Estudo da proteção renal com antioxidante durante isquemia e reperfusão e hiperglicemia transitória

(1)

Introdução 1

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Anestesiologia da

Faculdade de Medicina de Botucatu,

UNESP, para a obtenção do título de

Doutor

Orientador:

Professor Titular Dr. Pedro Thadeu Galvão Vianna

Botucatu – SP

2011

(2)

Introdução 2

Dedicatória Especial

Aos meus pais, pelo que fizeram por mim...

À minha família pelo que tem de esperar por

mim...

(3)

Introdução 3

Dedicatórias

Aos que me iniciaram na Anestesiologia,

Luis Antonio Paredes e Walter Teixeira Filho;

Aos que me tornaram Anestesiologista,

Bento Gonçalves, Carmen Baptista dos Santos,

Peter Spiegel, José Calasans Maia e Luiz Bomfim.

(4)

Introdução 4

Agradecimento Especial

Ao Prof. Titular Pedro Thadeu Galvão Vianna,

meu incansável orientador, pelos ensinamentos,

dedicação e paciência que me guiaram na conquista

de mais esta importante etapa da minha vida.

Muito Obrigado!

(5)

Introdução 5

Agradecimentos

À

UNESP

_{– Universidade Estadual Paulista “Júlio}

de Mesquita Filho”, pela oportunidade de acesso ao

ensino e pesquisa de qualidade.

Aos professores do Departamento de Anestesiologia

da Faculdade de Medicina de Botucatu, pela

convivência e ensinamentos ministrados com

dedicação e carinho.

À Neli Aparecida Pavan, Joana Jacirene Costa

Teixeira, Cristiano Correa de Oliveira, Jurandir

Antonio e ao acadêmico Vitor Vasques dos Santos

que colaboraram diretamente

para concretizar este objetivo.

À Prof

a

Dr

a

Maria Aparecida Domingues e à Aparecida

Vitória Gonçalves de Souza, pelas análises

laboratoriais que tornaram este estudo possível.

(6)

Introdução 6 Vinagre RCO. Estudo da proteção renal com antioxidante durante isquemia e reperfusão e hiperglicemia transitória. Botucatu, 2011. 58p. Tese (Doutorado em Anestesiologia). Faculdade de Medicina de Botucatu. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.

RESUMO

Justificativa e Objetivo: A isquemia/reperfusão (I/R) provoca lesão nas células

renais, que pode ser potencializada pela ocorrência de hiperglicemia, em ratos anestesiados com isoflurano. Sabe-se que a melatonina apresenta efeito protetor em órgãos, atuando nos produtos do estresse oxidativo. Os objetivos foram avaliar se a melatonina oferece proteção renal na I/R associada à hiperglicemia transitória e se potencializa a ação protetora do isoflurano. Método: Foram estudados 36 ratos Wistar machos distribuídos, aleatoriamente, em seis Grupos: MH – Melatonina e Hiperglicemia; M - Melatonina; H - Hiperglicemia; I - Isoflurano SH – Sham e Hiperglicemia e S - Sham. Todos os ratos foram anestesiados com isoflurano em concentrações entre 1 a 3%. A pressão arterial média (PAM), a temperatura e saturação de oxigênio foram aferidas ao longo do experimento. Hiperglicemia foi induzida com 2,5 g.kg-1 _{de solução de glicose a 50% e a melatonina utilizada na dose}

de 20 mg.kg-1_{, ambas}_{por via intraperitoneal. Todos os animais foram submetidos à}

nefrectomia direita. Nos grupos SH e S não houve isquemia. Os valores da glicemia (mg.dL-1_{) e da creatinina (mg.dL}-1_{) foram obtidos através de coleta de sangue na}

(7)

Introdução 7 análise histológica, realizada através da escala para avaliação da necrose tubular (0 a 5 = lesão máxima). Houve tratamento estatístico para os valores: peso, temperatura, saturação de oxigênio, PAM, glicose, creatinina e escore de lesão histológica.

Resultados: Não houve diferença entre o peso, temperatura e saturação de oxigênio

nos ratos. Houve diferença estatisticamente significativa entre parâmetros de PAM, em diferentes momentos e entre os grupos. A glicemia em M2 foi maior nos grupos H

(320,5±66,9), MH (363,3±99,1) e SH (311,2±86,2) em relação aos grupos M

(143,2±29,3) e I (162,7±40,2) e S (174,2±28,0). A creatinina plasmática foi maior em

M3 nos grupos MH (2,88±1,47) e H (3,18±0,99), que não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre si. No Grupo MH (2,88±1,47), a dosagem de creatinina foi estatisticamente semelhante ao grupo I (1,42±1,00), que por sua vez foi semelhante estatisticamente aos grupos M (1,00±0,46), SH (0,62±0,12) e S

(0,65±0,14). A análise histológica mostrou no primeiro, no terceiro quartil e na mediana que os grupos MH (3,0;[2,0;3,0]) e H (2,5;[2,0;3,0]) não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre si, porém apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0,05) em relação aos grupos M (0,0[0,0;0,0]), SH (0,0[0,0;0,0]) e S

(0,0[0,0;0,0]). O grupo I (2,0[1,0;3,0]) expressou valores intermediários (medianas e [quartis]). Conclusões: Nesse modelo de isquemia-reperfusão renal, em rato, o isoflurano conferiu grau de proteção contra a lesão renal, assim como a melatonina potencializou o efeito do isoflurano na I/R, sem hiperglicemia. A melatonina não protegeu e houve lesão renal bem definida quando a hiperglicemia aguda transitória foi associada à I/R. Desse modo concluiu-se que, em ratos anestesiados com isoflurano, a melatonina protegeu da lesão renal pela I/R mas, neste mesmo modelo, não protegeu da lesão quando a hiperglicemia foi associada.

Palavras-chave: Hiperglicemia; Isquemia; Isoflurano; Lesão renal; Melatonina; Rato;

(8)

Introdução 8 Ronaldo COV. Study of kidney protection with antioxidant in rats ischemia and reperfusion model with transient hyperglycemia. Botucatu, 2011. 58p. Thesis (PhD in Anesthesiology), Botucatu Medical School, São Paulo State University, UNESP.

ABSTRACT

Backgroud and objective: Ischemia/reperfusion (I/R) cause renal cell injury that may

be worsened by hyperglycemia in rats anesthetized with isoflurane. N-acetyl-5-methoxytryptamine (melatonin) is known to have a protective effect on multiple organs by acting on the products of oxidative stress. The objectives of this study were to determine whether melatonin provides renal protection during I/R associated with transient hyperglycemia, and whether it enhances isoflurane protective action. Method:

Thirty-six Wistar male rats were randomly allocated into six groups: MH – hyperglycemia and melatonin; M - melatonin; H - hyperglycemia; I – isoflurane, SH – sham and hyperglycemia, and S - sham. All rats were anesthetized with isoflurane at concentrations of 1 to 3%. Mean arterial pressure (MAP), temperature and oxygen saturation were measured throughout the experiment. Hyperglycemia was induced by intraperitoneal 2.5 g.kg-1_{of glucose solution at 50%, and 20 mg.kg}-1_{of melatonin. All}

animals underwent right side nephrectomy. There was no ischemia in groups SH and

S. Glycemia (mg.dL-1_{) and creatinine (mg.dL}-1_{) values were obtained through the}

(9)

