Efeito anticonvulsivante de frações isoladas da peçonha da formiga Dinoponera quadriceps (Formicidae: Ponerinae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

EFEITO ANTICONVULSIVANTE DE FRAÇÕES ISOLADAS DA PEÇONHA DA FORMIGA Dinoponera quadríceps (Formicidae: Ponerinae)

Aluna: Diana Aline Nôga Morais Ferreira

Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Mussi Ribeiro

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DIANA ALINE NÔGA MORAIS FERREIRA

EFEITO ANTICONVULSIVANTE DE FRAÇÕES ISOLADAS DA PEÇONHA DA FORMIGA Dinoponera quadríceps (Formicidae: Ponerinae)

Dissertação apresentada à

Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de mestre em Psicobiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Mussi Ribeiro

Natal

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Título: Efeito Anticonvulsivante de Frações Isoladas da Peçonha da Formiga Dinoponera quadríceps (Formicidae: Ponerinae)

Autora: Diana Aline Nôga Morais Ferreira

Data da defesa: 11/05/2015

Banca Examinadora:

Profª Dr. Alessandra Mussi Ribeiro

Universidade Federal de São Paulo, SP

Profª Dr. Regina Helena da Silva

Universidade Federal de São Paulo, SP

Prof. Dr. Wagner Ferreira dos Santos

(5)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a minha família. Aos meus pais, Sônia e

Ferreira, que investiram pessoal e financeiramente em mim, permitindo que

chegasse a esse momento. E ao meu irmão mais velho, David, pela amizade,

suporte e as inúmeras caronas.

Agradeço a todo grupo do LEME que sempre esteve presente para

ajudar, fosse nos experimentos ou apenas com aquele incentivo tão

necessário. Especialmente a Ramón Hypolito e Ywlliane Meurer que

seguraram as pontas no momento de maior necessidade, atuando como

administradores, pedreiros, pintores, mas principalmente como co-orientadores

e amigos, que não permitiram que nos deixássemos abater diante das

dificuldades.

A todos os meus amigos, que me apoiaram nos momentos de dúvida e

tristeza e proporcionaram diversos momentos de alegria. Especialmente a

Jéssica Damasceno, Alexandre Costa, Amanda Borges, Fernanda Cagni,

Ramón Hypolito e Ywlliane Meurer.

Ao meu namorado e grande companheiro, Luiz Eduardo, que me ajudou

em praticamente todos os experimentos e esteve sempre ao meu lado, me

apoiando e me fazendo uma pessoa melhor a cada dia.

Por fim, a minha orientadora, Alessandra Ribeiro, pela paciência, pelos

direcionamentos e ensinamentos durante esses cinco anos de orientação. E a

todos que de alguma forma contribuíram para minha formação e para

construção desse trabalho.

(6)

RESUMO

A epilepsia é uma patologia crônica do sistema nervoso central que afeta

cerca de 65 milhões de indivíduos no mundo. Aproximadamente 30% desses

indivíduos desenvolvem crises convulsivas que persistem apesar do tratamento

monitorado com drogas antiepilépticas. Assim, há uma evidente necessidade

do desenvolvimento de novos fármacos antiepilépticos e as peçonhas podem

ser uma excelente fonte de modelos. Nesse contexto, enquanto já vários

estudos sobre peçonhas de serpentes, escorpiões e aranhas, pouco se sabe

sobre as peçonhas de formigas. Estudos prévios do nosso laboratório

demonstraram que a peçonha desnaturada da formiga Dinoponera quadríceps

protegeu camundongos de crises convulsivas e morte induzidas por bicuculina

(BIC). Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi investigar o potencial

anticonvulsivante de frações isoladas da peçonha de D. quadríceps em crises

convulsivas induzidas pela BIC, bem como uma análise dos efeitos dessas

frações no comportamento natural dos camundongos no campo aberto. Os

animais foram divididos em grupos, os quais receberam injeções (1 mg/ml

i.c.v.) de seis frações distintas e tiveram seu comportamento geral observado

no campo aberto durante 30 min. No segundo experimento, os animais

receberam as mesmas frações 20 min antes da administração de bicuculina

(10 mg/ml). Em seguida, foi analisado o comportamento motor convulsivo

desses animais durante 30 minutos no campo aberto. No primeiro experimento,

não foram observadas alterações comportamentais. Já no segundo

experimento, a administração prévia de DqTx1, DqTx3, DqTx4 e DqTx6

aumentou a latência para o desenvolvimento de crises tônico-clônicas. Além

(7)

dos animais. Ainda, os melhores resultados foram obtidos com a fração DqTx6,

que protegeu 62,5% dos animais testados contra o desenvolvimento de crises

tônico-clônicas e 100% dos animais contra a morte.

