Re v is ta d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28(3):249- 257, jul- se t, 1995.
HIPERSENSIBILIDADE TARDIA A ANTÍGENO DE
TRYPANO SO M A CRUZI. I - ESTUDO
EXPERIMENTAL EM COELHOS
Antonio R.L. T eixeira
Re açõe s de h ip e rs e n s ib ilid ad e c u tân e a ta rd ia em coe lhos in fe c tad o s com T rypanosoma cruzi hom ólogo ou he terólogo, fo ram obtidas p e la in je ção de 50ytg de p ro te ín a do antíg e n o T 12E, de riv ado de um clone do p aras ito . A e s pe cificidade do teste f o i in d ic a d a pe la au s ê nc ia de re ação em coelhos controle s no rm ais que re ce be ram a m e sm a q u an tid ad e de antíg e no n a pe le . A in je ção in trad é rm ic a do antíg e no , em c inc o ocasiões, n ão in d u z iu re ação c u tân e a p o s itiv a ou soroconv e rs ão dos ex am es de h e m ag lu tin aç ão e ag lu tin aç ão , em coelhos controle s no rm ais . Po r o utro lado , coelhos chagás icos s ubm e tidos a s érie de c inc o testes cutâne os , com inte rv alos de u m a s e m ana, n ão e x ibiram alte ração d a inte n s id ad e das re açõe s de h ip e rs m s ib ilid ad e ou dos p e rfis dos título s de antic o rpo s séricos. Os re gistros e le trocardiogrãficos tam bém n ão fo ram alte rados pe los testes c utâne os em coelhos no rm ais e chagãs icos . A in o c u id ad e do antíg e n o T 1 2 Efoi c o n firm ad a em e x pe rim e ntos re aliz ado s e m 3 6 coelhos chagãs icos e 19 coelhos controle s no rm ais . Esse e studo m ostra que o teste c utâne o com o antíg e no T 12E po de ser ú t il no diag nós tic o , alé m de s e rv ir com o in d ic ad o r de m o rbidade d a doe nça.
Palav ras- chav e s: T rypanosoma cruzi. H ipe rs e ns ibilidade c u tân e a tard ia. A ntíg e no T 12E. D o m ç a de Chagas.
A re ação de hipe r s e ns ibilidade tardia na do e nça de Chagas e x pe r ime nta l10 11 15 19 e h u m a n a 2 20 21 t e m s i d o e s t u d a d a e s poradicame nte , vis ando a caracterização da im unida de ce lular e specífica. O alvo dessas inve s tiga çõe s e ra as re açõe s tiss ulare s, formadas e m s e guida à inje ção do paras ito viáve l1015 o u a pós a inje ção de extratos do
T ry p a n o s o m a c r u z i m o r to 11 20. Em duas
ocas iõe s 19 20, por é m, fora m obtidos resultados s uge s tivos de que o tes te c utâne o de hipe r s e ns ibilida de tardia contra e xtrato a ntigênic o de formas de cultivo do parasito pode ria ter s ignificado s e me lhante àque le da re ação contra o de rivado protéico purificado (P PD) e m pacie nte s c o m tube rculos e.
A caracterização pr e liminar da fração do parasito que c onté m os antíge nos do T. c r u z i
as s ociados c o m hipe r s e ns ibilida de cutâne a tardia, mos trou que essas prote ínas estão pre s e nte s e m dive rs os c ompa r time ntos
Laboratório Multidis ciplinar de Pesquisa e m Doe nça de Chagas. De partame nto de Patologia, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasília, DE
E n d e r e ç o p a r a c o r r e s p o n dê n c ia: Dr. Antonio R. L. Teixeira. Laboratório Multidis ciplinar de Pesquisa em Doe nça de Chagas. Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília. Caixa Postal 04- 685. 70919- 970, Brasília, DE Brasil. Fax: (061) 273- 4645.
Recebido para publicação em 25/01/95.
subce lulare s 18. Entre tanto, foi obs e rvado que as fraçõe s micros omal e ribos omal, s e dime ntadas a 3 0 .0 0 0 g x 3 5 m in e a 1 0 0 .0 0 0 g x 9 0 m in , p r o d u z i a m fo r t e s r e a ç õ e s c u t â n e a s d e hipe rs e ns ibilidade tardia n o s ítio de inoc ula ção de d im in u ta qua n tid a d e d o a ntíg e no . A imunid a de ce lular foi, e ntão, obs e rvada e m e x pe rime ntos de trans fe rê ncia pas s iva, i n i b i ç ã o d a m i g r a ç ã o d e c é l u la s mononucle are s e tr ans formação blás tica de linfócitos na pre s e nça do a ntíge no e s pe cífico19.
No s e ntido de dar c o ntinuida de a essa linha de pe s quis a for am inicia dos e s tudos c om diversos e s toque s e clone de T. c r u z i e,
ta mbé m, c om outro flage la do não patogênico. Nesse trabalho, apre s e ntamos re s ultados de e x pe rime ntos que ide ntific a m o a ntíg e no T12E, de r iva do de u m clone d o e s toque Eme s tina de T. c ru z i, c o mo c a pa z de in duzir
reações cutâne as de hipe r s e ns ibilidade tardia de grande inte ns idade e m coe lhos chagás icos .
