Expressão gênica em síndrome mielodisplásica do subtipo AREB

(1)

Carlos Fabián Mendiburu

Expressão Gênica em Síndrome Mielodisplásica do

Subtipo AREB

Tese Apresentada

para obtenção do

Título de Doutor em

Genética

.

(2)

Carlos Fabián Mendiburu

Expressão Gênica em Síndrome Mielodisplásica do

Subtipo AREB

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da UNESP, Campus de São José do Rio Preto, SP, para a obtenção do título de Doutor em Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Agnes Cristina Fett Conte Co-Orientador: Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior

(3)

I

Carlos Fabián Mendiburu

Expressão Gênica em Síndrome Mielodisplásica do Subtipo AREB

COMISSÃO JULGADORA

TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR

Presidente e Orientador:...

2º Examinador:...

3º Examinador:...

4º Examinador:...

5º Examinador:...

(4)

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(8)

VI

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ... VII LISTA DE FIGURAS ...VIII LISTA DE ABREVIATURAS ...IX

I. INTRODUÇÃO... 1

I. 1 Aspectos gerais das Síndromes Mielodisplásicas...2

I. 2 Incidência...3

I. 3 Etiologia e fatores de risco...5

I. 4 Aspectos clínicos e tratamento...6

I. 3 Classificação morfológica...10

I. 4 Anemia refrataria com excesso de blastos (AREB)...15

I. 6 Patogênese e evolução...16

I. 7 Aspectos citogenéticos e moleculares...17

I. 8 Análise serial da expressão gênica (SAGE)...21

II. OBJETIVOS... 24

II. 1 Objetivo geral...25

II. 2 Objetivos específicos...25

III. MATERIAL E MÉTODOS... 26

III. 1 Casuística...27

III. 2 Métodos...28

III. 2. 1 Processamento das amostras de medula óssea...29

III. 2. 2 Extração do RNA total e síntese de cDNA...30

III. 2. 3 Análise serial da expressão gênica (SAGE)...31

III. 2. 4 Análise da biblioteca SAGE de AREB...37

III. 2. 5 Seleção dos genes para validação...38

III. 2. 6 Validação por PCR em tempo real...38

IV. RESULTADOS... 43

IV. 1 Análise global da expressão gênica das bibliotecas de SAGE de AREB...44

IV. 2 Análise do perfil funcional da biblioteca de AREB...46

IV. 3 Análise comparativa da biblioteca AREB e identificação dos benes diferencialmente expressos...47

IV. 4 Analise funcional das bibliotecas e dos genes com expressão diferencial...50

IV. 5 Seleção dos genes candidatos para validação...52

IV. 6 Análise da expressão gênica por PCR em tempo real...55

V. DISCUSSÃO... 58

VI. CONCLUSÕES... 75

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 77

VIII. RESUMO... 89

IX. ABSTRACT... 91

(9)

VII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sintomas associados às citopenias ...7

Tabela 2. Principais sinais morfológicos de displasia no sangue periférico e na medula óssea...8

Tabela 3. Formas de tratamento das SMD...9

Tabela 4. Classificação das Síndromes Mielodisplásicas posposta pelo Grupo FAB...11

Tabela 5. Sistema de pontuação prognóstica internacional para SMD ...12

Tabela 6. Classificação das Síndromes Mielodisplásicas posposta pela OMS...14

Tabela 7. Característica dos pacientes com AREB incluídos no estudo...28

Tabela 8. Seqüência dos primers utilizados na validação da expressão dos genes. candidatos e dos genes usados como normalizadores da expressão...41

Tabela 9. Estatística geral da biblioteca SAGE-AREB...45

Tabela 10. Tags (20) mais expressas na biblioteca de AREB...46

Tabela 11. Genes candidatos selecionados para validação...53

Tabela 12. Genes candidatos. Expressão nas bibliotecas Normal e Câncer (AREB) analisadas neste trabalho (PT); expressão global em tecidos normais e tumorais e especifica em MO normal e cancerosa; dados obtidos do CGAP...54

(10)

VIII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Incidência anual das SMD por idade...4

Figura 2. Principais fatores de risco associados com as SMD...5

Figura 3. Modelo de múltiplos passos da patogênese das SMD...17

Figura 4. Porcentagem relativa das anormalidades citogenéticas mais freqüentes nas SMD de novo...17

Figura 5. Representação esquemática geral da metodologia SAGE...23

Figura 6. Esquema de trabalho do presente estudo...29

Figura 7. Foto de um dos géis de agarose a 1% utilizado para verificação da qualidade do RNA total...30

Figura 8. Foto de um gel de agarose que mostra o resultado da síntese de cDNA...32

Figura 9. Foto de um gel de produtos de PCR usando primers específicos para os genes GAPDH e EEF1A1...32

Figura 10. Verificação da ligação dos adaptadores...33

Figura 11. Amplificação dos ditags nas diluições 1/20, 1/40 e 1/80...34

Figura 12. Foto do gel com produtos precipitados da amplificação em grande escala....34

Figura 13. Foto de um gel de poliacrilamida que mostra os produtos da digestão enzimática...35

Figura 14. Foto de um gel de poliacrilamida dos concatâmeros para isolamento dos fragmentos a serem clonados...36

Figura 15. Foto do gel feito para análise da transformação das bactérias por PCR...36

Figure 16. Classificação funcional dos genes expressos na biblioteca AREB... 47

Figura 17. Diagrama de Venn com o numero de tags exclusivos de cada biblioteca e comum às duas bibliotecas...48

Figura 18. Comparação entre as bibliotecas SAGE de MO com AREB (pool AREB) e de medula óssea normal (pool Normal)...48

Figura 19. Lista de alguns tags (TAG) com expressão diferencial identificadas pelo programa H2G...49

Figura 20. Perfil funcional dos genes das bibliotecas AREB e normal...51

Figura 21. Classificação funcional dos genes hipo-expressos em AREB...51

Figure 22. Clasificação funcional dos genes hiper-expressos em AREB...52

(11)

IX

LISTA DE ABREVIATURAS

AR: anemia refrataria

AREB: Anemia refratária com excesso de blastos AREB-t: AREB em transformação

ARSA: Anemia refratária com sideroblastos em anel CGAP: Cancer Genome Anatomy Project

CsA: Ciclosporina A CT: Cycle threshold

FAB: Grupo de Estudo Franco-Americano-Britanico GAT: Globulina antitimocítica

IPSS: Internacional Prognostic Score Systems

LMA: Leucemia mieloide aguda

LMMC: Leucemia Mielomonocítica Crônica

MILE: Microarray innovations in leukemia

MO: Medula óssea

OMS: Organização Mundial da Saúde SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

SEERS: Surveillance, Epidemiology and End Results

(12)

1

(13)

Introdução 2

I. 1 Aspectos gerais das Síndromes Mielodisplásicas

As Síndromes Mielodisplásicas (SMD) compreendem um grupo heterogêneo de doenças clonais das células tronco hematopoéticas caracterizadas por hematopoese ineficaz, displasia de múltiplas linhagens, citopenias periféricas e susceptibilidade à transformação leucêmica (NISHINO; CHANG, 2005).

Alterações na proliferação, maturação e apoptose das células tronco hematopoéticas provocam hematopoese ineficaz, uma condição na qual a medula óssea (MO) é incapaz de produzir e liberar um número adequado de células maduras para o sangue periférico (YOSHIDA, 2007; HELLSTRÖM-LINDBERG; MALCOVATI, 2008) .

As conseqüências da deficiência medular são as citopenias periféricas, que freqüentemente envolvem as três linhagens de células sanguíneas (eritróide, granulocítica e megacariocítica) e provocam graus variáveis de anemia, neutropenia e trombocitopenia (ECONOMOPOULOU et al., 2008). As citopenias do sangue periférico em combinação com MO hipercelular e displásica são achados característicos das SMD (HOFMANN; KOEFFLER, 2005). As citopenias podem levar à dependência de transfusões e aumentar a susceptibilidade a infecções e hemorragias (FENAUX, 2004).