Palavras-chave: Bicuculina, crises tônico-clônicas, design de fármacos,

(8)

ABSTRACT

Epilepsy affects at least 65 million people worldwide and the available

treatment is associated with various side effects. Approximately 20-30% of the

patients develop seizures that persist despite of careful monitored treatment

with antiepileptic drugs. Thus, there is a clear need for the development of new

antiepileptic drugs and the venoms can be an excellent source of probes. In this

context, while there are studies on venoms from snakes, scorpions and spiders,

little is known regarding venom from ants. Previous studies from our group

showed that denatured venom from ant Dinoponera quadriceps protected mice

from seizures and death induced by bicuculline (BIC). In this context, the aim of

this study was to investigate the anticonvulsant activity of compounds isolated

from D. quadriceps venom on seizures induced by BIC, as well as an analysis

of its effects on spontaneous behavior in mice. Animals were divided into

groups, which received injections (1 mg/ml; i.c.v.) of six distinct venom fractions

and had their general behavior analyzed for 30 min in the open field. In the

second experiment, we carried out the same fractions injection protocol 20 min

before the administration of bicuculline (10 mg/ml). Immediately after, we

analyzed animals’ seizures behavior during 30 min in open field. In the first

experiment we did not observe behavioral alterations. Conversely, in the

second experiment, previous administration of DqTx1, DqTx3, DqTx4 and

DqTx6 increased latency for onset of tonic-clonic seizures. Moreover, all

fractions, except DqTx5, increased latency to _animals’death. Yet, we obtained

our best result with DqTx6 fraction, which protected 62.5% of tested animals

from development of tonic-clonic seizures. Further, this fraction protected all

(9)

Keywords: bicuculline, tonic-clonic seizures, drug design, bioactive

(10)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 11

1.1. Epilepsia ... 11

1.2. Breve histórico dos produtos naturais: Os venenos como fontes de fármacos .. 12

1.3. Venenos e peçonhas: uma visão geral ... 14

1.4. Peçonhas e toxinas de vertebrados ... 17

1.5. Peçonhas e toxinas de invertebrados ... 19

1.5.1 Dinoponera quadriceps... 24

2. REFERÊNCIAS ... 26

3. OBJETIVOS ... 33

3.1 Objetivo Geral ... 33

3.2 Objetivos Específicos ... 33

4. ARTIGO ... 34

Introduction ... 38

Material and Methods ... 40

Ants collection and fraction obtainment ... 40

Animals ... 41

Surgery ... 41

General Procedures ... 42

Behavioral analysis ... 42

Verification of the injection site ... 43

Statistical analysis ... 44

Results ... 44

HPLC purification ... 44

Primary screening ... 45

Anticonvulsant assay ... 46

Discussion ... 48

Acknowledgements ... 52

References ... 52

(11)

1. INTRODUÇÃO

1.1. Epilepsia

A Epilepsia é uma doença do cérebro caracterizada por uma contínua

predisposição para a geração de uma atividade neuronal excessiva ou

sincrônica, bem como pelas consequências neurobiológicas, cognitivas,

psicológicas e sociais resultantes dessa condição (Fisher et al., 2005, 2014).

As crises epilépticas podem ser classificadas como do tipo focal ou

generalizada. As crises focais são caracterizadas por se originarem e

permanecem em redes neurais limitadas a um hemisfério cerebral e pela

consistência com relação ao seu local de início. Já as crises generalizadas se

caracterizam por envolverem redes distribuídas nos dois hemisférios cerebrais,

sendo subclassificadas em ausência, ausência com características especiais,

mioclônica, clônica, tônica, atônica e tônico-clônica (Berg et al., 2010). Este

transtorno neurológico afeta aproximadamente 65 milhões de indivíduos no

mundo (Thurman et al., 2011) e aproximadamente 30% desses desenvolvem

uma epilepsia crônica que não responde a nenhum fármaco antiepiléptico

(Löscher, 1997; Rosillo-de la Torre, 2014).

