Expressão de antígenos MHC classe I e de células CD4 e CD8 na polimiosite e dermatomiosite.

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REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Expressão

de

antígenos

MHC

classe

I

e

de

células

CD4

e

CD8

na

polimiosite

e

dermatomiosite

Carla

Renata

Grac¸a

∗

_e

_João

_Aris

_Kouyoumdjian

FaculdadedeMedicinadeSãoJosédoRioPreto,SãoJosédoRioPreto,SP,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem3dejunhode2014 Aceitoem6deoutubrode2014 On-lineem21denovembrode2014

Palavras-chave: Patologiamuscular

Imuno-histoquímicamuscular Biópsiamuscular

Antígenosdecomplexoprincipal dehistocompatibilidadeclasseI (MHC-I)

Miopatiasinflamatórias

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Analisarasfrequênciasdeexpressãodosantígenosdecomplexoprincipalde histo-compatibilidadeclasseI(MHC-I)ecélulasCD4eCD8nomúsculoesqueléticonapolimiosite (PM)edermatomiosite(DM).

Métodos:Estudo retrospectivode34 casosde PM,oitocasos deDMe29 controlescom miopatiasnãoinflamatórias.

Resultados: OsantígenosMHC-Iexpressaram-senosarcolemae/ousarcoplasmaem79,4% doscasosdePM,62,5%doscasosdeDMe27,6%doscontroles(aexpressãodeCD4foi observadaem76,5%,75%e13,8%,respectivamente).QuandoosantígenosdeMHC-Iforam coexpressadoscomCD4,houveelevadasuspeitadePM/DM(principalmentePM).Em14,3% doscasosdePM/DM,observou-seaexpressãoisoladadosantígenosMHC-I,semcélulas inflamatórias.

Conclusão:AexpressãodosantígenosMHC-IeapositividadedoCD4podemaumentara suspeitadiagnósticadePM/DM.Nãofoiobservadoinfiltradocelularem14,3%doscasos.

MHC

class

I

antigens,

CD4

and

CD8

expressions

in

polymyositis

and

dermatomyositis

Keywords: Musclepathology

Muscleimmunohistochemistry Musclebiopsy

Majorhistocompatibilitycomplex classIantigens(MHC-I)

Inflammatorymyopathies

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective:Toanalyzethefrequenciesoftheexpressionofmajorhistocompatibilitycomplex classI(MHC-I)antigens,andCD4andCD8cellsinskeletalmuscleinpolymyositis(PM)and dermatomyositis(DM).

Methods:Thiswasaretrospectivestudyof34PMcases,8DMcases,and29controlpatients withnon-inflammatorymyopathies.

Results:MHC-Iantigenswereexpressedinthesarcolemmaand/orsarcoplasmin79.4%of PMcases,62.5%ofDMcases,and27.6%ofcontrols(CD4expressionwasobservedin76.5%, 75%,and13.8%,respectively).TherewasahighsuspicionofPM/DM(mainlyPM)inpatients inwhomMHC-IantigensandCD4wereco-expressed.In14.3%ofPM/DMcases,weobserved MHC-Iantigensexpressionalone,withoutinflammatorycells.

∗ _Autor_para_{correspondência.}

E-mails:[email protected],[email protected](C.R.Grac¸a).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2014.10.005

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tológicas, são definidos três subgrupos principais de MI: polimiosite(PM),dermatomiosite(DM)emiositeporcorpos deinclusão (MCI).O diagnóstico dessasdoençasébaseado emexamesclínicoselaboratoriais,particularmenteosníveis decreatinoquinase,eletromiografiaeosachados doexame patológicodosmúsculosfeitopormeiodebiópsia.1-3_As carac-terísticaspatológicasmarcantesparaodiagnósticocorretosão necrosedafibramuscular(geralmenteemáreasisoladas)ea presençadecélulasinflamatóriasnoperimísioenoendomísio etambémalgumasvezesemregiõesperivasculares.Achado típicoé ainvasão linfocítica emfibras nãonecróticas, que logosubstituídapormacrófagosecélulasTeentãosetorna necrótica.4_A_atrofia_{perifascicular}_é_específica_e_{característica} daDM,assimcomoosvacúolosrimmedsãoparaaMCI.4_É_bem reconhecidoqueaausênciadeinfiltradosinflamatóriosnão excluiMI.Nessescasos,apresençadeantígenosdocomplexo dehistocompatibilidadeprincipaldeclasseI(MHC-I)no sar-colemae/ousarcoplasmapodecontribuirparaodiagnóstico emcasossuspeitosdeMI,emboranãosejaespecífico.