(14)

Introdução 3

pouco conhecidos (PLATZBECKER; MEREDYTH-STEWART; EHNINGER, 2007).

Estas doenças já receberam diversas denominações, como anemia refratária (1941), pré-leucemia (1953), anemia refratária com sideroblastos em anel (1956) e leucemia mielomonocitica (1970) (LORAND-METZE, 2005). A descrição mais apropriada, Síndrome Meielodisplásica, foi adotada em 1976, pelo Grupo de Estudo Franco-Americano-Britanico (FAB).

I. 2 Incidência

As SMD são consideradas doenças de pessoas idosas, pois aproximadamente 80% dos pacientes possuem mais de 60 anos ao diagnóstico (STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008). São raras na infância, sendo observadas em menos de 5% das neoplasias hematológicas que acometem pacientes com menos de 14 anos de idade (HASLE et al., 2003).

As SMD estão entre as doenças hematológicas mais comuns na população idosa, porém, as mudanças na classificação, os critérios inconsistentes de diagnóstico, a falta de inclusão nos registros populacionais e a resistência de alguns médicos em coletar MO de idosos, compromete a fidelidade dos dados e dificulta o estabelecimento da incidência, além da comparação entre as diferentes freqüências populacionais (GERMING et al., 2008; STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008).

(15)

Introdução 4

Um estudo recente realizado nos Estados Unidos relatou uma incidência anual de 5,4 a 36,2/100.000 em pessoas entre 60 e 84 anos. Segundo os autores, 86,4% dos pacientes diagnosticados tinham mais de 60 anos e apenas 6% menos de 50 anos (MA et al., 2007). De acordo com dados do programa americano SEERS

(Surveillance, Epidemiology and End Results), cerca de 12.000 e 20.000 pacientes

com SMD são diagnosticados por ano nos Estados Unidos e na Comunidade Européia, respectivamente. Estes dados indicam que existe um número significativamente maior de casos de SMD do que de leucemias agudas e de doenças mieloproliferativas (GERMING et al., 2008; STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008).

A incidência anual das SMD no Brasil não é conhecida (PALLOTA; AZAVEDO, 2004). Particularmente no Serviço de Hematologia e Hemoterapia do Hospital de Base de São José do Rio Preto – SP são atendidos aproximadamente 10 pacientes por ano (RICCI Jr., comunicação pessoal).

(16)

Introdução 5

I. 3 Etiologia e fatores de risco

A maioria dos casos (80 a 90%) de SMD são eventos de novo (SMD primarias) e 10 a 20% são secundários (AA&MDSIF; FOUNDATION, 2005).

A etiologia das SMD primárias não esta bem esclarecida, mas a exposição ambiental ou ocupacional a vários agentes, como solventes orgânicos, metais pesados e pesticidas, além do tratamento de outras doenças com quimioterapia e radioterapia, são fatores etiológicos reconhecidos nas secundárias (NISSE et al., 2001; STROM et al., 2005; CORTES; LIST; KANTARJIAN, 2007). A Figura 2 resume os principais fatores de risco que já foram associados com as SMD (LEONE

et al., 2007).

O uso da quimio e/ou radioterapia tem melhorado a sobrevida de pacientes com câncer, no entanto, estes tratamentos têm como efeito colateral a indução de

(17)

Introdução 6

SMD-t (SMD relacionada a terapia) (STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008). Os casos de SMD-t estão fortemente associados com a exposição a agentes alquilantes, inibidores da topoisomerase II e radiação (LEONE et al., 2007). Os pacientes com SMD-t geralmente são mais jovens que os pacientes com SMD de novo, apresentam citopenias mais severas, displasia de medula mais pronunciada, fibrose de medula, elevada incidência de anormalidades cariotípicas clonais e curso clínico desfavorável (STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008). O risco de desenvolver SMD-t para pacientes tratados com quimio e/ou radioterapia é de 2 a 10% (AA&MDSIF; FOUNDATION, 2005; COREY et al., 2007).

A exposição a solventes orgânicos, incluindo o benzeno, tabaco, álcool e radiação tem sido associada com o risco aumentado de desenvolver SMD secundária (STROM; VELEZ-BRAVO; ESTEY, 2008; JADERSTEN; HELLSTROM-LINDBERG, 2009).

A exposição prolongada ao benzeno e derivados aumenta o risco em 5 a 20 vezes. O tabaco contém agentes carcinogênicos conhecidos derivados do benzeno e nitrosaminas e vários estudos têm demonstrado um aumento da incidência de SMD e leucemia mieloide aguda (LMA) em fumantes (LORAND-METZE, 2005).

I. 4 Aspectos clínicos e tratamento

(18)

Introdução 7

acentuada diminuição da qualidade de vida, provocadas por sintomas associados às citopenias (Tabela 1) (HEANEY; GOLDE, 1999; HOFMANN; KOEFFLER, 2005).

Uma das maiores causas de morbidade das SMD é a anemia, observada em 90% dos pacientes (HELLSTRÖM-LINDBERG; MALCOVATI, 2008). Outras citopenias podem estar presentes e resultar em um quadro mais grave. A neutropenia e a plaquetopenia (presentes em 40 a 60% dos casos) aumentam a incidência de infecções e complicações hemorrágicas (GERMING; STRUPP; GIAGOUNIDIS, 2007). Estas, associadas à sobrecarga de ferro e transformação leucêmica, são as principais causas de óbito dos pacientes com SMD (GANSER; MORGAN; WEISSINGER, 2007).

Na análise hematológica, as citopenia(s) periféricas frequentemente coexistem com MO normo ou hipercelular porém, um pequeno grupo de pacientes pode apresentar MO hipocelular. No exame da MO também podem ser observadas mudanças displásicas nas células diferenciadas ou em suas precursoras. Os núcleos

Tabela 1. Sintomas associados as citopenias.

Citopenias Sintomas

Anemia

Fatiga Palidez Astenia

Intolerância a exercícios físicos Palpitações

Angina peitoral

Insuficiência cardíaca e tonturas

Plaquetopenia

Hematomas Petéquias

Púrpura

Sangramento nasal e gengival

(19)

Introdução 8

apresentam características anormais e os grânulos citoplasmáticos podem estar ausentes ou aumentados (COREY et al., 2007). Os principais sinais morfológicos de displasia, observadas no sangue periférico e na MO estão resumidas na Tabelas 2,

(GERMING et al., 2008).

Tabela 2. Principais sinais morfológicos de displasia no sangue periférico e na medula óssea (GERMING et al., 2008).

Sinais no sangue periférico

Células pseudo-Pelger, blastos e leucócitos hipo/degranulados. Plaquetas gigantes e anisometria de plaquetas.

Anisocitosis, poiquilocitose, hemáceas dismórficas, policromasia, hipocromasia, megalócitos, precursores eritróides nucleados, ovalócitos, fragmentócitos e células em forma de gota.

Sinais na medula óssea Diseritropiese

Porcentagem de eritropoiese, mudanças megaloblastóides, multinuclearidade, pontes nucleares, mitose atípica, citoplasma anormal, sideroblastose e sideroblastos em anel.

Dismegacariopoiese

Micromegacariócitos, megacariócitos mononucleares e megacariócitos hipersegmentados com nucléolos múltiplos.

Disgranulopoiese

Hiperplasia da granulopoiese, bastonetes de Auer, promielócitos ou mielócitos hipo/degranulados, células pseudo-Pelger, granulócitos com anormalidades nucleares (hipersegmentação), defeitos de peroxidase e porcentagem de monócitos.

(20)

Introdução 9

(KOPPEL; SCHILLER, 2008; NIMER, 2008; KASNER; LUGER, 2009), algumas apresentadas na Tabela 3.

Nos pacientes mais jovens com doador compatível, o transplante alogênico de medula óssea é o único tratamento com potencial de cura (KASNER; LUGER, 2009). Com o uso de terapia de condicionamento não-mieloablativa, que é menos tóxica, foi possível aumentar a idade de indicação ao transplante porém, apenas 30% dos pacientes com SMD têm menos de 70 anos e 20% a 30% possuem doador compatível. Assim, menos de 10% dos pacientes podem ser favorecidos por esta modalidade terapêutica (LORAND-METZE, 2005; SHADDUCK et al., 2007).

