Diversidade genética e filogeografia de Puma Yagouaroundi (Mammalia, Carnivora, Felidae)

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA

D

G

F

P

(M

,

C

,

F

)

CARLA BETTIN PIRES

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA

Diversidade Genética e Filogeografia de

Puma

yagouaroundi

(Mammalia, Carnivora, Felidae)

Aluna: Carla Bettin Pires

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Eizirik

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO PORTO ALEGRE – RS – BRASIL

i

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ...ii

RESUMO... v

ABSTRACT ...vi

APRESENTAÇÃO... 1

1. Introdução Geral ... 1

1.1 Biodiversidade... 1

1.2 Genética da Conservação... 2

1.3 A filogeografia ... 5

1.4 Marcadores moleculares ... 6

1.5 A família Felidae e a espécie Puma yagouaroundi... 8

2. Objetivos... 15

3. Apresentação do artigo... 15

Phylogeography and evolutionary history of the jaguarundi (Puma yagouaroundi) (Mammalia, Felidae)... 16

ABSTRACT... 17

INTRODUCTION ... 18

MATERIALS AND METHODS ... 20

Sample collection and laboratory methods... 20

Sequence Analysis... 21

Microsatellite data analyses... 24

RESULTS ... 25

Mitochondrial markers... 25

Microsatellite markers... 28

DISCUSSION ... 30

CONCLUSIONS ... 34

REFERENCES ... 36

TABLES AND FIGURES... 43

ii

AGRADECIMENTOS

A Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), em especial ao Programa de Pós-Graduação em Zoologia, pela oportunidade de realização do curso de mestrado.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudo.

Gostaria de agradecer ao meu orientador, Prof. Dr. Eduardo Eizirik, por ter me aceitado como orientanda, pois graças a este aceite eu tive a oportunidade de aprender muito, muito mesmo, durante todo o mestrado. Obrigada por ter confiado e acreditado em mim, e principalmente pela paciência, apoio e por compartilhar experiências e ensinamentos ao longo destes dois anos.

À todos os colaboradores que contribuíram, de certo maneira, para a elaboração deste trabalho, muito obrigada.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação de Zoologia da PUCRS por terem me ensinado tanto durante as disciplinas que cursei. Pois muito do que aprendi ao longo do mestrado, está diretamente relacionado à elas, e por isso, o meu muito obrigada.

Ao Professor Dr. Sandro Bonatto, agradeço pela sua disposição e boa vontade em me ajudar sempre que precisei, e também, por sempre compartilhar seu conhecimento, auxiliando assim em minha formação.

iii

quando a saudade era grande. Agradeço não só por estes dois anos que estive longe, mas por tudo que fizeram por mim até hoje. Enfim, estes são alguns dos motivos pelos quais eu queria dizer: muito obrigada!

À todo o pessoal que conheci no “Genoma”: Alemoa, Ane, Aninha, Beta, Cadu, Cris, Felipe, Flávia, Gi, Henrique, Laura, Lisie, Lucas, Luiza, Manoel, Marina, Rê, Taia, Talita, Tatinha e Tiaguinho. Obrigada por terem me recebido tão bem e por todos os momentos de descontração e alegria, que tornaram os dias de trabalho muito mais divertidos e agradáveis. Vocês também me ensinaram e ajudaram em muitos momentos durante toda a realização dessa dissertação, e por isso eu agradeço todos vocês.

A Alemoa, pelo transporte de algumas amostras, pois sei que isso demandou tempo e trabalho de sua parte. Agradeço a você porque devido ao seu auxílio e ajuda, meu trabalho ficou mais completo, então: obrigada.

Agradeço em especial a Cris, a Lisie, a Rê e a Pri por me ajudarem muito no final do mestrado, pois de certo modo, todas nós estávamos em situações parecidas. Meninas, muito obrigada mesmo! Agradeço demais pela ajuda, paciência, conselhos e conhecimentos compartilhados comigo durante esses últimos meses. Do mesmo modo, agradeço ao Manoel, a Taia e a Tatinha, que também me ajudaram bastante nessa fase final.

Gostaria de agradecer em particular a Lisie, que além de toda a ajuda durante mestrado, foi uma das grandes amizades que ganhei aqui. Lisie, a gente entrou junto no mestrado e durante todo esse tempo você sempre me ajudou em todos os momentos que precisei, e por isso eu queria te agradecer muito mesmo! Obrigada pela paciência que teve comigo quando muitas vezes eu te perguntava a mesma coisa, mais de uma vez, e você respondia tranquilamente.

iv

que essa minha experiência aqui fosse possível e por isso eu sou extremamente grata. Miroca, obrigada por ter sido como uma amiga/irmã tão querida, que acreditou e me ajudou muito, principalmente no começo. Muito obrigada.

A Cladi, por ter sido tão querida e me ajudado tanto no meu início no laboratório. Muito obrigada pela sua paciência em me explicar e mostrar como tudo funcionava, e por ser um exemplo de organização, o que acabava facilitando não só o seu trabalho, mas o nosso também. Agradeço a Cladi e também a Pri, por todo suporte oferecido sempre que foi necessário.

A Luana, secretária do curso de Pós-Graduação em Zoologia, pela atenção e auxílio necessário durante o curso de mestrado.

Agradeço também as minhas amigas e amigos, tanto de Foz do Iguaçu quanto de Londrina, que sempre estiveram presentes e me ajudaram em muitos momentos.

v

RESUMO

vi

ABSTRACT

Genetic Diversity and Phylogeography of Puma yagouaroundi (Mammalia, Carnivora, Felidae)

1

APRESENTAÇÃO

1. Introdução Geral

1.1 Biodiversidade

O Brasil é um país que possui uma alta diversidade biológica, constando na lista dos países de maior biodiversidade no mundo (LEWINSOHN; PRADO, 2004). Lewinsohn e Prado (2005) estimaram que o Brasil possua aproximadamente 13% da biodiversidade mundial, sendo esta estimativa baseada tanto em espécies conhecidas atualmente quanto em projeções daquelas ainda não descobertas ou descritas.

Neste contexto, a fauna de mamíferos no Brasil é extremamente diversa, com mais de 530 espécies descritas, e muitas a serem descobertas e catalogadas (BRANDON et al., 2005; COSTA et al., 2005). Costa e colaboradores (2005) ressaltam que apesar de os mamíferos serem um grupo de animais bem conhecido, quando comparado a outros grupos, poucas regiões do Brasil foram adequadamente inventariadas, as listas locais de espécies são geralmente incompletas e a falta de conhecimento sobre muitas espécies dificulta iniciativas conservacionistas e de manejo. No que tange especificamente aos carnívoros neotropicais, grupo focal deste estudo, Oliveira (2006) ressaltou que, apesar do recente aumento na quantidade e abrangência dos estudos conduzidos sobre este grupo, pouco ainda se conhece sobre aspectos básicos da ecologia e história natural da maioria das espécies contidas neste táxon.

2

habitat, entre outras) podem, portanto, ter conseqüências na estrutura vegetal encontrada em uma floresta (PARDINI et al., 2003).