Nocasodasfibrasmuscularesnormais,osantígenos MHC--I são detectados apenas nos vasos sanguíneos e podem serfacilmente vistos nos capilaresdoendomísio. Em con-traste,naMI,aexpressãodosantígenosMHC-Iéobservada no sarcolema e também internamente (sarcoplasma) em váriasfibras.5,6_A_indução_e_a_expressão_dos_antígenos_MHC-_I ocorremprecocemente,comfrequênciaantesdosinfiltrados inflamatórios,econtinuadurantetodaaevoluçãodadoença crônica,mesmocomouso deimunossupressoresedepois de aparente remissão clínica.1,7-10_As _fibras _musculares _em regeneração e/ou imaturasexpressam antígenosMHC-Ino sarcolemaindependentementedapresençadedoença;11_por causadisso,éimportantedistinguiresseachadonormalde outroanormaleaplicaratécnicaimuno-histoquímicapara miosinaneonatal,4_marcador_de_imaturidade._A_expressão_do MHC-Inosarcolemae/ousarcoplasmadasfibrasmusculares maduraséanormalerepresentaumaferramentaútilparao diagnósticodeMI,particularmentenaausênciadeinfiltrados inflamatórios,necrosedafibramuscular,vacúolosrimmedou atrofiaperifascicular.

Esteestudovisaaenfatizaraimportânciadaanálise roti-neiradosantígenosMHC-Ijuntamentecomaexpressãode subtiposdecélulasTnastécnicasdebiópsiamuscularquando houver suspeitade MI. Embora oachado patológico carac-terísticoda MIsejainfiltradoinflamatório(comosalientado anteriormente),algumasvezeselepodeestarausente.

parabiópsiamuscularpormédicosdeváriasespecialidades, particularmenteneurologiaereumatologia.

Foram constituídos dois grupos de pacientes para a avaliação.Ogrupo1foicompostopor42pacientescomquadro clínicoepatológicocaracterísticosdemiopatiainflamatória, PM ou DM: presença de necrosemuscular, infiltrado infla-matórionoendomísioe/ouperivascular(fig.1AeB),invasão defibrasmuscularesnãonecróticase/ouatrofia perifascicu-lar. O grupo2foi formado por29 pacientesencaminhados parabiópsiamuscularporsuspeitadeoutrasmiopatiasnão inflamatóriasecujoresultadofoinormaloucompresençade anormalidadesmiopáticasdiscretasenãoespecíficas.

Biópsiamuscular

Todasasbiópsiasforamfeitaspormédicoespecializadoem doençasneuromuscularesnomúsculoDeltoideuspormeiode técnicaaberta,sobanestesialocal.Aamostradomúsculofoi enviada ao Laboratório de InvestigaçãoNeuromuscular em estadofresco,semfixadoresouaditivos,imediatamente con-gelada emnitrogêniolíquido a–176◦_C_e_armazenada _até_o processamento.Asespécimesmuscularescongeladasforam cortadasnocriostatonatemperaturade–30◦_C_em_seções_de 5␮mdeespessura.Otecidocortadofoimontadoemlâminas devidrorevestidascompolilisina.Adistribuiçãodos antíge-nosMHC-Ifoianalisadacomousodeanticorpomonoclonal pela técnica de imunoperoxidase.Amarcação dos anticor-pos a serem visualizados sob microscopia óptica foi feita com um sistema de detecção de polímero (NovoLink Max PolymerDetectionSystem,NovocastraLaboratoriesLtd., New-castleupon-Tyne,England),deacordocomasinstruçõesdo fabricante.Osanticorposusadosforam:anti-MHC-I(Rhea Bio-tech,Campinas, Brasil),anti-CD8(anticorpo monoclonalde camundongo,clone1A5,isotipoIgG1)eanti-CD4(anticorpo monoclonaldecamundongo,clone4B12,isotipoIgG1).Os anti-corpos CD4eCD8eram da DakoCytomationDenmark A/S, Dinamarca.