Introdução 9 5 = maximum lesion). Weight, temperature, oxygen saturation, MAP, glucose, creatinine and histologic lesion score values were statistically treated. Results: No difference in weight, temperature and oxygen saturation were observed. MAP parameters showed statistically significant differences among time points and groups. Glycemia (mg.dL-1_{) at}_M2_{was higher in groups}_H_{(320.5±66.9),}_MH_{(363.3±99.1) and} SH (311.2±86.2) than in groups M (143.2±29.3) and I (162.7±40.2) and S (174.2±28.0). Plasma creatinine (mg.dL-1_{) was higher at}_M3_{in groups}_MH_{(2.88±1.47) and}_H

(3.18±0.99), which did not significantly differ from each other. In group MH (2.88±1.47), creatinine dosage was statistically similar to that in group I (1.42±1.00), which in turn was similar to those in groups M (1.00±0.46), SH (0.62±0.12) and S (0.65±0.14). Histologic analysis showed that, in the first and third quartile and median, there was no significant difference between groups MH (3.0;[2.0;3.0]) and H (2.5;[2.0;3.0]), which significantly differed (p<0.05) from groups M (0.0[0.0;0.0]), SH (0.0[0.0;0.0]) and S

(0.0[0.0;0.0]). Group I (2.0[1.0;3.0]) expressed intermediate values (medians and [quartiles]). Conclusions: In the renal ischemia/reperfusion rat model used in this study, isoflurane had a protective effect against kidney injury while melatonin enhanced isoflurane effect in group M (I/R without hyperglycemia). Melatonin had no protective effect and kidney injury was clearly seen when transient hyperglycemia associated with I/R. In conclusion, although melatonin protected the kidney against I/R injury in rats anesthetized with isoflurane, this protective effect was not observed in the presence of hyperglycemia .

Key words: Hyperglycemia; ischemia; Isoflurane; renal lesion; Melatonin; Rat;

(10)

Introdução 10

SUMÁRIO

RESUMO ABSTRACT LISTA DE TABELAS LISTA DE GRÁFICOS LISTA DE FIGURAS 1. INTRODUÇÃO ... 14

2. OBJETIVO ... 18

3. MATERIAL E MÉTODO ... 19

3.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS... 19

3.2 SEQUÊNCIA EXPERIMENTAL... 22

3.3 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA ... 32

3.4 METODOLOGIA ESTATÍSTICA ... 33

4. RESULTADOS... 34

4.1 PESO DOS ANIMAIS... 34

4.2 TEMPERATURA... 35

4.3 PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (PAM)... 36

4.4 GLICEMIA... 37

4.5 CREATININA... 38

4.6 HISTOLOGIA... 39

5. DISCUSSÃO... 42

6. CONCLUSÃO... 53

(11)

Introdução 11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Graduação da lesão celular atribuída aos exames

histológicos... 33

Tabela 2 Peso dos animais por grupos. Média e desvio padrão (DP) 34

Tabela 3 Temperatura corporal dos animais... 35

Tabela 4 Média e desvio-padrão referentes à PAM segundo

momento e grupo... 36

Tabela 5 Média e desvio-padrão referentes à glicemia segundo o

momento e o grupo... 37

Tabela 6 Média e desvio-padrão referentes à creatinina segundo o

Tabela 7 Mediana, 1° e 3° quartil, referentes à histologia segundo

grupo... 39

Tabela 8 Critérios da Acute Kidney Injury Network (AKIN) para

(12)

Introdução 12

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Média e desvio-padrão referentes à PAM segundo momento e

grupo. ... 36

Gráfico 2 Média e desvio-padrão referentes à glicemia segundo o

momento e o grupo. ... 37

Gráfico 3 Média e desvio-padrão referentes à creatinina segundo o

Gráfico 4 Mediana, 1° e 3° quartil, referentes à histologia segundo

(13)

Introdução 13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ligadura temporária da artéria renal esquerda ... 21

Figura 2 Histologia - Grupo Sham (S) 400x... 40

Figura 3 Histologia - Grupo Melatonina (M) 400x... 40

Figura 4 Histologia - Grupo Melatonia + Hiperglicemia (MH) A - 200x e B

400x... 41

Figura 5 Histologia - Grupo Hiperglicemia (H) A – 200x e B 400x... 41

(14)

Introdução 14

A lesão renal aguda durante o período perioperatório é uma complicação grave, relacionada à alta morbimortalidade, geralmente definida como uma rápida diminuição da função renal associada a acúmulo de escórias nitrogenadas, uréia e creatinina no plasma. Geralmente associa-se a desfecho ruim, principalmente quando, evolutivamente, requer diálise. A utilização de estratégias objetivando proteger a função renal é necessária para oferecer melhor prognóstico aos pacientes nesta situação.1

Anestesiologistas têm uma importante função na proteção renal perioperatória quando há risco de lesão ou de destruição renal. A identificação dos pacientes com risco de lesão renal e a monitoração constante dos parâmetros hemodinâmicos são muito importantes para que os fatores de risco sejam minimizados.2

Durante e após procedimentos cirúrgicos a resposta fisiológica ao estresse, muito bem definida, ativa mediadores inflamatórios, endócrinos, metabólicos e imunológicos.2_{A hiperglicemia transitória nestes períodos é fato comprovado,}

decorrente do estresse oxidativo. Se até a alguns anos acreditava-se que era uma resposta adaptativa e benéfica em cirurgias de pacientes graves, atualmente é identificada como importante fator contribuindo para a morbimortalidade peri e pós-operatória. Deve ser combatida com a manutenção rigorosa de níveis glicêmicos, o mais próximo da normalidade possível.3,4_{Van den Berghe et al.}5_{publicaram estudo em}

(15)

Introdução 15 apresentados o controle da glicemia tomou importância fundamental.5_{A hiperglicemia}

piora o desfecho de cirurgias e transplantes de vários órgãos, além de ter importância no prognóstico de cirurgias cardíacas, principalmente aquelas com circulação extracorpórea, onde o estresse oxidativo é exacerbado; cirurgias vasculares e cirurgias realizadas nos rins, inclusive transplantes renais, quando a ocorrência de hiperglicemia transitória pode inviabilizar o rim implantado. Estes efeitos adversos envolvem isquemia/reperfusão (I/R), provavelmente, o motivo pela qual a hiperglicemia aguda é ainda mais deletéria aos pacientes. A hiperglicemia aumenta o estresse oxidativo, inerente ao próprio procedimento anestésico-cirúrgico. Os mecanismos deste aumento da sensibilidade à lesão causada por isquemia/reperfusão durante hiperglicemia ainda são muito pouco compreendidos.3,4,6-8

A necrose tubular aguda, consequencia final da lesão renal aguda, ocorre por uma combinação de dano microvascular e tubular. A vasoconstrição intrarrenal que ocorre pela ação de mediadores vasoativos locais, a ativação da resposta tubuloglomerular, a danificação da estrutura endotelial e a ativação leucocitária levam, inevitavelmente, à deterioração microvascular. Os mecanismos da lesão tubular ainda incluem apoptose, necrose epitelial, obstrução tubular e extravasamento transglomerular do filtrado glomerular. Quando ocorre hiperglicemia estes danos, e os próprios mecanismos, estão aumentados.4,7,9

A lesão causada da I/R é um fenômeno complexo que pode causar danos celulares estruturais e funcionais. Os eventos que ocorrem durante a I/R vêm sendo muito estudados nas últimas três décadas e vários mecanismos têm sido propostos para explicar a origem dos danos ao tecido submetido ao processo. Apesar da hipóxia e da acidose estarem frequentemente envolvidos na lesão que ocorre durante o período isquêmico, a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o recrutamento de

(16)

Introdução 16 lesão isquemia/reperfusão ainda ser controverso. Em grandes concentrações, NO interage com superóxido e produz perioxinitrato, um potente oxidante da membrana celular. O óxido nítrico também modula interações celulares leucócito-endoteliais, inibe a infiltração neutrofílica e a agregação plaquetária. Todos estes eventos são importantes durante o processo isquemia/reperfusão.