Estendendo esta avaliação para os carnívoros em particular, Miller et al. (2001) destacam como estas espécies são importantes para a “saúde” de um ecossistema, participando da cadeia trófica, da transferência de energia e também influenciando a diversidade de espécies presentes naquele ambiente. Esta conclusão é baseada no fato de que os herbívoros controlam a biomassa das plantas, e os carnívoros por sua vez, controlam a biomassa dos herbívoros (CROOKS; SOULÉ, 1999; MILLER et al., 2001; TERBORGH et al., 2001). Assim sendo, a atividade predatória dos carnívoros influencia toda a cadeia trófica de um ecossistema, e por este e outros motivos, as ações de manejo realizadas em uma região devem levar em conta o papel dos carnívoros naquele ambiente (CROOKS; SOULÉ, 1999; MILLER et al., 2001; TERBORGH et al., 2001). Complementando esta idéia, Chiarello et al. (2008) ressaltam que, como os carnívoros necessitam de grandes áreas para manter populações viáveis, os esforços para conservar áreas suficientes à manutenção/conservação deste grupo acabam por preservar também outras espécies da comunidade. No entanto, o ambiente em que esses animais vivem vem sendo constantemente degradado por ações causadas por humanos.

1.2 Genética da Conservação

3

(WILCOVE et al., 1998; FAHRIG, 2003; PIRES; FERNANDEZ; BARROS, 2006), sendo que esta é a principal ameaça as populações de mamíferos brasileiros (COSTA et al., 2005; HAYWARD, 2009).

Em carnívoros, em especial no caso das espécies da família Felidae, fatores adicionais de interferência humana são ameaças importantes, como por exemplo, a perseguição direta (EIZIRIK; JOHNSON, 2006; CHIARELLO et al., 2008; HAYWARD, 2009), que ocorre principalmente devido ao fato de estes animais atacarem rebanhos de gado de muitos fazendeiros ocasionando prejuízos econômicos para os criadores, e outro motivo seria porque sua pelagem possui valor comercial no mercado, embora hoje a caça seja considerada uma atividade ilegal. Outra ameaça a esse grupo de animais é a morte acidental devido à colisão com veículos em estradas (COSTA et al., 2005; CHIARELLO et al., 2008). Conforme Morato et al. (2006), atualmente todas as dez espécies de felídeos neotropicais encontram-se ameaçadas pelos fatores descritos acima. Portanto, tendo em vista a crescente ameaça que a perda e fragmentação de habitats, juntamente com outras ações humanas, tem causado à sobrevivência de muitas espécies de carnívoros, é importante realizar estudos que forneçam informações sobre estas espécies, visando a embasar estratégias adequadas para a sua conservação.

Foi justamente no âmbito desta “crise” da biodiversidade mundial, ou seja, do grande número de espécies da flora e da fauna terrestre sofrendo ameaças diretas ou indiretas à sua sobrevivência, que surgiu uma nova disciplina: a biologia da conservação, que ao longo do tempo englobou várias áreas de pesquisa, como ecologia, genética, entre outras (PRIMACK; RODRIGUES, 2001; PEREZ-SWEENEY; RODRIGUES; MELNICK, 2003). A biologia da conservação procura, de modo geral, entender os efeitos das ações antropogênicas sobre as espécies e também quais medidas podem ser utilizadas para tentar evitar/prevenir a extinção destas, e quando for o caso, reintroduzir uma espécie no seu ambiente natural (PRIMACK; RODRIGUES, 2001).

4

O’BRIEN, 2006; FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Esta disciplina tem por objetivo principal, em longo prazo, preservar espécies como entidades dinâmicas capazes de se adaptarem às mudanças ambientais (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008), e também preservar a continuidade dos processos ecológicos e evolutivos que ali atuaram e continuam atuando (EIZIRIK; JOHNSON; O’BRIEN, 2006).

As pesquisas nesta área incluem o uso de análises genéticas para elucidar aspectos da história e biologia das espécies relevantes para seu manejo e conservação (PEREZ-SWEENEY; RODRIGUES; MELNICK, 2003; EIZIRIK; JOHNSON; O’BRIEN, 2006; FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Em conjunto com outras disciplinas, como a ecologia e a biologia de populações, a genética está se tornando uma ferramenta importante na determinação de o que conservar (sistemática molecular), onde focalizar os esforços de conservação (filogeografia) e como conservar a maior quantidade de diversidade genética nas populações, com o objetivo de manter o “potencial evolutivo” de uma espécie ou população (genética de populações) (PEREZ-SWEENEY; RODRIGUES; MELNICK, 2003).

Neste contexto, um exemplo da importância da genética é a definição de unidades evolutivamente significativas (UES ou ESU – “Evolutionarily Significant Units”) dentro de uma espécie, ou seja, a definição de unidades evolutivas infra-específicas. Neste conceito recente, criado nas décadas de 1980 e 1990, as ESU são definidas quando uma população (ou um grupo de populações de uma espécie) possui uma diferenciação genética alta em relação a outras populações, refletindo assim uma história de isolamento geográfico (EIZIRIK, 1996; EIZIRIK; JOHNSON; O’BRIEN, 2006; FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Dessa maneira, por possuírem características próprias, estas UES deveriam ser consideradas como unidades independentes em termos conservacionistas (EIZIRIK, 1996; EIZIRIK; JOHNSON; O’BRIEN, 2006; FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008).

5

relevantes para a distinção real entre os grupos, como a variação individual intra-populacional. De fato, estudos utilizando marcadores moleculares com felinos já evidenciaram que muitas vezes as subespécies tidas como “clássicas”, na realidade não correspondiam a unidades evolutivas reais (p. ex. Eizirik et al. 1998, 2001). Portanto, considerando que grande parte dos processos de avaliação de ameaças e estratégias de conservação envolve essas categorias subespecíficas, é de extrema importância que estas definições sejam re-consideradas à medida que novas informações são obtidas acerca dos padrões de subdivisão populacional geográfica observados nestas espécies (EIZIRIK; JOHNSON, 2006).

Outro aspecto interessante da utilização de ferramentas genéticas visando à conservação é o auxílio que esta pode trazer no entendimento da biologia das espécies. Por exemplo, o conhecimento dos padrões de dispersão e da história demográfica das espécies é freqüentemente crítico para assegurar a sobrevivência destas, e pode ser inferido através de análises genéticas (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Portanto, diante do que foi relatado até o momento, estudos como a filogeografia, por exemplo, podem contribuir significativamente para o planejamento de ações de manejo visando à conservação, visto que estes podem fornecer informações sobre o grau de estruturação entre as populações, sobre aspectos da biologia da espécie, entre outros, todos os quais são úteis no entendimento da história evolutiva de uma espécie.

1.3 A filogeografia

6

algum nível, “moldar” a diferenciação genética encontrada nas populações (BALLOUX; LUGON-MOULIN, 2002). Ainda segundo estes autores, como a distribuição geográfica das espécies é tipicamente mais ampla do que a capacidade de dispersão de um indivíduo, geralmente as populações são geneticamente diferenciadas através do isolamento por distância, ou seja, populações mais próximas são geneticamente mais similares entre si do que populações mais distantes.

Nesse contexto, a filogeografia é a área da ciência que investiga a distribuição geográfica de linhagens genealógicas dentro de uma espécie (ou comparando espécies próximas), e procura explicar quais são os principais fatores ou barreiras ambientais que influenciaram na distribuição da diversidade encontrada nas diferentes populações. Para a análise e interpretação da distribuição das linhagens, geralmente são necessárias informações ou abordagens provenientes da genética molecular, genética de populações, etologia, demografia, análise filogenética, paleontologia, geologia, e geografia histórica (AVISE, 2000). Outro aspecto interessante da filogeografia é a possibilidade de definir regiões geográficas prioritárias para a conservação, onde existam UES de várias espécies diferentes (MORITZ, 1994; MORITZ; FAITH, 1998). Assim, estudos filogeográficos podem contribuir para o planejamento da conservação, revelando rompimentos históricos entre populações e espécies, ou ainda áreas com alta divergência genética e endemismo (PEREZ-SWEENEY; RODRIGUES; MELNICK, 2003).

