spp. e 72h para Cryptococcus neoformans. O
critério de leitura dos ensaios com azólicos e 5-FC foi definido como a menor
concentração capaz de gerar inibição significativa (50% para microdiluição e
(CIM) foi definida como a menor concentração capaz de inibir qualquer
crescimento visível (Pfaller et al., 1988; Pfaller et al., 1990; Espinell-Ingroff et
al., 1992; Fromtling et al., 1993; Pfaller, Rinaldi, 1993; Rex et al., 1993; Rex et
al., 2001; NCCLS, 2002).
A correlação clínico-laboratorial dos valores das CIMs gerados
pelo método de microdiluição em caldo foi avaliada em diversos estudos em
pacientes com aids, portadores de candidíase orofaríngea. Dados obtidos por
vários autores mostraram que valores mais elevados das CIMs frente a
fluconazol para isolados de Candida albicans originários da cavidade oral de
pacientes com aids, correlacionaram-se com falência terapêutica. De forma
complementar, aqueles isolados cujos valores das CIMs foram baixos,
correlacionaram-se com êxito à terapêutica antifúngica (Rex et al.,2001; Pfaller
et al., 2004). Após a revisão dos dados de correlação clínico-laboratorial
obtidos por diversos trabalhos, o NCCLS publicou uma proposta para a
interpretação dos valores das CIMs de fluconazol e itraconazol, dividindo as
amostras testadas em três categorias: susceptível, susceptibilidade
dose-dependente (SDD) ou resistente (Rex et al., 1997, Martin-Mazuelos et
1.1.1 EUCAST: a padronização européia para ensaios de microdiluição
Paralelamente aos esforços do NCCLS para o aprimoramento de
testes de susceptibilidade, a comunidade científica européia se organizou na
realização de estudos para otimização destes ensaios. Recentemente, a
entidade responsável pela normatização de técnicas de laboratório clínico na
Europa, o European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST), designou um subcomitê para elaborar uma proposta alternativa em
relação a padronização do teste de microdiluição em caldo para leveduras
fermentadoras, baseada no documento NCCLS M27-A (1997). Esta
metodologia incorporou algumas modificações no teste padrão do NCCLS,
sendo as principais a utilização do meio RPMI suplementado com 2% de
glicose, para suportar melhor crescimento de leveduras fermentadoras, o
aumento no tamanho do inóculo para 0,5-2,5x105 UFC/mL, possibilitando
menor tempo de incubação do ensaio de 48h para 24h e, finalmente, a leitura
dos testes por espectrofotometria, para eliminar a subjetividade da leitura visual
do ensaio (Estrella et al., 2002; Chryssanthou et al., 2002;
Cuenca-Estrella et al., 2003).
Cuenca-Estrella et al. (2002) avaliaram a correlação dos resultados
obtidos entre dois métodos de microdiluição em caldo: NCCLS M27-A (1997)
versus EUCAST. Foram avaliadas um total de 109 amostras de Candida spp.
isoladas de hemoculturas obtidas de um programa de vigilância de resistência
a antifúngicos em Baltimore, Connecticut. Foram utilizadas as seguintes drogas
antifúngicas: anfotericina-B, fluconazol, 5-FC e itraconazol. A leitura dos
ensaios do EUCAST foi realizada após 24h de incubação e a metodologia do
NCCLS, após 48h de incubação. O índice de correlação entre as CIMs geradas
pelos dois métodos foi de 92%. Para ensaios com anfotericina-B houve boa
concordância entre todas as amostras testadas: Candida glabrata (95,3%),
Candida parapsilosis (95,1%), Candida albicans (94,5%) e Candida tropicalis
avaliados (100%). Em relação a fluconazol houve boa correlação para todas as
amostras: C. parapsilosis (94,6%), C. albicans (93,9%), C. glabrata (93,8%) e
C. tropicalis (88,5%). Entretanto, para itraconazol houve menor concordância
em ensaios envolvendo C. glabrata (81%), C. parapsilosis (80,7%), C. albicans
(80,4%) e C. tropicalis (78,8%). Pode-se concluir que em relação as amostras
avaliadas, houve maior correlação entre os ensaios envolvendo isolados de C.
albicans e C. parapsilosis e menor correlação para as amostras de C. tropicalis.
Já para as drogas testadas, houve concordância maior em ensaios envolvendo
anfotericina-B, fluconazol e 5-FC, sendo menor para itraconazol. De forma
geral, os autores concluíram que a concordância entre os dois métodos foi
bastante significativa, havendo vantagem de leitura após 24h para os ensaios
do EUCAST.
Em estudo realizado por Chryssanthou et al. (2002) foi analisada
a concordância entre os valores das CIMs para voriconazol e caspofungina em
relação a dois diferentes ensaios: o método de microdiluição em caldo
padronizado pelo NCCLS M27-A (1997) e a proposta do EUCAST. Foram
avaliadas 102 amostras de leveduras isoladas de vários materiais biológicos
provenientes de pacientes admitidos no Hospital Karolinska, Suécia. A
correlação entre os resultados das CIMs obtidas pelas duas metodologias para
leitura de 24h foi boa para ambas as drogas testadas: voriconazol (99%) e
caspofungina (98%). Já a correlação entre as leituras de 24h para o EUCAST e
48h para o NCCLS foi maior para caspofungina (96%) e menor para
voriconazol (87%). Em ensaios com leitura de 48h para ambas as
metodologias, a concordância foi boa para as duas drogas testadas:
voriconazol (97%) e caspofungina (100%). Os autores concluíram que a leitura
de 24h pelo método EUCAST oferece excelente performance e permite a
Cuenca-Estrella et al. (2003) realizaram estudo multicêntrico
avaliando a reprodutibilidade de dois métodos de microdiluição em caldo:
EUCAST e NCCLS M27-A2 (2002). Participaram deste trabalho nove
laboratórios, sendo testados 60 isolados clínicos de Candida spp. frente a três
drogas antifúngicas (fluconazol, itraconazol e 5-FC). A correlação entre as
leituras de 24h para ambos os métodos foi de 99,2% e após 48h foi de 96,4%.