A reperfusão renal, com a consequente reoxigenação adequada do tecido renal é, por sua vez, outro desafio. O fluxo sanguíneo para os rins é autorregulado, para manter a filtração glomerular estável, entre pressão arterial média de 80 a 160 mm Hg. A autorregulação mantém o balanço de fluidos e sais, preservando a estrutura glomerular através de uma resposta miogênica tubuloglomerular.7-10

Mesmo sem evidências sólidas de que algum fármaco possa proteger os rins contra a lesão renal aguda no período perioperatório, salvo em condições especiais, alguns fármacos podem ser utilizados no controle da lesão renal aguda. Antioxidantes, conhecidos como “varredores” de ROS, como a N-(2-mercaptopropionil 1) glicina (MPG)

e o Mn(III) tetrekis (4-ácido benzóico) cloreto de porfirina (MnTBAP), bloqueiam a proteção cardíaca causada pelo isoflurano.3_{Entretanto, posteriormente, exercem efeitos}

benéficos inibindo a formação de ROS. Igualmente, a N-acetilcisteina bloqueio o PCA

com isoflurano em coelhos intactos.11-13

Anestésicos inalatórios protegem órgãos de forma semelhante ao pré-condicionamento isquêmico, o conhecido pré-condionamento anestésico (PCA). Estudos mostraram o paradoxo de ROS no PCA: é necessária liberação inicial de ROS

para ocorrer proteção do órgão, com posterior inibição da formação destes.12

Radogna et al.14_{mostraram que, em leucócitos normais e tumorais, melatonina}

causa rápida e transitória produção de ROS. Assim, pode-se lançar a hipótese de que,

(17)

Introdução 17 sangue e no liquor para exercer funções regulatórias no ciclo circadiano. Apesar de agir no Sistema Nervoso Central, primariamente, como marcapasso circadiano e reguladora dos eixos hipotálamo e hipofisário, a melatonina age perifericamente em vários locais do organismo, com algumas diferentes funções, o que é explicado por suas ações independentes de receptores. Sua ação como antioxidante é particularmente eficiente em diminuir o dano causado por radicais livres ao DNA. Se este dano não for interrompido ou reparado pode causar mutações importantes e iniciar o processo de degeneração celular, tumoral. Como número significativo de tumores em seres humanos envolvem danos no DNA, consequente a exposição aos produtos tóxicos do oxigênio e do nitrogênio, espera-se que antioxidantes que protejam o DNA reduzam a incidência de câncer. Evidências fortes sugerem que a melatonina protege o DNA destes danos mais eficientemente do que outros antioxidantes clássicos.15-18

A melatonina, assim como seu metabólito 6-hidroximelatonina, possuem ação direta e indireta sobre radicais de oxigênio e nitrogênio, com evidências na redução da lesão oxidativa em rins e em outros órgãos, de ratos, em algumas situações.19-21

Portanto, apesar de existirem evidências de que a melatonina pode agir como varredora de radicais e metabólitos reativos do oxigênio e do nitrogênio,21-23_{não há}

(18)

Objetivos 18 O objetivo do estudo foi avaliar no modelo I/R, em ratos, se a melatonina:

(19)

Material e Métodos 19

O experimento foi realizado no Laboratório Experimental de Anestesiologia da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP. Após aprovação na Comissão de Ética e Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, 36 ratos Wistar, machos, com peso entre 320 e 400 gramas fornecidos pelo Biotério Central do Campus de Botucatu, UNESP, foram incluídos no estudo.

3.1 Grupos

Experimentais

Os animais foram divididos, aleatoriamente, em seis grupos de seis animais.

No Grupo M (Melatonina) os ratos foram submetidos à injeção intraperitoneal de de

20 mg.kg-1 _de _{melatonina diluída em álcool a 1%. No}_{Grupo H (Hiperglicemia)}_foi

injetada, pela mesma via, solução de glicose a 50%, 2,5 g.kg-1_{, objetivando causar}

hiperglicemia transitória. No Grupo MH (Melatonina e Hiperglicemia) foi injetada melatonina, na dose de 20 mg.kg-1_{, e glicose hipertônica a 50%, na dose de 2,5 g.kg}-1_{. No}

Grupo I (Isoflurano), os ratos foram anestesiados com isoflurano, e submetidos ao

procedimento cirúrgico com nefrectomia direita e fechamento abdominal. Nos Grupos

S (Sham) e SH (Sham + Hiperglicemia) foi realizada a nefrectomia direita. No Grupo

SH (Sham + Hiperglicemia) foi tambéminjetado glicose hipertônica a 50%, 2,5 g.kg-1_.

(20)

Os animais foram anestesiados por cinco minutos em compartimento acrílico com oxigênio, 3 a 4 litros por minuto e isoflurano, em concentrações que variaram entre 3 e 4%, em aparelho de anestesia Datex-Ohmeda 210 SE£

e vaporizador calibrado Isotec 5 Ohmeda£

por 5 minutos. Foram mantidos em respiração espontânea através de dispositivo “facial”. Após o animal ser anestesiado, foi introduzido sensor para monitorização de temperatura retal (TR) objetivando aferir a temperatura corporal e mantê-la entre 37ºC e 38ºC usando bolsas de gel aquecidas (Bolsa Térmica Gel – Body Care - Mercur£

). Foi colocado sensor de oximetria de pulso em uma das patas para monitorização contínua da saturação de oxigênio (Sat O2).

Foram dissecadas a veia jugular interna direita e a artéria carótida esquerda. Na veia jugular foi mantida hidratação com Ringer lactato, 3 mL.h-1_{usando bomba de}

infusão Anne£

, (ABBOTT Laboratórios do Brasil Ltda.). A artéria carótida foi utilizada para monitorização da pressão arterial média (PAM) e da frequência cardíaca (FC) do animal.

Toda a monitorização foi realizada através do aparelho Datex-Engstron£

(Finlândia). Os atributos dos animais foram anotados em protocolo individual, para cada rato, com intervalos de 5 minutos até o 15º minuto e a cada 15 minutos entre o 15º e o 75º minutos do experimento (PAM, FC, TR, e SatO2). Todos os parâmetros

foram aferidos e anotados pelo mesmo pesquisador.

Após monitorização e dissecção da artéria carótida foi colhida amostra de sangue arterial, para dosagem de creatinina e glicemia séricas (M1) e reposto com o volume de 2 mL de Ringer lactato.

(21)

esquerda. O animal teve seu abdome fechado por sutura contínua e a isquemia renal mantida por 25 minutos. Nos animais dos grupos S e SH o rim esquerdo permaneceu intacto, ou seja, não foi realizado “clampeamento” temporário da arterial e a isquemia de 25 minutos do rim esquerdo.

Figura 1 - Ligadura temporária da artéria renal esquerda e consequente isquemia renal,

demonstrada pela imediata alteração de cor do rim isquêmico.

Terminado o tempo de isquemia, o abdome do animal era reaberto, nova amostra de sangue arterial era colhida para dosagens de glicose e de creatinina séricas (M2) e retirado o “clamp” da artéria renal esquerda para reperfusão do órgão. Após fechamento da parede abdominal o rato foi despertado e encaminhado ao biotério, onde permaneceu por vinte e quatro horas. Todos os animais foram anestesiados na região cervical com 0,3 mL de bupivacaína a 0,2% e na região abdominal com 0,7 mL de bupivacaína a 0,2%.

A manutenção da anestesia durante todo o período foi obtida com isoflurano nas concentrações que variaram entre 1 e 3%, com fluxo de oxigênio de 1 litro por minuto, e respiração espontânea.