Em estudos de espécies neotropicais, a filogeografia tem se mostrado uma ferramenta bastante útil e capaz de revelar o papel que eventos históricos complexos possuem sobre a distribuição atual da diversidade e a estrutura genética das espécies. Como salientado acima, o conhecimento desta estruturação é de grande relevância para o manejo e a conservação (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008).

1.4 Marcadores moleculares

7

seriam mais difíceis de obter por meio de observações diretas (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Nas últimas décadas, com os crescentes avanços em técnicas laboratoriais e estudos envolvendo o material genético da mitocôndria, o DNA mitocondrial (mtDNA) animal passou a ser amplamente utilizado em estudos populacionais e evolutivos, em especial na filogeografia (AVISE, 2000). O mtDNA é herdado maternalmente e é relativamente abundante, uma vez que existem muitas mitocôndrias por célula, o que o torna de fácil purificação ou análise por amplificação direcionada (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Em estudos sobre os carnívoros neotropicais, marcadores moleculares com base em variação no mtDNA têm sido amplamente utilizados visando a determinar padrões filogeográficos (p.ex. JOHNSON et al., 2001; EIZIRIK; JOHNSON; O’BRIEN, 2006).

Segundo Avise (2000), algumas características particulares ao mtDNA têm feito com que este seja muito utilizado em estudos filogeográficos, como: herança materna (mencionada anteriormente), alta variabilidade intra-específica (entre indivíduos da mesma espécie) e ausência de recombinação entre diferentes moléculas. A alta variação intra-específica é conseqüente da alta taxa de evolução (mutação) do mtDNA quando comparado aos genes nucleares. Algumas hipóteses têm sido levantadas para tentar explicar essa alta taxa de evolução, como: (i) relaxamento da constrição funcional, visto que o mtDNA não codifica para proteínas envolvidas diretamente no seu processo de replicação ou transcrição; (ii) um mecanismo de reparo de DNA ineficiente e a alta exposição a agentes mutagênicos, como os radicais livres da cadeia oxidativa da respiração celular; e (iii) o fato de o mtDNA estar “nu”, já que não é complexado com as histonas, e assim estaria menos protegido do que o genoma nuclear.

Recentemente, além da utilização de mtDNA, tem crescido o número de estudos que incluem outros tipos de marcadores moleculares em suas análises, como por exemplo, marcadores nucleares. Hare (2001), e Emerson e Hewitt (2005), destacaram a importância de se analisar mais de um tipo de marcador, incluindo um ou mais marcadores nucleares, pois estes podem mostrar diferentes aspectos da história evolutiva do grupo sob estudo.

8

nucleotídeos repetidas em tandem (ou seja, em seqüência contínua) no genoma nuclear. Esses marcadores têm sido amplamente utilizados em estudos genéticos por serem altamente informativos, já que são co-dominantes e muitas vezes multi-alélicos, permitindo assim a identificação de genótipos individuais. Os microssatélites amplificados via PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase) possuem uma alta reprodutibilidade e resolução, facilitando assim o seu uso em testes laboratoriais (OLIVEIRA et al., 2006). Ainda conforme estes autores, inicialmente o uso deste marcador era limitado pelo alto custo de se isolar microssatélites na espécie em estudo. Contudo, é comum adotar uma medida alternativa que torna o estudo mais viável, a chamada transferibilidade, na qual primers desenvolvidos para uma determinada espécie podem ser utilizados em espécies filogeneticamente próximas (mesmo gênero ou até mesma família) (OLIVEIRA et al., 2006).

De modo geral, os microssatélites são bastante polimórficos, abundantes e similarmente distribuídos ao longo das regiões eucromáticas do genoma (SCHLÖTTERER, 2004). Devido a essas características, este tipo de marcador tem sido amplamente utilizado em estudos populacionais, pois permite inferir a diversidade genética de uma espécie e os níveis de diferenciação genética entre grupos, detectar migrantes, fluxo gênico, entre outros aspectos (FRANKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Nesse aspecto, os microssatélites têm se mostrado marcadores nucleares úteis para determinar a estruturação genética e a história populacional de uma espécie, tornando-se, portanto, complementações interessantes ao mtDNA em estudos filogeográficos (SUNNUCKS, 2000; RICHARD; THORPE, 2001).

1.5 A família Felidae e a espécie Puma yagouaroundi

9

pelagem macia e lanosa, sendo que a coloração predominante dos pêlos varia de cinza a avermelhado, de amarelado a marrom, acrescida na maioria das espécies de marcações escuras como faixas/listras, pintas ou rosetas. Por esse motivo, certas espécies de felinos são caçadas propositalmente, devido ao valor comercial de sua pelagem. Este grupo de animais possui um hábito alimentar altamente predatório, caçando principalmente outros mamíferos, mas também aves, répteis e peixes. Quanto ao habitat, ocorrem em diversos tipos de ambiente, incluindo áreas de vegetação densa como florestas tropicais ou temperadas, bem como campos abertos e regiões alagadiças (NOWAK, 1999).

10

Figura 1: A. Desenho esquemático de Puma yagouaroundi em suas diferentes ‘fases’ de coloração, usualmente denominadas ‘avermelhada’ e ‘cinza-escura’; B. Fotografia de um jaguarundi cinza/marrom-escuro. (FONTE: A - MASSOIA; CHEBEZ; BOSSO, 2006; B -http://www.wildearthguardians.org).

São poucos os estudos focados na espécie Puma yagouaroundi, sendo que a maioria dos trabalhos aborda o seu hábito alimentar ou padrões de movimentação (NOWAK, 1999). Desta forma, pouco se conhece ainda sobre o jaguarundi, sendo muito relevante qualquer informação adicional sobre esta espécie, especialmente porque os estudos com a dieta ou a extensão de locomoção geralmente são realizados com poucos indivíduos (OLIVEIRA, 2006).

Recentemente, um trabalho realizado por Tófoli, Rohe e Setz (2009) sobre a dieta de P. yagouaroundi em um mosaico da Mata Atlântica secundária e também silvicultura no Estado de São Paulo revelou que o jaguarundi possui uma dieta generalista, mas que possui preferência por pequenos vertebrados terrestres. Entre os itens alimentares observados nas fezes de 26 amostras analisadas, estavam: pequenos mamíferos (com a maior porcentagem), seguido de aves, invertebrados, répteis, grandes mamíferos (provavelmente consumo de carniça, ou indivíduos jovens), e também foi registrada a presença de uma serpente da família Viperidae. Guerrero e colaboradores (2002), analisando 36 fezes de jaguarundi no sul do México, também encontraram uma dieta similar ao trabalho descrito acima. Estes autores também observaram a importância de pequenos vertebrados para a sua alimentação, e encontram também itens alimentares como peixes e vegetais. Neste último caso, observou-se que durante a estação úmida, a freqüência de vegetais diminuiu e a de mamíferos e insetos aumentou, indicando assim que o material vegetal foi um complemento à sua alimentação (GUERRERO et al., 2002). Em um estudo

11

realizado por Konecny (1989), na Colômbia, o mesmo padrão geral foi encontrado (a partir de 46 amostras de fezes): pequenos mamíferos (em maior porcentagem), aves, invertebrados (artrópodes), e ainda foram encontradas sementes de frutas em 11,3% das fezes analisadas.

