Alterações quantitativas das células de purkinje na moléstia de chagas experimental no camundongo.

ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DAS CÉLULAS DE PURKINJE NA

MOLÉSTIA DE CHAGAS EXPERIMENTAL NO CAMUNDONGO

EDYMAR JARDIM

Desde as primeiras descrições de Carlos Chagas sobre a patologia

da moléstia que leva o seu nome, é salientada a importância do

comprome-timento do sistema nervoso central. O grande cientista brasileiro afirmava

então, "que relativamente à freqüência das formas nervosas da

tripanoso-míase, possuímos numerosas observações que nos autorizam a afirmar que

esta doença, talvez, provoque, em patologia humana o maior número de

afecções orgânicas do sistema nervoso central"

.

No entanto, a partir das publicações iniciais sobre a moléstia de

Cha-gas, a atenção dos estudiosos dirigiu-se para as formas cardíacas, talvez em

virtude de sua maior freqüência. Daí o elevado número de trabalhos sobre

os diferentes aspectos clínicos e patológicos dessa forma da moléstia.

Por outro lado, as investigações neuropatológicas são escassas,

restrin-gindo-se, em geral, à descrição de lesões observadas no sistema nervoso.

Uma nova etapa das pesquisas sobre a moléstia de Chagas foi inaugurada

por Kõberle que, através de investigações originais, deixou bem clara a

ne-cessidade de estudos quantitativos sistematizados para a avaliação do grau

de comprometimento do sistema nervoso, de sua extensão e de sua

corre-lação com os achados clínicos. Este investigador chamou a atenção paia

o fato de que a simples verificação de lesões parenquimatosas não é

sufi-ciente para o estudo da forma nervosa, mas que "o patologista deve fazer

constar o grau de destruição dos neurônios mediante investigações

quanti-tativas das distintas partes do sistema nervoso central"

.

Os estudos de Kõberle e seus colaboradores, dirigidos sempre para a

determinação das alterações quantitativas neuronais, vieram abrir novo

pa-norama nas pesquisas sobre a patogenia dos megas (megaesôfago, megacolo,

megabexiga, etc.) e da cardiopatia chagásica.

A ampla documentação neurológica apresentada por Chagas, há 50 anos,

não encontrou repetição. A análise da literatura especializada não confirma

o elevado número de casos neurológicos previsto por Chagas em suas

pri-meiras publicações. A casuística é, em verdade, escassa. Poderia, então,

surgir a pergunta: teriam desaparecido as formas nervosas da doença?

Parece-nos que não. Existe, sim, dificuldade na correlação entre os

diverR e s u m o d a t e s e de d o u t o r a m e n t o a p r e s e n t a d a à F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d e diverR i -b e i r ã o P r ê t o d a U n i v e r s i d a d e d e S ã o P a u l o .

sos aspectos clínicos e a possível etiología chagásica; somente os estudos

experimentais e os exames neuropatológicos de rotina poderão confirmar

as suspeitas clínicas diagnósticas, permitindo que a moléstia de Chagas

ve-nha ocupar a posição de relevo que lhe é devida dentro da Neurologia.

O estudo quantitativo sistematizado dos elementos neuronals na

mo-léstia de Chagas vem sendo realizado na Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto desde 1955. Nessa ocasião Kõberle iniciou suas pesquisas, que vêm

se desenvolvendo de maneira contínua através dos últimos anos,

congregan-do os esforços de diferentes Serviços. Vários setores da moléstia têm sicongregan-do

abordados, resultando em novos e importantes esclarecimentos sobre o

pro-blema; investigações de valor têm constituído o assunto básico de várias

teses apresentadas à nossa Faculdade, e o Departamento de Patologia

con-tinua a estabelecer os alicerces da estrutura dessa nova fase da moléstia

de Chagas, demonstrando que as formas nervosas são, indiscutivelmente, "a

essência da enfermidade"

, pois as demais alterações orgânicas observadas

devem ser consideradas como conseqüência da agressão inicial ao sistema

nervoso, central ou periférico.

Kõberle tem acentuado que esse estudo "exige uma estreita

colabora-ção do clínico com o patologista"

. Decidimo-nos, pois, estudar um pequeno

item da neuropatologia chagásica, ou seja, as alterações quantitativas das

células de Purkinje na moléstia de Chagas experimental no camundongo.