Análiseestatística

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Figura1–Biópsiamusculardepacientecommiopatiainflamatória.(A)Necrosedafibramusculareinfiltradoinflamatório endomisial(hematoxilina&eosina).(B)Aumentodaatividadelisossomal(fosfataseácida).

Ética

OestudofoiaprovadopelocomitêdeéticadaFamerp.

Resultados

Ogrupo1incluiu42pacientes(PMouDM):28dosexo femi-nino(66,7%)e14domasculino(33,3%),commédiade44,7±

19,9anos(variaçãodeseisa80).Desses42casos,34(80,1%) erampacientes com PM,22 mulheres(64,7%)e12 homens (35,3%);médiade49,3±17,7anos(variaçãodeoitoa80).Os outrosoitocasos(19,9%)eramDM,seismulheres(75%)edois homens(25%);amédiaerade25,3±17,4anos(variaçãodeseis a51).Ogrupo2incluiu29pacientes:17mulheres(58,6%)e12 homens(41,4%),commédiade34,2±21,9anos(variaçãode uma71).

AfrequênciadeexpressãodosantígenosMHC-Inasfibras muscularesémostradaemdetalhesnatabela.Afigura2A-C mostrasuaexpressãonosarcolemaousarcoplasma, assim como ausência de expressão. A expressão dos antígenos MHC-Ifoiobservadatantonosarcoplasmaquantono sarco-lemaem79,4%dospacientescomPM,62,5%doscomDMe 27,6%doscontroles.Nãofoiobservadaexpressãodos antíge-nosMHC-Inosarcolemanemnosarcoplasmaem20,6%dos pacientescomPM,37,5%doscomDMe72,4%doscontroles.

AsfrequênciasdepositividadedeanticorposparaCD4e CD8 estão detalhadasna tabela 1. A figura 3A-Cmostra a expressãodeCD4/CD8principalmentenoendomísio.Amaior partedoscasosdePM(76,5%)reveloupositividadena expres-sãodeCD4;em23,5%havianegatividadeparaexpressãode ambos, CD4 e CD8. De modo semelhante, 75% dos casos de DM revelaram positividade para expressão de CD4; em 25%havianegatividadeparaexpressãodeambos,CD4eCD8. AexpressãodeCD4ouCD8foiobservadaem24,1%dos paci-entescontrole;em75,9%havianegatividadeparaexpressão deCD4eCD8;jáapositividadedeambos,CD4eCD8,nãofoi observada.

AexpressãodosantígenosMHC-Inosarcoplasmaou sar-colemafoiobservadaemconjuntocompositividadeparaCD4 em88,2%dospacientescomPM,50%doscomDMe3,5%dos

dogrupocontrole.Emcomparac¸ão,aexpressãodosantígenos MHC-Inosarcoplasmaousarcolemafoiobservadaem con-juntocomapositividadeparaCD8em35,3%doscasosdePM, 12,5%dosdeDMe0%dosdocontrole.

EmcincocasosdePM(14,7%)eemumcasodeDM(12,5%) osantígenosMHC-Iforammarcadosnosarcolemaouno sar-coplasmanaausênciadeexpressãoparaCD4eCD8.