Quanto ao período de atividade, de modo geral o jaguarundi possui uma atividade predominantemente diurna (KONECNY, 1989; EISENBERG; REDFORD, 1999; MAFFEI; NOSS; FIORELLO, 2007), o que coincide com o período de atividade de suas presas (TÓFOLI; ROHE; SETZ, 2009). No entanto, esta espécie também pode apresentar alguma atividade crepuscular (EISENBERG; REDFORD, 1999).

Em relação a estudos genéticos com esta espécie, um trabalho realizado por Moreno et al. (2006) estimou o conteúdo de informação polimórfica (PIC – Polymorphic Information Content) de quatro loci de microssatélites (originalmente desenhados para gato doméstico) testados em Puma yagouaroundi e outras duas espécies de felinos neotropicais. Utilizando 36 amostras de jaguarundi obtidas em zoológicos brasileiros, estes autores obtiveram valores de PIC entre 0.73 e 0.92, indicando um alto grau de polimorfismo e, portanto, o alto poder informativo destes marcadores para estudos genéticos.

12

Figura 2: Distribuição geográfica atual aproximada de Puma yagouaroundi ao longo da região Neotropical (área demarcada em vermelho) (FONTE: IUCN, 2010)

13

Conforme Oliveira (1998), ao longo de sua distribuição geográfica, o jaguarundi possui oito subespécies descritas (Figura 3), sendo estas: 1 - P. yagouaroundi ameghinoi (Argentina), 2 - P. yagouaroundi cacomitli (litoral leste do México), 3 - P. yagouaroundi eyra (Paraguai e sul do Brasil), 4 - P. yagouaroundi fossata (sul do México), 5 - P. yagouaroundi melantho (leste do Peru), 6 - P. yagouaroundi panamensis (Panamá), 7 - P. yagouaroundi tolteca (litoral oeste do México), e 8 - P. yagouaroundi yagouaroundi (Guiana e região amazônica do Brasil). É importante ressaltar que estas classificações clássicas de subespécies de felinos foram produzidas com base em aspectos morfológicos e critérios bastante subjetivos, muitas vezes empregando tamanhos amostrais pequenos. Assim sendo, como mencionado anteriormente, esta divisão em oito subespécies pode não refletir realmente a estruturação filogeográfica da espécie, e requer uma avaliação crítica empregando diferentes conjuntos de dados e abordagens analíticas.

Figura 3: Mapa indicando a distribuição geográfica das oito subespécies descritas para P. yagouaroundi (FONTE: OLIVEIRA, 1998).

14

4) (JOHNSON; O’BRIEN, 1997; JOHNSON et al., 2006). Contudo, devido à distinta aparência física desta espécie quando comparada à de outros gatos, conforme descrito anteriormente, sua classificação foi considerada historicamente confusa (SUNQUIST; SUNQUIST, 2002). Puma yagouaroundi já foi inserido no gênero Felis, no subgênero Herpailurus dentro do gênero Felis, ou mesmo em um gênero próprio, Herpailurus (WONZENCRAFT, 2005). No entanto, estudos recentes mostraram que o jaguarundi forma um grupo monofilético com o puma (Puma concolor), e o guepardo (Acinonyx jubatus), posicionando-se como grupo irmão do primeiro (JOHNSON; O’BRIEN, 1997; WONZENCRAFT, 2005; JOHNSON et al., 2006). Como consequência, foi proposto que o gênero desta espécie mudasse de Herpailurus para Puma (WONZENCRAFT, 2005; JOHNSON et al., 2006).

15

2. Objetivos

O presente trabalho tem por objetivos (i) estimar a diversidade genética e o padrão filogeográfico de Puma yagouaroundi (É Geoffroy Saint-Hilaire 1803), incluindo inferências sobre sua estrutura populacional atual, sua história demográfica, e a validade das unidades previamente propostas como subespécies para este felídeo; (ii) relacionar os resultados obtidos a informações disponíveis sobre paleogeografia (incluindo processos históricos associados a possíveis barreiras ao fluxo gênico entre diferentes populações), com a finalidade de compreender sua influência sobre a distribuição atual da variabilidade genética nesta espécie.

3. Apresentação do artigo

16

Phylogeography and evolutionary history of the jaguarundi

(

Puma yagouaroundi

) (Mammalia, Felidae)

CARLA B. PIRES

, TADEU G. DE OLIVEIRA

, WARREN E. JOHNSON

,

STEPHEN J. O’BRIEN

, EDUARDO EIZIRIK

1

Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências,

PUCRS, Avenida Ipiranga, 6681, prédio 12C, sala 172, Porto Alegre, RS

90619-900, Brazil.

2

Departamento de Biologia, UEMA, Cidade Universitária Paulo VI, Caixa

Postal 09, São Luis, MA 65055-970, Brazil.

3

Instituto Pró-Carnívoros, Av. Horácio Neto, 1030, casa 10, Atibaia, SP

12945-010, Brazil.

4

Laboratory of Genomic Diversity, National Cancer Institute (NCI), Frederick,

MD 21702-1201, USA.

Corresponding authors:

Carla B. Pires and Eduardo Eizirik

E-mails: carla.pires@gmail.com and eduardo.eizirik@pucrs.br

17

ABSTRACT

Jaguarundis (Puma yagouaroundi) are small cats widely distributed across the Neotropics,

ranging from Mexican lowlands to central-southern Argentina. So far no study has assessed

the extent of its present genetic diversity, as well as its population structure, demographic

history and phylogeographic patterns. We have addressed these issues by analyzing 1191 bp

of the mitochondrial DNA (mtDNA) and eight microsatellite loci in up to 95 individuals,

covering a large portion of the species’ geographic range. MtDNA results showed low to

moderate levels of genetic diversity, while the microsatellites exhibited moderate to high

variability. Contrary to the eight subspecies classically recognized for the jaguarundi,

mitochondrial analyses revealed the existence of two major phylogeographic groups

(Northern and Southern) that appear to be at least in part influenced by a historical barrier

such as the Amazon river. The microsatellites suggested a similar pattern but with a lower

degree of differentiation, possibly due to male-biased gene flow. No evidence of significant

demographic changes through time was observed, indicating that the species has maintained

rather stable population size in the past. The results presented here may be useful in

developing conservation strategies on behalf of this intriguing and poorly studied wild cat.

Keywords: population structure, evolution, conservation, P. yagouaroundi, mitochondrial

18

INTRODUCTION

Understanding the population history of a species and also its current genetic structure

can reveal which evolutionary processes (e.g. barriers to gene flow, isolation by distance,

among others) may have played a role in the distribution of its present genetic variability

(Avise 2000; Frankham et al. 2002). This knowledge is important given that it can indicate

the existence of ESUs (Evolutionarily Significant Units) or MUs (Management Units), which

in turn are useful in management actions (Diniz-Filho et al. 2008; Eizirik et al. 2006; Moritz

1994). Moreover, understanding phylogeographic patterns and population structure is of great

value not only from the conservation point of view, but also because it provides important

knowledge on the species’ biology, since it may be used to infer the evolutionary processes

that have shaped the observed pattern, and their relationship to life-history traits (Avise 2000;

Diniz-Filho et al. 2008; Eizirik et al. 2006; Frankham et al. 2002).