RIM ISQUÊMICO

BAÇO

ARTÉRIA RENAL ESQUERDA

(22)

Vinte e quatro horas após, os animais foram anestesiados com oxigênio e isoflurano, utilizando a mesma técnica e reabertura de abdome. A nefrectomia esquerda foi realizada e colhida a terceira amostra de sangue arterial para dosagens de creatinina e de glicose sanguíneas (M3), diretamente do coração do animal sendo este imediatamente sacrificado com 125 mg de tiopental em injeção intracardíaca.

O rim esquerdo foi mantido em solução de Duboscq-Brasil por no mínimo 48 horas, quando era transferida para solução de álcool 70% e encaminhada ao laboratório de patologia clínica animal. A solução de Duboscq-Brasil, preparada com 6 mL de formol a 40%, 12 mL de álcool absoluto, 1,5 mL de ácido acético e 8 mL de ácido pícrico foi utilizada com o objetivo de preservar e fixar as estruturas renais e aumentar a fidedignidade da análise histológica.

3.2 Sequência

Experimental

Os animais foram alocados, aleatoriamente, nos seguintes grupos:

Grupo Melatonina (Grupo M)

1. Indução da anestesia geral com oxigênio a 100%, com fluxo entre 3 e 4 litros por minuto e isoflurano em concentração de 3 a 4% por 5 minutos.

2. Anestesia mantida com oxigênio, 1 litro por minuto e isoflurano em concentração variável entre 1 e 3%.

3. Monitorização da temperatura retal e da oximetria de pulso.

4. Dissecção da veia jugular interna direita e da artéria carótida esquerda.

(23)

Material e Métodos 23 6. Hidratação com Ringer lactato em infusão venosa de 3 mL.h-1_{, utilizando a}

bomba de infusão ANNE£

(ABBOTT Laboratórios do Brasil Ltda.) e a veia jugular interna direita.

7. Coleta de 1 mL de sangue arterial (M1) para dosagens de creatinina e de glicose séricas. Reposição do volume sanguíneo colhido com 2 mL de Ringer lactato.

8. Injeção de 20 mg.kg-1_{de melatonina, via intraperitoneal.}

9. Trinta minutos após a injeção da melatonina abertura da cavidade abdominal. Foi feita nefrectomia direita e ligadura temporária da artéria renal esquerda durante 25 minutos.

10. Fechamento da parede abdominal com sutura contínua.

11. Após 25 minutos de isquemia renal, o abdome do rato foi reaberto sendo colhida a segunda amostra de sangue arterial para dosagem de creatinina e glicose séricas (M2). Reposição do volume sanguíneo colhido com 2 mL de Ringer lactato.

12. Retirada do “clamp” para reperfusão do órgão.

13. Após infiltração local com 0,7 mL de bupivacaína a 0,2%, foi realizado o fechamento do peritônio e da parede abdominal.

14. Ligaduras da artéria carótida, da veia jugular e sutura da ferida. Infiltração local com 0,3 mL de bupivacaina a 0,2 %.

15. Interrupção do isoflurano.

16. Despertar do animal.

17. Retorno do rato à gaiola com água e alimentação oferecidas livremente.

18. Encaminhado ao biotério e permanecendo neste local por vinte e quatro horas.

19. Vinte e quatro horas após o rato foi anestesiado com a mesma técnica descrita anteriormente.

(24)

Material e Métodos 24 21. O rim esquerdo retirado foi imerso em solução de Duboscq-Brasil, onde ficou por no mínimo 48 horas, sendo então transferido para solução de álcool a 70% e encaminhado ao laboratório de patologia clinica animal.

22. Colhida a terceira amostra de sangue arterial (M3) diretamente do ventrículo esquerdo.

23. Sacrifício do rato com injeção intraventricular de 125 mg de tiopental sódico.

24. Descarte do animal após confirmação de sua morte.

Grupo Melatonina + Hiperglicemia (Grupo MH)

1. Indução da anestesia geral com oxigênio a 100%, com fluxo entre 3 e 4 litros por minuto e isoflurano em concentração de 3 a 4 % por 5 minutos.

2. Anestesia mantida com oxigênio, 1 litro por minuto e isoflurano em concentração variável entre 1 e 3 %.

5. Monitorização da pressão arterial média (PAM) usando a artéria carótida esquerda.

6. Hidratação com Ringer lactato em infusão venosa de 3 mL.h-1_{, utilizando a}

7. Coleta de 1 mL de sangue arterial (M1) para dosagens de creatinina e de glicose séricas. Reposição do volume sanguíneo colhido com 2 mL de Ringer lactato.

8. Injeção de 20 mg.kg-1_{de melatonina por via intraperitoneal e de glicose a 50%,}

(25)

Material e Métodos 25 9. Trinta minutos após a injeção intra-abdominal da melatonina e da glicose foi

realizada nefrectomia direita e clampeamento da artéria renal esquerda durante 25 minutos.

10. Fechamento da parede abdominal com sutura contínua.

11. Após 25 minutos de isquemia renal, a sutura continua foi desfeita e colhida à segunda amostra de sangue arterial para dosagens de creatinina e de glicose séricas (M2). Foi reposto o volume de 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular.

12. Retirada do “clamp” para a reperfusão do órgão.

13. Fechamento da parede abdominal e infiltração com anestésico local (0,7 mL de bupivacaina a 0,2%).

14. Ligadura da artéria carótida da veia jugular e sutura da ferida. Infiltração do local com 0,3 mL de bupivacaína a 0,2%.

17. Retorno do rato a gaiola com água e alimentação oferecidas livremente.

18. O animal foi encaminhado ao biotério e permanecendo neste local por vinte e quatro horas.

20. Realizada abertura do abdome e nefrectomia esquerda.

21. O rim esquerdo retirado foi imerso em solução de Duboscq-Brasil, onde ficou por no mínimo 48 horas, sendo então transferido para solução de álcool a 70% e encaminhado ao laboratório de patologia clínica animal.

(26)

Material e Métodos 26 24. Descarte do animal após confirmação de sua morte.

Grupo Hiperglicemia (Grupo H)

2. Anestesia mantida com oxigênio 1 litro por minuto e isoflurano em concentração variável entre 1 e 3 %.

5. Monitorização da PAM usando a artéria carótida esquerda.

7. Coleta de 1 mL de sangue arterial (M1) para dosagem de creatinina e glicose séricas. Após retirada do sangue, reposto 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular.

8. Injeção intraperiponeal de glicose a 50%, 2,5 g.kg-1_.

9. Trinta minutos após a injeção de glicose foi feita a abertura da cavidade abdominal, realizada nefrectomia direita e ligadura temporária da artéria renal esquerda.

10. Fechamento do peritônio e da parede abdominal com sutura contínua.

(27)

Material e Métodos 27 12. Retirada do “clamp” para a reperfusão do órgão.

13. Fechamento da parede abdominal e infiltração desta com 0,7 mL de bupivacaina a 0,2%.

14. Ligaduras da artéria carótida e da veia jugular e sutura da ferida. Infiltração do local com 0,3 mL de bupivacaína a 0,2%.

18. Encaminhado ao biotério e permanecendo neste local por vinte e quatro horas.

Grupo Isoflurano (Grupo I)

2. Anestesia mantida com oxigênio, 1 litro por minuto e isoflurano em concentração variável entre 1% e 3 %.

(28)

Material e Métodos 28 4. Dissecção da veia jugular interna direita e da artéria carótida esquerda.

(ABBOTT Laboratórios do Brasil Ltda.).e a veia jugular interna direita.

7. Coleta de 1 mL de sangue arterial (M1) para dosagem de creatinina e glicose séricas. Após retirada do sangue, reposto 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular.