Discussão

EsteestudodemonstrouqueaexpressãodeantígenosMHC-I nosarcolemaousarcoplasmaocorreumaisfrequentemente empacientescomPM/DMdoquenoscontroles,embora ape-nasadiferençaentreoscontroleseospacientescomPMtenha sidoestatisticamentesignificativa.Demodogeral,os antíge-nosMHC-Iestavamexpressosem79,4%dospacientescom PM/DM. Segundoaliteratura,a sensibilidade dotestepara o diagnóstico de MI éde 78%, semelhantementeà encon-tradanesteestudo(79,4%).12 _Quando_se_considerou_apenas aexpressãodosantígenosMHC-Inosarcolema,nãohouve diferençaestatisticamentesignificativaentreoscontrolese ospacientescomPMouDM.Quandoseconsideraapenasa expressãodosantígenosMHC-Inosarcoplasma,adiferença foisignificativaapenasentreospacientescontroleversusPM. OsantígenosMHC-Inãoestavamexpressosnosarcolemanem nosarcoplasmanamaiorpartedoscontroles,oquediferiu significativamente apenasnoscasosdePM. Deacordocom Karpatietal.,11 _na_PM,_a_maior_parte_das_fibras_musculares apresentaumaexpressãofortedosantígenosMHC-Ino sar-colema;naDM,asfibrasmuscularesperifascicularesouem regiõesdistribuídasaoacasotambémrevelaramforte expres-são.

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quantocomaDM.Nenhumcontrolereveloupositividadepara CD4eCD8,oquerepresentouumachadonotável.

Aexpressão dosantígenosMHC-Ino sarcolema ou sar-coplasmaem combinaçãocom apositividadepara CD4foi o achado mais comum na PM em relação aos controles e maisútil para o diagnóstico. Já para o diagnóstico de DM ele foi menos comum, embora ainda útil na ausência de outrosachados típicos. Também valea pena ressaltar que nãoforam observados casos deassociação entrea expres-sãodosantígenosMHC-I(nosarcolemaousarcoplasma)ea expressãodoCD8nogrupocontrole. Esseachado provavel-menterepresentaumaferramentamuitoútilparadescartar PM/DM.

Nãofoiobservadoinfiltradoinflamatórioemcincocasos dePMeumdeDM,emboraosantígenosMHC-Iestivessem expressosnosarcolemaounosarcoplasma.Esseachado mos-traqueaproximadamente15%doscasosdePM/DMpodem nãoserdiagnosticadoscombaseapenasnoinfiltrado infla-matório, o que corrobora a afirmac¸ão de Dalakas1 _de _que aexpressãodosantígenosMHC-Iéummarcador útilpara confirmarodiagnósticodeMI,mesmoquandonãoexistam célulasinflamatóriasnabiópsiadomúsculo.

Deacordocomosresultadosobtidosdabiópsiamuscular porVanderPasetal.,13_a_expressão_dos_antígenos_MHC-_I_foi observadaem67%dospacientescomDMeem61%doscom PM.NoscasosdeDM,aanáliseimuno-histoquímicarevelou expressão significativamente maior dos antígenos MHC--I no tipo juvenil (96,4%) do que no tipo adulto (50%).12 A expressão dos antígenos MHC-I foi observada em 11% das biópsias de pacientes com distrofia muscular e em4%dasbiópsiasdepacientescomdoenc¸as neuromuscu-laresvariadas,totalizando15%(menordoqueaexpressãode 27,6%encontradanesteestudo).

Amaiorpartedasfibras muscularesinvadidaspor célu-las T, CD4 e/ou CD8, expressa os antígenos MHC-I em suasuperfície.7_No_entanto,_como_citado_{anteriormente,}_em alguns casosfoi observadaexpressãodosantígenos MHC-I seminvasãoporcélulasmononucleares.Nybergetal.14 tam-bémenfatizaramaimportânciadaexpressãodosantígenos MHC-InaPM ouDM crônicainativa com fraqueza muscu-larpersistentenaausênciatantodeinfiltradosinflamatórios quanto de sinaisde inflamac¸ão naressonância magnética. Alémdisso,aexpressãodosantígenosMHC-Inãoémodificada pelo tratamento prévio com fármacos imunossupressores,

Tabela1–ExpressãodeantígenosMHC-I(sarcolemaesarcoplasma),CD4eCD8embiópsiasmuscularesdepacientes

compolimiosite(PM),dermatomiosite(DM)econtroles(C)