Even though Brazil’s biodiversity is considered to be very high in terms of the

number of species, with estimates ranging from 9.5% to 13.1% of the world’s total species,

many of these species and even higher taxonomic levels remain poorly known (Brandon et al.

2005; Lewinsohn and Prado 2005; Schipper et al. 2008). This is the case of many Neotropical

carnivores, for which even basic information is lacking, considering that few robust and

thorough studies have been performed so far (Oliveira 2006). Although this scenario has

changed to some extent in the last few years, with studies addressing aspects such as

population history and phylogeography of some species, (e.g. Culver et al. 2000; Eizirik et al.

1998, 2001; Haag et al. 2010; Tchaicka et al. 2007; Trinca et al. [in press]), the majority of

studies published so far involves food habits, often employing limited sample size. Hence,

information on the ecology, natural history, population structure and phylogeographic

patterns of many Neotropical carnivores remains scarce (Eizirik et al. 2006, 2012; Oliveira

2006).

The jaguarundi (Puma yagouaroundi) is a wild cat that fits the scenario described

above, as it is one of the Neotropical felids with the least available information (Eizirik et al.

2006; Oliveira 2006). Nearly all studies conducted so far with the jaguarundi addressed

aspects of its diet, which is considered to be generalist since it mainly consists in small

mammals, birds and reptiles (Silva-Pereira et al. 2011; Guerrero et al. 2002; Konecny 1989;

Tófoli et al. 2009), although fish (Guerrero et al. 2002), arthropods and plants might also be

19 This curious animal, considered to be a cat with few feline features due to its unique

appearance, has a broad geographic distribution (Fig 1) ranging from the eastern and western

lowlands of Mexico to central-southern Argentina (Nowak 1999; Oliveira 1998; Sunquist and

Sunquist 2002). As a result, it is found in a variety of open and closed habitats such as

tropical rainforests, semideciduous forests, scrub savannas and swampy grasslands, indicating

that it is quite flexible ecologically (Caso et al. 2008; Eisenberg and Redford 1999; Oliveira

1998). Unlike many other cats, P. yagouaroundi seems to have a diurnal activity (Di Bitetti et

al. 2010; Konecny 1989; Maffei et al. 2007; Oliveira 1998; Sunquist and Sunquist 2002),

which is possibly why it is often seen by field researchers. This fact may induce the false

impression that this felid is common and abundant, which is at odds with recent findings

indicating that it is actually an uncommon, low-density species (Caso et al. 2008). In

accordance with the most recent molecular phylogeny of the Felidae (Johnson et al. 2006),

the jaguarundi diverged from its sister species (the puma [Puma concolor]) ca. 4.2 million

years ago (MYA). Consequently, one may hypothesize that this split may have occurred in

North America, prior to the Great American Biotic Interchange (GABI) in the Pliocene, and

followed by independent colonization of South America by each species (Eizirik 2012).

However, the estimated credibility estimated leaves room for an alternative hypothesis, i.e.

that their speciation occurred in South America after the invasion by a common ancestor

during the GABI. Regarding intra-specific genetic issues, only two published studies

included this species: Eizirik et al. (2003) discovered a 24-bp deletion in the MC1R gene that

affects coat color variation in this species, while Moreno et al. (2006) evaluated the

Polymorphism Information Content (PIC) of four microsatellite loci originally described for

the domestic cat. Still, none of these studies focused exclusively on the jaguarundi, nor

revealed aspects of its range-wide population structure and demographic history.

In this study, we addressed the evolutionary history of the jaguarundi using biological

samples that span most of the species’ distribution. We performed several analyses based on

two distinct data sets, one comprising two mitochondrial DNA (mtDNA) segments and the

other consisting of eight microsatellite loci. On the basis of these data, we make inferences on

20

MATERIALS AND METHODS

Sample collection and laboratory methods

A total of 71 biological samples such as blood and/or tissue was obtained for this

study. The majority of blood samples was collected from wild specimens caught by

collaborators in field ecology studies, or from captive individuals of known geographic

origin. Tissue samples were obtained mostly from road-killed individuals, and a few samples

came from museums. Blood samples were preserved in a saturated salt solution (100 mM

Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS), and tissue samples in 96% ethanol. Genomic DNA

extraction was performed using a commercial kit (DNeasy Blood & Tissue - Qiagen)

following the manufacturer’s guidelines. After this procedure, the total DNA was quantified

in a 1% agarose gel stained with GelRed® (Biotium Inc.) using a molecular marker of known

concentration such as the LowMass DNA Ladder (Invitrogen), and the samples were

subsequently diluted to a 5ng/µL concentration. In addition to the samples mentioned above,

33 additional samples that were also included in this study already had their DNA extracted

and quantified previously. Thus, a total of 104 biological samples of P. yagouaroundi was

included in the study, covering most of the species’ range (Fig. 1, Table 1).

DNA amplification of both mitochondrial and nuclear (microsatellite) markers was

carried out by the polymerase chain reaction (PCR). Two different mitochondrial DNA

(mtDNA) fragments were amplified: (i) the 5’ portion of the NADH dehydrogenase subunit 5

(ND5) gene, using primers reported by Trigo et al. (2008); and (ii) a partial fragment of the

cytochrome b (cyt-b) gene, using primers described by Irwin et al. (1991) [L15162 and

H15915]. Each PCR reaction (20 µL) contained 10 – 15 ng of DNA, 0.2µM of each primer,

1X Buffer (Invitrogen), 1.5 – 2.0 mM of MgCl2, 200 µM of each dNTP and 0.2 U of

Platinum® Taq Polymerase (Invitrogen). Negative controls (all reagents but no DNA) were

included in every PCR reaction. Thermocycling conditions for the ND5 segment included an

initial denaturing step of 94°C for 3min, followed by 10 touchdown cycles of 94°C for 45s,

60-51°C for 45s (-1°C per cycle), 72°C for 1.5 min; and 30 additional cycles of 94°C for 45s,

50°C for 45s, 72°C for 1.5 min; and a final extension step of 72°C for 3 min. The

thermocycling profile for the Cytb segment was similar to the one described above, differing

in the touchdown step (5 cycles of 94°C for 45s, 55-50°C for 45s [-1°C per cycle], 72°C for

21 (72°C for 30 min). PCR amplification was then confirmed and quantified in a 1% agarose gel

stained with GelRed®, and the products were purified using the enzymes Exonuclease I and

Shrimp Alkaline Phosphatase. After this step, PCR products were sequenced using the

DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit (GE Healthcare), and analyzed in a

MegaBACE 1000 automated sequencer (GE Healthcare).