Pacientes em risco baixo, especialmente com anemia refratária (AR) e anemia refratária com sideroblastos em anel (ARSA), são tratados apenas com medidas paliativas. Estas medidas podem melhorar a qualidade de vida e diminuir o número

Tabela 3. Formas de tratamento das SMD.

Suporte: transfusões e antibióticos.

Fatores de crescimento hematopoéticos: eritropoetina (EPO), darbapoetina, fatores de estimulação de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)

Terapia de modificação da transcrição: agentes hipometilantes (5-azacitidine*, decitabine*) e inibidores de histonas desasetilases♦_.

Agentes imunossupressores: lenalinomide*, CsA, GAT e talidomida.

Quimioterapia: baixa dose (citarabine) e intensiva (como usada em LMA - citabirina + antraciclina).

Transplante alogênico de células sanguíneas ou de MO (raramente transplante autólogo de células sanguíneas)

(21)

Introdução 10

de complicações, no entanto, não influenciam a sobrevida dos pacientes (HOFMANN; KOEFFLER, 2005).

A quimioterapia é recomendada para os indivíduos em bom estado geral, com blastos medulares acima de 10%, já que neles a probabilidade de transformação leucemia é alta e a sobrevida, com medidas paliativas, é muito curta. Este tratamento é similar ao usado na LMA, mas os resultados tem sido menos significativos (LORAND-METZE, 2005; SLOAND, 2008).

I. 3 Classificação morfológica

Vários sistemas de classificação têm sido desenvolvidos com o objetivo de predizer a sobrevida ou a transição para LMA após o diagnóstico de SMD. A primeira classificação foi proposta pelo Grupo FAB, em 1982 (MUFTI et al., 2008). De acordo com ela, os pacientes eram diagnosticados com SMD quando apresentavam MO displásica e/ou com 5 a 30% de mieloblastos.

Com base no percentual de blastos presentes no sangue periférico (SP) e na MO, na presença de sideroblastos em anel na MO e no número de monócitos circulantes no SP, foram diferenciados cinco subtipos: anemia refrataria (AR), AR com sideroblastos em anel (ARSA), AR com excesso de blastos (AREB), AREB em transformação (AREB-t) e Leucemia Mielomonocítica Crônica (LMMC) (BENNETT et al., 1982). A classificação e os critérios utilizados estão apresentados na Tabela 4.

(22)

Introdução 11

subgrupo era muito variável para se estimar a sobrevida ou o risco de transformação para LMA (MALCOVATI; DELLA PORTA; CAZZOLA, 2006; MUFTI et al., 2008).

Tabela 4. Classificação das Síndromes Mielodisplásicas posposta pelo Grupo FAB.

Subtipo Morfológico Periférico Sangue

(% de blastos)

Medula Óssea

(% de blastos) Diagnostico (%)

Anemia refratária (AR) ≤ 1% _{< 15% sideroblastos em}< 5%

anel

10-40

Anemia refratária com sideroblastos em anel

(ARSA)

≤ 1% < 5%

≥ 15% sideroblastos em

anel

10-35

Anemia refratária com excesso de blastos

(AREB)

< 5% 5-19% 25-30

Anemia refratária com excesso de blastos em transformação (AREBt)

≥ 5% ou presença

de bastonetes de Auer

20-29% ou presença de

bastonetes de Auer 10-30

Leucemia mielomonocítica crônica

(LMMC)

< 5% e

> 1.000/ul monócitos

≤ 20% 10-20

Com o objetivo de estratificar os grupos de risco em relação à sobrevida global e tendência a evolução para LMA, em 1997 foi desenvolvido um novo sistema de classificação, o sistema IPSS (Internacional Prognostic Score Systems– IPSS) (GREENBERG et al., 1997).

(23)

Introdução 12

obtido pela somatória dos valores individuais das três variáveis. Como resultado, os pacientes são estratificados em quatro grupos de risco: baixo (pontuação 0), Intermediário-I (pontuação de 0,5-1), intermediário-II (pontuação de 1.5-2) e elevado (pontuação > 2) (Tabela 5). Os quatro grupos mostras diferenças significativas na sobrevida global e no risco de transformação para LMA. A sobrevida media varia de 5,7 anos para pacientes de baixo risco a 0,4 anos para pacientes de risco elevado (GALANOPOULOS, 2004; MALCOVATI; NIMER, 2008).

Tabela 5. Sistema de pontuação prognóstica internacional para SMD

Valores de sobrevidas e tempo de evolução para LMA

Variável

prognostica 0 0,5 1 1,5 Blastos na MO <5 5-10 - 11-20

Cariótipo* Bom Intermediário Pobre -

Citopenias** 0 ou 1 2 or 3 - -

Categorias de risco IPSS

Baixo Intermediário I Intermediário II Elevado Valor IPSS 0 0.5-1.0 1.5-20. ≥ 2.5

Sobrevida media (anos) 5.7 3.5 1.2 0.4 Freqüência de evolução

para LMA (%) 19 30 33 45 Intervalo médio de

25% de evolução para LMA (anos)

9.4 3.3 1.1 0.2

* Bom= normal ou –Y, del(5q), del(20q); Intermediário = outras anormalidades; Pobre = complexos (3 anormalidades)

(24)

Introdução 13

Em 1999, um comitê da Organização Mundial da Saúde (OMS), propôs modificações na classificação FAB original para melhorar o valor prognóstico, e incorporou características biológicas e genéticas (BENNETT, 2000; JAFFE et al., 2001). Nesta classificação, a porcentagem de blastos na MO utilizada para separar SMD de LMA foi mudada de 30 para 20 %. Foram excluídos os subtipos AREB-t e LMMC; este último foi considerado um quadro intermediário entre SMD e síndromes mieloproliferativas, junto com a leucemia mielomonocítica juvenil e a leucemia mielóide crônica atípica. Também, foi criado o subtipo citopenia refrataria com displasia multilinear (RCMD), com maior grau de insuficiência medular e curso mais agressivo. A síndrome 5q- foi definida como um novo subtipo e a AREB foi dividida em 1 e 2, de acordo com a porcentagem de blastos na MO (BENNETT, 2000, 2005).

(25)

Introdução 14

Tabela 6. Classificação das Síndromes Mielodisplásicas posposta pela OMS.

Subtipo de SMD Sangue periférico Medula Óssea

Citopenia refrataria com displasia uni-linhagem

(CRUD) Anemia refrataria (AR) Neutropenia refrataria (NR)

Trombocitopenia refrataria (TR)

.unicitopenia ou bicitopeniaa

.blastos ausêntes ou raros (<1%)

.displasia uni-linhagem . ≥10% das celulas das

linhagens afetadas são displásicas

.< 5% de blastos .< 15% dos precursores

eritroides com sideroblastos em anel

Anemia refrataria com sideroblastos em anel

(ARSA)

.anemia

.asência de blastos

.displasia eritróide isolada .< 5% de blastos

.≥ 15% de sideroblastos em

anel

Citopenia refrataria com displasia de multi-linhagem

(RCMD)

.citopenia(s)

.ausência ou <1% de blastos;

.ausência de bastonetes de Auer

.< 1000/ul de monócitos

.displasia em ≥ 10% das

células de duas ou mais linhagens mieloides; .< 5% de blastos;

.±15% de sideroblastos em

anel Anemia refrataria com

excesso de blastos 1(AREB-1)

.citopenias .< 5% de blastos .ausência de bastonetes

de Auer .< 1000/ul de monócitos

.displasia de uni ou multi-linhagem

.5%-9% de blastos .ausência de bastonetes de Auer

Anemia refrataria com excesso de blastos 2

(AREB-2)

.citopenias

.5%-19% de blastos .presença ou ausência

de bastonetes de Auer .< 1000/ul de

monócitos

.displasia de uni ou multilinear .10%-19% de blastos

.presença de bastonetes de Auerb

SMD associada com (del)5q isolada

.anemia

.blastos ausentes ou raros (<1%)

.contagem de plaquetas normal ou aumentada

.megacariocitos normais ou aumentados com núcleos hipolobulados

.< 5% blastos

.deleção de 5q isolada

a_{Bicitopenia pode ser observada ocasionalmente. Casos com pancitopenia devem ser classificados como}

SMD-U. b _{Se os critérios diagnósticos para SMD são cumpridos e bastonetes de Auer estão presentes, o}

(26)

Introdução 15

No mesmo ano, o Grupo Internacional de Trabalho em Morfologia de SMD (IWGM-MDS) realizou uma revisão das características morfológicas da MO para todos os subtipos de SMD e apresentou uma série de recomendações para a definição e enumeração de blastos e sideroblastos em anel (MUFTI et al., 2008).