M A TERIA L E M ÉT O D O S
Parasitos
Nesses e studos fora m utiliza dos quatr o e s toque s e u m clone de T. c r u z i: a) e s toque Y
T e ix e ira ARL. H ipe rs e ns ibilidade tard ia a antíg e no de T rypanosoma cruzi. I. Estudo e x pe rim e ntal em coelhos. Re v ista d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28:249- 257, jul- s e t,, 1995.
a guda, e m São Paulo, 195412; b) e stoque Ernes tina (TE), is ola do de criança c om a infe c ção aguda, e m São Fe lipe , Bahia, 19649. Foi us a do ta m b é m o clone T12E de rivado desse e stoque ; c) e stoque Albuque r que (TA), is ola do de a dulto c o m a forma a guda da doe nça, proce de nte de Barreiras, Bahia, 197819; d) e s toque T. c r u z i (P H), is ola do do morce go P h y lo s to m a h a s t a tu s de cave rna, (corte sia do
Dr. Willia m Barbos a, IPTESP), no Es tado de Goiás , e ) foi utiliza do ta m b é m H e rp e to m o n as s am u e lp e s s o ai, fla ge la do m o no g e né tic o de
ins e to, não- patogênico para o ho m e m 14.
Cultura de células
Cultura s de c é lula s de fetos de c a mundongos for am e s tabe le cidas e mantidas de a c o r do c o m té c nic a p a d r ão 18. As m o n o c a m a d a s de célula s mus culare s e squeléticas e m frascos plás ticos de 25cm2 fo r a m infe c ta das c o m 105 formas tripomas tigotas de T. c ru z i. De z dias a pós a
infe c ção as formas tripomas tigotas (=95%) e me rge nte s no me io s obr e na da nte e ram c o lhid a s p o r c e ntrifuga ção. Após duas s e m a n a s , as c u lt u r a s s u p e r in f e c t a d a s apre s e ntavam ma io r qua ntida de de formas amas tigotas (=30± 15%) n o s obre nadante . T ripomas tigotas e amas tigotas e ram colhidas e c onge la da s pa ra o b te nção de a ntíge nos s ubcelulares.
Cultura em LTT
Os e s toque s e clone s de T. c r u z i e,
t a m b é m , o t r i p a n o s s o m a t í d e o H . s am u e lp e s s o ai for am cultivados e m me io LIT4.
As cultura s e ra m m a ntid a s e m fase e x pone nc ia l de cre s cime nto e os inóc ulos e ram feitos na re lação de 105 paras itos /ml de me io. Yras cos Erle nmaye r de 500ml c om tampa de ros ca e ram inoc ula dos e le vados para e nc uba dor a a 27°C, c o m agita ção cons tante a lOOrpm. De a c o r do c o m o p a d r ão de cre s cime nto do e s toque d o protozoário, o me io de cultura era e x a mina do a o micros cópio e as formas e pimas tigotas e ram contadas , 10 a 12 dias pós - inoculação, e m fase e x pone nc ial de cre s cime nto. Em geral, obtinham- s e 107 pa r a s ito s / m l de m e io de c ultur a. Ne s sa c o n d iç ão e x pe r im e nta l 99% das formas e x aminadas e ram e pimastigotas típicas. Essas formas do paras ito e ram, e ntão, colhidas po r ce ntr ifuga ção e us adas para obte nção d o antíge no.
Obtenção de antígenos subcelulares
a) A ntígenos ob tidos de form as am astigotase trip o m astig o tas de T. c r u z i. Os
s obre nadantes das culturas de células infectadas eram centrifugados e lavados três vezes e m PBS, pH 7,2, a 4°C. Em s eguida, o s e dime nto era ress uspens o e m H2O bides tilada (1:20 p/v) e s ubme tido a cinco ciclos de conge lame nto e desconge lame nto sucessivos. O extrato solúvel de amastigotas e tripomastigotas (AT) era o s obre nadante obtido por centrifugação a 5000g x 25 min, a 4°C.
b ) A n t í g e n o s o b t i d o s d e f o r m a s epim astigotas. Formas epimastigotas de T. c ru z i e de H . s am ue lpe s s oai foram colhidas
de me io LIT, e m fase e x pone nc ia l de crescimento, por centrifugação a 3000g x lOmin. O s edime nto foi lavado três vezes e m PBS, pH 7,2, a 4°C. O s e dime nto também foi ressuspenso e m H2O bides tilada e s ubme tido a c in c o c ic lo s de c o n g e la m e n t o e desconge lame nto sucessivos. O sobrenadante obtido após centrifugação a 5000g x 25 min, a 4°C, era o extrato solúvel de epimastigotas (EP).