A leitura de 24h do EUCAST possibilitou concordância maior que 95% para a
grande maioria das drogas e para as espécies de leveduras testadas. Apenas
ensaios realizados com isolados de C. glabrata apresentaram menor
concordância e reprodutibilidade. Estes dados confirmam que a leitura de 24h
do EUCAST oferece melhores resultados, devendo-se realizar leitura de 48h
apenas para amostras com limitado crescimento após curto período de
incubação.
Espinel-Ingroff et al. (2005) compararam as CIMs de fluconazol,
itraconazol, posaconazol e voriconazol obtidas segundo duas metodologias:
EUCAST e NCCLS M27-A2 (2002). Foram selecionados 421 isolados de
Candida spp. de seis diferentes centros. A concordância entre as duas
metodologias para leitura de 24h em ambos os métodos foi boa em todas as
drogas avaliadas: fluconazol (95%), voriconazol (94%), posaconazol (91%) e
itraconazol (90%). A leitura de 48h não aumentou a concordância entre os
métodos avaliados. Entretanto, os autores verificaram que os resultados das
CIMs do EUCAST em relação a azólicos foram consistentemente menores que
os dados obtidos com o método padrão do NCCLS. Sendo assim, é possível
que os pontos de corte para a susceptibilidade a azólicos sugeridos pelo
1.1.2 Sensititre Yeast-One: sistema colorimétrico para ensaios de diluição em caldo
Devido à necessidade de métodos de susceptibilidade a
antifúngicos que pudessem gerar resultados com maior rapidez e praticidade,
auxiliando a rotina de laboratórios clínicos, vários sistemas comerciais foram
desenvolvidos para a avaliação in vitro de drogas antifúngicas. Dentre eles,
destaca-se o sistema comercial Sensititre Yeast-One, consistindo numa placa
de microdiluição contendo diferentes concentrações de cinco agentes
antifúngicos: anfotericina-B, fluconazol, 5-FC, itraconazol e cetoconazol. Essa
placa contém um indicador colorimétrico (azul de alamar) que permite visualizar
mudança de pH frente à multiplicação das células fúngicas. Desta forma, este
sistema colorimétrico desencadeia uma reação de óxido-redução com
conseqüente mudança de cor azul para vermelho nos poços onde há
crescimento do inóculo. Essa reação facilita a identificação do ponto de leitura
das CIMs, na transição de mudança de cor. As vantagens desse método
comercial incluem não apenas as facilidades operacionais, (visto que as drogas
já se apresentam prontas na placa de leitura), como também a rápida liberação
de resultados (leitura de 24h) e interpretação do ponto de leitura por mudança
de cor (Tiballi et al., 1995; Espinel-Ingroff et al., 1999; Chryssanthou, 2001;
Morace et al., 2002).
No estudo conduzido por Davey et al. (1998) foram comparados
os seguintes métodos de microdiluição em caldo: Sensititre Yeast-One e
NCCLS M27-A (1997) para determinar a susceptibilidade de 180 isolados de
Candida spp. em relação a quatro drogas antifúngicas: anfotericina-B,
fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Houve concordância superior a 90%
entre os métodos para ensaios envolvendo anfotericina-B e fluconazol em
relação a todas as cepas avaliadas. Em ensaios envolvendo itraconazol e
cetoconazol os índices de concordância para a maioria das amostras avaliadas
foi boa (91%), com exceção de ensaios envolvendo isolados de C. tropicalis
duas metodologias foi maior com testes envolvendo fluconazol e anfotericina-B,
tendo menor concordância para amostras de C. tropicalis em relação a
antifúngicos azólicos.
Espinel-Ingroff et al. (1999) avaliaram a concordância do método
comercial Sensititre Yeast-One em relação ao método padronizado pelo
NCCLS M27-A (1997), em três diferentes laboratórios, testando 1.176 isolados
clínicos de espécies de Candida. Os resultados das CIMs do método comercial
em relação aos cinco agentes antifúngicos (anfotericina-B, fluconazol, 5-FC,
itraconazol e cetoconazol) foram comparados após 24h de incubação para o
teste colorimétrico, e 48h para o método do NCCLS. A concordância entre as
duas metodologias variou de 90 a 98% para todas as espécies avaliadas. Os
dados sugerem que a placa Sensititre Yeast-One tem uso potencial em
laboratórios de rotina por sua facilidade de execução e concordância com o
NCCLS.
Chryssanthou et al. (2001) conduziram estudo comparando o
sistema Sensititre Yeast-One com o método de macrodiluição em caldo frente a
anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e 5-FC. Foram selecionadas para o
estudo 233 espécies de Candida isoladas de hemoculturas na Suécia. A
concordância entre as leituras de 24h para o teste colorimétrico e 48h para o
método do NCCLS foi de 87%. Houve concordância maior para anfotericina-B
(97%), 5-FC (94%), fluconazol (93%) e menor para itraconazol (70%) quando
avaliadas amostras de C. albicans. Já para as espécies de Candida
não-albicans, houve concordância maior apenas para anfotericina-B (82%), sendo
menor para fluconazol (78%), 5-FC (75%) e itraconazol (44%). Os autores
concluíram que houve discrepância de resultados entre as espécies avaliadas,
sendo que para ensaios com isolados de C. albicans houve boa correlação em
quase todas as drogas avaliadas, exceto para itraconazol. Em relação as
amostras de Candida não-albicans, principalmente C. glabrata, C. krusei e C.
parapsilosis apresentaram baixa correlação de resultados para quase todas as
faz-se necessária a confirmação dos resultados com o método de referência para
os resultados do teste de susceptibilidade a azólicos frente aos isolados de C.
glabrata, C. krusei e C. parapsilosis.