Recentemente, o programa de investigação internacional e multi-institucional

Microarray Innovations in Leukemia (MILE) (ELN, www.leukemia-net.org)

investigou a utilidade clinica do perfil de expressão gênica obtidas por microarray no diagnóstico e sub-classificação de leucemias agudas e crônicas. O modelo de classificação diagnóstico desenvolvido e avaliado pelo MILE, também foi desenhado para distinguir leucemia de SMD e outras condições não leucêmicas. Este modelo provou ser muito preciso para a classificação das leucemias, no entanto, só confirmou 50% dos pacientes com diagnóstico clinico de SMD (MILLS et al., 2009).

I. 4 Anemia refrataria com excesso de blastos (AREB)

O subtipo anemia refrataria com excesso de blastos (AREB) criado pelo grupo FAB representa de 25 a 30% das SMD diagnosticadas e inclui pacientes com 5 a 19% de blastos na MO e menos de 5% de blastos no sangue periférico (BENNETT

et al., 1982). Mudanças displásicas nas três linhagens hematopoéticas e citopenias de

pelo menos dois tipos de células sanguíneas são achados frequentes neste subtipo (AA&MDSIF; FOUNDATION, 2005; NISHINO; CHANG, 2005).

(27)

Introdução 16

de evolução, provavelmente devido a variação no percentual de blastos (BRECCIA

et al., 2009). Mesmo assim, AREB é considerada um subtipo de risco alto no sistema

IPSS de classificação (MA et al., 2007; SHADDUCK et al., 2007).

Com a nova classificação da OMS, a subdivisão em AREB-1 e AREB-2 melhorou o valor prognóstico (GERMING et al., 2006; BRECCIA et al., 2009).

I. 6 Patogênese e evolução

Cerca de 30 a 40% dos pacientes em estágios iniciais de SMD sofrem progressão para AREB e subseqüentemente para LMA, especialmente aqueles com cariótipo desfavorável (MANO, 2006).

(28)

Introdução 17

PLATZBECKER; MEREDYTH-STEWART; EHNINGER, 2007; NOLTE; HOFMANN, 2008; JIANG et al., 2009).

Injuria: Químicos Radiação (Idade)

Célula tronco normal

Alterações iniciais: Ciclo celular Transcrição

Estagio inicial de SMD

Estagio avançado de SMD

LMA Alterações adicionais:

Hipermetilação Supressores de tumor

Oncoproteínas

Apoptose aumentada Diferenciação prejudicada

Hematopoese displásica Citopenias periféricas Sem expansão de blastos

PROGRESSÃO

Apoptose diminuída Diferenciação prejudicada

Aumento da proliferação

Hematopoese displásica Citopenias periféricas

Expansão de blastos Injuria:

Químicos Radiação (Idade)

Célula tronco normal

Alterações iniciais: Ciclo celular Transcrição

Estagio inicial de SMD

Estagio avançado de SMD

LMA Alterações adicionais:

Hipermetilação Supressores de tumor

Oncoproteínas

Apoptose aumentada Diferenciação prejudicada

Hematopoese displásica Citopenias periféricas Sem expansão de blastos

PROGRESSÃO

Apoptose diminuída Diferenciação prejudicada

Aumento da proliferação

Hematopoese displásica Citopenias periféricas

Expansão de blastos

I. 7 Aspectos citogenéticos e moleculares

As aberrações cromossômicas são freqüentes nas SMD. Ocorrem em cerca de 40 a 50% dos casos novos e em mais de 80 % das formas secundárias às terapias (SMD-t). Portanto, cerca de 50% dos casos novos podem apresentar cariótipo normal (LOOK, 2005). As aberrações variam com o subtipo de SMD, sendo mais frequentes nas de maior risco e nas SMD-t. A frequência das anormalidades cromossômicas entre os diferentes subtipos de SMD varia de 10% para ARSA até 50% para AREB (BENNETT; KOMROKJI, 2005).

(29)

Introdução 18

Anormalidades cromossômicas balanceadas, como translocações recíprocas, inversões e inserções, são raras nas SMD, que geralmente apresentam alterações desbalanceadas, como deleções e monossomias (HAASE, 2008). As deleções parciais ou totais dos cromossomos 5, 7, 11, 17, 20 e Y, além da trissomia do 8, são as anomalias citogenéticas mais frequentemente relatadas (OLNEY; LE BEAU, 2001; HOFMANN; KOEFFLER, 2005; CHERIAN; BAGG, 2006). A Figura 4 mostra as principais alterações encontradas nas SMD.

De acordo com os grupos de risco definidos pela classificação IPSS, as alterações 5q-, -Y e 20q- estão associadas com prognóstico favorável quando ocorrem isoladamente. Contudo, a deleção parcial ou completa do cromossomo 7 e os cariótipos complexos, que envolvem mais de três alterações, apresentam prognóstico desfavorável ou risco elevado de evolução para leucemia aguda. Todas as demais anormalidades, incluindo a trissomia do cromossomo 8, são consideradas de risco intermediário (SHADDUCK et al., 2007; HAASE, 2008).

(30)

Introdução 19

Não foram relatadas alterações citogenéticas características de AREB, que podem apresentar cariótipo normal em até 60% dos casos. Técnicas mais sensíveis como fluorescence in situ hibridation (FISH) mostraram que uma minoria dos pacientes com cariótipo normal pode ser portador de um defeito cromossômico submicroscópico (FENAUX; MOREL; LAI, 1996). Um estudo recente mostrou que 46 e 50% dos pacientes com AREB-I e AREB-II, respectivamente, apresentavam cariótipo normal. Entre as alterações observadas as mais freqüentes foram as complexas, seguidas pela del de d -5p e pela trissomia do cromosomo 8 (SHADDUCK et al., 2007; HAASE, 2008).

Numerosos genes, com diferentes funções, têm sido implicados na patogênese molecular da SMD. Entre eles são descritos oncongenes (RA e, FMS), genes reguladores do ciclo celular (P15, EVI-1, CHK2, P53 e ,MLL), genes de apoptose

(BCL-2, C-MY e, P53), fatores de crescimento e angiogênese (VEGF, Angiogenina,

Angiotropin e, Angiopoetina), receptor tirosina quinase (FTL3), genes envolvidos na

regulação da metilação do DNA e desacetilaçao de histonas, além de genes de citocinas imunomoduladoras (TNF-

α

, TGF-

β,

IL-1

β,

RIP e TRAIL) (GYULAI et al., 2005; NISHINO; CHANG, 2005; BOULTWOOD; WAINSCOAT, 2007; JIANG et al., 2009).

(31)

Introdução 20

Nos últimos anos, a elevada quantidade de dados gerados pelo Projeto Genoma Humano permitiu a análise da expressão gênica nas SMD e facilitou a identificação de genes novos (MANO, 2006).