M A T E R I A L E MÉTODOS

U t i l i z a m o s 24 c a m u n d o n g o s a l b i n o s j o v e n s , c o m idades v a r i a n d o e n t r e 18 e 20 dias, de a m b o s os s e x o s , cujos p e s o s v a r i a r a m e n t r e 10 e 12 g. D e s s e s 24 a n i m a i s , 10 c o n s t i t u í r a m o g r u p o c o n t r o l e e 14 o grupo p a t o l ó g i c o .

A i n o c u l a ç ã o foi f e i t a por v i a i n t r a p e r i t o n e a l c o m 0,1 m l de s a n g u e citratado, obtido por p u n ç ã o c a r d í a c a de o u t r o s c a m u n d o n g o s p a r a s i t a d o s c o m T. cruzi. Foi u s a d a a cepa "Y" m a n t i d a n o D e p a r t a m e n t o de P a t o l o g i a d a F a c u l d a d e de Me-d i c i n a Me-de Ribeirão Preto, c u j o s a n i m a i s f o r a m s u b m e t i Me-d o s p r e v i a m e n t e a o e x a m e p a r a s i t ê m i c o , c o l o c a n d o - s e , e n t r e l â m i n a e l a m í n u l a , u m a gota de s a n g u e e x t r a í d o por p u n ç ã o da c a u d a do a n i m a l . A p a r a s i t e m i a r e v e l o u , e m t o d o s os casos, 20 a 25 p a r á s i t o s e m m é d i a por c a m p o de 400 X, obtida por c o n t a g e m de 30 c a m p o s d i f e r e n t e s ( t a b e l a 1 ) .

A p a r a s i t e m i a dos a n i m a i s i n o c u l a d o s foi v e r i f i c a d a d i a r i a m e n t e a p a r t i r do 5* dia de i n o c u l a ç ã o , s e g u n d o a t é c n i c a d e s c r i t a . Os v a l o r e s c o r r e s p o n d e n t e s cons-t a m da cons-t a b e l a 1.

F o r a m a p r o v e i t a d o s os a n i m a i s que m o r r e r a m ou f o r a m s a c r i f i c a d o s e n t r e o 7o e 9 ' d i a s após a i n o c u l a ç ã o . Os a n i m a i s f o r a m o b s e r v a d o s c a d a 2 h o r a s a p a r t i r do 5v dia após a i n o c u l a ç ã o , a fim de que, e m c a s o de m o r t e , n ã o h o u v e s s e d e m o r a n a f i x a ç ã o do m a t e r i a l , e v i t a n d o a lise d o s i s t e m a n e r v o s o c e n t r a l . Os a n i m a i s só f o r a m s a c r i f i c a d o s q u a n d o a p r e s e n t a v a m q u a d r o s a g ó n i c o s , c a r a c t e r i z a -dos por g r a n d e p r o s t r a ç ã o e por p a r a l i s i a s d e s e g m e n t o s corporais.

Os c e r e b e l o s f o r a m retirados e m b l o c o c o m o cérebro e f i x a d o s i m e d i a t a m e n t e e m formol a 1 0 % .

A n t e s de proceder a o e s t u d o do m a t e r i a l , v e r i f i c a m o s o t a m a n h o m é d i o das c é l u l a s de P u r k i n j e no c a m u n d o n g o , a fim de d e t e r m i n a r a e s p e s s u r a dos cortes q u e d e v e r i a m ser u s a d o s , e v i t a n d o q u e u m a m e s m a c é l u l a f o s s e c o n t a d a m a i s de u m a v e z e m c o r t e s h i s t o l ó g i c o s s u c e s s i v o s . P a r a e s s a v e r i f i c a ç ã o u s a m o s a c â m a r a d e Spencer, r e a l i z a n d o m e d i d a s c e l u l a r e s e m 5 c a m u n d o n g o s n o r m a i s . E n c o n t r a -m o s os v a l o r e s c i t a d o s n a t a b e l a 2.

B a s e a d o s n e s s e v a l o r médio, f i z e m o s c o r t e s s e r i a d o s de 8 m i c r a d e espessura, e s t u d a n d o c a d a terceiro corte. O b t i v e m o s c e r c a de 90 cortes para c a d a a n i m a l .

O m é t o d o de c o l o r a ç ã o e m p r e g a d o foi o da h e m a t o x i l i n a - e o s i n a , s a t i s f a t ó r i o para o e s t u d o q u a n t i t a t i v o , s e g u n d o a e x p e r i ê n c i a d e K õ b e r l e e colaboradores.

c o n t a g e m foram i n c l u í d a s t o d a s as c é l u l a s de P u r k i n j e ainda presentes, m e s m o a q u e l a s que m o s t r a v a m a l t e r a ç õ e s e v i d e n t e s de s u a e s t r u t u r a .