8. Trinta minutos após a injeção intra-abdominal de soro fisiológico a cavidade abdominal foi aberta e realizada nefrectomia direita e ligadura temporária da artéria renal esquerda durante 25 minutos.

9. Fechamento do peritônio e da parede abdominal em sutura contínua.

10. Após 25 minutos de isquemia do órgão, o abdome do rato foi reaberto e colhida a segunda amostra de sangue arterial para dosagens de creatinina e de glicose séricas (M2). Foi reposto o volume de 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular interna.

11. Retirada do “clamp” para a reperfusão do órgão.

12. Fechamento da parede abdominal.

13. Ligadura da artéria carótida e da veia jugular. Sutura e infiltração da ferida com 0,3 mL de bupivacaina a 0,2%.

(29)

Material e Métodos 29 18. Vinte e quatro horas após o rato foi anestesiado com a mesma técnica descrita

anteriormente.

21. Colhida a terceira amostra (M3) de sangue arterial, diretamente do ventrículo esquerdo.

Grupo Sham (Grupo S)

1. Indução da anestesia geral com oxigênio a 100%, com fluxo entre 3 e 4 litros por minuto e isoflurano em concentração de 3% a 4 % por 5 minutos.

(ABBOTT Laboratórios do Brasil Ltda.) e a veia jugular.

(30)

Material e Métodos 30 8. Trinta minutos após a injeção intra-abdominal de soro fisiológico foi feita a

abertura da cavidade abdominal e feita a nefrectomia direita.

9. Após 25 minutos foi colhida a segunda amostra de sangue arterial para dosagens de creatinina e de glicose séricas (M2). Foi reposto o volume de 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular interna.

10. Fechamento do peritônio e da parede abdominal. Sutura e infiltração da ferida com bupivacaina 0,7 mL a 2%.

15. O animal foi encaminhado ao biotério para permanência por vinte e quatro horas.

16. Vinte e quatro horas após o rato foi anestesiado com a mesma técnica do experimento.

17. Realizada laparotomia e nefrectomia esquerda.

(31)

Grupo Sham + Hiperglicemia (Grupo SH)

1. Indução da anestesia geral com oxigênio a 100%, com fluxo entre 3 e 4 litros por minuto e isoflurano em concentração de 3% a 4 % por 5 minutos.

4. Dissecção da veia jugular interna direita e da artéria carótida esquerda

7. Coleta de 1 mL de sangue arterial (M1) para dosagem de creatinina e glicose séricas. Após retirada do sangue, reposto 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular interna direita.

8. Injeção de glicose a 50%, 2,5 g.kg-1_.

9. Trinta minutos após a injeção intra-abdominal de glicose abertura da cavidade abdominal e realizada nefrectomia direita.

10. Após 25 minutos foi colhida a segunda amostra de sangue arterial para dosagem de creatinina e glicose séricas (M2). Foi reposto o volume de 2 mL de Ringer lactato pela veia jugular.

11. Fechamento do peritônio e da parede abdominal e infiltração da ferida com 0,7 mL de bupivacaina a 0,2%.

(32)

Material e Métodos 32 14. Despertar do animal.

16. Encaminhado ao biotério permanecendo o animal por vinte e quatro horas.

18. Realizada laparotomia e nefrectomia esquerda.

3.3 Avaliação

Histológica

Após ser retirado, o rim esquerdo foi mantido em solução de Duboscq-Brasil durante as primeiras 48 horas sendo, a seguir, acondicionado em álcool a 70% para avaliação histológica posterior. A solução de Duboscq-Brasil é uma solução utilizada para a preservação, fixação das estruturas renais e aumento da fidedignidade da análise histológica, formulada com: álcool 80%, 150 mL; ácido pícrico, 2,4 g; formalina 40%, 60 ml; ácido acético glacial, 12,5 mL.

O corante usado para a avaliação histológica foi hematoxilina-eosina e os cortes foram examinados sob diversos aumentos de microscopia ótica.

(33)

classificadas com o uso de um escore descrito por Park e colaboradores, em 2008, apresentado a seguir na tabela 1.24

Tabela 1 - Graduação da lesão celular atribuída aos exames histológicos

GRAU TIPO % DA LESÃO (área de necrose)

0 Sem lesão -

1 Leve _< 10%

2 Moderada 10 a 25%

3 Moderada a Grave 25 a 50%

4 Grave 50 a 75%

5 Muito grave _> 75%

Adaptado de Park et al. 200824

A patologista que realizou a avaliação histológica não conhecia a que grupo pertencia o rim examinado.

3.4 Metodologia

Estatística

Para as variáveis de peso foi utilizada a análise de variância no delineamento inteiramente ao acaso, seguida do teste de Tukey quando necessário.

Para as demais variáveis cujo interesse era comparar grupos e momentos, foi utilizada a análise de perfil.

(34)

Resultados 34

4.1 PESO DOS ANIMAIS

Não houve diferença estatisticamente significativa no peso, em gramas, dos ratos incluídos nos seis grupos do estudo.

Tabela 2 - Peso dos animais por grupos. Média e desvio padrão (DP).Grupos MH (Melatonina

+ Hiperglicemia), H (Hiperglicemia). M (Melatonina), I (Isoflurano), SH (Sham + Hiperglicemia),

S (Sham)

Grupo Média ± DP

H 361,7 ± 44.0

MH 353,3 ± 24,2

I 380,0 ± 35,8

M 346,7 ± 23,4

SH 366,7 ± 21,6

S 351,7 ± 29,3

p = 0,47

(35)

Resultados 35

4.2 TEMPERATURA CORPORAL DOS ANIMAIS

Não houve diferença estatisticamente significativa entre momentos em cada grupo e entre grupos

Tabela 3 - Temperaturas dos animais

p = 0,54

Grupo Momento

M1 M2 M3

H 37,2 ± 0,5 37,6 ± 0,6 36,8 ± 1,4

MH 36,9 ± 1,2 37,2 ± 0,5 37,4 ± 0,5

I 36,9 ± 0,5 36,9 ± 1,2 36,7 ± 0,6

M 37,4 ± 0,2 37,7 ± 0,4 36,7 ± 0,8

SH 36,2 ± 1,2 37,1 ± 0,5 37,4 ± 0,3

(36)

Resultados 36 Ϭ ϮϬ ϰϬ ϲϬ ϴϬ ϭϬϬ ϭϮϬ ϭϰϬ ϭϲϬ

, ,D / D ^, ^

WϬ Wϭ WϮ ΎΎ Ύ ΎΎ

4.3 PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (PAM)

Houve diferença estatisticamente significativa estatisticamente significativa entre momentos em cada grupo e entre grupos

Tabela 4 - Média e desvio-padrão referentes à PAM segundo momento e grupo

Grupo _{M1 M2 M3}Momento

H 131 ± 14 aA 111 ± 16 abA 94 ± 25 bA

MH 119 ± 30 aAB 101 ± 24 aA 97 ± 27 aA

I 110 ± 13 aAB 91 ± 21 aA 85 ± 20 aA

M 128 ± 12 aA 115 ± 12 aA 107 ± 18 aA

SH 91 ± 27 aB 96 ± 16 aA 94 ± 24 aA

S 106 ± 9 aAB 86 ± 21 aA 100 ± 15 aA

p < 0,001

Letras minúsculas comparam médias de momentos em cada grupo Letras maiúsculas comparam médias de grupos em cada momento

Médias seguidas de pelo menos 1 letra em comum não diferem estatisticamente

Gráfico 1 - Média e desvio-padrão referentes à PAM (Pressão Arterial Média) segundo

momento e grupo. * M1 > M3 em H; ** SH M e H em M1 (p < 0,001).