No Brasil, são poucos os estudos que abordam o caráter epidemiológico

da epilepsia. O mais recente, que foi realizado por Kanashiro (2006) em

Campinas e São José do Rio Preto sugere que aproximadamente 0,88% da

população brasileira teria epilepsia e destes, aproximadamente 25,3% não

receberia o tratamento correto.

Os fármacos antiepilépticos atualmente utilizados atuam através de três

(12)

mediada pelo ácido gama-aminobutírico (GABA), tendo como exemplos os

benzodiazepínicos, os barbitúricos, a tiagabina, a vigabatrina, dentre outros. (2)

através da modulação de canais iônicos voltagem-dependente de sódio, cálcio

e potássio, tendo como exemplos a fenitoína, a pregabalina, a carbamazepina,

dentre outros. (3) através da atenuação da transmissão excitatória

glutamatérgica, tendo como representantes o felbamato e, de forma parcial, o

topiramato.

O grande problema é que estes fármacos precisam ser utilizados de

forma crônica e estão associados a efeitos colaterais negativos, como

desconforto gástrico, sedação, diplopia, ataxia, nistagmo, hipertrofia gengival,

osteomalacia, hirsutismo, neuropatia periférica, aumento paradoxal de crises,

prejuízos cognitivos, distúrbios comportamentais, bem como reações

idiossincráticas como agranulocitose, pseudolinfoma, falência hepática, falência

múltipla e anemia aplástica (Kwan, et. al., 2001; Macdonald & Kelly, 1995;

Mortari et al., 2007b; Rogawski, 2006). Nesse contexto, é clara a necessidade

do desenvolvimento de novos fármacos que possam tratar os pacientes

resistentes e/ou apresentar menos efeitos colaterais. Então, uma fonte

potencial de novos fármacos para o tratamento da epilepsia são os compostos

isolados de produtos naturais.

1.2. Breve histórico dos produtos naturais: Os venenos como fontes de fármacos

Os produtos naturais constituem uma fonte para obtenção de novas

(13)

remotos (Koehn & Carter, 2005). Por exemplo, desde o século VII a.C. povos

na Índia utilizavam venenos extraídos de serpentes para prolongar a vida e

para o tratamento de problemas gastrointestinais (Gomes et al., 2010). Na

medicina tradicional chinesa (desde a dinastia Song – 960 a 1279), tanto a

peçonha e/ou corpo do escorpião Buthus martensis são utilizados no

tratamento de doenças como epilepsia, acidente vascular cerebral e paralisia

facial (Zhao et al., 2008 and 2011). Ainda, em populações indígenas na

América Latina, as tarântulas são utilizadas no tratamento de diversas

doenças, como asma, câncer e erisipela (Machkour-M’Rabet et al., 2011).

As pesquisas na área de produtos naturais derivados de venenos

tiveram um aumento considerável entre os anos de 1970 a 1980, com o

desenvolvimento do anti-hipertensivo captopril a partir do veneno da serpente

Bothrops jararaca, porém passaram por um declínio durante os anos seguintes.

Esse declínio foi provavelmente resultado de diversos fatores, entre eles o

desenvolvimento da química combinatória e os avanços na biologia celular,

molecular e genômica, que aumentaram a quantidade de substâncias para

testes e de alvos moleculares, além de reduzirem o tempo para descoberta de

novos fármacos (Greene et al, 1972; King, 2011; Koehn & Carter, 2005).

Porém, com o desenvolvimento de técnicas mais eficientes para fracionamento

e caracterização de produtos naturais e o fato de técnicas concorrentes, como

a química combinatória, terem falhado na apresentação de novas substâncias

promissoras, a pesquisa baseada na prospecção de compostos bioativos

obtidos a partir de produtos naturais voltou a ganhar notoriedade, de forma

(14)

partir de substancias obtidas a partir de produtos naturais (King, 2011; Molinski

et al., 2009; Newman & Cragg, 2012).

Atualmente, dentre os diversos produtos naturais pesquisados, seja para

o desenvolvimento de novos fármacos utilizados na clínica ou como

ferramentas para a pesquisa científica, grande parte são princípios ativos

isolados a partir de peçonhas de serpentes. Isso se deve provavelmente ao

fato desses animais apresentarem maior quantidade de veneno quando

comparado com as quantidades obtidas de invertebrados como aranhas,

escorpiões, dentre outros. Esse quadro começou a mudar com o

desenvolvimento de técnicas sofisticadas de fracionamento, avanços em

espectrometria de massa, miniaturização dos testes funcionais e o advento das

bibliotecas de cDNA, que permitiram a análise direta dos transcritos dos

venenos (King, 2011).