Morace et al. (2002) determinaram a susceptibilidade de
fluconazol através de seis metodologias, dentre estas o comercial Sensititre
Yeast-One e NCCLS M27-A (1997), sendo testadas 800 amostras clínicas de
Candida spp. A concordância entre os métodos avaliados foi de 81,4%. Houve
maior correlação em ensaios com fluconazol para isolados de C. parapsilosis
(88,9%), C. albicans (88,4%), C. tropicalis (83,1%) e menor em amostras de C.
krusei (66,7%) e C. glabrata (50,8%). Através deste estudo, os autores
concluíram que os resultados do teste colorimétrico para os isolados de C.
krusei e C. glabrata apresentaram baixa correlação com o método de
referência. Isto pode ser devido as dificuldades de adaptação a diferença de
curva de crescimento para amostras de C. glabrata e C. krusei em diferentes
condições na realização do teste de susceptibilidade a antifúngicos.
Trabalhos mais recentes têm avaliado a eficácia deste sistema
comercial com novas drogas antifúngicas como: voriconazol, posaconazol e
ravuconazol. No estudo de Pfaller et al. (2004b) foi avaliado o sistema
Sensititre Yeast-One, comparando os resultados do teste com o NCCLS
M27-A2 (2002). Foram avaliados 300 isolados clínicos de C. albicans, C.
parapsilosis, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. glabrata frente a
fluconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol. A concordância entre os
resultados dos métodos avaliados foi de 95,4%. Em relação a fluconazol,
ravuconazol, voriconazol e posaconazol houve boa correlação para todas as
espécies testadas (98%, 96%, 95,3% e 92,3%, respectivamente). No trabalho
citado acima, foram obtidos melhores resultados para o sistema comercial
Sensititre Yeast-One envolvendo azólicos quando comparados aos estudos de
Após vários anos de pesquisas avaliando o sistema comercial
Sensititre Yeast-One, pode-se concluir que este método apresenta boa
reprodutibilidade e acurária significativa comparado ao NCCLS M27-A2 (2002).
Entretanto, os resultados parecem depender da combinação entre espécies de
Candida e as drogas testadas. Estes estudos levaram à aprovação deste
sistema pelo “Food and Drug Administration” (FDA) nos EUA. Contudo, por se
tratar de um método com custo elevado, torna-se limitante a utilização em
1.2 Testes de susceptibilidade a antifúngicos – avanços em métodos de ágar difusão
1.2.1 Ensaios com E-test
Apesar dos métodos de diluição em caldo representarem um
importante avanço no desenvolvimento de testes de susceptibilidade a
antifúngicos, seja por suas características de reprodutibilidade e boa correlação
clínica observada, tratam-se de métodos laboriosos e de difícil execução em
laboratórios de rotina. Por estes motivos, vários pesquisadores tiveram a
necessidade de desenvolver ensaios mais adequados à rotina de laboratórios
clínicos, cujos resultados fossem equivalentes àqueles gerados pelo método de
referência (Martin-Mazuelos et al., 1999; Koc et al., 2000; Laverdiere et al.,
2002).
Na tentativa de encontrar ensaios que pudessem ser utilizados
em laboratórios de rotina para obter maior rapidez e praticidade, foram
desenvolvidos métodos alternativos de difusão em ágar, como o teste de
disco-difusão e o E-test, com a finalidade de determinar in vitro a susceptibilidade de
leveduras frente a várias classes de antifúngicos (Colombo et al.,1995; Koc et
al., 2000; Matar et al., 2003; Maxwell et al., 2003; Hospenthal et al., 2004).
O E-test (AB Biodisk, Solna, Suécia) é um teste de difusão em
ágar, que fornece valores quantitativos referentes à CIM do antifúngico para o
microrganismo em estudo. Este método consiste numa fita plástica contendo
droga em diferentes concentrações expressas no reverso da tira. Uma vez
colocada na superfície do meio solidificado, a droga contida na fita difunde-se
rapidamente para o meio, mantendo por longo tempo um gradiente fixo de
inibe o crescimento do microrganismo inoculado no meio, gerando área de
inibição em formato de elipse. A CIM é lida como sendo a concentração da
droga superior àquela expressa na fita no ponto em que a tira de E-test
intercepta a borda da zona de inibição. Deste modo, este método reúne a
vantagem na simplicidade de execução de testes de difusão em ágar, com as
informações quantitativas fornecidas pelos ensaios de diluição (Baker et al.,
1991; Sanchez, Jones, 1993; Colombo et al., 1995).