N o t r a t a m e n t o e s t a t í s t i c o dos r e s u l t a d o s , c a l c u l a m o s os l i m i t e s de n o r m a l i d a d e para o n ú m e r o de n e u r ô n i o s c o n t a d o s e m c a d a g r u p o o b s e r v a d o , u s a n d o u m a e s -t i m a -t i v a do d e s v i o p a d r ã o d a s m é d i a s dos n e u r ô n i o s dos c a m u n d o n g o s n o r m a i s , b a s e a d a no c á l c u l o da v a r i â n c i a entre os c a m u n d o n g o s , obtida m e d i a n t e a n á l i s e de v a r i â n c i a .

Verificamos, a s s i m , que o l i m i t e inferior do i n t e r v a l o da n o r m a l i d a d e é de 14,4 n e u r ô n i o s por c a m p o de 400 x .

As m é d i a s n e u r o n a l s o b t i d a s n a o b s e r v a ç ã o do grupo p a t o l ó g i c o c o n s t a m da t a b e l a 3, onde p o d e m o s v e r i f i c a r que, dos 14 a n i m a i s p a r a s i t a d o s , a p e n a s dois n ã o m o s t r a r a m d i m i n u i ç ã o da m é d i a de n e u r ô n i o s por c a m p o c o n t a d o , e que os 12 rest a n rest e s a p r e s e n rest a r a m r e d u ç ã o , que v a r i o u de 8,8 a 11,6, correspondendo d e s s a m a -neira a 85,7% de a l t e r a ç õ e s . A t a b e l a 4 m o s t r a os n ú m e r o s t o t a i s das c o n t a g e n s i n d i v i d u a i s e as m é d i a s n e u r o n a l s c o r r e s p o n d e n t e s a c a d a a n i m a l n o r m a l . A c o m -p a r a ç ã o das t a b e l a s 3 e 4 d e m o n s t r a que a a n á l i s e e s t a t í s t i c a dos r e s u l t a d o s n o s a u t o r i z a a a f i r m a r que, d u r a n t e a f a s e a g u d a d a m o l é s t i a de C h a g a s e x p e r i m e n t a l no c a m u n d o n g o , h á r e d u ç ã o s i g n i f i c a t i v a do n ú m e r o de c é l u l a s de P u r k i n j e .

R E S U L T A D O S

-l u -l a s , c o m m é d i a s de 8,5 a 11,6 n e u r ô n i o s por c a m p o , os dois a n i m a i s r e s t a n t e s m o s t r a r a m v a l o r e s que correspondem a o l i m i t e inferior do i n t e r v a l o de normalidade, i s t o é, de 2.886 e 2.912 neurônios, c o m m é d i a s de 14,4 e 14,6.

N o g r u p o n o r m a l as v a r i a ç õ e s f o r a m de 2.999 a 3.390 c é l u l a s , c o m m é d i a s de 14,9 a 16,9. A m é d i a dos v a l o r e s obtidos para os 12 a n i m a i s do grupo p a t o l ó g i c o c o m a l t e r a ç õ e s q u a n t i t a t i v a s s i g n i f i c a n t e s foi de 1.962 neurônios, a o p a s s o que no g r u p o c o n t r o l e e s t a m é d i a foi de 3.177. A c o m p a r a ç ã o d e s t e s dois v a l o r e s r e v e l a q u e h o u v e u m a redução de 38,3% dos n e u r ô n i o s n o g r u p o p a t o l ó g i c o , r e s u l t a d o que é c o n c o r d a n t e c o m t r a b a l h o s sobre r e d u ç ã o q u a n t i t a t i v a n e u r o n a l , r e a l i z a d o s por A l c â n t a r a , Kõberle, B r a n d ã o , S c h w a r t z b u r d e Kõberle, P e n h a e G. Kõberle.

As a l t e r a ç õ e s q u a n t i t a t i v a s no g r u p o p a t o l ó g i c o n ã o foram, porém, c o n s t a n t e s e m t o d o s o s c a m p o s e x a m i n a d o s . U m dos a n i m a i s (CP 10) a p r e s e n t o u d i m i n u i ç ã o d o s n e u r ô n i o s e m t o d o s os c a m p o s , a o passo que 11 a n i m a i s ( 1 , 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 1 3 e 14) s o f r e r a m e s s a d i m i n u i ç ã o na m a i o r parte dos c a m p o s e x a m i n a d o s , porém, c o m á r e a s de p o p u l a ç ã o n e u r o n a l a p a r e n t e m e n t e n o r m a l .