1.3. Venenos e peçonhas: uma visão geral

Os venenos são secreções tóxicas, que contem moléculas que

interferem na fisiologia e em processos bioquímicos de outros animais e são

produzidas em uma glândula especializada (King, 2011). Alguns animais

desenvolveram sistemas complexos para aplicação dessas secreções em suas

vítimas, como dentes modificados, arpões, ferrões, presas, probóscides, entre

outros (Fry et al., 2009). Esses animais são denominados peçonhentos e seus

venenos, peçonhas. As composições dos venenos são resultado de um

processo evolutivo de milhões de anos, o qual permitiu o desenvolvimento e

(15)

objetivo de defesa, predação e de afastar indivíduos competidores (Fry et al.,

2009; Miijanich, 1997; Mortari et al., 2007b).

Em geral, os venenos são formados por uma combinação de proteínas,

peptídeos, poliaminas, sais, aminoácidos, minerais e alcaloides (Fry et al.,

2009; Gomes et al., 2010; Lewis & Garcia, 2003; Wong & Belov, 2012). As

proteínas presentes nesses compostos são resultantes de um processo de

recrutamento, o qual envolve a duplicação de um gene que codifica uma

proteína e a expressão seletiva desse gene na glândula (Fry et al., 2009).

Essas duplicações de genes podem promover o surgimento de novas funções

e a formação de “famílias multigênicas” (multigene family), que consistem numa

família de proteínas codificadas por genes similares, que são variações de um

gene ancestral. Dessa forma, essas proteínas preservam uma mesma estrutura

básica, que recebe alterações chaves, permitindo uma diversidade de funções

(Fry et al., 2009; Wong & Belov, 2012).

Apesar da diversidade na composição de venenos uma grande

diversidade de espécies apresenta proteínas como as cistatinas, defensinas,

hialuronidases, lectinas, peptidases, fosfolipases, proteínas secretórias ricas

em cisteína, esfingomielinases, dentre outras. Todas essas proteínas

apresentam precursores que possuem um peptídeo sinal na posição N-terminal

(Fry et al., 2009). Outra característica em comum, é que essas proteínas, bem

como os peptídeos que agem como toxinas, possuem uma maior quantidade

de cisteínas, o que permite a formação de pontes de sulfeto, as quais garantem

maior estabilidade e resistência à degradação por proteases. Essa estabilidade

é importante para permitir que as toxinas cheguem ainda ativas aos seus alvos

(16)

em que a via de administração seja oral (Fry et al., 2009; King, 2011; Miijanich,

1997).

Por ter uma composição diversificada, os venenos possuem alvos e

ações diversas no organismo humano. Eles podem agir nos sistemas nervoso,

cardiovascular, respiratório, gastrointestinal, além de poderem atingir pele,

músculos e rins, seja por uma ação tecido-específica ou por ações citotóxicas.

Como consequência, podem causar dor, inchaço, necrose tecidual, náuseas,

vômitos, paralisias, diarreia, febre, dores de cabeça, visão borrada, tonturas,

fraqueza ou falta de coordenação muscular, hipotensão, hemorragia, efeitos

trombóticos e podem levar até a morte, seja por ação direta ou por reações

anafiláticas (Sitprija & Suteparak, 2008; Wong & Belov, 2012). Quase todos

esses efeitos podem ser resultados de enzimas presentes no veneno, ou da

ação de suas toxinas sobre diversos alvos, como canais iônicos,

transportadores e os mais diversos receptores celulares.

Como mencionado, as toxinas de venenos sofrem constante pressão

seletiva, já que é de sua eficácia que depende a aquisição de alimento e

defesa de muitos animais que as produzem. Assim, geralmente possuem alta

potência e especificidade de ação para seu alvo molecular. Em suma, essas

características são difíceis de serem replicadas por outras fontes, e fazem das

toxinas animais uma fonte única para o desenvolvimento de novos modelos de

(17)

1.4. Peçonhas e toxinas de vertebrados

Os vertebrados peçonhentos incluem principalmente serpentes, outros

répteis, peixes e anfíbios. Dentre esses como já mencionados, os mais

estudados com relação ao potencial de suas peçonhas são as serpentes, as

quais são divididas em quatro famílias, Elapidae (najas, cobras-coral, etc),

Viperidae (cascavel, jararaca, etc), Atractaspidinae e Colubridae (Warrell,

2012).