Colombo et al. (1995) analisaram a concordância de dois
métodos: E-test e NCCLS M27-T (1992). Foram avaliados 100 isolados de
Candida spp. frente a fluconazol, cetoconazol e itraconazol. A correlação entre
as metodologias para fluconazol foi maior em ensaios envolvendo as amostras
de C. glabrata (95%) e C. albicans (84%), sendo menor para os isolados de C.
tropicalis e C. parapsilosis (53%). Em ensaios envolvendo cetoconazol a
correlação foi maior entre as amostras de C. albicans (88%) e C. parapsilosis
(87%), tendo menor correlação para isolados de C. tropicalis (73%) e C.
glabrata (45%). Em relação a itraconazol, houve maior concordância em
relação as amostras de C. glabrata (100%) e C. parapsilosis (87%), tendo
menor concordância entre os isolados de C. albicans (76%) e C. tropicalis
(33%). Em conclusão, o E-test apresentou correlação variável com o método
de referência, com maior acurácia em ensaios com itraconazol e fluconazol e
menor para cetoconazol. Entre as espécies testadas houve menor performance
apenas para amostras de C. tropicalis.
Em estudo desenvolvido por Martin-Mazuelos et al. (1999) foi
avaliada a utilização do E-test em relação ao teste padronizado pelo NCCLS
M27-A, (1997) para ensaios com fluconazol e itraconazol. Foram testadas 102
amostras de Candida spp. isoladas da cavidade orofaríngea de pacientes
admitidos no Hospital da Universidade de Sevilla, Espanha. A concordância
entre as metodologias avaliadas foi de 74,5%. A concordância para ensaios
com fluconazol foi maior nos testes envolvendo amostras de C. tropicalis
glabrata (66,6%). Em relação a itraconazol, a correlação foi maior entre os
isolados de C. glabrata (88,8%) e C. tropicalis (82,3%), apresentando menor
correlação para C. albicans (60,5%) e C. parapsilosis (42,9%).
Koc et al. (2000) avaliaram a concordância do E-test com o teste
de microdiluição em caldo frente a anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e
cetoconazol. Foram selecionados para o estudo 102 isolados de Candida spp..
A concordância entre as metodologias para anfotericina-B foi boa em relação a
todas as amostras avaliadas: C. parapsilosis (100%), C. albicans (96,7%), C.
tropicalis (90%) e C. glabrata (87,5%). Em ensaios com fluconazol e itraconazol
houve maior concordância entre as amostras de C. albicans (83,3%) e C.
tropicalis (80%) e menor para C. parapsilosis e C. glabrata (75%). Ensaios
envolvendo cetoconazol foram similares a fluconazol e itraconazol, mudando
apenas em relação aos isolados de C. albicans (86,7%). Sendo assim, pode-se
concluir que houve maior concordância entre as metodologias nos ensaios
envolvendo anfotericina-B, sendo menor com azólicos. Entre as espécies
analisadas houve menor correlação para as amostras de C. glabrata quando
testadas com azólicos.
Laverdiere et al. (2002) determinaram a susceptibilidade a
anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e caspofungina através de dois métodos:
E-test e NCCLS M27-A (1997). Foram testadas 178 amostras de Candida spp.
isoladas de hemoculturas, provenientes de dois centros canadenses. A
correlação entre as duas metodologias com a variação de até duas diluições
para as espécies avaliadas variou de 81% à 97%. A correlação para
anfotericina-B foi boa para todas as amostras avaliadas: C. albicans, C.
glabrata, C. tropicalis (100%) e C. parapsilosis (90%). Em relação a fluconazol
houve maior correlação entre as amostras de C. parapsilosis (90%), C. albicans
Em relação a itraconazol houve maior correlação para C. tropicalis (86%), C.
parapsilosis (85%) e C. albicans (84%), sendo menor para C. glabrata (77%).
Já para caspofungina, houve boa correlação em relação a todas as amostras
testadas: C. tropicalis (100%), C. parapsilosis (90%), C. albicans (88%) e C.
glabrata (85%). Em conclusão, os autores confirmaram que apesar da
correlação satisfatória entre os dois métodos, há variáveis de concordância
conforme a droga e espécie avaliada.
Maxwell et al. (2003) avaliaram a performance do E-test para
fluconazol e voriconazol frente aos resultados das CIMs determinadas pelo
método NCCLS M27-A (2002). Foram avaliadas 279 amostras de Candida spp.
isoladas de hemoculturas, obtidas de 68 diferentes laboratórios. A
concordância entre os resultados das metodologias avaliadas em ensaios com
fluconazol foi boa para todas as espécies testadas. Já em relação a voriconazol
houve maior concordância para C. lusitaniae e C. rugosa (100%), sendo menor
para amostras de C. guilliermondii (79%). Os autores concluíram que houve
boa correlação para as duas drogas avaliadas, tendo baixa correlação para os
isolados de C. guilliermondii quando testado voriconazol. O E-test pareceu ser
um método alternativo para determinar a susceptibilidade de espécies
incomuns de Candida.
Os resultados dos vários estudos demonstram que o E-test
apresenta significativa concordância com o método padronizado pelo NCCLS
M27-A2 (2002). Conseqüentemente, este teste também foi aprovado pelo FDA
para utilização em laboratórios de rotina. Deve-se mencionar que vários
autores sugerem que E-test gera maior variação de valores das CIMs para
anfotericina-B quando comparado ao NCCLS. Esta qualidade permite maior
poder discriminatório para o E-test na identificação de espécies resistentes a
1.2.2 Ensaios com disco-difusão
O método de disco-difusão, descrito por Anderson e modificado
por Kirby e Bauer, vem sendo empregado com sucesso na bacteriologia desde
1966, com a finalidade de determinar a susceptibilidade de bactérias a
antimicrobianos, apresentando ótima correlação clínico-laboratorial. Tendo em
vista sua simplicidade operacional e bons resultados obtidos na bacteriologia é
de extrema importância a tentativa de adaptar esta metodologia para os
ensaios com antifúngicos (Bauer et al., 1966; Jorgensen et al., 1977; NCCLS,
1993; ).