A s s i m , a n a l i s a n d o s e a f r e q ü ê n c i a dos v a l o r e s e n c o n t r a d o s n a s c o n t a g e n s e c o n -s i d e r a n d o - -s e o i n t e r v a l o d e n o r m a l i d a d e , o-s v a l o r e -s inferiore-s e -superiore-s a e -s t e i n t e r v a l o c o n s t a m da t a b e l a 5.

N e s t a ú l t i m a , o b s e r v a m o s que no grupo p a t o l ó g i c o os c a m p o s c o m r e d u ç ã o de n e u r ô n i o s c o r r e s p o n d e r a m a 85,1% do t o t a l ; os c a m p o s c o m v a l o r e s incidindo den-t r o dos l i m i den-t e s do i n den-t e r v a l o de n o r m a l i d a d e c o r r e s p o n d e r a m a 5,9% d o den-t o den-t a l e que o s c a m p o s c o m v a l o r e s m a i s e l e v a d o s que o l i m i t e superior do i n t e r v a l o de nor-m a l i d a d e corresponderanor-m a 4%.

COMENTARIOS

A diminuição de neurônios por campo, em cada animal, não foi

cons-tante, excetuados CP4 e CP11, nos quais essa redução se verificou na

maio-ria dos campos examinados. Contudo, alguns dos campos estudados

apre-sentavam valores normais. Isto nos permite deduzir que as alterações das

células de Purkinje não ocorrem com a mesma intensidade em todo o córtex

cerebelar.

adja-ceníes a estas zonas mostraram alterações morfológicas celulares

pronuncia-das. Tal fato já foi assinalado por Kõberle em 1959 e está documentado

nas figuras que se seguem ao texto.

Os animais CP4 e CP11 não evidenciaram alterações significativas. Os

valores encontrados são semelhantes àqueles obtidos para o grupo controle.

Este achado não parece constituir fato excepcional, pois o próprio Chagas

,

em 1916, achava razoável "admitir que a substância nervosa não constitui

de modo constante, ou pelo menos com a constância do miocardio, sede de

multiplicação do tripanosoma".

Como foi dito anteriormente, incluímos nas contagens toda e qualquer

célula de Purkinje que conseguimos identificar em cada campo

independen-temente do grau de alterações que apresentasse. As alterações morfológicas

celulares que observamos nos animais patológicos foram de tal modo

inten-sas que nos parece lícito admitir que, se houvesse sobrevivência à fase

aguda, um estudo histopatológico posterior provavelmente deveria mostrar

muito maiores destruições neuronais que as encontradas.

O mecanismo intrínseco desta destruição é ainda desconhecido.

Cha-gas

, em 1916, já suspeitava da presença de uma substância tóxica para

a célula nervosa; Torres

, em 1941, dizia que o "processo inflamatorio na

doença de Chagas é, pois, a conseqüência de uma ação induzida à distância

pelo 8. cruzi por meio de uma hipotética noxina esquizotripânica".

Alva-renga

Kõberle e Alcântara

, em 1960, sugeriram que a destruição das

célu-las se dá à custa de uma "toxina", liberada por destruição de formas em

leishmânia do parasito. Kõberle

, em 1962, afirmou que "à medida que se

desintegram as leishmânias, observam-se alterações neuronals, desde lesões

nucleocitoplasmáticas, até lise completa das células. Baseados nestas

obser-vações, somos forçados a concluir que, na ocasião da desintegração das

leishmânias, ocorre a liberação de uma substância extremamente deletéria

para o neurônio. Segundo a nossa opinião deve tratar-se de uma

endoto-xina (neurotoendoto-xina)".

A natureza desta substância neurotóxica é, ainda, questão pendente de

ulteriores investigações bioquímicas, e, na opinião de Kõberle

, secundária,

pois "o fato fundamental reside na destruição neuronal".

A fase aguda, no material estudado, teve duração máxima de 9 dias.

Dos 14 animais desse grupo, 6 (43%) morreram no 7.° dia, 7 (50%) no

8.° dia e 1 (7%) no 9.° dia.

Não nos pareceu, pois, que houvesse relação entre a duração da fase

aguda da moléstia e a diminuição do número de neurônios, cuja explicação

talvez esteja na curta duração desta fase.