Um dos primeiros estudos em SMD, com uso de microarray, comparou o perfil de expressão gênica entre indivíduos saudáveis e pacientes com SMD de vários subtipos, de risco baixo e alto. Com a utilização de um método estatístico de predição de associação de classes foram identificados 11 genes (TACST2, UQCRC1,

TNNC1, KDELR, CLC, H-PKL, RGS19, ATF3, FARP1, GNG7 e TPD52L2) com

expressão característica em cada um dos grupos analisados (HOFMANN et al., 2002). Embora o número de indivíduos analisados tenha sido pequeno, os dados reforçaram a hipótese de que cada estado da doença possui um perfil de expressão gênica característico ou “assinatura molecular” (MANO, 2006).

Outro estudo, também com microarray, comparou o perfil de expressão gênica entre diferentes estágios de SMD e identificou 11 outros genes (MAGEA8,

COX7A1, COX6A2, HSPB3, COX62, PSMD10, IL1R2, NDUFV1, SCN5A, LH2 e

PNAMA2) específicos dos estados tardios (AREB e LMA pós SMD), além de outros

seis (SLC7A7, ABCB2, PIASy, PAX4, NR4A2 e PIASx-

β

) específicos dos estágios

iniciais (controles sadios e AR). Porém, só a perda da expressão do gene PIASy foi relacionada pelos autores com a progressão de estado e evolução para LMA (UEDA

et al., 2003).

(32)

Introdução 21

A analise do perfil de expressão gênica de células CD34+ de pacientes com a síndrome 5q- mostrou que o gene SPARC e outros, localizados na região comumente perdida do cromossomo 5, podem estar envolvidos na patogênese da síndrome (BOULTWOOD et al., 2007).

Além disto, a expressão diferencial dos genes BMI-1, WT1 e LEF1 também foi observada em SMD. Os genes BMI-1 e WT1 apresentaram expressão aumentada nos subtipos mais graves da doença e o gene LEF1 foi identificado como hipo-expresso na síndrome 5q-. BMI-1 foi proposto como marcador de progressão e prognostico, enquanto LEF1 de progressão e sobrevida (HUANG; JIN; XU, 2006; MIHARA et al., 2006; PELLAGATTI et al., 2009).

Não há dúvidas que a aplicação da tecnologia de cDNA microarray permitiu analisar o perfil da expressão gênica e facilitou a identificação de genes associados com as SMD. Contudo, os resultados são limitados, a maioria dos estudos inclui amostras com diferentes subtipos de SMD e não um especificamente. Além disto, não há descrições de alterações gênicas especificamente observadas em AREB. Portanto, é necessária a aplicação de novas estratégias de estudo do genoma na investigação da patogênese molecular das SMD (NISHINO; CHANG, 2005).

I. 8 Análise serial da expressão gênica (SAGE)

(33)

Introdução 22

utilizados para analisar a expressão gênica global é o SAGE (Serial Analysis of Gene

Expression) (DINEL et al., 2005).

O metodo de SAGE foi desenvolvido por Valculesco et al. (1995) como um ferramenta para determinar quantitativamente o nível de expressão de todos os transcritos expressos em qualquer tipo celular ou estado biológico (HERMEKING, 2003; PORTER; YAO; POLYAK, 2006). O metodo baseia-se em três afirmações:

(1)Uma sequência pequena de cDNA (9-14pb) derivada de uma posição especifica de cada RNAm é suficiente para identificar um transcrito - esta sequência curta é chamada de “tag” ou “etiqueta”;

(2)As tags podem ser ligadas entre si para formar sequências longas de DNA

(concatâmeros) que são clonados e sequenciados;

(3)O nível de expressão de cada transcrito é determinado pelo número de vezes que a tag que o identifica é observada.

A coleção de tags derivadas de uma célula ou tecido compõe uma “Biblioteca SAGE”. A Figura 5 mostra um esquema geral do SAGE.

(34)

Introdução 23

Figura 5. Representação esquemática geral do método de SAGE. O perfil de expressão é determinado das celulas de interese pela captura inicial do RNAm usando esferas magneticas ligadas a oligos-dT e a posterior síntese de cDNA. A enzima de ancoragem

(35)

24

(36)

Objetivos 25

II. 1 Objetivo geral

Investigar a expressão gênica das células da MO de pacientes com AREB, com o objetivo de identificar genes envolvidos na origem e evolução da doença.

II. 2 Objetivos específicos

1. Obter o perfil global de expressão gênica das células da MO de indivíduos com SMD do subtipo AREB, ao diagnóstico, pelométodo de SAGE;

2. Obter a primeira biblioteca SAGE para AREB;

3. Comparar o perfil de expressão gênica obtido com a expressão gênica da MO de indivíduos normais de um banco de dados já existente, para identificar genes diferencialmente expressos com a utilização de ferramentas de bioinformática;

4. Selecionar genes com expressão diferencial, com base em sua função celular para validação;

5. Validar a expressão dos genes selecionados por PCR em tempo real em todas nas amostras coletadas ao diagnostico e analiza-las nas amostras dos mesmos pacientes, coletados seis meses após o diagnostico;

(37)

26

(38)

Material e Métodos 27

III. 1 Casuística

No período de julho de 2006 a julho de 2007, após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do IBILCE-UNESP, (CAAE – 0001.0.229.000-06) e obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO 1), foram coletadas amostras de MO de 17 pacientes atendidos no Ambulatório de Hematologia e Hemoterapia do Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP/FUMFARME), com hipótese diagnóstica de SMD. Após a coleta, uma parte (0,2ml) da amostra foi encaminhada ao Hemocentro da mesma instituição para avaliação laboratorial de rotina. Outra parte (1-1,5ml) foi enviada ao Laboratório de Genética (FAMERP/FUMFARME) para estudo citogenético e uma terceira (3-5ml) foi destinada a este estudo.

Dos 17 pacientes cujas amostras foram coletadas, seis foram confirmados por hematologistas, de acordo com os critérios da OMS, com o diagnóstico de SMD do subtipo Anemia Refrataria com Excesso de Blastos (AREB) e suas amostras foram incluídas neste estudo. Tais amostras, obtidas de três homens e três mulheres, com idades entre 26 a 68 anos (média de 52 anos) apresentaram cariótipo normal na analise citogenética. A Tabela 7 mostra os dados dos pacientes. Os dados hematológicos mostrados foram derivados da análise do mielograma e hemograma ao diagnóstico.

(39)

diagnóstico e após seis meses, o paciente 5 foi submetido a tratamento com quimioterápico (cinco sessões com Citarabina e Daunorubicina) e fator estimulante de colônias granulocítica (G-CSF), e o paciente 4 foi tratado com transfusão mensal de concentrado de hemácias.

Tabela 7. Característica dos pacientes com AREB incluídos no estudo.

N Idade _(a) Sexo Cariótipo _(MO) Celularidade da MO (m) Blastos na MO (%) Hb (h) (g/dl) RBC (h)

(x 1012_/L)

WB (h)

(x 109_/L)

Plaquetas (h)

(x 109_/L)

1 66 M 46,XY Hiper 10 13.3 5.12 1.4 139

2 26 F 46,XX Normo 18 9.0 2.64 4.3 89

3 35 F 46,XX Hiper 8 13.4 4.33 3.5 110

4 60 F 46,XX Hiper 10 9.1 2.9 4.0 565

5 68 M 46,XY Hiper 20 8.1 2.96 4.9 140

6 55 M 46,XY Hiper 8 14.3 5.04 2.4 93

N= código da amostra; a= anos; M= masculino; F=feminino; MO= medula óssea; m=mielograma; h=hemograma; Hb=hemoglobina; RBC= eritrócitos; WBC= leucócitos.

III. 2 Métodos

(40)

verificar mudanças na expressão nesse período. Um esquema resumido das etapas realizadas está representado na Figura 6.

Os procedimentos de SAGE e PCR em tempo real foram realizados no Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (Depto. de Genética da FMRP USP/FUNDHERP, Ribeirão Preto – SP) com a colaboração do Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Jr., co-orientador deste trabalho.