Nas décadas de 70 e 80, vários autores trabalharam com o
método de disco-difusão em micologia utilizando discos de 5-FC,
anfotericina-B, miconazol e clotrimazol. Entretanto, os trabalhos foram realizados com
diferentes metodologias, sendo difícil a comparação entre seus resultados. Da
mesma forma, não houve preocupação dos autores no desenvolvimento de
estudos que possibilitassem a padronização de diferentes variáveis
fundamentais para garantir consistência e reprodutibilidade nos ensaios
(Marks, Eickhoff, 1970; Utz, Shadomy, 1977; Grendahl, Sung, 1978; Saubolle,
Hoeprich, 1978; Casals, 1979; Torres-Rodríguez et al., 1990).
Na década de 90, após a padronização do método de
microdiluição em caldo, o NCCLS designou um subcomitê para padronizar o
teste de disco-difusão frente a leveduras, onde vários estudos foram realizados
analisando as variáveis mais importantes na acurácia dos ensaios, incluindo o
meio a ser utilizado, a temperatura, o tempo de incubação, o disco contendo
antifúngico e a determinação dos critérios de leitura do teste (Pfaller et al.,
O meio de cultura a ser utilizado no teste de disco-difusão deve
ser capaz de suportar crescimento adequado dos microrganismos a serem
testados, sem causar qualquer interação com a atividade das drogas utilizadas
no ensaio. Têm sido preconizados meios de composição química
completamente definida, para viabilizar a reprodutibilidade dos ensaios
(Hoeprich et al.,1970; Hoeprich, Finn,1972; Radetsky, 1986).
Barry, Brown (1996) propuseram estudo com o método de
disco-difusão utilizando o meio RPMI-1640 com 2% glicose e 1,5% de ágar, levando
em conta os bons resultados deste meio nos ensaios de microdiluição em caldo
padronizados pelo NCCLS M27-T (1995). Neste estudo, os autores observaram
que o meio RPMI parece não ser apropriado para testar algumas espécies de
leveduras que apresentam pobre crescimento nesse meio, como foi visto para
amostras de C. glabrata e C. krusei, que apresentaram crescimento satisfatório
somente após 48h de incubação.
Estudos posteriores foram realizados a fim de encontrar um meio
mais adequado para o teste de disco-difusão na rotina de laboratórios clínicos.
Barry et al. (2002) avaliaram a utilização de dois meios para o método de
disco-difusão a fluconazol, testando 495 isolados de Candida spp.: meio
Mueller-Hinton ágar (MHA) suplementado com glicose e azul de metileno e o meio
RPMI-1640 ágar suplementado com glicose. Os resultados do teste de
disco-difusão para os dois meios foram comparados com os resultados do método de
referência (microdiluição em caldo). A correlação dos resultados para os dois
meios avaliados foi maior para a leitura de 24h com MHA (96,9%), sendo
menor com o meio RPMI (93,6%). Já em relação a leitura de 48h, houve menor
concordância para ensaios com ambos os meios testados: MHA (93,3%) e
RPMI (93,5%). Pode-se verificar que com a utilização do meio RPMI as
tempo maior (48h) para a leitura do teste. Também houve problemas com três
isolados de C. krusei e duas amostras de C. albicans. Para ensaios com o meio
MHA suplementado com glicose e azul de metileno houve melhor crescimento
para todos os isolados de diferentes espécies testadas e melhor definição do
halo de inibição, respectivamente. Os autores verificaram que ensaios de
disco-difusão utilizando o meio MHA apresentaram maior compatibilidade com
os resultados da microdiluição, suportando melhor o crescimento para as
diferentes espécies de leveduras avaliadas. Além disso, os resultados gerados
pelo teste de disco-difusão após 24h de incubação apresentaram maior
reprodutibilidade que aqueles obtidos após 48h de incubação.
Rubio et al. (2003) desenvolveram estudo para avaliar a
performance de três meios em relação ao teste de disco-difusão: meio MHA
suplementado com dextrose e azul de metileno, meio RPMI-1640 com glicose e
o meio Shadomy (SHDM). Foram selecionados 150 isolados de Candida spp.
provenientes de pacientes admitidos no Hospital Universitário Lozano Blesa,
Espanha. Os resultados do teste de disco-difusão para os três meios avaliados
foram comparados com os resultados do método de microdiluição em caldo
(NCCLS M27-A2). A correlação dos resultados após 24h de incubação foi
maior para o meio MHA (95,3%), sendo um pouco menor para os meios RPMI
(94%) e SHDM (92,6%). Em relação as leituras de 48h também houve maior
correlação com o meio MHA (94,6%), sendo menor para os meios SHDM
(91,3%) e RPMI (75,3%). O crescimento de microcolônias dentro do halo de
inibição foi comum para os meios RPMI (63,4%) e SHDM (64,7%), sendo
infrequente para o meio MHA (8,7%). O meio MHA apresentou um halo de
inibição claro e definido em 91,3% dos testes de disco-difusão. Com este
estudo, os autores concluíram que o meio MHA parece ser o meio ideal para o
método de disco-difusão devido à menor ocorrência de crescimento de
microcolônias dentro do halo de inibição, facilitando a leitura do teste e
minimizando qualquer subjetividade. Da mesma forma, o MHA apresentou
melhores índices de equivalência com os resultados gerados pelo método de
Barry et al. (2003) propuseram trabalho colaborativo internacional
envolvendo oito instituições para definir os limites do halo de inibição para as
cepas-controle a serem utilizadas nos testes de disco-difusão com fluconazol,
em meio MHA suplementado com glicose e azul de metileno. As oito
instituições avaliaram em dez dias distintos, três cepas-controle como controle
de qualidade (CQ) para definir o tamanho do halo de inibição: C. albicans
(ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019), C. tropicalis (ATCC 750). Os
resultados gerados pelas cepas-controle foram: C. albicans variaram de 28 a
39mm, para C. parapsilosis variaram de 22 a 33mm e para C. tropicalis
variaram de 26 a 37mm. Os autores concluíram que houve maior
reprodutibilidade com leitura de 24h de incubação em todos os ensaios. Os
resultados mostraram também que a adição de azul de metileno ao meio MHA
define melhor o halo de inibição, produzindo um halo de inibição com razoável
grau de precisão quando avaliadas as cepas-controle C. albicans (ATCC
90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e C. tropicalis (ATCC 750).