(37)

Resultados 37 Ϭ ϱϬ ϭϬϬ ϭϱϬ ϮϬϬ ϮϱϬ ϯϬϬ ϯϱϬ ϰϬϬ ϰϱϬ ϱϬϬ

, ,D / D ^, ^

Dϭ DϮ Dϯ Ύ Ύ Ύ

4.4 GLICEMIA (mg.dL

-1

₎

Houve diferença estatisticamente significativa entre momentos em cada Grupo e entre Grupos.

Foi utilizada a análise de perfil. O nível de significância utilizado foi de 5%.

Tabela 5 -Média e desvio-padrão referentes à glicemia segundo o momento e o grupo

Momento

Grupo M1 M2 M3

H 153,5 ± 17,8 bA 320,5 ± 66,9 aA 163,2 ± 23,8 bA

MH 145,7 ± 18,6 bA 363,3 ± 99,1 aA 161,8 ± 28,2 bA

I 157,7 ± 16,5 aA 162,7 ± 40,2 aB 189,0 ± 11,9 aA

M 165,5 ± 14,3 aA 143,2 ± 29,3 aB 212,5 ± 27,8 aA

SH 164,0 ± 20,1 bA 311,2 ± 86,2 aA 184,0 ± 12,9 abA

S 171,3 ± 20,8 aA 174,2 ± 28,0 aB 179,3 ± 20,9 aA

p < 0,001

Gráfico 2 - Média e desvio-padrão referentes à glicemia segundo os momentos e os grupos.

* H = MH = SH > M = I = S em M2 (p < 0,001)

(38)

Resultados 38 Ϭ ϭ Ϯ ϯ ϰ ϱ

, ,D / D ^, ^

Dϭ DϮ Dϯ Ύ ΎΎ ΎΎ Ύ ΎΎ

4.5 CREATININA (mg.dL

-1

₎

Os valores médios da creatinina plasmática (mg.dL-1_{) obtidos foram similares}

entre os grupos nos momentos M1, imediatamente após a dissecção da artéria carótida esquerda; M2, imediatamente antes da retirada do clamp do rim esquerdo,

mas, foram estatisticamente diferentes em relação ao M3, vinte e quatro horas após, imediatamente depois da nefrectomia esquerda. Os valores médios da creatinina plasmática nos momentos em cada grupo, só variaram nos grupos MH e H em M3, no momento da coleta de sangue, imediatamente a nefrectomia esquerda.

Foi utilizada a análise de perfil. O nível de significância utilizado foi de 5%.

Tabela 6 – Média e desvio-padrão referentes à creatinina segundo o momento e o grupo

Momento

Grupo M1 M2 M3

H 0,32 ± 0,04 bA 0,57 ± 0,08 bA 3,18 ± 0,99 aA

MH 0,28 ± 0,04 bA 0,52 ± 0,04 bA 2,28 ± 1,47 aAB

I 0,40 ± 0,06 aA 0,57 ± 0,05 aA 1,42 ± 1,00 aBC

M 0,30 ± 0,00 aA 0,53 ± 0,05 aA 1,00 ± 0,46 aC

SH 0,30 ± 0,09 aA 0,30 ± 0,06 aA 0,62 ± 0,12 aC

S 0,28 ± 0,04 aA 0,32 ± 0,04 aA 0,65 ± 0,14 aC

p < 0,001

Gráfico 3 - Média e desvio-padrão referentes à creatinina (mg.dL-1) segundo os momentos e os

grupos.

* H = MH; I = MH em M3; M1 e M2 < M3 em H e MH; (p < 0,001) ** M = SH = S < H = MH; I = M = SH = S em M3 (p < 0,001)

(39)

Resultados 39 * * *

4.6 HISTOLOGIA

Os valores obtidos através dos exames histológicos mostraram que os Grupos

MH, hiperglicemia seguida de melatonina; H, hiperglicemia e o I - sem hiperglicemia e melatonina não diferiram estatisticamente entre si, enquanto apresentaram diferença estatisticamente significativa para os outros grupos, M, melatonina; SH, sham com hiperglicemia e S, sham,que também não diferiram entre si.

Para a variável histológica foi utilizado o teste de Kruskall-Wallis. O nível de significância utilizado foi de 5%.

Tabela 7 - Mediana, 1° e 3° quartil, referentes à histologia segundo grupo

Grupo Mediana 1° quartil 3° quartil

H 2,5 A 2,0 3,0

MH 3,0 A 2,0 3,0

I 2,0 A 1,0 3,0

M 0,0 B 0,0 0,0

SH 0,0 B 0,0 0,0

S 0,0 B 0,0 0,0

p < 0,001

Gráfico 4 – “Box Plot” Mediana, 1° e 3° quartil, referentes aos escores de porcentagem de

lesão tubular nos grupos.

*H = MH = I > M = S = SH (p < 0,001)

(40)

Resultados 40

Figura 2 - Grupo sham (S) – grau zero de Park23 (aumento 400x)

(41)

Resultados 41

Figura 4 - Grupo melatonina + hiperglicemia (MH) – grau três de Park23;A aumento 200x; B

aumento 400x

Figura 5 - Grupo Hiperglicemia (H) – grau cinco de Park23; A aumento 200x; B aumento 400x

(42)

Discussão 42

O estudo utilizou o modelo isquemia/reperfusão (I/R) em ratos desenvolvido pelo laboratório de Anestesia Experimental da UNESP, campus de Botucatu. É um modelo consolidado, tendo sido utilizado para estudos de proteção renal em mais de 1000 ratos machos Wistar, em que há controle da ventilação pulmonar, pressão

arterial e temperatura.

Foi realizada nefrectomia direita para que não houvesse compensação do rim contralateral, sendo a isquemia temporária renal executada com clamp microvascular

atraumático, garantindo assim a integridade vascular com subseqüente reperfusão adequada após a liberação do fluxo pelo vaso, iniciando o processo de reperfusão.

Estas preocupações com o modelo são importantes para que não ocorram fatores de confundimento que coloquem em dúvida os resultados encontrados neste ou em outros estudos que utilizem o mesmo modelo.

O tempo de isquemia utilizado, de 25 minutos, foi semelhante ao utilizado por autores para causar lesões renais isquêmicas leves a moderadas. É considerado também o tempo de isquemia que melhor delineia o impacto causado pela hiperglicemia.8

Foram utilizados ratos machos por serem estes mais susceptíveis à lesão por isquemia e reperfusão.24

O estado de nutrição e, consequentemente, o peso dos animais é importante. Fatores ligados a alimentação, principalmente ao controle da ingestão de proteínas podem ser benéficos evitando ou diminuindo a possibilidade de lesão renal.25

(43)

Discussão 43

oximetria de pulso com a colocação do sensor em uma das patas traseiras de todos os animais. Não houve dificuldade na aferição deste parâmetro. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os momentos e entre os Grupos estudados, garantindo que as avaliações do processo I/R foram feitas sob condições de saturação de oxigênio normais, sem interferência no modelo utilizado. Sabe-se atualmente que o pré-tratamento de ratos com concentrações superiores a 95% de oxigênio por um período de uma hora por dia durante cinco dias, antes da I/R, é capaz de atenuar a lesão renal. Não houve este pré-condicionamento no estudo. 26

O controle da temperatura foi continuo através de sensor retal com as aferições anotadas a cada 5 minutos. Os animais foram colocados sobre e sob bolsas térmicas de gel aquecidas objetivando manter temperatura entre 37°C e 38°C. Não houve diferença significativa entre os momentos e entre os Grupos do estudo. A importância da manutenção da temperatura no modelo I/R é importante porque hipotermia durante I/R protege o órgão, com menor grau de lesão renal, da mesma forma que quando há hipertermia os graus de lesão são maiores. Portanto, a especificação e o controle da temperatura, como variável do modelo experimental na I/R é essencial para o estímulo isquêmico controlado e para a comparação adequada entre as intervenções terapêuticas.27-28 _{Zager & Altschuld}29_{também obtiveram resultados comprovando que}

a hipertermia potencializa a lesão isquêmica renal enquanto a hipotermia confere proteção aos rins.