III. 2. 1 Processamento das amostras de medula óssea

Imediatamente após a coleta, cada amostra de medula óssea foi transferida da seringa para um tubo de centrífuga de 15ml e centrifugada por 12 minutos a 2.000rpm. Após o descarte do sobrenadante, o pellet foi resuspendido em uma solução de lise de glóbulos vermelhos e mantido em gelo por 15 minutos. Completada a lise, as amostras foram centrifugadas por 8 minutos a 2.000rpm e o

(41)

pellet foi resuspendido novamente em solução de lise e incubado no gelo por 15

minutos. Após nova centrifugação por 8 minutos, o pellet foi lavado duas vezes com PBS 1X e resuspendido em 250ul de PBS e 750ul de Trizol. Após homogeneização, cada amostra foi dividida em dois tubos de 1,5ml e conservada em freezer a –80°C até a extração do RNA.

III. 2. 2 Extração do RNA total e síntese de cDNA

O RNA total foi extraído da MO usando Trizol, de acordo com as instruções do fornecedor (Invitrogen). As amostras foram quantificadas com a utilização de espectrofotômetro (NanoDrop® ND-1000) em comprimento de onda de 260nm. A qualidade das amostras foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%. Foram visualizadas as bandas correspondentes aos RNAs ribossômicos 18S (1,9kb) e 28S (4,5kb). A ocorrência destas bandas indicou que as amostras de RNA total utilizadas apresentaram qualidade adequada (Figura 7). A partir de quantidades iguais de RNA de cada amostra foi gerado um pool de 27μg de RNA total.

Para as análises de validação, 2μg do RNA total extraído de cada amostra foi tratado com DNAse I, segundo as recomendações do fabricante (MBI Fermentas), com o objetivo de degradar todo DNA genômico presente. Após o tratamento com

Figura 7. Foto de um dos géis de agarose a 1% utilizado para verificação da qualidade do RNA total. As setas indicam os RNAs ribossômicos 18S e 28S.

28S

(42)

DNAse I, cada alíquota de RNA foi submetida à transcrição reversa com uso do produto High-Capacity cDNA Archive kit, seguindo as recomendações do fabricante

(Applied Biosystems). Para a síntese de cDNA, a cada alíquota de RNA tratada com

DNAseI foi adicionada água DPEC para um volume final de 50μl e em seguida adicionados 10μl de Tampão (10X), 4μl de dNTPs (25X), 10μl de random primers

(10X), 5μl de MultiScribe™ Reverse Transcriptase (50 U/μL) e 21μl de água DEPC. A solução de reação foi incubada a 25°C por 10 minutos e a 37°C por 120 minutos..

III. 2. 3 Análise serial da expressão gênica (SAGE)

A metodologia do SAGE permite a determinação e quantificação em larga escala dos transcritos de uma amostra sem conhecimento prévio dos genes expressos. Envolve a produção e sequênciamento de um grande número de tags (ou etiquetas) originadas de segmentos da porção 3’ dos RNAm. O número de cópias de uma dada

tag é proporcional ao nível de expressão do RNAm correspondente, o que possibilita a quantificação da expressão gênica em diferentes tecidos e/ou estados biológicos (VELCULESCU et al., 1995), sem conhecimento prévio ou indicação do que pode ser observado, motivo pelo qual foi a opção deste estudo.

(43)

DNA Polimerase, 5μl de E. coli DNA ligase e 5μl E. coli de Rnase H. A síntese de cDNA foi verificada por PCR com primers para GAPDH e EEF1A1 (Figura 8).

O cDNA foi digerido com a enzima-âncora NlaIII e originou um cDNA com uma extremidade coesiva 5’ e esferas magnéticas ligadas à cauda poliA. A digestão foi verificada pela perda do sítio do primer para amplificação do gene GAPDH

(Figura 9).

Figura 8.Foto de um gel de agarose que mostra o resultado da síntese de cDNA. 1 e 2 = amplificados da GAPDH de células HELA (controle) e do pool-AREB, respectivamente; 3 e 4 = amplificados de EE1A1 de células HELA (controle) de do pool-AREB, respectivamente; MW = marcador de peso molecular

MW 1 2 3 4

Figura 9.Foto de um gel de produtos de PCR usando primers

específicos para os genes GAPDH (1) e EEF1A1 (3). Após a digestão, um dos sítios de ligação do primer de

GAPDH é perdido (2), enquanto os sítios para

EEF1A1 continuam intactos (4). MW: marcador de

(44)

O cDNA foi dividido em duas alíquotas iguais e cada uma foi ligada a um adaptador (sequência de 40pb com extremidades coesivas complementares ao sítio da enzima NlaIII) diferente, A ou B, com uso de 10U de T4 DNA ligase. A ligação dos adaptadores foi verificada por PCR com primers específicos para cada adaptador, DTP1 para o adaptador A e DTP2 para o adaptador B, e o primer

antisense EF (Figura 10). Os adaptadores possuem um sítio de reconhecimento para

a enzima de restrição BsmFI e sítios alvo dos primers usados na posterior amplificação das ditags.

As alíquotas ligadas aos adaptadores A e B foram digeridas com a BsmFI e o resultado da digestão foi verificado por PCR. Esta enzima corta o cDNA 10-14pb distante do seu sitio de ligação. A digestão libera a cauda poli-A do cDNA e a esfera magnética, originando uma fita de aproximadamente 50pb com uma extremidade 5’ coesiva. Nesta fase a tag consiste em 40pb da seqüência do adaptador e 10-14pb da

tag propriamente dita. A extremidade 5’ coesiva foi posteriormente preenchida com o uso da polimerase Klenow.

Figura 10. Verificação da ligação dos adaptadores. A foto do gel mostra os poços 1 e 3 que correspondem ao produto de PCR com os pares de primers corretos, DTP-1 no pool A e DTP-2 no pool B, respectivamente. Os poços 2 e 4, correspondem ao produto de PCR com o conjunto de

primers trocados, DTP-1 no pool B e DTP-2 no pool A,

onde não deve ocorrer amplificação. MW: marcador de peso molecular.

Adaptador A A B B

Primer DTP1 DTP2 DTP2 DTP1

(45)

As tags unidas aos adaptadores A e B foram ligadas entre si para formar as

ditags e, posteriormente, foram amplificadas por PCR em grande escala. Antes da

amplificação, a PCR foi “otimizada” com a utilização de diluições diferentes, 1/20, 1/40 e 1/80 de ditags (Figura 11). Como foi obtida uma boa amplificação nas três diluições, a técnica de PCR em grande escala foi realisada a partir de uma diluição de 1/120 de templado, seguindo as recomendações do fornecedor

Foram realizadas 342 reações de amplificação com primers complementares aos adaptadores A e B. Os amplificados foram combinados em dois tubos de 50ml e purificados com fenol-clorofórmio, etanol, acetato de amônio e glicogênio, e aplicados em nove poços de gel de poliacrilamida (PAGE) 12% (Figura 12).

Figura 11. Amplificação dos ditags nas diluições 1/20 (1), 1/40 (2) e 1/80 (3); controle positivo (4). MW marcador de peso molecular

MW 1 2 3 4

Figura 12. Foto do gel com produtos precipitados da amplificação em grande escala. A banda de 102pb corresponde aos ditags amplificados.

(46)

Após eletroforese, os fragmentos de 102pb foram recortados do gel, purificados em colunas de acetato de celulose, diluídos e novamente precipitadas com etanol, acetato de amônio e glicogênio. Foram, então, digeridos novamente com

NlaIII, para eliminar os adaptadores e obter somente as ditags de 26pb. Os produtos da digestão foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% (Figura 13) e as bandas de 26pb purificadas da forma descrita para os fragmentos de 102pb.

As ditags puras foram ligadas umas às outras e originaram os concatâmeros,

de tamanhos variáveis, (200-1000pb), em função da diferença do número de ditags

unidas. Após eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%, foram purificados os fragmentos de 200 a 500pb, de 500 a 800pb e de 800 a 1000pb (Figura 14).

Os concatâmeros foram inseridos em vetor pZErO-1 (Invitrogen) e clonados em bactérias DH10B por eletroporação. As bactérias foram cultivadas em placas de petri com agar LB Low Salt contendo o antibiótico Zeocin (50mg/mL) e incubadas a 37°C overnigth.