Pfaller et al. (2004d) realizaram estudo similar ao citado
anteriormente, mas para determinar os resultados de leitura para o controle de
qualidade no teste de disco-difusão a voriconazol com o meio MHA
suplementado com glicose e azul de metileno. Foram utilizadas três
cepas-controle no ensaio: C. albicans (ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e
C. krusei (ATCC 6258). Assim como no teste para fluconazol, foram realizadas
leituras de 24h e 48h para determinar o impacto do tempo de incubação nas
leituras para este método. Os resultados gerados pelas cepas-controle foram:
ATCC 90028 – (31 a 42mm), ATCC 22019 - (28 a 37mm) e ATCC 6258 – (16 a
25mm). Os autores concluíram que, assim como reportado para os testes com
fluconazol, houve melhor performance dos resultados com leitura de 24h de
incubação para voriconazol. Pode-se também estabelecer a confiabilidade das
cepas-controle como parâmetros para interpretação dos testes: C. albicans
Os trabalhos de Barry et al. (2003) e Pfaller et al. (2004d)
avaliando as cepas-controle foram fundamentais para consolidar a leitura de
24h como melhor parâmetro de leitura para o teste de disco-difusão, como
também para permitir o uso de cepas-padrão no controle de qualidade destes
ensaios em laboratórios de rotina.
Uma vez definida a melhor condição de realização do método de
disco-difusão, foi importante avaliar qual a sua correlação com o método
referência de diluição em caldo do NCCLS M27A-2 (2002), na categorização
dos isolados como: susceptível, SDD ou resistente.
Barry et al. (2002) compararam os métodos de disco-difusão e
microdiluição em caldo para avaliar o perfil de susceptibilidade a antifúngicos
frente a 495 isolados de Candida spp.. Através de uma curva de regressão
linear os autores correlacionaram o tamanho do halo inibitório do teste de
disco-difusão com os valores das CIMs gerados pelo método de microdiluição.
Todas as espécies avaliadas para a susceptibilidade foram interpretadas frente
a três categorias: isolado susceptível - se observado valores das CIMs de ≤
8µg/mL ou diâmetro do halo de ≥19mm; amostra SDD - se observado valores
das CIMs de 16 a 32µg/mL ou diâmetro do halo de 15 a 18mm; isolado
resistente - se observado valores das CIMs de ≥ 64µg/mL ou diâmetro do halo
de ≤ 14mm. Os resultados do teste de microdiluição em caldo tiveram uma
concordância de 97% com o método de disco-difusão. A correlação entre as
duas metodologias foi realizada frente a três resultados de discrepância: erro
gravíssimo (a espécie testada apresenta susceptibilidade para o teste de
disco-difusão e resistência para o método de microdiluição em caldo); erro grave (a
espécie avaliada apresenta resistência para o teste de disco-difusão, sendo
susceptível para o método de microdiluição); e erro leve (a espécie apresenta
SDD para um teste e susceptível ou resistente para o outro método). Os
resultados mostraram erro gravíssimo somente para uma amostra de C. krusei,
não apresentando ocorrência de erro grave. Houve a presença de 14 erros
duas amostras de C. glabrata e um isolado de C. albicans. Os autores
concluíram que os resultados do teste de susceptibilidade a fluconazol pelo
método de disco-difusão tiveram boa equivalência com o método de
microdiluição em caldo, tendo aplicação potencial em laboratórios de rotina
para a triagem de amostras resistentes a fluconazol.
Matar et al. (2003) avaliaram a concordância do método de
disco-difusão com o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS
M27-A2 (2002) frente a fluconazol e voriconazol. Foram avaliadas 400 amostras de
Candida spp. isoladas de hemocultura. Os diâmetros dos halos de inibição
foram interpretados com base no estudo prévio de Barry et al. (2002). A
concordância entre as categorias de susceptibilidade a fluconazol,
considerando resultados gerados pelo teste de disco-difusão e microdiluição
em caldo, foi de 88,8% para leitura de 24h. Erro gravíssimo foi observado em
15 amostras testadas, não ocorrendo erro grave. Houve a presença de 14 erros
leves para os isolados testados. Em relação a voriconazol, como ainda não
foram definidos os pontos de corte de susceptibilidade, foi realizada apenas
análise descritiva dos resultados dos métodos de microdiluição e teste de
disco-difusão após 24h de incubação. Esses dados sugerem que apesar da
boa equivalência entre os métodos, o teste de disco-difusão tem melhor
performance na identificação de amostras susceptíveis e algumas limitações no
reconhecimento de amostras resistentes.
