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Universidade de São PauloFaculdade de Saúde Pública
VO LUM E 33
NÚM ERO 3
JUNHO 1999
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Revista de Saúde Pública
Journal of Public Health
p. 281-6
Problemas na padronização da reação
em cadeia da polimerase para diagnóstico
da tuberculose pulmonar*
Problems in the standardization of the
polymerase chain reaction for the diagnosis
of pulmonary tuberculosis
Valdes R. Bollela, D aisy N . Sato e Benedito A. L. Fonseca
Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, SP Brasil (VRB, BALF); Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, SP -Brasil (DNS)
Problemas na padronização da reação
em cadeia da polimerase para diagnóstico
da tuberculose pulmonar*
Problems in the standardization of the
polymerase chain reaction for the diagnosis
of pulmonary tuberculosis
Valdes R. Bollela, D aisy N . Sato e Benedito A. L. Fonseca
Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, SP - Brasil (VRB, BALF); Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto. Ribeirão Preto, SP - Brasil (DNS)
D escritores
Tuberculose pulmonar, diagnóstico. Reação em cadeia por polimerase.
Mycobacterium tuberculosis.
Resumo
Objetivo
Padronizar reação em cadeia da polimerase para diagnóstico de tuberculose pul-monar, comparando os resultados obtidos com as técnicas microbiológicas clás-sicas, e analisar seu uso numa região de alta prevalência da tuberculose. Métodos
Foram descontaminadas, após a baciloscopia, 42 amostras de escarro de pacien-tes. Em seguida, procedeu-se ao cultivo em Lowenstein-Jensen e à reação em cadeia da polimerase com “primers” que amplificam um fragmento de 123 pares de base do genoma do Mycobacterium tuberculosis.
Resultados
Das 42 amostras de escarro, 10 apresentaram cultura positiva para M. tuberculo-sis. Dez foram positivas à baciloscopia e 16 mostraram-se positivas na reação em cadeia da polimerase. A sensibilidade e especificidade do teste em relação à cultura foi de 90% e 81%, respectivamente.
Conclusões
A reação em cadeia da polimerase tem sensibilidade comparável à da cultura e pode ser realizada em apenas um dia, resultando em tratamento precoce e me-lhor controle da doença. A padronização e avaliação de técnicas de biologia molecular no diagnóstico da tuberculose no Brasil é imprescindível na discus-são da implantação deste exame na rotina diagnóstica em centros de referência.
Abstract
Introduction
The recent increase in the number of tuberculosis cases has called the world’s attention once again to a perennial health problem, especially prevalent in devel-oping countries. The time elapsed between the diagnosis and the institution of
Keywords
Tuberculosis, pulmonary diagnostic. Polymerase chain reaction.
Mycobacterium tuberculosis.
Correspondência para/Correspondence to: Benedito A. L. da Fonseca
Av. Bandeirantes, 3900 - Monte Alegre 14049-900 Ribeirão Preto, SP - Brasil E-mail: baldfons@fmrp.usp.br
* Apresentado nos Anais do VIII Congresso Panamericano e X Congresso Brasileiro de Infectologia, Salvador, Bahia, 1997.
Edição subvencionada pela FAPESP (Processo nº 98/13915-5).
Reação em cadeia da polimerase e tuberculose Bollela VR et al.
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www.fsp.usp.br/ ~rsp
therapy is an obstacle to tuberculosis control and there is an urgent need for the development of techniques for the disease’s rapid diagnosis. To achieve this goal, molecular biology techniques have been exhaustively investigated. This work de-scribes the use of a polymerase chain reaction for rapid diagnosis of tuberculosis in a developing country. The sensitivity and specificity of this technique is com-pared to standard techniques used in the microbiology laboratory.
Methods
This study was undertaken in Ribeirão Preto, S. Paulo State, Brazil. Forty-two sputum samples from suspected cases of tuberculosis attending the municipal health care centers were sent to the microbiology laboratory. The samples were processed for the detection of Mycobacterium tuberculosis by acid-fast bacilli determination, culture in Lowenstein-Jensen medium, and by a polymerase chain reaction that amplified a fragment of 123 base pairs of the Mycobacte-rium tuberculosis genome.
Results
Of the forty-two samples studied, one was contaminated and excluded from the study, ten were culture positive, ten were positive for the presence of acid-fast bacilli, and sixteen were polymerase chain reaction positive. The sensitivity and specificity of this technique were 90% and 81%, respectively.