Várias substâncias com grande potencial terapêutico já foram extraídas

de peçonhas de serpentes. Como já descrito anteriormente, uma das primeiras

foi a base para o desenvolvimento do anti-hipertensivo Captopril®, um inibidor

da enzima conversora de angiotensina II, largamente utilizado na clínica para

tratamento de hipertensão, alguns tipos de patologias cardíacas congestivas e

na preservação da função renal em indivíduos com neuropatia diabética

(Izidoro et al., 2014; Liu et al., 2014; Rodrigues & Santos, 2012; Vogel et al.,

2014)

Outros exemplos de substâncias promissoras extraídas de serpentes

são a eptifibatida (Integrilin®) e o tirofiban (Aggrastat®), dois anticoagulantes

que bloqueiam o receptor de glicoproteína IIb/IIIa, que são sintetizados a partir

de proteínas extraídas do veneno das serpentes Sistrurus miliarus barbouri e

Echis carinatus, respectivamente (Kereiakes et al., 1996; Earl et al., 2012).

Esses fármacos estão sendo testados como adjuvantes para recanalização

vascular em situações como infarto agudo do miocárdio, acidentes vasculares

isquêmicos e complicações cirúrgicas tromboembolíticas, uma vez que podem

impedir a ativação plaquetária, impedindo assim a reoclusão e facilitando uma

(18)

al., 1992; Sedat et al., 2014). Outra substância é o peptídeo TNP-c, isolado do

veneno da Oxyuranus microlepidotus, que apresenta similaridade com

peptídeos natriuréticos, possuindo atividade vasodilatadora e hipotensiva (Fry

et al., 2005); ou a textilinina-1 (Q8008), um inibidor de serina protease isolada

do veneno da Pseudonaja textilis, que é um potente e seletivo inibidor de

plasmina e tripsina e vem sendo testada como agente hemostático em cirurgias

cardiotorácicas (Earl et al., 2012; Flight et al., 2009).

Alguns peixes também podem possuir peçonhas, um exemplo é o

Thalassophryne nattereri, que possui dois espinhos laterais e dois espinhos

dorsais conectados a glândulas produtoras de peçonha. Essa peçonha quando

inoculada em humanos é capaz de causar edema e dor severa, seguida de

necrose tecidual (Lopes-Ferreira et al., 2001). Estudos prévios mostram que a

peçonha desse peixe pode causar dano a membrana de células musculares,

bem como alteração de todas as organelas dessas células, além de outras

propriedades miotóxicas (Lopes-Ferreira et al., 2001). Outras ações

relacionadas a essa peçonha são a alteração da estrutura da matriz

extracelular, do conteúdo de colágeno durante a fase de recuperação, da

organização do citoesqueleto e da formação de pseudópodes em células

epiteliais (Pareja-Santos et al., 2009). Algumas toxinas isoladas do veneno do

T. nattereri como as natterinas apresentam ação proteolítica sobre os

colágenos dos tipos I e IV e componentes da matriz extracelular, convertem

angiotensina I em angiotensina II, além de inibirem a adesão entre célula e

matriz extracelular e causarem morte celular. A nattectina é uma lectina do tipo

C, que apresenta a capacidade de aumentar a adesão celular mediada por

(19)

mediado por sua interação com integrinas (Komegae et al., 2011; Tenório et al.,

2015).

Um dos poucos, se não o único mamífero peçonhento é o

Ornithorhynchus anatinus, que injeta sua peçonha através de esporas nas

patas traseiras, as quais estão ligadas a uma glândula produtora da peçonha

que surge durante o período de reprodução. O envenenamento de humanos

causa inchaço e dor intensa, que não é amenizada pela administração de

morfina (Fenner et al., 1992). A peçonha bruta deste animal foi capaz de

causar edema na pata de ratos, com pico entre 20 a 30 minutos e relaxamento

do útero pré-contraídos de ratos (De Plater et al., 1995). O isolamento da

peçonha desse animal demonstrou a presença de peptídeos semelhantes à  e

a -defensinas e peptídeos natriuréticos (Whittington et al., 2008).