Finquelievich et al. (2003) conduziram estudo para avaliar o teste
de disco-difusão para fluconazol comparando os resultados com o método de
microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS M27-A2 (2002), sendo
testados 290 isolados de Candida spp. A concordância entre as duas
metodologias foi de 90%. Foram identificadas 258 amostras susceptíveis para
disco-difusão, com concordância de categoria de 99,6%. Houve 13 amostras
SDD para o teste de microdiluição e 21 isolados para o método de
disco-difusão. Em relação a resistência, houve 19 amostras para o teste de
microdiluição e 21 isolados para o método de disco-difusão. Não ocorreu erro
gravíssimo na correlação dos dois métodos. Entretanto, erro grave ocorreu em
1,03% dos isolados testados e erro leve em 8,97% das espécies avaliadas. Os
resultados sugerem que o método de disco-difusão tem boa correlação com o
teste de referência para determinar amostras susceptíveis a fluconazol. Já a
menor correlação entre as duas metodologias para SDD e resistência pode ter
ocorrido devido ao fenônemo in vitro conhecido como “trailing”, sendo
caracterizado pelo crescimento reduzido mais persistente de alguns isolados
de Candida spp. na presença de drogas fungistáticas. Este fenômeno pode
prejudicar a leitura e, por conseguinte, o resultado final do ensaio de
disco-difusão.
Pfaller et al. (2004e) avaliaram a acurácia dos resultados do teste
de disco- difusão comparado ao método de microdiluição em caldo a fluconazol
dos laboratórios participantes do projeto ARTEMIS. Foram selecionados 2.949
isolados de Candida spp. com significância clínica nos sítios de infecção
(sangue e sítios estéreis) causando infecção invasiva em pacientes de diversos
hospitais sentinela da América do Norte, América Latina, Europa, África e Ásia.
Estas amostras foram posteriormente enviadas para o laboratório central em
Iowa (EUA) para comparação dos resultados obtidos entre as duas
metodologias. Através de uma curva de regressão linear foram correlacionados
o tamanho do halo inibitório do teste de disco-difusão com os valores das CIMs
gerados pelo método de microdiluição. Foi realizado monitoramento do
diâmetro do halo do disco relatado em 54 diferentes centros médicos entre
2001 e 2002. A concordância entre as metodologias avaliadas foi maior para o
(87,4%). A concordância entre as metodologias foi maior para amostras de C.
albicans (97,7%) não apresentando erro gravíssimo, ocorrência de 1,4% dos
isolados com erro grave e 0,9% das amostras com erro leve. Para ensaios com
C. tropicalis houve concordância de 87,7%, apresentando erro gravíssimo em
7,3% dos isolados, 3,4% das amostras com erro grave e 0,6% de erro leve. A
concordância para isolados de C. parapsilosis foi de 85,5%, apresentando erro
gravíssimo em 9,7% dos isolados, 4,8% das amostras com erro grave e
nenhum erro leve. Houve menor concordância para os isolados de C. glabrata
(60,6%), com ocorrência de erro gravíssimo em 31,3% dos isolados, erro grave
para 7,4% das amostras e erro leve para 0,7% dos isolados. Este estudo foi de
grande importância para validação da performance do teste de disco-difusão de
acordo com o NCCLS M44-A (2004), no programa de vigilância antifúngica
entre os laboratórios participantes e o centro de referência em Iowa.
Baseado nos resultados mencionados anteriormente, o NCCLS
padronizou o método de disco-difusão através do documento M44-A (2004),
utilizando o meio MHA suplementado com dextrose e azul de metileno, o
tamanho do inóculo de 0,5 a 2,5x103 UFC/mL preparado com o auxílio de
espectrofotometria, a temperatura de incubação de 35oC e com tempo de
leitura de 24h.
O teste de disco-difusão proporciona um resultado rápido, de
baixo custo, não exigindo equipamento especial, proporcionando resultados
qualitativos de fácil interpretação, podendo assim ser utilizado em laboratórios
de rotina avaliando a susceptibilidade de espécies de Candida para discos de
fluconazol e voriconazol. Entretanto, é necessário cautela na interpretação de
resultados de disco-difusão em ensaios envolvendo amostras de C. glabrata e
C. krusei, onde o crescimento inadequado da espécie testada pode ocasionar
resultado de falsa susceptibilidade.
1.3 Resistência a amostras de Candida spp. no Brasil
No Brasil, são poucos os estudos disponíveis na detecção de
resistência a azólicos envolvendo um número significativo de amostras clínicas
de Candida spp.. Nos anos 90, alguns autores destacaram a ocorrência de
espécies de Candida resistentes a azólicos em pacientes com aids. Na era
pré-HAART (terapia anti-retroviral de alta potência), cerca de 50 a 90% dos
pacientes evoluíam com candidíase oral recorrente necessitando de uso
prolongado de azólicos e, conseqüentemente, a seleção de isolados
resistentes. Milan et al. (1998) conduziram o primeiro trabalho para determinar
resistência a azólicos frente a 109 pacientes com aids apresentando cultura de
cavidade oral positiva para isolados de Candida spp.. Os autores concluíram
que 21 (19%) dos pacientes avaliados apresentavam isolados SDD ou
resistentes a um ou mais azólicos, sendo que 18 destes isolados pertenciam a
espécies de Candida não-albicans.
Na era pós-HAART, Sant’Anna et al. (2002) realizaram estudo
multicêntrico para avaliar o perfil de susceptibilidade a azólicos de 142
amostras de Candida spp. isoladas de 130 pacientes com aids apresentando
candidíase oral. Os resultados deste estudo demostraram redução de 19%
para 11% na porcentagem de espécies de Candida apresentando SDD ou
resistência a azólicos comparado ao estudo de Milan et al. (1998). No ambiente
hospitalar, há crescente preocupação com a emergência de cepas resistentes
a fluconazol, particularmente nos EUA e Europa (Pfaller et al., 1998, Diekema
et al., 2002; Ostrosky-Zeichner et al., 2003; Almirante et al., 2005).