Os extratos solúveis AT e EP foram s ubmetidos a centrifugação diferenciar8 a 15.000gx 25min, 30.000g x 35min, e lOO.OOOg x 90min. Em cada uma dessas etapas de ce ntrifugação o s e dime nto cons tituía as frações subcelulares (F4, F5 e Fó), e nquanto o s obrenadante solúvel da última centrifugação era a fração F7. As frações F l, F2 e F3, que encerram organelas de vários compartimentos s ubcelulares, foram descartadas porque pode m produzir reação tecidual inespecífica no sítio de inje ção19.
T eix eira ARL. H ipe rs e ns ib ilidad e tard ia a antíg e no de T rypanosoma cruzi. I. Estudo e x pe rim e ntal em coelhos. Re v ista d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28:249- 257, jul- s e t,, 1995.
fla mbage m. Dur ante o pe ríodo de quare nte na de u m mês foi feito tratame nto coccidios tático (s ulfame taxol + trime tr opin durante 7 dias ), e nq ua n to que infe s ta ção c o m ácaros foi c oibida c om e ctomos ol (monos ulfure to de tetraetiluran).
Trinta e seis coe lhos for am inoc ula dos com tr ipoma s tigota s de T. c r u z i. O g r u p o A
cons is tiu de 24 coe lhos que re ce be ram, po r via s ubcutâne a, 106 formas do e s toque Ernes tina d o paras ito p o r kg de pe s o. O - grupo B foi fo r ma do p o r 12 coe lhos que re ce be ram 106 tripomas tigotas do e s toque Albuque r que por kg de pe s o, via s ubc utâne a.
O g r upo controle cons is tiu de 19 coe lhos d o me s mo gr upo e tário, ma ntidos nas me smas c ondiçõe s e xpe rime ntais. T odos os animais desse e s tudo for am alime ntados c om ração Gua b i e ág ua a d lib it u m .
Parasitemias
A de te cção de parasite mias e m coe lhos infe c ta dos c o m T. c r u z i fo i fe ita pe lo
xe nodia gnós tic o17. Em cada x e no for a m usadas 2 0 n i n f a s d e p r i m e i r o e s t á d i o d e
D ip e talo g as te r m ax im u s .
Detecção de anticorpos específicos
Os testes s orológicos de he ma glutinaçâo indire ta e de a glutina ção dire ta de formas de c ultivo do paras ito, trips inizadas e fixadas com forma lde ído a 2%, fora m us ados para de te cçãode anticorpos específicos, conforme descrito e m tr abalho pr é vio17. O teste de aglutina ção foi fe ito a pós tr a ta me nto d o s oro c o m 2- me rcaptoe tanol, para r e moção de anticorpos Ig M e c o m pa r a ç ão c o m amos tras s e m tratame nto, para ide ntificação principalme nte d e a n t i c o r p o s d a c la s s e Ig G. F o r a m cons ide rados c omo pos itivos títulos iguais o u s upe riores a 1:8 e 1:64, re s pe ctivame nte, nos testes de he ma glutina çâo e de aglutina ção direta.
Teste cutâneo
Fora m feitos testes cutâne os e m coe lhos infe c ta dos c o m T. c r u z i e e m c oe lhos
controle s , normais . O teste cons is tiu na inje ção intradérmica de 50pg de prote ína contida e m lOOyil de cada fr ação antigênica s ubce lular (Tabe la 1). Uma áre a de e ndura ção, me dindo pe lo me nos 0,5cm nos diâme tros horizonta l e
transversal, 48h a pós a inje ção do a ntíg e no foi cons ide rada um a re ação pos itiva. Em cada teste c o m a ntíge no o controle cons is tiu na in je ção de lOOpl de s a lina na re gião contralate ral da pe le de pila da d o a bdo m e do coe lho.
Estudos eletrocardiográfícos
Fora m feitos registros e le trocardiográfícos e m coe lhos normais e e m coe lhos chagás icos dos me s mos gr upos e tários, us ua lme nte após a re alização dos xe nodiagnós tic os . Em geral, os t r a ç a d o s e r a m o b t id o s a c a d a s e m a n a d u r a n t e o pr im e ir o mê s de infe c ção e, s ubs e qüe nte me nte , um a ve z por mês durante o pe r íodo de u m ano. As de rivaçõe s pa d r ão 17 for am registradas por u m e le trocardiógrafo m o d e lo ECG- IV (FUNBEC, São Paulo). Os registros e le tr oca r diográfíc os e m c oe lhos controle s , não- infe ctados , fo r a m feitos , pare adame nte , para c ompa ra ção c om aque le s obtidos de coe lhos chagás icos .
Quantificação de proteínas
O mé to do de Lowry8 foi e mpr e ga do para de te r minação da qua ntida de de prote ínas no antíge no. Uma s olução de a lb um ina bovina c om conce ntração conhe c ida foi us a da c omo padrão.