Apesar dos vertebrados, especialmente as serpentes, terem sido os

principais alvos dos estudos iniciais com peçonhas, como já mencionado

anteriormente, os avanços técnicos recentes e o desenvolvimento de um maior

conhecimento sobre o sistema nervoso, permitiram que as peçonhas de

invertebrados também fossem alvo de novas pesquisas.

1.5. Peçonhas e toxinas de invertebrados

Os invertebrados peçonhentos incluem, entre outros, aranhas,

escorpiões, caramujos, águas-vivas, vespas, abelhas e formigas. As peçonhas

desses animais contêm componentes químicos de diversas classes, mas os

peptídeos e as poliaminas constituem os compostos neuroativos mais

(20)

As peçonhas de escorpiões podem provocar em humanos febre,

agitação psicomotora, salivação, lacrimejamento, aumento da mobilidade

intestinal, arritmias cardíacas e respiratórias, hipertensão seguida de

hipotensão, edema pulmonar e choque, dentre outros (Ossanai et al., 2012).

Dentre as várias espécies existentes, apenas algumas possuem importância

médica, sendo distribuídas principalmente entre os gêneros Centruroides,

Tityus, Buthus, Androctonus, Buthotus, Leiurus e Parabuthus (Nencioni et al.,

2009). Em relação ao gênero Tityus, a maioria dos estudos investigou a

peçonha do T. serrulatus, onde se observou que a injeção da peçonha bruta no

hipocampo de ratos é capaz de causar comportamentos convulsivos, como

mioclonias, automatismos faciais e sacudidela de cachorro (wet dog shakes), e,

além disso, a injeção intraperitoneal resulta na indução de descargas neuronais

epileptiformes (Dorce & Sandoval, 1994; Nencioni et al., 2009). Esses efeitos

se devem, pelo menos em parte, às toxinas TS-8F e TsTX-I, que isoladamente

causam descargas epileptiformes e wet dog shakes, quando injetadas no

hipocampo de ratos (Carvalho el al., 1998; Teixeira et al., 2010).

Outra espécie de escorpião bastante estudada é o Buthus martensis. A

peçonha desse escorpião é bastante interessante, pois contém tanto toxinas

com potencial convulsivante como com potencial anticonvulsivante. Assim, a

toxina convulsivante BmK I, é uma -toxina moduladora de canais de sódio

voltagem-dependente que, quando injetada no hipocampo dorsal de ratos em

doses baixas, promove crises límbicas, automatismos faciais, wet dog shakes e

mioclonias, enquanto que na dose de 2 g causa crises tônico-clônicas

seguidas de morte (Bai et al., 2006). Por outro lado, com relação ao potencial

(21)

primeira, quando injetada previamente no hipocampo, reduz de forma

dose-dependente a duração e o número de crises convulsivas induzidas pelo

pentilenotetrazol (PTZ) e aumenta a latência para o início do estado epiléptico

induzido pela pilocarpina (Zhao et al., 2011). Já a segunda toxina, quando

injetada previamente em CA1, protege os animais da morte e reduz a

intensidade das crises induzidas pelo PTZ (Zhao et al., 2008).

Entre os invertebrados também podemos destacar os estudos com

peçonhas de aranhas. As aranhas existem há pelo menos 300 milhões de

anos, representadas por aproximadamente 40.000 espécies já descritas (Rash

& Hodgson, 2002).

A grande maioria das neurotoxinas extraídas de aranhas são proteínas,

peptídeos ou acilpoliaminas (McCormick & Meinwald, 1993). Na literatura

existem vários exemplos de neurotoxinas extraídas de aranhas, dentre eles

está a Ph1, isolada da peçonha da Phoneutria nigriventer, que é capaz de

reduzir, de forma duradoura, a alodinia no modelo de incisão plantar, podendo

ter uso potencial no controle de dores persistentes (de Souza et al., 2011).

Outro exemplo, é a toxina JZTX-XIII isolada da peçonha da Chilobrachys

jingzhao, que apresenta a capacidade de bloquear canais de potássio

dependentes de voltagem dos tipos Kv2.1, Kv4.1 e Kv4.2, com maior afinidade

pelo primeiro (Yuan et al., 2012).