Regarding the microsatellite data, eleven loci originally described for the domestic cat

(Menotti-Raymond et al. 1999) were tested for Puma yagouaroundi. A test with different

annealing temperatures for each locus was performed in order to optimize the use of these

primers in jaguarundi samples. Taking into account the results obtained in this test, eight

microsatellite loci where selected based on amplification efficiency and yield. Two of them

contained trinucleotide repeats (F98 and F146) and six comprised tetranucleotide repeats

(F124, F42, FCA441, FCA391, FCA453 and FCA424). For all loci, every forward primer

had a M13 tail (5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’) at their 5’ end, allowing the paring of

a third complementary primer (M13) that was dye-labeled (Boutin-Ganache et al. 2001). PCR

reactions were performed separately for each locus in a final 10 µL volume, containing 10 –

20ng of DNA, 0.013 µM of the M13-tailed forward primer, 0.2µM of the reverse primer and

a fluorescent M13 primer (6-FAM, NED or HEX), 1X Buffer (Invitrogen), 1.5 – 2.0 mM of

MgCl2, 200 µM of each dNTP and 0.1 U of Platinum® Taq Polymerase (Invitrogen). Again,

negative controls (all reagents but no DNA) were included in all PCR reactions.

Thermocycling conditions were the same for all loci (except for the annealing temperatures,

which varied across loci - Table 5), and consisted of an initial denaturing step at 94ºC for 5

min, followed by 30 cycles of 94ºC for 45s, 53 - 60ºC (see Table 5) for 45s, 72ºC for 1 min,

and a final extension at 72ºC for 15 min. After PCR amplification, all samples (including the

negative control) were diluted 1:5,loci with different fluorescent dyes were pooled together

in a multiplex set (see Table 5), and then genotyped using a MegaBACE1000 (GE

Healthcare) automated sequencer with the internal size standard ET550-R. The software

Genetic Profiler 2.2 was used to analyze the results.

Sequence Analysis

DNA sequence electropherograms were visualized and checked using FinchTV 1.4.0

(http://www.geospiza.com/Products/finchtv.shtml), and then aligned using the Muscle

algorithm (Edgar 2004) implemented in the software MEGA 5 (Tamura et al. 2011). The

22 described above, we found evidence of mtDNA heteroplasmy in some individuals, where

high quality sequences (high peaks and low baseline) sometimes presented double “clean”

peaks on both strands at a specific nucleotide site. Some of these samples were re-sequenced

in order to verify the ambiguity at that position; if confirmed, the ambiguous site was scored

as missing information and excluded from subsequent analyses.

Summary statistics such as haplotype (Hd) and nucleotide (π) diversity, and the

number of variable and parsimony-informative sites, were estimated for each mitochondrial

segment separately, as well as the concatenated data set, using Arlequin 3.5 (Excoffier et al.

2005) and MEGA 5. Only samples that had both segments (ND5 and Cytb) sequenced were

included in the mtDNA concatenated data set, which was then used for all subsequent

analyses.

We performed phylogenetic analyses of the concatenated mtDNA data using three

different approaches: (i) maximum parsimony (MP) using the software TNT (Goloboff et al.

2008), (ii) maximum likelihood (ML) using the online version of PhyML 3.0

(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/) and (iii) Bayesian inference (BI) using Beast v. 1.6.2

(Drummond and Rambaut 2007). For the latter two, we initially determined the model of

DNA evolution that best represented our data using the Akaike Information Criterion (AIC)

implemented in the software JModeltest (Posada 2008). For the MP phylogenetic

reconstruction, we used heuristic searches with 1.000 replicates of random starting trees

(random addition sequence-Wagner trees) followed by the tree bisection-reconnection (TBR)

branch swapping algorithm. A similar search profile was used for the ML method, with

heuristic searches followed by TBR, where the starting trees used the BIONJ algorithm

(Gascuel 1997). In both analyses, the confidence on the results was evaluated by performing

1.000 bootstrap pseudoreplicates. The BI phylogenetic analysis was carried out using a

Markov Chain Monte Carlo (MCMC) algorithm that ran for 5,000,000 generations, sampling

trees every 500 steps, and discarding the first 500,000 generations as burn-in. A coalescent

tree prior was used in this analysis. The program Tracer v.1.5 (Rambaut and Drummond

2007) was used to verify if the estimated parameters generated by the MCMC run were

stabilized, and then posterior probabilities were calculated. Additional DNA sequences of

Puma concolor (GenBank accession numbers: AY598493 and AY598487), the sister species

of the jaguarundi (Johnson et al. 2006), were used as outgroups in all phylogenetic analyses.

To further evaluate the evolutionary relationships among the P. yagouaroundi

haplotypes, we generated a haplotype network for the concatenated mtDNA data set using the

23 (www.fluxus-engineering.com). In addition, we investigated the demographic history

underlying the current haplotype diversity by performing neutrality tests (Tajima’s D [Tajima

1989] and Fu’s Fs [Fu 1997]) and a mismatch distribution analysis, as implemented in

Arlequin.

We also estimated a Bayesian Skyline Plot (Drummond et al. 2005), using the

concatenated data set and the software Beast, to infer the dynamics of population size through

time, and to assess if there was any evidence of demographic change in the past. For this

purpose, we initially estimated a substitution rate for a subset of the ingroup samples using a

uniform prior distribution for the age of the split between the jaguarundi and the puma, whose

boundaries were set by the 95% credibility interval reported by Johnson et al. (2006) for this

divergence (3.16 to 6.01 million years ago [MYA]). We assumed a Yule Process for the tree

prior and an uncorrelated lognormal relaxed molecular clock, and performed a MCMC of 50

million steps (burn-in of 10%). We then performed a second Beast run for the Bayesian

Skyline analysis, assuming a strict molecular clock and the substitution rate estimated in the

previous run, along with a Skyline piecewise-constant tree prior. The MCMC was run for

100,000,000 generations, with the first 10% discarded as burn-in. The software Tracer was

used to verify and analyze the estimated parameters.

To assess if there was any population structure and differentiation among geographic

groups, we estimated frequency-based fixation indices such as ФST, and carried out an

Analyses of Molecular Variance (AMOVA) (Excoffier et al. 1992) using Arlequin, with

10,000 permutations. Different population structure scenarios were tested, including some

suggested by the phylogenetic and network analyses, and also by subdividing South

American individuals into groups sampled in the major biomes found on this continent.

Several distance measures were used during each analysis, and the results reported here are

from a Kimura 2P + G distance (the closest model to the one estimated as a best-fit to this

data set) and the proportion of differences (p-distance). Unlike conventional F-statistics,

these measures also take into account the molecular distance among haplotypes, and thus the

information of how much a haplotype is different or similar to another is incorporated.

Finally, we used the software Alleles In Space (AIS) (Miller 2005) to perform a Mantel test

(Mantel 1967), assessing the correlation between genetic and geographic distances among

samples, which would indicate the occurrence of isolation by distance in the jaguarundi. The

24

Microsatellite data analyses

The program Convert (Glaubitz 2004) was used to facilitate the conversion between

different input files required by the population genetic software. Indices of genetic diversity

were estimated by calculating the number of alleles per locus, the polymorphic information

content (PIC), and the observed (Ho) and expected heterozygosity (He) using Cervus 3.0.3

(Kalinowski et al. 2007) and Arlequin. The latter program was also used to test for Linkage

Disequilibrium (LD) between loci and to detect departures from Hardy-Weinberg equilibrium

at each locus. The software HP-Rare (Kalinowski 2005) was used to compute the allelic

richness and the number of private alleles for each population (see Results for further

information regarding defined groups) using the rarefaction approach, which compensates for

differences in sample size. The number of gene copies considered was set based on the

number of diploid individuals of the smallest population sample being compared.