26 pb (ditags)

(47)

Após incubação, as colônias foram transferidas para placas de cultura de 96 poços contendo meio líquido 2xYT com Zeocin 50mg/mL. A transformação das bactérias foi analisada por PCR usando os primers universais M13. Os insertos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% (Figura 15).

Uma vez confirmada a transformação bacteriana, os clones foram amplificados com a utilização do DYEnamic ET Dye Terminator Sequencing Kit

Figura 14. Foto de um gel de poliacrilamida dos concatâmeros para isolamento dos fragmentos a serem clonados.

300 pb

(48)

(Amesham Biosciences, USA) e sequenciados em sequenciador automático MegaBace 1000 (Amesham Biosciences, USA).

III. 2. 4 Análise da biblioteca SAGE de AREB

As seqüências geradas foram analisadas pelo programa SAGE 2000

(Invitrogen). Este programa analisa as sequências geradas no sequênciamento

identificando as tags limitadas por sítios NlaIII e quantificando seu número. A identificação de cada gene e a determinação do cluster de cada tag foi obtida usando

tag-to-gene map do site SAGEmap NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As tags

extraídas foram submetidas ao SAGEmap e o número de acesso correspondente foi obtido com o uso do banco de dados NCBI-GenBank para H. sapiens.

Os genes identificados na biblioteca gerada foram analisados funcionalmente pela ferramenta de enriquecimento funcional FatiGO+ (AL-SHAHROUR et al., 2007). A classificação funcional dos genes hipo e hiper-expessos foi realizadas com a utilização do programa Gene Class Expression (PEREIRA et al., 2006).

Para a análise comparativa das bibliotecas SAGE AREB e normal foram utilizados os programas H2G (Hyper and Hypoexpressed Genes) e ProFAST

(49)

III. 2. 5 Seleção dos genes para validação

A seleção de genes para validação foi feita com base nos seguintes aspectos: 1) razão de expressão do gene; 2) envolvimento etiológico já descrito em neoplasias malignas humanas com uso de testes in vivo e in vitro; 3) disponibilidade de dados do nível de expressão em tecidos normais e tumorais no Monochromatic SAGE/cDNA Virtual Northern do Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) e 4) conhecimento existente sobre os processos celulares no qual o gene participa. Foram, então, selecionados 10 genes: NUMB [Numb homolog (Drosophila)], TXNIP (Thioredoxin interactin

protein), SGPL1 (Sphingosine-1-phosphatase lyase 1), MSH2 [mutS homolog 2,

colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)], FOXO3 (Forkhead box O3), RHOG

[Ras homlog gene family, member G (rho G)], ICAM-3 (Intercellular adhesion

molecule 3), CHI3L1 [Chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)], MIF

[Macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibitor factor)] e

NOTCH1 [Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila)].

III. 2. 6 Validação por PCR em tempo real

(50)

As reações foram preparadas em placas de 96 poços, utilizando o reagente

Power SYBR-Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e o equipamento 7500

Real Time PCR System (Applied Biosystems).

A determinação da intensidade da fluorescência na reação foi feita pelo cálculo do ¨Rn (¨Rn = Rn+-Rn-), onde Rn+ é a intensidade de emissão do

SYBR-Green – intensidade de emissão do ROX em um dado momento da reação e Rn- é a intensidade de emissão do SYBR-Green – intensidade de emissão do ROX antes da amplificação. O composto ROX é utilizado como controle interno passivo, pois a fluorescência que emite tem intensidade constante durante toda a reação, enquanto a intensidade da fluorescência emitida pelo SYBR-Green aumenta à medida que este composto se liga às duplas fitas de DNA. Durante os ciclos iniciais da reação não há acúmulo de produtos de amplificação e os valores de ¨Rn permanecem na linha de

base (a fluorescência do ROX é maior que a emitida pelo SYBR-Green). Na fase logarítmica da reação ocorre o acúmulo dos produtos de amplificação e ¨Rn

ultrapassa a linha de base. Para a quantificação relativa, após a reação foi estabelecido um valor de ¨Rn, que é uma linha de corte (threshold) para cada curva

de amplificação de um dado par de primers, definido acima da fluorescência inespecífica. O número do ciclo em que a ¨Rn da amostra cruza o threshold

corresponde ao cycle threshold (CT) da amostra. O valor de CT representa a quantidade de RNAm alvo presente na amostra.

Os primers utilizados nas reações de amplificação são mostrados na Tabela 8.

Os mesmos foram desenhados com o auxilio do programa Primer3

(51)

alinhamento no banco de dados BLAST, no website do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para evitar a amplificação de DNA contaminante, cada primer do par foi desenhado para se ligar em um exon diferente.

Para a padronização das reações de PCR em tempo real foram feitas diluições seriadas dos cDNAs e calculada a eficiência de amplificação para os genes normalizadores e para os genes-alvo. As reações foram preparadas em triplicata em um volume final de 20μL. As condições da reação para todos os genes avaliados incluiram 10 minutos a 95°C para ativação da polimerase, além de 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e a 60°C por um minuto. O coeficiente máximo de variação permitido entre as triplicatas foi de 1%. Nos casos em que esse valor foi superior, o experimento foi repetido.

(52)

A especificidade dos primers foi avaliada pela curva de dissociação dos produtos de PCR, que pode detectar amplificações inespecíficas, inclusive, a formação de dímeros de primers. Para isso, após a amplificação as amostras foram submetidas a 95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 95°C por 1 minuto. A formação de apenas um pico de fluorescência em uma determinada temperatura, característica observada para todos os primers utilizados, indica a amplificação de um produto específico.

A escolha do gene normalizador utilizado foi feita com o auxílio do programa BestKeeper, disponível no site http://gene-quantification.com/bestkeeper.html.

Tabela 8. Sequência dos primers utilizados na validação da expressão

dos genes candidatos e dos genes usados como normalizadores

da expressão(*).

Genes Pimers

Sequências 5’-3’

Amplificado (pb)

Temperatura de

annealing NUMB ACATTCCTTCTCCCGCTTCT _{TGTCACTGCTTCATGGCTGT} 108 60°C

TXNIP TTCCTGCATGTTCATTCCTG _{CTCAAAGTCAGCATGGATGG} 103 59,5°C

SGPL1 AAAGCAGGATACCCACTGGA _{ACCAATGATGAGCCTTTTGG} 110 60°C

MSH2 TTCATGGCTGAAATGTTGGA _{ATGCTAACCCAAATCCATCG} 118 60°C

FOXO3 CTTCAAGGATAAGGGCGACA _{TCTTGCCAGTTCCCTCATTC} 113 60°C

RHOG GTACGGAGGCGGTCATACTC _{AGTACATCCCCACCGTGTTC} 115 60°C

ICAM3 GCTCGCTGAGGTTCACAATG _{GAGATCGTCTGCAACGTGAC} 100 61°C

CHI3L1 TGCTAATGAAATCCAGGTGTTG _{GAAAAAGCAGCTCCTGCTCA} 104 60,5°C

MIF AGAACCGCTCCTACAGCAAG _{AGTTGTTCCAGCCCACATTG} 120 60,5°C

NOTCH1 GACGCACACTCGTTGATGTT _{TGAATCCAACCCTTGTGTCA} 120 60°C

GAPDH* ACCCACTCCTCCACCTTTGA _{CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT} 100 60°C

HPRT* GAACGTCTTGCTCGAGATGTGA _{TCCAGCAGGTCAGCAAAGAAT} 107 60°C

(53)

Foram testados três potenciais genes normalizadores: TUBA1C, GAPDH e HPRT. O gene GAPDH mostrou-se um normalizador mais eficiente nas amostras de MO.