Ainda, a -latrotoxina e -latroinsetotoxina, isoladas da peçonha da

viúva negra (Latrodectus sp), atuam sobre a membrana pré-sináptica formando

poros que facilitam a passagem de íons como o cálcio, gerando uma liberação

(22)

atua em mamíferos e não em insetos, enquanto que para a -latroinsetotoxina

é ao contrário, apresentando assim potencial inseticida (Finkelstein et al., 1992;

McCormick & Meinwald, 1993).

A peçonha da aranha Scaptocosa raptoria quando administrada i.c.v.

promove alterações comportamentais em ratos, como crises pro-cursivas (wild

running), um comportamento que geralmente precede crises convulsivas

(Ribeiro et al., 2000). Entretanto, quando a peçonha é desnaturada e injetada

previamente na substância negra parte reticulada, é capaz de proteger ratos de

crises convulsivas induzidas pela injeção de bicuculina na Area tempestas.

Este efeito foi atribuído a toxina isolada SrTx 1.3 (Mussi-Ribeiro et al., 2004).

A aranha Parawixia bistriata, cuja peçonha bruta promove o surgimento

de crises convulsivas límbicas em ratos, com mioclonias e wet dog shakes

(Rodrigues et al., 2001), também quando desnaturada protege animais de

crises tônico-clônicas induzidas por bicuculina, picrotoxina e PTZ. A toxina

Parawixina 10, também apresentou potencial anticonvulsivante em modelos de

crises tônico-clônicas induzidas por ácido kaínico, NMDA e PTZ em ratos,

através de um mecanismo que envolve o aumento da recaptação de glutamato

e glicina (Fachim et al., 2011).

Outro grupo importante no estudo de venenos é o dos insetos

peçonhentos que fazem parte da ordem Hymenoptera, a qual compreende

abelhas, vespas e formigas. Esses insetos injetam suas peçonhas através de

um ovopositor modificado, que se encontra em seu abdômen (Fitzgerald &

(23)

As peçonhas das abelhas são mais conhecidas pelas reações

anafiláticas provocadas em mamíferos. No entanto, essas apresentam toxinas

com grande potencial terapêutico, por exemplo, na medicina oriental são

utilizadas para o tratamento de doenças imunológicas, como a artrite

reumatoide. Essa capacidade de modular a resposta imune vem sendo

investigada como forma de tratamento complementar em outros tipos de

patologias. Um exemplo é a doença de Parkinson, Chung et al., (2012)

demonstraram que, em camundongos com administrações intraperitoneais da

toxina MPTP, a aplicação intraperitoneal da peçonha de abelha foi capaz de

reduzir a morte de neurônios dopaminérgicos na substância negra, reduzir

citocinas pró-inflamatória como IL-1 e TNF-, além de diminuir a formação de

espécies reativas de oxigênio e o infiltrado de linfócitos TCD4.

Da mesma forma que as aranhas, as vespas possuem peçonhas com

potencial terapêutico. Um exemplo é a toxina AvTx8 isolada da peçonha da

vespa Agelaia vicina, que quando injetada previamente na Substância negra

parte reticulada, reduz os comportamentos defensivos gerados pela

estimulação química de camadas profundas do colículo superior (de Oliveira et

al., 2005).

A peçonha desnaturada da vespa Polybia occidentalis, quando injetada

previamente no ventrículo lateral direito de ratos, é capaz de proteger animais

de crises convulsivas causadas pela administração de bicuculina, picrotoxina e

ácido kaínico, além de aumentar a latência para o aparecimento de crises

induzidas por PTZ (Mortari et al., 2005). Além disso, o peptídeo Thr6-BK,

(24)

mais potente que a morfina no teste de retirada de cauda (tail-flick) em ratos

(Mortari et al., 2007a).

As formigas também possuem peçonhas com grande potencial

farmacológico, porém, apesar de existirem mais de 35.000 espécies descritas

(“Taxonomic List - Ants of All Antweb (Species) - _{AntWeb,” n.d.)}, o estudo de

suas peçonhas é bastante reduzido. Um dos poucos exemplos já descritos é da

poneratoxina, isolada do veneno da peçonha da formiga Paraponera clavata,

que é capaz de bloquear a transmissão sináptica no sistema nervoso central de

baratas (Piek et al., 1991) e aumentar a capacidade do baculovírus em matar a

larva da lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda (Szolajska et al., 2004).