Analise estatística
O teste
t
de Stude nt foi utiliza do para análise de grupo.RESULTA D O S
O e s tudo teve c omo p o n to de pa r tida a c o m pa r a ção da inte ns id a de das re açõe s c utâne as de hipe r s e ns ibilida de tardia produzidas por antíge nos pres entes e m fraçõe s s ubcelulare s de amas tigotas e tripomas tigotas de T. c ru z i, de rivadas de cultura de células , e
Teixeira ARL. H ipersensibilidade tardia a antígeno de T rypanosom a cruzi. I. Estudo experimental em coelhos. Revista da So ciedade Brasileira de M edicina Tropical 2 8 :2 4 9 - 2 5 7 , jul- set„ 1995.
A Tabela 1 mo stra resultados d e testes cutâneo s co m antígeno s presentes nas fraçõ es subcelulares (F4 a F7) d e quatro esto ques d iferentes d e T. c ru z i e, aind a, d e H . sam uelpesso ài. N o g rup o A, 12 co elho s infectad o s co m o esto que Ernestina d e T. c ru z i fo ram testad o s co m o s antíg eno s subcelulares d o clo ne T12E, derivado d esse m esm o esto que. Esses co elho s tam bém foram testad o s co m fraçõ es subcelulares derivadas de formas epimastigo tas d e T. cruz i d os esto ques A lbuquerque, Y, e PH. Em geral, os antígeno s p resentes nas fraçõ es subcelulares derivadas d o clo ne T12E pro duziram reaçõ es cutâneas d e h ip e rs e n s ib ilid a d e tard ia d e m aio r intensid ad e no s co elho s ino cu lad o s co m trip o m astig o tas d o esto q u e Ernestina. As fraçõ es subcelulares derivadas d o s demais esto ques d e T. cru z i tam bém pro duziram reaçõ es cutâneas, ainda que d e intensid ad e menor. D e interesse, o s antígeno s derivados de T. cruz i d o esto que PH pro duziram reaçõ es cutâneas tard ias d e intensid ad e muito m eno r que aquela o btid a co m o s antígeno s derivados d o s d em ais esto ques d e T. cruz i. Todavia, os antíg eno s d erivad o s d e H . sam uelpes so ai produziram reaçõ es cutâneas d e intensidad e mínima quand o co m p arad as co m aquelas o btid as co m os d emais antígeno s (Tabela 1).
No grupo B, o s 12 co elho s infectad o s co m o esto que A lbuquerque d e T. cru z i também foram testad o s co m os antígeno s subcelulares d o p a ra s ito . Em g e ra l, o s a n tíg e n o s su b c e lu la re s d e riv ad o s d o c lo n e T 12E pro duziram reaçõ es cutâneas mais fo rtes que aq u e la s p ro d u z id as c o m o s a n tíg e n o s derivados dos demais esto ques do parasito . Os antígeno s derivados do esto que PH semp re prod uziram reaçõ es cutâneas tard ias mais fracas que aquelas o btid as co m os outros esto ques do parasito. Em ad ição , os antígeno s d erivado s de II. sam uelpesso ai pro duziram reaçõ es cutâneas m uito fracas o u então negativas. Essas d iferenças d e intensid ad e das reaçõ es tam bém tiveram significad o estatístico (Tabela 1).
Os resultad os ap resentad o s na Tabela 1 mostram ainda que as fraçõ es subcelulares F5 e F6, derivadas d e formas epimastigo tas do clo ne T12E d e T. cruz i, pro duziram reaçõ es cutâneas tard ias d e g rand e intensid ad e. To d avia, as fraçõ es F4 e F7 tam bém pro duziram reaçõ es de intensid ad e mod erad a. Essas o bserv açõ es sugeriram a necessid ad e de introduzir m o d ificação no m éto d o d e preparo do antígeno . Um estud o pilo to mo stro u que o antígeno co m p o sto das fraçõ es F4 a F7, derivado do clo ne de T. cruz i T12E, co ntinha o (s) p rincíp io (s) ativ o (s) cap az(es) d e produzir reaçõ es cutâneas tardias de intensid ad e m aio r que aquelas mostradas na Tabela 1. Esse antígeno T12E fo i usad o no r exp erim ento s descritos a seguir.
A Figura 1 mostra reação cutânea papulo sa, endurada, na p ele de co elho chagásico , 48h ap ó s a ino culação d e 50]ig do antígeno T12E. Em exp erim ento s co ntro le, 19 co elho s normais receberam injeçõ es intrad érmicas d e 50pg d o antígeno T12E, (Tabela 2). N enhum d esses anim ais ap resento u reação cu tânea ao antígeno T12E ap ó s cinco testes co nsecutiv o s, co m intervalo s d e uma semana.