Conclusions
The polymerase chain reaction presented a sensitivity comparable to the culture and the whole procedure took only one day to complete. The results presented here make it a strong candidate for rapid diagnosis of tuberculosis in clinical settings making it possible to begin the specific therapy early in the course of the disease. However, standardization of the technique is necessary, and the corre-lation with clinical findings is of paramount importance due to the high sensitiv-ity of this technique.
IN TRO D U ÇÃO
Estima-se que um terço da população mundial está infectada pelo Mycobacterium tuberculosis, que é a causa de aproximadamente 8 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes por ano14. Em várias
regiões do mundo a tuberculose ainda é a principal causa de morte por um agente infeccioso isolada-mente. Cerca de 26% de todas as mortes evitáveis no mundo são diretamente relacionadas à tuberculo-se14
, que nunca deixou de ser um grave problema de saúde pública nos países em desenvolvimento. No entanto, a partir da década de 80, com a dissemina-ção da infecdissemina-ção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a deterioração dos programas de controle da doença, a tuberculose retorna como im-portante questão de saúde pública nos países desen-volvidos da América do Norte e Europa. Dados da Fundação Nacional de Saúde6
, de 1996, mostram que o Brasil convive com 90 mil novos casos de tubercu-lose anualmente, morrendo cerca de cinco mil pes-soas neste período. A região Sudeste é a mais atingi-da, com mais de 50% dos casos6
. O indivíduo co-infectado (M. tuberculosis e HIV) tem risco 6 a 100 vezes maior de adoecer de tuberculose do que o in-divíduo infectado apenas com o M. tuberculosis11.
Dados do Centro de Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo13, de 1994, mostravam que
cer-ca de 14,7% dos cer-casos novos de tuberculose apre-sentavam sorologia positiva para o HIV. Desde abril de 1993, a Organização Mundial da Saúde considera a tuberculose uma emergência global incentivando medidas de controle da doença em todo o mundo. Sem mudança nas condições socioeconômicas da população o controle da tuberculose reside no diag-nóstico precoce e tratamento efetivo, além da vaci-nação e quimioprofilaxia para os contactantes.
A mais promissora técnica para o diagnóstico rápido da tuberculose é baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica capaz de detectar até uma cópia de DNA de qualquer célula1,2
. Além de alta sensibilidade e especificidade, esta técnica é ca-paz de produzir resultados em algumas horas. A amplificação específica de seqüências de ácidos nucléicos através da PCR tem sido empregada no diagnóstico de inúmeras doenças infecciosas8. Vários
protocolos com diferentes “primers”, número de ci-clos e tratamento de amostras vêm sendo desenvol-vidos para o diagnóstico rápido da tuberculose4, 6
. Conhecendo a complexidade das técnicas de bio-logia molecular, buscou-se padronizar uma reação que pudesse ser realizada de maneira simplificada e fosse facilmente reproduzida em laboratórios com recursos mínimos para a realização do teste.
MÉTODOS
Cepa de Referência e Espécimes Clínicos
A cepa de referência de Mycobacterium tuberculosis
HRa37 foi usada para a padronização dos parâmetros da reação e avaliação da sensibilidade da PCR, em relação à quantidade de cópias de genoma do M. tuberculosis que seriam detectadas por essa técnica.
Amostras de escarro de 42 pacientes, enviadas ao la-boratório, entre janeiro e março de 1996, foram avaliadas pela técnica da auramina-rodamina e Ziehl-Neelsen em busca de BAAR, e em seguida tratadas para cultivo em Lowenstein-Jensen e PCR.
Processamento das Amostras de Escarro
Todas as amostras foram descontaminadas pelo méto-do de Petroff, com NaOH 4%9. Após ser semeado em meio sólido, o material restante foi estocado a -20oC em “eppendorfs” de 1,5 ml.
Extração do D N A
Técnica adaptada de Kocagöz et al.8 consistiu da lava-gem repetida do sedimento do escarro com Tris-HCl EDTA (TE), 10mM Tris pH = 8,0 e 1mM EDTA, por 3 vezes, e centrifugadas a 13.500 rpm. Após cada centrifugação, o sedimento era suspenso em 500 µl de tampão TE e agita-do vigorosamente por 30 s. Na última vez, o “pellet” foi suspenso em 50 µl de TE, fervido 10 min e centrifugado a 13.500 rpm por 5 min. Cinco microlitros do sobrenadante foi usado para a PCR.