Estudo multicêntrico conduzido por Godoy et al. (2003) foi
avaliado o perfil de susceptibilidade a antifúngicos envolvendo pacientes
internados em cinco hospitais terciários da América Latina, reunindo 103
amostras de Candida spp. isoladas de hemocultura. Neste estudo, apenas um
isolado de C. albicans mostrou resistência a 5-FC, porém isolados de Candida
susceptibilidade preservada a anfotericina-B. Pode-se concluir que os isolados
de C. glabrata desta casuística apresentaram valores das CIMs menores para
fluconazol, o que se justifica pelo menor uso de fluconazol nos países da
América Latina, em contrapartida com os EUA e Europa.
Colombo et al. (2003b) determinaram a susceptibilidade a
antifúngicos frente a 200 espécies de Candida isoladas de hemocultura de
cinco hospitais terciários. Em relação a fluconazol foi observado resistência
somente para duas amostras de C. krusei e nove de C. glabrata, Apenas uma
amostra de C.albicans e um isolado de C. guilliermondii apresentaram SDD.
Em relação a itraconazol, apenas uma amostra de C. glabrata apresentou
resistência e 13 isolados (6,5%) exibiram SDD. Em ensaios com 5-FC, 3% dos
isolados foram resistentes. Para anfotericina-B foi observada resistência em
2,5% dos isolados (duas amostras de C. albicans e C. parapsilosis e um
isolado de C. krusei). Através deste estudo os autores concluíram que é
necessário realizar vigilância periódica no perfil de susceptibilidade para
detectar resistência a drogas antifúngicas.
Antunes et al. (2004) avaliaram a susceptibilidade a antifúngicos,
selecionando 120 isolados de Candida spp. provenientes do Complexo
Hospitalar da Santa Casa, Porto Alegre. Para as drogas antifúngicas testadas,
fluconazol apresentou SDD em 1,6% das amostras testadas. Já para ensaios
com itraconazol foi observado SDD em 14,2% das espécies avaliadas. Não foi
encontrada resistência aos antifúngicos testados, possivelmente devido ao
baixo consumo de fluconazol neste hospital.
Devido ao aumento da incidência de candidemias, vários
programas de vigilância têm sido implantados nos Estados Unidos da América
(EUA) para analisar a epidemiologia das infecções fúngicas, incluindo o
Programa Internacional de Vigilância das Infecções da Corrente Sanguínea
(SENTRY) e o Programa de Susceptibilidade Antifúngica Global Ártemis
O programa de vigilância SENTRY utiliza um laboratório central
para monitorar variação da susceptibilidade antifúngica e resistência em 74
hospitais sentinelas em 11 países. Desde 1997, um dos principais objetivos
deste programa é realizar vigilância de resistência antifúngica entre espécies
de Candida causando infecções na corrente sanguínea nos EUA, Canadá,
América Latina e Europa (Pfaller et al., 2001; Pfaller et al., 2002; Antunes et al.,
2004; Hajjeh et al., 2004).
TrabaIhos envolvendo o SENTRY, em centros nos EUA, Canadá
e América do Sul relataram que 2,4% das amostras de Candida spp. originadas
da América do Sul foram resistentes a fluconazol. Entretanto, o número de
cepas analisadas nos cinco centros da América do Sul que participaram deste
estudo foi muito pequeno (n=42) e, portanto, não foi representativo da
realidade epidemiológica destes países. Outro dado a ser citado é que o estudo
SENTRY não coleta nem analisa dados clínicos e epidemiológicos dos
pacientes dos quais os isolados são obtidos (Pfaller et al., 1998, Pfaller et al.,
2001).
O programa Artemis foi iniciado em 2001, contando com a
participaçäo de mais de 80 laboratórios em 35 países, incluíndo o Brasil,
promovendo monitoramento dos resultados de vigilância a fluconazol e
voriconazol frente a isolados de Candida spp. com relevância clínica. Além
disso, este programa auxilia na continuidade no desenvolvimento e validação
de vários testes de susceptibilidade, dentre eles o teste de disco-difusão. Os
isolados coletados nestes programas são enviados ao laboratório de referência
central em Iowa, sendo utilizados como ferramenta importante na detecção de
resistência principalmente com fungos emergentes. Claramente, os resultados
gerados por tais programas de vigilância servem como base para o tratamento
antifúngico empírico de diferentes grupos de risco (Pfaller et al., 2003; Hazen et
As publicações referentes a estes programas não permitem
análise acurada do fenômeno de resistência no Brasil, pois os resultados são
avaliados em conjunto com outros países da América Latina. No Artemis,
apesar de haver algum detalhamento de Brasil, não há informações sobre as
diferentes espécies de Candida e materiais biológicos. Sendo assim, estes
estudos sugerem que resistência a fluconazol em pacientes atendidos na
comunidade e no ambiente hospitalar ainda é pouco freqüente, e particularmente
relacionada a amostras de C. glabrata e C. krusei. Tendo em vista o crescente
uso de azólicos em esquemas de profilaxia e terapêutica empírica, é fundamental
a realização contínua de estudos de vigilância para detecção de amostras
resistentes a estes antifúngicos no sentido de otimizar as opções terapêuticas em
2. OBJETIVOS
A presente investigação tem por objetivos:
I – Estabelecer e correlacionar a distribuição de espécies de Candida identificadas com relação a diferentes materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados.
II - Descrever o perfil de susceptibilidade pelo método de disco-difusão para as diferentes amostras de Candida spp. frente a discos de dois antifúngicos triazólicos: fluconazol e voriconazol.