A Figura 2 mostra a intensid ad e das reaçõ es cutâneas tardias em co elho s chagásico s ao lo ng o d e 12 m eses de ev o lução da infecção crô nica. O bservo u-se que 10 dias ap ó s a infecção o s co elho s chagásico s apresentavam reação cutânea no sítio d e ino culação do antígeno T12E. Essas reaçõ es apresentavam m eno r intensid ad e ao s 2 e 3 m eses d e infecção . À med id a que a infecção cro nifico u, p o ré m , as re a ç õ e s c u tâ n e a s tard ias aumentaram d e intensid ad e e sustentaram um p u blicad o s). Em vista d esses resultad o s,
Teixeira ARL. H ipersensibilidade tardia a antígeno de Trypanosoma cruzi. I. Estudo experim ental em coelhos. Revista da So ciedade Brasileira de M edicina Tropical 2 8:249- 257, jul- set, 1995.
p latô d e longa d uração. C om o se ob serva, a ad m inistração d e 50y g d o antígeno T 12E p o r 15 v ez es, ao longo d e um an o , n ão produziu efeito co o p erativ o q ue resultasse n o aum ento co n tin u ad o d a in ten sid ad e d as reaçõ es cu tân eas tard ias n o s co elh o s ch ag ásico s crônicos.
Figura 1 - Reação papulosa endurecida na pele de coelho cnagásico, 48h apos a injeção de 50fig de proteína contida em lOOfil do antígeno T12E, derivado de um clo ne de Trypanosoma cruzi.
A Figura 2 tam b ém m ostra a curva de p arasitem ias em 12 co elh o s inoculad os com tripom astigotas d o estoq ue Ernestina de T. c r u z i. O b serve q ue as parasitem ias atingiram um p ico ao s 30 dias de inf ecção , q uand o 70 p o r cen to d os triato m ín eo s u sad o s n o xen o d iag n ó stico m o straram -se positivos. Entretanto, n o q uinto m ês d e inf ecção ap enas
três p o r cen to d os triatom íneos eram positivos. A partir d o sexto m ês to d o s o s xen o s foram persistentem ente negativos.
O v eto r d o to p o d a Figura 2 m ostra a evolução dos traçad os eletrocard iográficos ao l o n g o d a i n f e c ç ã o c h a g á s i c a c rô n i c a . O b s e r v o u - s e q u e d u r a n t e o s t r ê s p rim eiro s m eses, q uand o as parasitem ias e ra m p a t e n t e s , n ã o f o ra m re g i s t ra d a s alteraçõ es eletro card io g ráf icas. A lteraçõ es transitórias, co m o b loq ueio AV d o prim eiro grau, foram registrad as a partir d o q uarto m ês d e infecção. Entretanto, alteraçõ es persistentes e m ú l t i p l a s f o r a m r e g i s t r a d a s n o eletrocard iogram a a partir d o q uinto m ês, q uand o os co elho s ch ag ásico s tiveram os xen o d iag n ó stico s n eg ativ o s. O s ach ad o s eletrocardiográficos consistiram d e alterações d e rep olarização ventricular, desvio d e eixo, b loq ueio de ram o direito d o f eixe d e His e b loq ueio átrio-ventricular d e prim eiro grau. Baixa voltagem d o Q RS, arritm ias e alterações consistentes co m isq uem ia tam b ém foram registradas nos co elh o s ch ag ásico s d os grupos A e B. D e in teresse, n en h u m a d essas alterações foi registrada nos co elh o s controles (g ru p o C ). A p enas em um d eles registrou-se taquicardia sinusal transitória.
Teixeira ARL. H ipersensibilidade tardia a ant ígeno de T rypanosom a cruzi. 1. Estudo experim ent al em coelhos. Revista da So ciedade Brasileira de M edicina Tropical 28:2 4 9 - 2 5 7 , jul- set,, 1995.
cutâneo , feito ao s seis m eses d e infecção . A Tabela 2 m o stra que o em p rego d e cinco testes cutâneo s no s co elho s chagásico s d o grupo A, co m interv alo s d e uma sem ana, não aum ento u a freqüência das alteraçõ es do eletro card io grama quand o co m parad o co m a freqüência d e alteraçõ es no grupo de 12 co elho s d o g rup o B, que não fo ram subm etid o s ao teste cutâneo . D e fato , a ev o lução das alteraçõ es d o eletrocardio grama no s co elho s chag ásico s d o grup o A fo i sem elhante àquela o bservad a no s co elho s do grupo B. No grupo co ntro le, 19 co elho s normais fo ram subm etid o s, paread am ente po r id ad e, a testes cutâneo s co m o antígeno T12E, co m intervalo s d e uma sem ana. O s resultados ap resentad o s na Tabela 2 mostram ausência de alteraçõ es eletro card io gráficas, ap ó s cinco testes cutâneo s. O estud o histo p ato ló gio de secçõ es d e co ração d e co elho s chagásico s subm etid o s a cinco testes cutâneo s mostro u mio cardite sem elhante àquela presente em co elho s chagásico s que não foram submetid os ao exam e17. O s co elho s co ntro les, não - chagásico s, exibiram secçõ es d e co ração co m asp ecto histo ló gico normal.