In order to assess the presence of genetically differentiated groups and to assign

individuals to their respective group, we employed the Bayesian clustering approach

implemented in Structure 2.3.3 (Pritchard et al. 2000). We performed an MCMC run with

1,000,000 steps (after a burn-in of 100,000 generations), varying the values of K (number of

assumed genetic clusters) from 1 to 5. Five replicates were run for each value of K. The

analysis was performed without any prior information regarding the sampling location of the

individuals. The estimates of log likelihoods of each replicate were checked to verify that

there was little variation within each assumed K, indicating that the MCMC runs had

converged. Otherwise, five additional runs for each value of K were performed with longer

MCMC runs and longer burn-in lengths as well. If necessary, the number of K values was

also increased. The population structure inferred with this approach was further tested in the

subsequent analyses.

To evaluate how the microsatellite diversity is distributed among populations, we

used the software Arlequin to estimate the FST index (Wright 1978), based on the number of

different alleles, and also to perform an Analyses of Molecular Variance (AMOVA). As in

the mtDNA analyses, we tested different scenarios of population structure to assess which

subdivision best explained the observed variation in allele frequencies. To assess the

existence of an isolation-by-distance pattern, we performed a Mantel test (10,000

25

RESULTS

Mitochondrial markers

The estimated statistics of mtDNA diversity (Table 2) showed a similar pattern of

variability for the two analyzed segments, with the number of variable and

parsimony-informative sites varying from 22 (Cytb) to 25 (ND5), and 17 (Cytb) to 18 (ND5),

respectively. The nucleotide diversity (π) indices were low to moderate, and indicated a

slightly higher value of overall diversity in the Cytb segment (0.0053) than in ND5 (0.0050).

The haplotype diversity was moderate to high for both segments, ranging from 0.8151 (ND5)

to 0.8849 (Cytb). The concatenated data set comprised an alignment that contained 1191 bp,

42 variable sites (32 of which were parsimony-informative), 21 different haplotypes, and a

moderate to high level of haplotype diversity (Hd = 0.87). Although this data set included

fewer samples than the individual segments, most of the variability found in each separate

segment was maintained in this concatenated data set.

The haplotype network (Fig 2, see also Table 3) showed that most mtDNA sequences

from South America were a least six mutational steps away from the Central America and

Mexico haplotypes, thus suggesting the existence of geographic structure in jaguarundi

matrilines. Interestingly, the haplotype found in Venezuela was identical to the one found in

Mexico. On the other hand, individuals from Guatemala were more closely related to the

South America haplotypes than to the Central America ones, suggesting some historical

female gene flow between these regions. Another interesting feature was the presence of one

highly frequent haplotype (Py-H3), shared across different areasin the southern part of South

America, whereas other haplotypes differed from this central one by only one or two

mutations (Fig 2, Table 3). Also within this southern region, we found two additional

haplotypes (Py-H1 and Py-H2) with relatively high frequency, one encompassing most

individuals from Rio Grande do Sul and Paraná states H1) in Brazil, and the other

(Py-H2) with a broader range including samples from other areas such as southeastern and

northeastern Brazil. This indicates that, although some haplotypes appear to be

geographically restricted, others are shared among different regions within Brazil.

The model of DNA substitution that best fit the data according to the AIC was the

3-parameter-model (K3P) (Kimura 1981) with unequal base frequencies and a gamma

distribution (G) of rate variation among sites. The second best model was a very similar one,

26 the two rates regarding the transversions, and had an AIC value only slightly higher (∆AIC =

0.6411) than the K3P. Burnham and Anderson (2002) suggested that models having ∆AIC

(difference between AIC values of two models) values within 1 or 2 of the best model have

strong support and should also be considered. Therefore, considering that the analytical

packages used for ML and BI phylogenetic analyses have the second model as an

implemented option, but not the K3P, we employed the HKY+G model in all analyses.

The phylogenetic reconstruction obtained with the three different methods (Fig 3, and

Supplementary Fig. S1) recovered most of the aspects observed in the network analysis. We

found in all trees the presence of a highly supported clade containing most of the South

America (SA) haplotypes. As in the network analysis, the Guatemala haplotype (Py-H6) was

placed within this major SA clade. The maximum parsimony analysis found 12 trees with

186 steps, in which the most basal haplotype was Py-H14 followed by Py-H7, both from the

North America (Mexico) + Central America (NCA) region. The strict consensus tree

(Supplementary Fig S1) also depicted two derived clades in which almost all internal

branches were collapsed, indicating the lack of structure within each group. The main

difference between the topologies produced with the three approaches was that, whereas in

the MP and ML trees the haplotypes from Mexico + Central America were in a basal

position, suggestive of a north-south migration of the jaguarundi, in the Bayesian approach

there were two well-defined major clades (NCA and SA, both with posterior probabilities of

1.0), precluding any inference regarding which group arose first.

In order to test which population structure was most likely, taking into account the

genetic differentiation among haplotypes, an Analysis of Molecular Variance (AMOVA) was

performed and ФST values were estimated for three different scenarios of population

subdivision. The first one was based on the geographic origin of the individuals, but partially

taking into account the separation between South and Central America observed in the

network and phylogenetic analyses. That is, one group (NCA) comprised haplotypes from

Mexico and Central America, while the other (SA) by all the samples from South America.

The AMOVA analysis indicated that there was more genetic variation between these two

major groups than within each of them. This was reflected in high and significant ФST values:

0.5433 for Kimura 2P + G distance, and 0.5354 for the proportion of differences (both p

-values < 0.001).

The second scenario of population structure that was assessed took into consideration

that the haplotype found in the Venezuela specimens was identical to the one found in

27 located to the north of the Amazon river (Northern group – Venezuela included) were

compared with those originating from areas to the south of this river (Southern group). In this

case, the inferred differentiation was even higher than in the first scenario, with an ФST of

0.6124 for the Kimura 2P + G distance, and 0.6043 for the proportion of differences (both p

-values < 0.001). The Mantel test (r = 0.3316, p = 0.0009) results indicated that part of this

high genetic differentiation between these two groups was due to isolation by distance, as

indicated by correlation between the genetic and geographic distances.

The third and last scenario was aimed at testing for further subdivision of South

America into major biomes. On the basis of the results from first two scenarios, we

hypothesized that the strongest population partition was between the Northern and Southern

groups. We thus compared the Northern group with three regional subpopulations of the

Southern group: the south-southeast (SSE) population, including samples from the southern

portion of the Atlantic Forest and adjacent Pampas grasslands; the central-west (CW)

population, encompassing mostly the Cerrado biome; and the northeast (NE) population with

samples from the northern portion of the Atlantic Forest along with the dry Caatinga biome.

The results showed that the highest ФST values were obtained in all comparisons made with

the Northern group (ФST values between 0.5350 and 0.6120 for the K2P + G distance; all p <

0.001), while when the southern subpopulations were compared to each other, the largest

difference was between the NE and SSE groups, with a relatively high and significant ФST of

0.2069 (p < 0.01) for the K2P + G distance (Table 4). Interestingly, when the CW population

was compared to either one of the other southern sub-groups, none of the ФST values was

significant (p > 0.05) and one of the comparisons (CW vs. NE) showed a negative ФST. This

result could be an indication that part of the differentiation between the SSE and NE

populations may be due to isolation by distance. This hypothesis was supported by a Mantel

test performed for the Southern group alone, where a moderate but significant correlation was

observed (r = 0.2615, p = 0.0001). Therefore, all the mtDNA results so far support the

existence of two major phylogeographic groups, Northern and Southern, with some genetic

structure within the latter. Further scenarios could not be tested due to the small sample size

available for some regions, which would likely bias the results of some analyses.