CONCLUSÕES

2) dos 14 animais estudados, 12 apresentaram diminuição neuronal; 3) as

reduções neuronais na maior parte dos animais estudados se apresentaram

alternadas com áreas de população neuronal aparentemente normal; 4) nas

regiões onde haviam leishmânias no interior de pseudocistos ou esparsas

nos tecidos, constatamos alterações morfológicas neuronais intensas; 5) não

nos pareceu que houvesse relação entre a duração da fase aguda e a

redu-ção do número de neurônios.

RESUMO

O autor estudou quantitativamente as células de Purkinje em cortes

semi-seriados do cerebelo de camundongos inoculados experimentalmente

com T. cruzi, tendo verificado considerável destruição neuronal na fase

aguda da enfermidade.

SUMMARY

Quantitative study of Purkinje cells in the acute phase of experimental

Chagas' disease

A quantitative study of Purkinje cells was done through semi-serial

sections of cerebellum of mice experimentally innoculated by Trypanosoma

cruzi. A very marked neuronal destruction was found in the acute phase

of Chagas' disease.

R E F E R Ê N C I A S

1 . A L C Â N T A R A , F . G. — S i s t e m a n e u r o v e g e t a t i v o do c o r a ç ã o n a m o l é s t i a d e C h a g a s e x p e r i m e n t a l . T e s e d e d o u t o r a m e n t o , F a c u l d a d e de M e d i c i n a d e R i b e i -r ã o P -r ê t o , 1959.

2 . A L V A R E N G A , R. J. — H i s t o p a t o l o g i a d a fase a g u d a d a m o l é s t i a de C h a g a s e m c a m u n d o n g o s . I C o n g r e s s o I n t e r n a c i o n a l s o b r e a M o l é s t i a d e C h a g a s , R i o d e J a n e i r o , 1959.

3 . B R A N D Ã O , H. J. S. — E s t u d o q u a n t i t a t i v o de n e u r ô n i o s s i m p á t i c o s e p a r a s ¬ s i m p á t i c o s n a m o l é s t i a de C h a g a s e x p e r i m e n t a l e m r a t o s . T e s e de d o u t o r a -m e n t o , F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d e R i b e i r ã o P r e t o , 1961.

4 . C H A G A S , C. — L e s f o r m e s n e r v e u s e s d ' u n e n o u v e l l e T r y p a n o s o m i a s e . Trypa-nosoma cruzi i n o c u l é p a r Triatoma megista ( m a l a d i e d e C h a g a s ) . N o u v . Ico¬ n o g r . S a l p ê t r i è r e 2 6 ( 1 ) : 1 - 1 9 , 1913.

5 . C H A G A S , C. — P r o c e s s o s p a t o g ê n i c o s d a t r i p a n o s o m i a s e a m e r i c a n a . M e m . I n s t . O s w a l d o C r u z , R i o 8 ( 2 ) : 5 - 3 6 , 1916.

7 . K Ö B E R L E , F . — E s t u d o s q u a n t i t a t i v o s d a d e s t r u i ç ã o n e u r o n a l n a m o l é s t i a d e C h a g a s . I V R e u n i ã o d a A s s o c i a ç ã o L a t i n o - A m e r i c a n a de C i ê n c i a s F i s i o l ó g i c a s , R i b e i r ã o P r ê t o , 1961.

8 . K Ö B E R L E , F . — P a t o l o g i a d a m o l é s t i a d e c h a g a s . M e d i c i n a C A R L , R i b e i r ã o P r ê t o 1 ( 2 ) : 7 3 - 9 8 , 1962.

9 . K Ö B E R L E , F . & A L C Â N T A R A , F . G. — M e c a n i s m o d a d e s t r u i ç ã o n e u r o n a l d o s i s t e m a n e r v o s o p e r i f é r i c o n a m o l é s t i a d e C h a g a s . H o s p i t a l 5 7 ( 6 ) : 1 7 3 - ¬ 178, 1960.

1 0 . P E N H A , F º , P . D. & K Ö B E R L E , G. — M e g a e s ô f a g o c h a g á s i c o . E s t u d o q u a n t i -t a -t i v o d o p l e x o d e A u e r b a c h . R e v . G o i a n a Med. 5:185-192, 1959.

1 1 . S C H W A R T Z B U R D , H . & K O B E R L E , F . — C h a g a s - M y e l o p a t h i e . Z s c h r . f. T r o p e n ¬ m e d . u. P a r a s t . 10:309-314, 1959.

1 2 . T O R R E S , C. M. — S ô b r e a a n a t o m i a p a t o l ó g i c a d a d o e n ç a d e C h a g a s . M e m . I n s t . O s w a l d o C r u z 3 6 ( 3 ) : 3 9 1 - 4 0 4 , 1941.