O s exam es so ro ló gico s d e hemaglutinação ind ireta e d e ag lu tinação d ireta fo ram em p reg ad o s para d etecção d e antico rp o s esp ecífico s em co elho s chag ásico s e no s co elho s co ntro les subm etid o s a testes cutâneo s co m o antígeno T12E. O bserv o u-se que os
co elho s chagásico s não tiveram o s título s de antico rp o s sérico s alterad o s p elo s testes c u tâ n e o s . D e f a to , o s e x a m e s d e hem aglutinação ind ireta e d e ag lutinação direta exibiram título s que se mantiveram semp re elev ad o s no s co elho s d o grupo A, submetid os ao s testes cutâneo s, assim co m o no s co elho s d o grupo B que não receberam o antígeno T12E.
A Tabela 3 mostra que o s 19 co elho s que tinham o exam e de hem aglutinação negativo antes do primeiro teste cutâneo co ntinuaram co m resultad o negativo ap ó s o segund o e, também, ap ó s o quinto teste co m 50p g d o antígeno T12E. Po r outro lad o , o exam e d e aglutinação direta, sem o agente redutor 2- m ercapto etano l, mostrou resultados positivos em dois co elho s co ntro les, antes d o teste cutâneo . Esses d ois co elho s mantiveram os títulos de antico rp o s heteró filo s, da classe IgM, d ep o is do teste cutâneo . D e interesse, a hem aglutinação revelo u ap enas um co elho co ntro le co m título “bo d erline” (d iluição 1:8) de antico rp o s da classe IgG, d ep o is d e cinco testes cutâneo s co m o antígeno T12E.
D ISCUSSÃ O
Este estud o m o stra que antíg eno s subcelulares o btid o s d e T. cruz i d e o rigens d iferentes apresentam variaçõ es na cap acid ad e d e ind uzir hip ersensibilid ad e tardia em co elho s chagásico s crô nico s. Os antígeno s subcelulares d o clo ne T12E induziu reaçõ es cutâneas mais fo rtes que aquelas resultantes das fraçõ es d o s esto ques A lbuquerque, Y e PH d esse flagelad o.
T e ix eira ARL. H ipe rs e ns ibilidade tard ia a antíg e n o de T rypanosoma cruzi. I. Es tudo e x pe rim e ntal em coelhos. Re v is ta d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28:249- 257, jul- se t„ 1995.
f o r m a s in t e r n a l i z a d a s r e p r o d u z ia m - s e le ntame nte e pouc os tripomastigotas era,m libe r a dos n o s obr e na da nte da cultura. A inoc ula ção de 106 formas tripomastigotas desse e s toque de T. c r u z i e m c a mundongos Suíços
n ã o p r o d u ziu pa ra s ite mia de te ctáve l. As fraçõe s s ubce lulares de formas e pimas tigotas d o e s toque PH de T. c r u z i pr oduzir a m reações
cutâne as de inte ns ida de m uito me nor que a que las obtidas c om os outros e stoque s do paras ito. Verificou- se ta mbé m que as fraçõe s s ubce lulares de formas e pimas tigotas de H . s am u e lp e s s o ai pr o duzia m reaçõe s cutâne as de
pe que na inte ns ida de e m alguns casos. Outras ve zes n ão pr o duzia m hipe rs e ns ibilidade tardia n o s ítio de inoc ula ção na pe le de coe lhos c ha gás ic os cr ônic os . De s s a forma , a pos s ibilida de de utiliza ção de protozoários de ba ix a p a to g e nic id a de , o u me s m o n ão patogênicos , para dia gnós tico da infe c ção pe lo
T. c r u z i de ve ser des cartada.
Os re s ultados desses e x pe rime ntos mos tram que as fraçõe s s ubce lulare s derivadas de formas e pimas tigotas pro duzir a m reações de hipe r s e ns ibilidade tardia mais fortes que a que las induzida s po r igual qua ntida de de pr ote ína s (5 0 y g/ 1 0 0 pl) nas fr açõe s de a mas tigota s e tripoma s tigota s , q ua n d o inje tadas na pe le de c oe lhos chagás icos crônicos . Essa obs e rvação foi e x plicada pe la pre s e nça de prote ínas não- antigênicas nas fraçõe s de rivadas das formas de T. c r u z i
or iunda s de cultura de células .
Em vista da pre s e nça do(s ) princ ípio(s ) a tivo(s ) induto r (e s ) de hipe r s e ns ib ilid a de tardia nas fraçõe s s ubce lulare s F4 a F7, foi feita um a s implifica ção d o mé to do de obte nção desses antíge nos de formas e pimastigotas do c lone T12E de r ivado do e s toque Erne s tina de
T. c ru z i, cuja c lo na ge m foi obtida a partir do
is ola me nto de u m tripomas tigota, de acordo c om técnica pa dr ão 6. As s im, o a ntíge no T12E foi o btid o pe la ce ntrifugação a 12.000g x 35min d o s obre nadante da fração F3 do e xtrato d o paras ito. Após centrifugação, o s obre nadante is os mola r (0,15M NaCl) era d iluíd o para a conce ntr ação fina l de 500pg de pr ote ína /ml e e s tocado a - 20°C. Ma ntido à baix a te mpe ratura, a potê nc ia do antíge no T12E n ão apre s e ntou alte ração após 24 meses.