With respect to the demographic history, our analyses did not reveal any clear signal

indicating major demographic changes in the jaguarundi over the past several thousand years.

Neither Tajima’s D nor Fu’s Fs test resulted in significant values (estimated for Northern and

Southern groups separately; data not shown). Likewise, the mismatch distribution analysis

28 reconstruct a clear pattern of demographic changes in the past. Although we observed a trend

suggesting gradual increase in the past 150,000 years, followed by a recent drop and

subsequent demographic recovery, these reconstructions were accompanied by broad

credibility intervals, thus failing to reject a null hypothesis of constant population size.

Microsatellite markers

Of the 104 available P. yagouaroundi samples, we were able to successfully amplify

most of the eight selected microsatellite loci for 76 individuals. Samples with too much

missing data (i.e. > 50% of the total number of loci) were excluded from the data set and thus

from all subsequent analyses. All loci but one (F146, with 5.26%) had less than 5% missing

data. We found evidence that could suggest potential allelic size homoplasy for two loci

(F124 and FCA391), since even though most of the adjacent alleles were four nucleotides

apart, some differed by only three or two base pairs. This might be a result of

insertion-deletion events surrounding the microsatellite region, or the existence of a complex repeat

locus in the jaguarundi, relative to the original target species for marker development

(domestic cat). Such factors could induce size homoplasy among the defined alleles, as

reported previously for Puma concolor (Culver et al. 2001). Other than these two exceptions,

no difference was found regarding the type of repeat (tetra or tri) between the domestic cat,

(Menotti-Raymond et al. 1999, 2005) and the jaguarundi (Table 5). Still, taking into account

the considerations mentioned above, we decided to perform the AMOVA analysis and FST

estimates using only the number of different alleles as input information.

We identified a total of 79 alleles across all loci (Table 6), and the number of alleles

per locus varied from 5 (FCA424) to 17 (F42). The former locus had the lowest polymorphic

information content (PIC), 0.096, and locus F124 had the highest PIC value (0.883). The

average number of alleles per locus was 9.88, and the average observed and expected

heterozygosities was 0.596 and 0.739, respectively (see Table 6). Tests for deviations from

Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) and linkage equilibrium were performed for two major

groups separately: NCA and South America (Venezuela included) (see below). After a

Bonferroni correction, departures from HWE remained at 3 loci (F42, F98 and F146), and 2

pairs of loci (F124 and F42, FCA391 and FCA424) were in linkage disequilibrium (LD), both

in the South American population. When Venezuela was placed with the NCA group (i.e.

within the Northern group, as previously defined) the same results were obtained, but an

29 in LD are actually on different chromosomes of the domestic cat (Menotti-Raymond et al.

1999), these deviations from equilibrium may indicate further population structure that has

not been captured, likely due to the small sample size available for some regions (see Fig 1,

and Table 1 for further information).

Initial runs with the software Structure showed considerable variation in the estimated

likelihood across replicates of each assumed K value. We thus performed more exhaustive

runs in order to obtain more consistent estimates, and also increased the maximum value of K

from five to seven. The final and more thorough MCMC run had a length of 5,000,000 steps

(first 510,000 discarded as burn-in) and showed similar values of posterior probability within

each value of K, indicating that the run had stabilized. The mean posterior values behaved as

a plateau after k = 2 (Fig 5a). Thus, to infer the number of genetically distinct populations (K)

in P. yagouaroundi, we used the _∆K approach suggested by Evanno et al. (2005), which

indicated that K = 2 was the most likely number of groups for this data set (Fig 5b).

Although the membership (Q) values of individuals from the Southern group where

mostly mixed between the two inferred genetic clusters, all the samples but one from Central

America, Mexico (NCA) and also Venezuela showed high membership values (>0.85) in one

specific cluster, thus suggesting that the two probable populations represent the Northern and

Southern groups (as in the mtDNA). We performed an additional run (5,000,000 MCMC

steps after 500,000 generations discarded as burn-in) setting K from 1 to 2 with 10 replicates

each, to confirm this assignment of Venezuelan individuals to the Northern group. In all 10

replicates, Venezuelan samples were consistently assigned (Q > 0.93) to the same cluster as

the NCA samples. The mixed assignment observed in other South American samples may be

a result of many factors, such as different sample size among regions, as well as an influence

of isolation by distance across different parts of the sampled range (Manel et al. 2005;

Pritchard et al. 2010; Schwartz and McKelvey 2009).

As in the mtDNA data set, three different schemes of population structure were tested

to evaluate the extent of genetic differentiation among groups. The AMOVA results for the

first scenario (NCA vs. South America [Venezuela included]) showed that a small but

significant portion of the detected genetic variation was located between these two groups

(FST = 0.0597, p < 0.001). The second population structure tested (Northern vs. Southern

regions, with Venezuela in the Northern one) resulted in a similar pattern, with a slightly

lower value of FST (0.0552, p < 0.001). Although might indicate that individuals from

Venezuela are more genetically similar to those found farther south in South America than to

30 set. Furthermore, a Mantel test (r = 0.2634, p = 0.0000) indicated that isolation by distance

might be playing a role in the genetic differentiation of these two broad geographical areas.

Finally, the third scenario tested was the Northern group vs. the southern

subpopulations. The only difference with respect to the mtDNA scenario is that, given the

small sample size available for the Cerrado biome (5 individuals, i.e. 10 alleles), we decided

to exclude this population from the comparisons, so that only two populations (SSE and NE)

were tested. Also, since we did not have any strong evidence (significantly higher FST in one

specific scenario) supporting the grouping of Venezuela in either major group, we chose to

allocate Venezuela with the NCA samples for this third scenario, considering the

geographical proximity of the regions compared to other sampling sites.The results from this

final analysis (Table 7) showed that, again, the highest FST values were obtained when

comparisons were made with the Northern group, varying from FST = 0.0404 to FST = 0.0679

with the NE and SSE populations, respectively (both p < 0.01). In contrast, the tests between

the southern subpopulations (SSE vs. NE) were not significant. A weak correlation between

geographic and genetic distances (r = 0.1520, p = 0.0138) was found when the Mantel test

was performed using only the Southern samples.

DISCUSSION

When compared with other felid species, as well as other carnivores, the genetic

diversity estimates obtained for the jaguarundi in this study can be considered to be low to

moderate. The nucleotide diversity estimated for ND5 (π = 0.0050) was higher than the ones

estimated for other Neotropical carnivores, such as the small cats Leopardus tigrinus (π =

0.0031) and Leopardus geoffroyi (π = 0.0039) (Trigo et al. 2008; T. Trigo, pers. comm.); the

crab-eating raccoon Procyon cancrivorus (π = 0.00239; Tsuchiya-Jerep 2009), a small

procyonid with a somewhat similar distribution to P. yagouaroundi; and the puma, Puma

concolor (π = 0.00318), the jaguarundi’s sister species with a noteworthy low genetic

diversity, albeit the latter study had also analyzed additional (partial) segments of the 16S and

ATP8 mitochondrial genes, besides the partial ND5 (Culver et al. 2000). But on the other

hand, were considerably smaller than the leopard’s estimated diversity (π = 0.0121),

although, again, a partial fragment of another segment, the control region (116bp), was also

included in that study (Uphyrkina et al. 2001). Similarly, a lower degree of diversity was also