“Primers”
Os “primers” usados no presente trabalho foram ori-ginalmente descritos por Eisenach et al.4 e amplificam uma seqüência de inserção repetitiva do genoma de
mico-bactérias do Complexo M. tuberculosis (IS6110). O pro-duto da amplificação são fragmentos de 123 pares de base. A seqüência dos “primers” é vista na Tabela 1.
Tabela 1 - Seqüência dos “ primers” usados na reação em cadeia da polimerase para tuberculose, descritos por Eisenach et al.4
TB1 5’ - C C T G CG A G C G T A G G CG T C G G - 3’
TB2 5’ - C T CG T C C A G C G C CG C T T C G G - 3’
Protocolo de Amplificação do D N A
Utilizaram-se reagentes do “kit” GeneAmp®. Para vo-lume final da reação de 50µl, 5µl do DNA extraído foi acrescentado a 45µl da mistura de reagentes da PCR con-tendo 1,25 U de Taq DNA polimerase, 200 µM de cada desoxinucleotídeo, tampão da Taq DNA polimerase (10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl; 0,15 mM MgCl2; 0,01% gelatina), 20 pmol de cada “primer”.
A amplificação consistiu de uma fase inicial a 94oC por 5 min; 35 ciclos com 1 min a 94oC para desnaturação, 2 min a 65oC para ligação dos “primers” ao molde genômico e 1 min a 72oC na extensão do amplificado, em cada ciclo. Ao final manteve-se a temperatura em 720C por 10 min para a polimerização dos fragmentos incompletos. O amplifica-do de 123 pares de base foi separaamplifica-do por eletroforese em gel de agarose a 3%, corado com brometo de etídio 1µg/ml, analisado em transiluminador de luz ultravioleta e fotogra-fado em máquina Polaroid DS34.
Controles da PCR
A cada amplificação das espécimes clínicas, os con-troles positivos com DNA, extraído da cepa de referência, e os negativos com todos os reagentes da PCR acrescidos de 5µl de TE, usado para lavar as amostras de escarro, eram feitos simultaneamente.
Análise de Sensibilidade e Especificidade
Foi feita nos moldes clássicos da epidemiologia, ava-liando-se os resultados em tabela 2X2 para obter sensibi-lidade, especificidade, valores preditivo positivo e negati-vo da PCR comparada à cultura do M. tuberculosis em meio sólido de Lowenstein-Jensen.
RESU LTAD O S
A padronização da PCR requer processamento criterioso das amostras para evitar intercorrências que podem interferir nos resultados do teste. Após a am-plificação, observou-se a presença da banda de 123 pares de base na definição dos positivos nas amos-tras (Figura).
Reação em cadeia da polimerase e tuberculose Bollela VR et al.
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tações atípicas, depara-se com pacientes muito gra-ves que precisam de instituição de terapêutica rápi-da e precisa. A associação do HIV e outras micobac-terioses tem se tornado freqüente, devendo ser con-siderada no diagnóstico diferencial da tuberculose. A baciloscopia além de pouco sensível, é incapaz de diferenciar estas duas situações comuns para o clíni-co e infectologista. A cultura apesar da alta especifi-cidade, demanda tempo para o resultado, tempo que geralmente não é disponível frente a casos graves, como os de imunodeficientes. A letalidade da tuber-culose em indivíduos infectados pelo HIV pode ser 2,4 a 19 vezes maior que nos indivíduos não infecta-dos7
.Por utilizar “primers” que são específicos para micobactérias do complexo tuberculosis, a PCR é capaz de, em poucas horas, definir sobre a presença ou não do patógeno na amostra e indicar a melhor terapêutica para o caso. Em condições extremas, esta técnica pode ser refinada para torná-la capaz de de-terminar não só a presença, mas também a sensibili-dade de micobactérias aos tuberculostáticos dispo-níveis para o tratamento da tuberculose, além de es-tudos de epidemiologia molecular e tipagem de ce-pas em cultura12
.
Quando se analisa um novo método, o desempe-nho do teste-padrão é um parâmetro crítico. Para a detecção do M. tuberculosis a cultura pode ser con-siderada o “gold standard”, por ter especificidade de 100% e sensibilidade de aproximadamente 90%2.