Alguns estudos apresentaram os efeitos deletérios da hiperglicemia em seus resultados alertando para a necessidade de controle rigoroso da glicemia objetivando diminuição da morbimortalidade. 30-31

(44)

Discussão 44

Os benefícios do controle rigoroso da glicemia foram, então, apresentados inicialmente em pacientes diabéticos submetidos a cirurgias cardíacas. A partir deste momento, o conceito expandiu e migrou para outras especialidades cirúrgicas e áreas médicas. Apesar de existirem resistências, discordâncias e controvérsias que circundam o controle rigoroso da glicemia no perioperatório, no pós-operatório e em pacientes internados em unidades fechadas em todo o universo médico, os benefícios demonstrados para estes pacientes é emblemático, representando redução da morbimortalidade, interferindo no desfecho de infecções, da isquemia aguda do miocárdio e da lesão renal.30,32,33

Kersten et al.34_{demonstraram que a hiperglicemia interfere no}

pré-condicionamento celular cardíaco, diminuindo ou mesmo abolindo os efeitos benéficos que poderiam ser alcançados em função da isquemia.33 _{Sabe-se que enquanto a}

hipoglicemia mimetiza e favorece o pré-condicionamento isquêmico, a hiperglicemia transitória, da mesma forma que a diabetes mellitus, apresentam efeito bloqueador da cardioproteção induzida pelo pré-condicionamento isquêmico, assim como também bloqueia o pré-condicionamento induzido pelos anestésicos, principalmente os inalatórios, tanto em animais como em seres humanos. A hiperglicemia aguda e transitória, mesmo com pequeno aumento da glicemia também é responsável pelos resultados que demonstraram abolição do pré-condicionamento in vivo encontrados

por Kerstenet al.35

(45)

Discussão 45

A denominação isquemia refere-se a diminuição ou ausência de fluxo

sanguíneo para o tecido causando hipóxia tecidual. A partir do processo isquêmico uma cadeia de eventos químicos intra e extracelulares é ativada resultando, frequentemente, em disfunção parcial ou total, com necrose celular e perda definitiva de funções. Com a interrupção da isquemia e restauração do fluxo sanguíneo, outra cadeia de eventos se sobrepõe ocasionando lesões adicionais denominadas como

lesões por reperfusão. A reperfusão nada mais é do que a restauração do fluxo

sanguíneo em direção àquelas células que, momentaneamente, foram privadas deste fluxo e submetidas a hipóxia. O grande e desafiador problema é que a reperfusão, benéfica e indispensável sem dúvida, aumenta a lesão tecidual acarretando danos além dos já estabelecidos pela lesão primária no momento da isquemia aguda.

Portanto, I/R, ou seja, interrupção de fluxo sanguíneo, seguida de reperfusão apresentará dois tipos de lesão: a lesão primária, direta, decorrente da isquemia por si própria e a lesão secundária, indireta, decorrente do processo de reperfusão.36

Associa-se, frequentemente, reperfusão de tecidos isquêmicos com disfunção microvascular ocorrendo comprometimento da dilatação das arteríolas do endotélio, aumento da filtração de fluidos, agregação dos leucócitos aos capilares, migração de leucócitos e extravasamento de proteínas plasmáticas nas vênulas pós-capilares. No período inicial após a reperfusão, a ativação das células endoteliais, em todos os segmentos da micro circulação, produz mais radicais de oxigênio e menor quantidade de óxido nítrico. Nas células endoteliais, o desequilíbrio entre os superóxidos e o óxido nítrico concorre para a produção e a liberação de mediadores inflamatórios e aumenta a síntese de moléculas de adesão que mediam a adesão celular leucócito-endotelial.37

Liu & Brakeman38_{descreveram, detalhadamente, os mecanismos de lesão e de}

(46)

Discussão 46

celular ocorre por necrose causada, primariamente, pela isquemia aguda ou por apoptose, secundariamente ao processo isquêmico, devido à alterações posteriores à isquemia que contribuem para a programação da morte celular. Porém, alguns mecanismos fisiopatológicos ainda não estão completamente esclarecidos e compreendidos.39

Stowe & Kevin,40_{em revisão sobre anestésicos inalatórios e}

pré-condicionamento cardíaco, apontam os efeitos destes fármacos na proteção celular na I/R. Por meio da revisão de estudos afirmaram que os anestésicos inalatórios exercem efeito pré-condicionante, semelhante ao pré-condicionamento isquêmico, sugerindo a terminologia pré-condicionamento anestésico. Esses autores apontaram que o

pré-condicionamento anestésico ocorre por ação sobre as chamadas espécies reativas de oxigênio (ROS, em inglês). Sabe-se que essas espécies reativas de oxigênio têm importância fundamental para que ocorra a lesão atribuída à reperfusão. ROS são

mediadores da lesão celular quando o oxigênio é oferecido à célula pela reperfusão e a sua formação supera a capacidade de eliminação do tecido. Na reperfusão ocorre consumo molecular de oxigênio, possibilitando a formação de dois superóxidos, peróxido de hidrogênio e o radical hidroxílico que, acredita-se, são os reais causadores da lesão por I/R.12,40

Lee et al.41_{apresentaram diferentes níveis de proteção pelos anestésicos}

inalatórios em modelos de I/R, em ratos, submetidos à anestesia com halotano, isoflurano e sevoflurano. Observaram que o isoflurano ofereceu melhor proteção diante dos demais anestésicos inalatórios e das técnicas venosas estudadas.

O aspecto marcante no pré-condicionamento anestésico é o contraste entre a necessidade da formação de ROS, no momento inicial da isquemia, e a necessidade

da diminuição da formação de ROS durante o processo subsequente de I/R, para que

(47)

Discussão 47

A questão é: como os anestésicos voláteis alteram a função mitocondrial para induzir a formação de ROS no momento inicial? Possivelmente, por serem

hidrofóbicos, os anestésicos voláteis passam facilmente pela membrana e atenuam a respiração mitocondrial, particularmente no Complexo III que está espalhado difusamente na membrana lipídica mitocondrial e ainda no Complexo I, que atravessa a membrana, o que é suficiente para causar uma pequena interrupção de elétrons causando aumento na geração de oxigênio, com subsequente formação ROS

envolvidas na lesão celular. 40,42

A figura a seguir, adaptada de Liu,39 _{resume a sequência de eventos que}

ocorrem a partir da isquemia na célula renal. Ajuda a compreender quando o pré-condicionamento poderia atuar impedindo progressões naturais do processo isquêmico apesar deste, seja com que fármaco for utilizado, ainda não está completamente elucidado.