De interesse, as fraçõe s s ubce lulare s de formas e pimas tigotas do clone T12E de T. c r u z i induzir a m re açõe s cutâne as mais fortes
que aque las obtidas c om as fraçõe s dos de mais
e s toque s do protozoário. Esse a c ha do ta mbé m foi obs e rvado qua n d o o a ntíge no de r ivado do clone T12E foi inje tado e m coe lhos infe ctados c o m T. c r u z i he te rólogo. Os re s ultados desses
e x pe rime ntos mos tr a m que T. c r u z i de
dife re nte s orige ns apre s e ntam var iação na c a pa c ida de de in d u zir hipe r s e ns ibilida de cutâne a tardia e m coe lhos chagás icos crônicos . Em conc ordânc ia c om os dados da lite ratura19, e s s e s a c h a d o s t a m b é m m o s t r a m q u e o ( s ) pr inc íp io (s ) ativo(s ) induto r (e s ) de hipe rs e ns ibilidade tardia e s tá(ão) a mplame nte dis tr ibuído(s ) e m dive rs os c ompa rtime ntos s ubce lulare s d o T. c ru z i. Enfim, esses dados
s ão cons iste nte s c om a grande dive rs idade g e né tic a q u e de ve re fle tir nas va r ia çõe s intrae s pecíficas que têm s ido descritas nesse protozoário3 51.
O teste c utâne o de hipe r s e ns ib ilida de tardia foi pos itivo e m coe lhos chagás icos crônicos e ne gativo e m coe lhos controles normais . A inte ns ida de das re açõe s cutâne as nos animais chagás icos va riou de a cor do c om a fase da infe cção. Nos prime iros 20 dias de infe c ção as re açõe s e ram fortes, por é m, a inte ns ida de d im inuiu bas tante e ntre o pr ime iro e o terceiro mês. A partir d o qua rto mês de infe c ção a hipe r s e ns ibilida de ta rdia ao a ntíg e no T12E v o lto u a ser de gr a nde inte ns id a de . Os e xame s s or ológic os de h e m a g lutina ç ão e de a g lutina ção for a m utiliza d o s pa ra de te c ção de a ntic or pos e specíficos e m coe lhos chagás icos s ubme tidos a um a série de c inc o testes cutâne os , o u e m c oe lhos chagás ic os que n ão re ce be r am inje çõe s d o antíge no. Os pe rfis dos títulos desses anticorpos for am s imilare s e m ambos gr upos de coe lhos chagás icos . Ape nas u m entre 19 coe lhos controles , s ubme tidos a cinco testes cutâne os , apre s e ntou título “bor de r line ” de anticorpos Ig G de te ctados pe la a glutina ção dire ta c o m tra ta me nto d o s oro c o m 2- me rcaptoe tanol. A pre s e nça de anticorpos IgM, detectados pe la a glutina ção dire ta s e m 2- me rcaptoe tanol, foi e ncontrada naturalme nte e m dois c oe lhos , mas os títulos des s e s anticorpos he te rófilos n ão fora m modifica dos , a pós cinco inje çõe s de 50yig do a ntíg e no T12E.
T e ix eira ARL. H ipe rs e ns ib ilidad e tard ia a antíg e n o de Trypanosoma cruzi. I. Es tudo e x pe rim e ntal em coelhos. Re v ista d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28:249- 257, jul- s e t,, 1995.
através dos sistemas prote olíticos naturais que ope r a m in v iv o. Co m o e spe rado, a inje ção da
p r o t e í n a s e m a d j u v a n t e n ã o i n d u z i u hipe r s e ns ibilida de tardia n e m ta m p o uc o anticorpos séricos. O e xame das secções de te cidos dos coe lhos controle s , não- chagásicos, e x ibia m his tologia nor mal. Cons is tenteme nte, os coe lhos chagás icos s ubme tidos o u não ao teste c utâne o tinha m miocardite crônica com as características descritas na lite ratura17, s e m que houve s s e agravame nto das les õe s no grupo de anima is que re ce be ram o antíge no T12E. A obs e rvação de que aque la qua ntida de d o a ntíge no T12E inje tada c inc o ve zes e m coe lhos normais , c o m inte rvalos de um a s e m a n a , n ã o p r o d u z i u a lt e r a ç õ e s his to pa to lóg ic a s te m gra nde impo r tânc ia , diante da pos s ibilida de de utiliza ção do teste c utâne o pa ra d ia g nós tic o da d o e n ç a de Chagas . Essa po s s ib ilida d e p o d e r á ser e s tuda da , pa r a le la me nte a o e mpr e g o de antíge nos re combinante s para us o e m exames s or ológicos 1 13 22, para que suas vantage ns ope racionais s e jam avaliadas.