PM DM Controles p p

N 34 8 29 PM/C DM/C

Idade 49,3±19,9 25,3±17,4 34,2±21,9

Masculino 35,3%(12) 25%(2) 41,4%(12)

Feminino 64,7%(22) 75%(6) 58,6%(17)

MHC-I(+)sarcolema 47,1%(25) 62,5%(5) 24,1%(7) 0,1037 0,1035

MHC-I(+)sarcoplasma 73,5%(16) 50,0%(4) 13,8%(4) <0,0001 0,0860

MHC-I(+)ambos 41,2%(14) 50,0%(4) 10,3%(3) 0,0135 0,0424

MHC-I(+)umououtro 79,4%(27) 62,5%(5) 27,6%(8) 0,0001 0,1579

MHC-I(–)ambos 20,6%(7) 37,5%(3) 72,4%(21) 0,0001 0,1579

CD8(+) 38,2%(13) 12,5%(1) 10,3%(3) 0,0247 0,6410

CD4(+) 76,5%(26) 75,0%(6) 13,8%(4) <0,0001 0,0027

CD4eCD8(+) 38,2%(13) 12,5%(1) nenhum(0) 0,0006 0,4846

CD4e/ouCD8(+) 76,5%(26) 75,0%(6) 24,1%(7) 0,0001 0,0243

CD4eCD8(–) 23,5%(8) 25,0%(2) 75,9%(22) 0,0001 0,0243

MHC-I(umououtro)eCD4(+) 88,2%(30) 50,0%(4) 3,5%(1) <0,0001 0,0048

MHC-I(umououtro)eCD8(+) 35,3%(12) 12,5%(1) nenhum(0) 0,0012 0,4846

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Figura3–ExpressãodeCD4eCD8:(A)CD4-positivo;(B)CD4-negativo;(C)CD8-positivo;(D)CD8-negativo.

emboraVanderPasetal.13_tenham_relatado_{diminuic¸ão}_da sensibilidadeparaotestedosantígenosMHC-Idepoisde qua-trosemanasdeterapiaimunossupressora.

Deve-seenfatizarqueosantígenosMHC-Itambémpodem serexpressosnasdistrofias musculares,principalmente na deficiência de disferlina, que se manifesta clinicamente comoumadistrofia dascinturasdosmembrosoumiopatia distal.15 _Nesses_casos, _foi _observado _aumento _da _resposta inflamatória,emconjuntocomopadrãodistróficoativo.Os infiltrados celulares sugerem que a reação inflamatória é secundáriaà necrose. Os antígenosMHC-I foram superex-pressosprincipalmenteemassociaçãocomafagocitoseea regeneraçãodasfibras.15,16_Nas_{disferlinopatias,}_os_linfócitos CD8 são raros e os linfócitos T invadem fibras muscula-res apenas ocasionalmente, enquanto ambos são achados comuns na PM.17 _A _{disferlinopatia} _deve _ser _considerada no diagnóstico diferencial de MI que não responde aos esteroides.

Conclusão

A presença de expressão de antígenos MHC-I e subtipos de células T pode ser útil na diferenciação de miopatias inflamatóriasdeoutrasnãoinflamatórias,muitasvezesum desafioclínico.Os antígenosMHC-Iforam mais frequente-menteexpressosnaPM;célulasforammaispositivasparaCD4 naPMenaDM;osantígenosMHC-Iforamexpressossem célu-lasinflamatóriasem14,6%doscasosdePM/DM;existeforte suspeitadePM/DM(principalmentePM)quandoosantígenos MHC-Isãoexpressosemcombinaçãocompositividadepara CD4;eháumaaltaprobabilidadedeexcluirtantoaPMquanto aDMnaausênciadeexpressãodeantígenosMHC-IeCD4.

Financiamento

BolsadeAuxílioàPesquisa,FaculdadedeMedicinadeSãoJosé doRioPreto,SãoPaulo,Brasil.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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