Para que a cultura de um espécime clínico seja posi-tiva são necessárias entre 10 e 100 células de M. tu-berculosis na amostra2. A PCR é capaz de detectar
até uma cópia de DNA de M. tuberculosis, como já foi demonstrado por Eisenach et al4. O presente
re-sultado mostrou um teste capaz de detectar até 3 bacilos em uma solução-padrão (dados não mostra-dos), o que confirma a extrema sensibilidade da téc-nica em amplificar seqüências genômicas do M. tuberculosis. Em amostras clínicas como o escarro, em que estão presentes várias substâncias inibidoras da PCR, o resultado também foi satisfatório, com sensibilidade de 90%. A padronização da técnica, principalmente da extração do DNA, é fundamental no sucesso do teste. Observou-se que a lavagem exaustiva do escarro descontaminado é essencial, pois elimina substâncias inibidoras da Taq DNA polime-rase que poderiam gerar resultados falso-negativos, comprometendo a sensibilidade do teste5. Apesar
deste cuidado, uma entre as 10 amostras com cultura positiva foi PCR negativa.
Figura - Eletroforese em gel de agarose a 3% dos produtos amplificados na reação em cadeia da polimerase para tuberculose. Amostras positivas: 6; 12; 13; 18; 22; 24; 29-32; 36-39; 41 e 42.
Dez amostras foram positivas com crescimento de
M. tuberculosis, no cultivo em meio sólido de Lo-wenstein-Jensen, e 16 mostraram-se positivas na PCR (Figura). Em uma amostra positiva na PCR a cultura contaminou e foi excluída da análise. A sensibilida-de e especificidasensibilida-de do teste em relação à cultura, con-siderada o padrão-ouro para a confirmação diagnós-tica, foi de 90% e 81%, respectivamente. Os valores preditivo positivo e negativo foram 60% e 96%, res-pectivamente (Tabela 2).
Tabela 2 - Resultados da reação em cadeia por polimerase (PCR) e da cultura para M. tuberculosis.
PCR
Cultura + – Total
+ 9 1 10
– 6 25 31
Total 15 26 41
Sensibilidade = 90% Especificidade = 81% Valor preditivo positivo = 60% Valor preditivo negativo = 96%
D ISCU SSÃO
apresen-A PCR mostrou uma sensibilidade de 90% e es-pecificidade de 81% quando comparada somente com os resultados da cultura. Dos 31 pacientes com cultura negativa, 6 apresentaram PCR positiva, o que representa uma perda de 19% na especificida-de, e das 15 PCR positivas, 6 eram cultura negati-va, expressa no valor preditivo positivo de 60%. Dentre os 6 pacientes com cultura negativa e PCR positiva, 2 tinham baciloscopia positiva, sendo im-portante esclarecer que a PCR não foi avaliada con-siderando essa informação, ou dados clínicos dos pacientes. Somente a cultura positiva foi critério para a definição de caso de tuberculose, o que pode ter excluído indivíduos doentes em que a cultura teve resultado negativo. Portanto, é realmente pos-sível que entre esses 6 exames houvesse pacientes com tuberculose que não foram considerados nesta análise, pela definição restrita de caso e por não se dispor das informações clínicas. A correlação dos resultados com a apresentação clínica do paciente é crucial na avaliação do teste, pois pode-se diag-nosticar tuberculose por indícios clínicos e labora-toriais quando a cultura está negativa e confirmar a hipótese após prova terapêutica. O maior número de PCR positivas do que culturas com crescimento de M. tuberculosis pode ser decorrente também da limitação intrínseca do cultivo, que tem uma sensi-bilidade em teoria menor que a da PCR. Outra li-mitação observada, quando se avaliou o teste ape-nas considerando o resultado microbiológico con-vencional, é a possibilidade de contaminação da cultura com bactérias ou fungos, como aconteceu em uma amostra do presente estudo, levando ao descarte da mesma. O tratamento da amostra para descontaminação, com hidróxido de sódio, pode inativar o M. tuberculosis e resultar em cultura fal-so-negativa. Por outro lado, a PCR pode detectar a presença do DNA e não a viabilidade do bacilo, podendo amplificar material genético de microor-ganismos mortos ou “latentes”, gerando resultado de PCR falso-positivo. Uma extensão da presente pesquisa está sendo desenvolvida com maior nú-mero de amostras, analisando a PCR contra resul-tados microbiológicos e informações clínicas, para avaliar a amplitude das limitações citadas acima e a real importância da PCR no diagnóstico da tuber-culose pulmonar no Brasil.