Por outr o lado, a ino c uida de d o teste c utâne o ta mbé m foi indic a da e m e xpe rime ntos que mos traram que a inje ção de 50pg do a ntíg e no T12E, e m c inc o oc as iõe s , não m o dific o u o pe rfil das re açõe s imune s e m coe lhos chagás icos e ta m po uc o aume nta ra m a f r e q ü ê n c i a n e m as c a r a c t e r ís t ic a s d a s alteraçõe s e letrocardiográficas registradas ao l o n g o d e u m a n o . As a l t e r a ç õ e s e le trocardiográficas registradas e m coe lhos chagás icos s ubme tidos aos testes cutâne os não for a m dife re nte s , na fr e qüê nc ia e na qua lida de , daque las obs e rvadas nos coe lhos chagás icos que não re ce be ram o antíge no. Esses dados mos tr am que o teste cutâne o c om 50pg d o a ntíg e no T12E é a bs oluta me nte in óc uo , pe los parâme tros e mpre gados nesse e studo. De fato, essa qua ntid a de de prote ína não- r e plicáve l é ins ig nific a nte dia nte da p r o d u ç ão ince s s a nte de antíge nos e m indivíduos c o m a infe c ção a guda o u crônica. Em a dição , os traçados e le trocardiográficos n ão s ão alterados e m c ons e qüê nc ia da inje ção do a ntíge no e m coe lhos controles normais . Em re s umo, a pe que na qua ntida de de prote ína desse a ntíge no inje tada e m coe lhos controle s nor ma is n ão in d u z iu s or oc onve rs ão n e m pos itivação do teste c utâne o, a pós cinc o testes s ubs e qüe nte s .
Outr o a c h a d o de inte re s s e fo i a c onfir ma ção de que o teste c utâne o po de ser
u m indic a dor de mor bida de 16. Nesse e s tudo, fo i. o b s e r v a d a in e x is t ê n c ia d e r e la ç ão e ntr e pa r a s ite mia pa te nte e alte raçõe s e le trocardiográficas. Essas s ó for am registradas após o quinto mês de infe c ção, q ua n d o as paras ite mias não e ram de mons tráve is pe lo x e nodiagnós tico. Em contraste, observou- se re lação pos itiva entre inte ns ida de de reações d e h i p e r s e n s i b i l i d a d e t a r d i a e i n í c i o e e s t a b e l e c i m e n t o d e a l t e r a ç õ e s e le trocardiográficas persistentes. Embor a os dados apre s e ntados a q ui não e s tabe le çam re lação ve rtical entre a pos itivida de no teste e alte raçõe s e le trocardiográficas , e x is te m na lite ratura20 da do s que mos tr a m inte ns a re atividade c utâne a de hip e r s e ns ibilid a de tardia a antíge nos de T. c r u z i e m pacie nte s
c om a infe c ção a guda apare nte e aus ência de r e a tivida de e m pa cie nte s c o m a for ma ina pa r e nte da in fe c ção . Em vis ta des se s achados , deve- se cons ide rar a pos s ibilida de de que o teste c utâne o c om o a ntíge no T12E seja um a fe rrame nta útil no e s tudo da doe nça de Chagas.
SUM M A RY
De lay e d- ty pe s k in hy pe rs e ns itiv ity in rabbits infe c te d w ith hom ologous o r he te rologous T. cruzi has been e lic ite d upon in je c tio n o f 50ptg o f p ro te in in the T 12E antig e n de riv e d fro m a p aras ite clone . T he s pe cificity o f this re ac tio n w as in d ic ate d by abs e nce o f s k in re activ ity in c o n tro l rabbits th at re ce iv e d s am e q u a n tity o f ant ig e n. A ls o, the in tra d e rm a l in je c tio n o f the an tig e n in fiv e o ccas ions in c o n tro l rab b its n e ith e r in d u c e d s e roconv e rsion n o r s hifte d th e ir s k in seitsitiv eness. On the othe r h an d , chagas ic rabbits th at unde rw e nt a series o f fiv e s k in testings one week apart, d id not alte r the inte ns ity o f the s k in re activ ity , a n d th e ir s pe cific s e rum antib o d y tite rs re m aine d s im ilarly h ig h . O f inte re s t, the ECG p atte rn s re m ain e d u n c h an g e d afte r a series o f fiv e s k in testings in c o ntro l a n d in chagas ic rabbits . T his s tudy show s th at the T 12E antig e n m ig h t be a n us e ful to o l f o r d iag n o s in g T. cruzi infe ctions , besides s e rv ing as an im m u n o lo g ic m ark e r f o r m o rb id ity in Ch ag as ’ disease.
Key- words: T rypanosoma cruzi. Delay ed- ty pe s k in hy persensitiiHty . T 12E antig e n. Chagas ’ disease.
A G RA D ECIM EN TO S
T e ix e ira ARL. H ipe rs e ns ibilidade tard ia a antíg e n o de Trypanosoma cruzi. I. Es tudo e x pe rim e ntal em coelhos. Re v is ta d a S ocie dade B ras ile ira de M e d ic in a T ropical 28:249- 257, jul- se t„ 1995.
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