A quantificação relativa da expressão gênica foi realizada utilizando-se o modelo matemático desenvolvido por Pfaffl (2001). Neste modelo, a taxa de expressão relativa de um determinado gene alvo é calculada com base na eficiência de amplificação da reação e o CT de uma determinada amostra versus uma amostra de referência (ou amostras calibradoras) e expressa em comparação a um gene endógeno ou normalizador (PFAFFL, 2001). Usando este método, os dados são representados como diferenças (em vezes) na expressão gênica, que foi normalizada para um gene endógeno de referência e é relativa a um controle ou calibrador. Em nossos experimentos, o calibrador usado foi o valor da expressão dos genes em células de medula óssea normal.

(54)

43

(55)

Resultados 44

IV.1 Análise global da expressão gênica das bibliotecas de SAGE de AREB

A primeira biblioteca SAGE gerada a partir do RNA da MO dos seis pacientes com AREB, foi denominada SAGE_Bone_Marrow_MDS_RAEB e

depositada no Genome Data Mining Website

(http://gdm.fmrp.usp.br/h2g/library/1153) do Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (FMRP-USP).

Foram sequenciadas 59.459 tags, das quais 16.835 corresponderam a tags

únicas. Entre estas, 11.074 eram de genes conhecidos (anotados) e 5.761 não corresponderam a nenhum gene conhecido, com base nos dados do GenBank. Estas sequências denominadas “no-match” tags representam transcritos ainda não caracterizados. Também foram observadas 229 e 278 tags únicas correspondentes a EST/cDNA e genes de proteínas ribossômicas, respectivamente. A Tabela 9 resume a estatística geral da biblioteca SAGE obtida de células de medula óssea de pacientes com AREB.

(56)

Resultados 45

As 20 tags com maior expressão na biblioteca SAGE da medula óssea de AREB são mostradas na Tabela 10. Oito (40%) delas, corresponderam a genes ribossômicos. No entanto, as duas tags mais expressas corresponderam a genes de proteínas de ligação ao cálcio (S100A8 e S100A9).

Tabela 9. Estatística geral da biblioteca SAGE-AREB.

Origem Ȉ do numero de tags Tags únicas

Total 59.459 16.835

Anotados 50.105 11.074

EST/cDNA 341 229

Ribossômicos 9.126 278

No-matches 9.354 5.761

Distribuição de freqüências

N° tags seqüenciadas (%) N° tags únicas anotadas (%)b

> 200 tags 14.202 (24,0) 33 (0,2)

100-200 tags 5.357 (9,0) 38 (0,2)

20-99 tags 8.918 (15,0) 223 (1,3)

5-19 tags 10.465 (17,5) 1.246 (7,4)

2-4 tags 8,686 (14,5) 3.464 (20,6)

1 tag 11.831 (20,0) 11.831 (70,3)

Total 59.459 (100) 16.835 (100)

(57)

Resultados 46

IV. 2 Análise do perfil funcional da biblioteca de AREB

Com o objetivo de obter informação funcional dos genes identificados na biblioteca AREB, 1924 genes anotados com frequência ≥ 3 foram analisados com a

utilização do o programa FatiGO+. A Figura 16 mostra a distribuição dos genes em 21 (com numero de genes >5%) das 36 categorias funcionais identificadas. Os transcritos mais frequentes corresponderam a genes envolvidos em processos metabólicos básicos, seguidos por processos de regulação, comunicação e biogênese,

Tabela 10. Tags (20) mais expressas na biblioteca de AREB

Tag N° Tags UniGene ID Gene Descrição

1 TACCTGCAGA 2050 Hs.416073 S100A8 S100 calcium binding protein A8

2 GTGGCCACGG 1336 Hs.112405 S100A9 S100 calcium binding protein A9

3 GCCTGCTATT 1089 Hs.380781 DEFA1 Defensin, alpha 1

4 CTTCTTGCCC 656 Hs.654744 HBA2 Hemoglobin, alpha 2

5 GAGGGAGTTT 480 Hs.523463 RPL27A Ribosomal protein L27a

6 GCAAGAAAGT 478 Hs.523443 HBB Hemoglobin, beta

7 GTTGTGGTTA 443 Hs.534255 B2M Beta-2-microglobulin

8 GGATTTGGCC 406 Hs.437594 RPLP2 Ribosomal protein, large, P2

9 GGGCTGGGGT 363 Hs.425125 RPL29 Ribosomal protein L29 10 ATGTAAAAAA 344 Hs.706744 LYZ Lysozyme (renal amyloidosis) 11 TAGGTTGTCT 328 Hs.374596 TPT1 Tumor protein,

translationally-controlled 1

12 CTGGGTTAAT 308 Hs.438429 RPS19 Ribosomal protein S19

13 CCCAACGCGC 302 Hs.654744 HBA2 Hemoglobin, alpha 2 14 GAAATAAAGC 300 Hs.510635 IGHG1 Immunoglobulin heavy constant

gamma 1 (G1m marker) 15 TGCACGTTTT 293 Hs.265174 RPL32 Ribosomal protein L32 16 CCCATCGTCC 289 Hs.559716 - Transcribed locus, moderately

similar to NP_536846.1 cytochrome c oxidase subunit II

[Homo sapiens]

17 ATAATTCTTT 286 Hs.156367 RPS29 Ribosomal protein S29

18 TTGGTCCTCT 282 Hs.632703 RPL41 Ribosomal protein L41 19 AGGGCTTCCA 279 Hs.534404 RPL10 Ribosomal protein L10 20 GAGCCCAGCC 276 Hs.654826 SPATS2 Spermatogenesis associated,

(58)

Resultados 47

e organização de componentes. Por outro lado, genes envolvidos em outros processos como produção de citocinas, divisão celular, homeostase celular e ativação celular apareceram com frequência menor que 5% e não foram incluídos na figura.

Categoria funcional Porcentagem de genes

63,6 60,3 52,6 32,1 26,8 23,3 20,3 16,5 15,0 13,5 13,2 8,7 8,3 7,9 7,7 7,6 7,4 6,7 6,2 5,5 5,5

0 20 40 60 80

processos metabólicos celulares processos metabólicos primários processos metabólicos de macromoléculasregulação de processos biológicos comunicação celular biogênese e organização de componentesdeterminação da localização processos biosintéticos processos de desenvolvimento celular desenvolvimento de estruturas anatômicas desenvolvimento de organização multicelularresposta ao estresse ciclo celular resposta imune processos catabólicoslocalização protéica proliferação celular resposta de defesamorte adesão celular resposta a estímulos externos

IV. 3 Análise comparativa da biblioteca AREB e identificação dos benes

diferencialmente expressos

Como as bibliotecas AREB e normal possuíam numero total de tags

diferentes, foram normalizados para um total de 300mil tags. Assim a frequência de cada tag foi calculada multiplicando-se o número da mesma por um fator de correição obtido após dividir-se 300mil pelo numero total de tags de cada biblioteca.

O resultado geral da comparação das bibliotecas de AREB e MO estão representados na Figura 17. Foram identificados 25.458 tags com expressâo diferencial, 21.006 expressas exclusivamente em cada uma das bibliotecas e 4.452

(59)

Resultados 48

tags expressas em ambas. Entre as tags comuns às duas bibliotecas, 2.689 estiveram hipo-expressos e 1.763 hiper-expressos em AREB.

Na Figura 18 é possível observar as tags comuns às duas bibliotecas distribuídas segundo a razão de expressão (fold_change). Os pontos no gráfico representam tags ou grupos de tags hipo e hiper-expressas.

Figura 18. Comparação entre as bibliotecas SAGE de MO com AREB (pool AREB) e de medula óssea normal (pool

Normal). Tags hiper e hipo-expressos representados em círculos.

Pool AREB

Pool Normal

H2G Analise (fold_change) Hiper-expressos

Hipo-expressos

FFigura 17. Diagrama de Venn com o numero de tags

(60)

Resultados 49

As tags com expressão diferencial foram listadas em uma planilha com informações sobre o numero de tags em cada biblioteca, a diferença e a razão de expressão, entre outras (Figura 19).

Entre os genes expressos nas dua bibliotecas foram identificadas 348 tags

hiper-expressas e 752 tags hipo-expressas com razão de expressão 3 e -3,

respectivamente. Entre as tags hiper-expressas, 307 corresponderam a transcritos