Por ter grande potencial como ferramenta de alta sensibilidade e especificidade, além da rapidez no diag-nóstico laboratorial da tuberculose, vários grupos têm desenvolvido esta tecnologia, inclusive com desenvol-vimento de “kits” comerciais, o que torna o teste mui-to caro3
. Apesar disso, PCR “in house” é factível con-siderando o custo de uma internação de um paciente com tuberculose, aguardando o diagnóstico definiti-vo, ou sua presença no ambiente familiar e social com alto risco de transmissão que essa doença possui. O grande impacto na prevenção da disseminação da tu-berculose deve-se a instituição do tratamento especí-fico, o mais precocemente possível. Para não se ini-ciar, empiricamente, tratamento que tem conhecidos efeitos colaterais e longa duração, o diagnóstico pre-coce é de fundamental importância, tanto do aspecto individual como de saúde pública. O desenvolvimen-to e padronização própria para o teste desenvolvimen-torna seu cusdesenvolvimen-to mais acessível, tendo em vista que esta tecnologia deve ser reservada para centro de referência em diagnósti-co e tratamento da tuberculose.
O presente trabalho é um dos primeiros de inves-tigação do uso da PCR no Brasil, que apesar das con-dições de saúde pública menos favoráveis quando comparado aos países desenvolvidos, deve avaliar o uso rotineiro da PCR. Certamente a PCR terá muita importância no diagnóstico da tuberculose no Bra-sil, quando usada com critério e em centros de refe-rência para o tratamento da tuberculose. Não se acre-dita que a PCR possa substituir ou superar plena-mente as ferramentas diagnósticas atualplena-mente dis-poníveis para a confirmação da tuberculose. O exa-me clínico cuidadoso, o estudo radiográfico, a baci-loscopia e a cultura às vezes são insuficientes para a definição-diagnóstica. A disponibilidade de uma fer-ramenta potente como a PCR será de grande utilida-de para essa utilida-definição com maior precisão e precoce instituição terapêutica.
No entanto, como ressaltam Kritski et al.10,
Reação em cadeia da polimerase e tuberculose Bollela VR et al.
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REFERÊNCIAS
1. Barnes PF, Barrows SA. Tuberculosis in the 1990s. Ann Intern Med 1993; 119:400-10.
2. Bates JH. Diagnosis of tuberculosis. Chest 1979; 76:757-63. 3. Cartuyvels R et al. Prospective clinical evaluation of
amplicor Mycobacterium tuberculosis PCR test as a screening method in a low-prevalence population. J Clin Microbiol 1996; 34:2001-3.
4. Eisenach KD et al. Polimerase chain reaction amplification of a repetitive DNA sequence specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis 1990; 161:977-81.
5. Fonseca BAL, Bollela VR. Tratamento das amostras de escarro para extração de DNA é essencial para o sucesso da reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico da tuberculose. Braz J Infect Dis 1997; 1 S1:57.
6. Forbes BA. Critical assessment of gene amplification approaches on the diagnosis of tuberculosis. Immunol Invest
1997; 26:105-16.
7. García MLG et al. Epidemiología del SIDA y la tuberculo-sis. Bol Oficina Sanit Panam 1994; 116:546-65.
8. Kocagöz T et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure. J Clin Microbiol 1993; 31:1435-8. 9. Koneman EW et al. Diagnostic microbiology. In: Koneman
EW, Allen SD. Mycobacteria. Philadelphia: J.B. Lippincott Company; 1992. p. 703-55.
10. Kritski AL et al. Reação em cadeia da polimerase (RCP/ PCR) aplicada ao diagnóstico de tuberculose. J Pneumol
1997; 23:33-42.
11. Ministério da Saúde. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis. Bol EpidemiolAIDS, 1996. 12. Otal I et al. Use of a PCR method based on IS6110
polymorphism for typing Mycobacterium tuberculosis
strains from BACTEC cultures. J Clin Microbiol 1997; 35:273-7.
13. Secretaria Estadual da Saúde de São Paulo. Centro de Vigilância Epidemiológica/Divisão de Tuberculose.
Tuberculose: uma emergência mundial. São Paulo; 1995. 14. Snider JDE, Montagne JRL. The neglected global