Figura 6 - A partir de uma lesão isquêmica ou tóxica, as células tubulares renais danificadas

(48)

Discussão 48

A creatinina é um produto endógeno e a dosagem da sua concentração plasmática é utilizada para a medida da filtração glomerular. A creatinina plasmática é quase que exclusivamente produto do metabolismo da creatina e fosfocreatina no músculo esquelético, apesar de que a ingestão de determinados alimentos pode contribuir para alterar seus níveis no plasma. Em pacientes com função renal estável, níveis plasmáticos da creatinina são praticamente constantes, com variação de até 8%. Aumento dos níveis plasmáticos de creatinina é sempre observado quando há lesão nas células renais. Com base nisso, os níveis de creatinina sérica são utilizados, há algumas décadas, como parâmetro de identificação e de qualificação da gravidade na ocorrência de lesão renal.43

Recentemente, foi proposto um novo critério de classificação da lesão renal em humanos que denomina a deterioração renal aguda como disfunção renal aguda, no Second International Consensus of The Acute Dialysis Quality Initiative Group (ADQI

Group), publicado em 2004. O critério identificado pelo acrônimo RIFLE define três

níveis crescentes de gravidade para a disfunção renal aguda: R: Risk, I: Injury, F: Failure, L: Loss e E: End Stage. Em Português poderíamos traduzir, livremente, para:

Risco, Dano ou Lesão, Falência, Perda da Função e Estágio Final. Cada um destes níveis, de disfunção ou de desfecho, é caracterizado por critérios definidos pela taxa de filtração glomerular, creatinina sérica e pelo débito urinário.

Em 2007 foi apresentado um novo critério: Critério AKIN (Acute Kidney Injury

(49)

Discussão 49

Tabela 8 -Critérios da Acute Kidney Injury Network (AKIN) para classificação da Lesão Renal

Aguda

ESTÁGIO Critério de Creatinina Sérica Critério de Débito Urinário

1 Aumento na creatinina sérica maior ou igual a 0,3 mg.dL-1_{ou maior que 150 a}

200% (1,5-2x) do valor basal

Menos de 0,5 mL.kg-1.h-1 por mais de 6 horas

2

Aumento na creatinina sérica maior ou

igual a 200 a 300% (2-3x) do valor basal Menos de 0,5 mL.kg-1.h-1 por mais de 12 horas

3

Aumento na creatinina sérica maior que 300% (> 3x) do valor basal ou creatinina

sérica maior ou igual a 4,0 mg.dL-1 com aumento agudo de, pelo menos, 0,5

mg.dL-1

Menos de 0,3 mL.kg-1_.h-1_{por mais}

de 24 horas ou anúria por 12 horas

Modificado de: Bellomo et al.2

A utilização da creatinina sérica como fator único na identificação e qualificação da lesão renal aguda sempre foi criticada, porém sempre foi utilizada por ser uma avaliação simples, prática e de fácil realização. A partir do Critério AKIN, que utiliza a

creatinina e débito urinário, a identificação precoce e a qualificação da lesão renal aguda passaram a ser melhor aceito pelos que criticavam a utilização isolada da creatinina plasmática, como Bagshaw & Gibney44_{, que questionam a utilização dos}

valores aferidos da creatinina plasmática para avaliar o ritmo de filtração glomerular. Como ocorre com o pré-condicionamento isquêmico, é conhecido que modificações no estresse oxidativo, através de fármacos que interfiram na produção e na eliminação de ROS reduzem a morbimortalidade em vários grupos de pacientes.45

(50)

Discussão 50

igualmente, a N-acetilcisteina que bloqueia o PCA pelo isoflurano em coelhos intactos.13,45,46

Radogna et al.13 _{mostraram que em leucócitos normais e tumorais, a}

melatonina causa rápida e transitória estimulação de ROS.Pode-se assumir, portanto,

que de forma contrária aos demais fármacos com características antioxidantes, a melatonina age de forma sinérgica ao isoflurano potencializando sua ação protetora antioxidante.

Segundo alguns autores, a melatonina possui efeito anti-apoptótico em vários órgãos, inclusive nos rins. Acredita-se que, de acordo com resultados obtidos nestes estudos, a melatonina exerça seu efeito anti-apoptótico através de alguma atuação sobre mecanismos básicos da apoptose, como por exemplo, no fator-alfa de necrose tumoral, na produção de óxido nítrico ou ainda inibindo a produção de ROS.

Possivelmente, devido a isso, sua ação anti-apoptótica seja efetiva não exatamente em um primeiro momento após I/R, considerando-se que o processo apoptótico não é imediato como o processo necrótico, mas dependerá da ação de produtos e de ações celulares, o que demandaria efetivamente maior tempo para ocorrer. Muito provavelmente, como no pré-condicionamento anestésico, a melatonina induz, inicialmente após I/R, aumento de ROS, para posteriormente agir diminuindo a

formação destes radicais.47,48,49

O estudo mostrou que nos Grupos H e MH houve aumento significativo dos níveis séricos de creatinina, indicando lesão renal. A utilização da melatonina diminuiu significativamente o nível de creatinina em vigência de hiperglicemia. Os níveis de creatinina sérica apresentados nos Grupos I e M, no M3, apontam que a ação da melatonina potencializou o efeito protetor do isoflurano, descrito por Lee et al.41_{. No}

(51)

Discussão 51

creatinina significativamente no Grupo SH. Os Grupos H e HM, com melatonina associada ao isoflurano e I/R com hiperglicemia apontam para a potencialização do efeito protetor do isoflurano pela melatonina.

Estudos realizados com modelos de I/R, em ratos, demonstraram o efeito protetor de vários fármacos, do pré-condicionamento e da própria melatonina. Entretanto não existiam estudos, como o realizado, que avaliassem a melatonina na proteção renal com I/R associada à hiperglicemia.17-19, 42,50-52

A análise histológica das lâminas dos rins, utilizando o escore de lesão proposto por Park et al.24_{para a avaliação da necrose tubular, confirmou os}

resultados demonstrados pela aferição dos níveis de creatinina sérica em M3, em todos os Grupos. Diante da diferença significativa entre os Grupos M e I pode-se atribuir à melatonina não só potencialização da proteção oferecida pelo isoflurano, mas efeito protetor intenso, per si, diante de I/R com ou sem hiperglicemia na célula

renal. A análise histológica aponta maior gravidade da lesão renal com I/R associada à hiperglicemia aguda transitória. A melatonina mostrou que sua utilização protege o rim na I/R com hiperglicemia transitória, porém, o efeito da melatonina com a associação apresentou menor intensidade do que o observado com I/R, possivelmente por excesso de estresse oxidativo e, consequentemente, grande produção de espécies reativas de oxigênio obtida pela associação de I/R e hiperglicemia aguda transitória. Possivelmente, questiona-se, doses maiores de melatonina seriam necessárias para proteger mais intensamente as células renais na I/R com hiperglicemia. Estudos com doses maiores de melatonina devem ser realizados para que haja esta definição.

Os resultados histológicos obtidos no estudo apontam para uma ação da melatonina contra a lesão nas células renais pós isquemia/reperfusão. Estes dados são coincidentes ao que Zhanga et al.53_{, assim como Santello et al.}54_{, mostraram em}

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Discussão 52

responsáveis pela apoptose, principalmente sobre os radicais livres de oxigênio e, muito provavelmente, sobre o óxido nítrico e radicais dele provenientes.

O estudo mostra que a associação isoflurano e melatonina é capaz de causar proteção renal evitando a lesão de I/R. Entretanto esta associação não foi capaz de causar proteção renal quando a hiperglicemia transitória foi produzida. Provavelmente o efeito da melatonina se deve a inicial e rápida liberação de ROS, de forma

semelhante aos anestésicos voláteis, ao contrário de outros antioxidantes que inibem a produção de ROS, no momento inicial da resposta oxidativa, bloqueando a geração

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Conclusão 53

A melatonina causou proteção renal da lesão de I/R, porém essa desapareceu quando hiperglicemia aguda transitória foi associada.

Portanto, conclui-se que a melatonina protege o tecido renal da lesão da I/R, não sendo mensurável lesão celular quando foi usada a avaliação histológica e a dosagem de creatinina sérica.

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Referências 54

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