Outros exemplos são da ectamotina, isolada da peçonha da formiga

Ectatomma tuberculatum, que inibe a corrente de cálcio em miócitos

ventriculares de ratos (Pluzhnikov et al., 1999) e as mirmexinas, isoladas da

peçonha da Pseudomyrmex triplarinus, que possuem atividade antiinflamatória,

demonstrada pela inibição dose-dependente do edema de pata induzido por

carragenina em ratos (Pan & Hink, 2000).

1.5.1 Dinoponera quadriceps

A subfamília Ponerinae, que inclui o gênero Dinoponera, apresenta as

formigas com maior tamanho, com picadas dolorosas e capazes de provocar

manifestações sistêmicas como febre, tremores, suor frio, náusea, vômito,

linfadenopatia e arritmias cardíacas (Haddad Junior et al., 2005). A Dinoponera

quadriceps, possui uma organização social atípica, não possuindo rainha. É

(25)

atlântica, sendo endêmica no Nordeste brasileiro (Medeiros et al., 2012;

Vasconcellos et al., 2004).

Poucos são os estudos com a peçonha dessa formiga, Sousa e

colaboradores (2012) demonstraram o potencial antinociceptivo da peçonha em

teste com formalina, ácido acético e carragenina em ratos. Mais recentemente

Lopes e colaboradores (2013) demonstraram o efeito neuroprotetor da peçonha

quando injetada i.p. no modelo de crises convulsivas induzidas por PTZ. No

campo molecular, Cologna e colaboradores (2013) realizaram a identificação

dos peptídeos presentes na peçonha de formigas coletadas em quatro

diferentes regiões, demonstrando significativas diferenças entre as

composições dessas peçonhas, bem como a presença de peptídeos com ação

antimicrobiana de amplo espectro. Enquanto que Torres e colaboradores

(2014) realizaram uma análise de transcriptoma da glândula de veneno da D.

quadriceps, demonstrando a presença de polipeptídeos alergênicos, proteínas

tipo-letal, dinoponeratoxinas e esterases.

Um trabalho realizado no nosso laboratório demonstrou que a peçonha

bruta, quando injetada em altas doses no ventrículo lateral esquerdo de

camundongos Swiss, é capaz de promover alterações comportamentais,

caracterizadas por um período inicial de imobilidade, seguido de um intenso

comportamento motor semelhante a crises convulsivas tônico-clônicas. Por

outro lado, a injeção i.c.v. prévia da peçonha desnaturada é capaz de proteger

animais de crises tônico-clônicas e morte no modelo de crises induzidas pela

bicuculina (Nôga et al. 2015). Esses resultados fomentaram o fracionamento da

peçonha, através de cromatografia líquida de alto desempenho, na tentativa de

(26)

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(33)

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O objetivo do presente trabalho foi verificar qual (is) fração (ões) isolada

(s) da peçonha da formiga Dinoponera quadriceps apresenta (m) potencial

efeito anticonvulsivante em modelo de crises induzidas por bicuculina quando

administrada em camundongos.

3.2 Objetivos Específicos

 Verificar o efeito comportamental da administração intracerebral, em

camundongos, das frações isoladas da peçonha quando os animais são

expostos a um campo aberto.

 Avaliar, em camundongos, o potencial efeito anticonvulsivante da

administração intracerebral das frações isoladas da peçonha através do

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4. ARTIGO

Título: Pro and anticonvulsant effects of fractions isolated from Dinoponera quadriceps ant venom (Formicidae: Ponerinae)

Autores: Diana Aline Nôga Morais Ferreira1_{, Luiz Eduardo Mateus Brandão}1_, Fernanda Carvalho Cagni1_{, Delano Silva}1_{, Dina Lília Oliveira Azevedo}1_{, Arrilton} Araújo1_{, Regina Helena da Silva}2_{e Alessandra Mussi Ribeiro}3_.

Filiações:

1_{Depto de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,}

Brasil.

2_{Depto de Farmacologia,}3_{Depto de Biociências, Universidade Federal de São}

Paulo, São Paulo, SP, Brasil

Periódico: Journal of Ethnopharmacology _– Qualis B1 (psicologia)

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Pro and anticonvulsant effects of fractions isolated from Dinoponera quadriceps ant venom (Formicidae: Ponerinae)

DAMF Nôga1_{, LEM Brandão}1_{, FC Cagni}1_{, D Silva}1_{, DLO. Azevedo}1_{, A Araújo}1_,

RH Silva2_{, AM Ribeiro}3

1_{Physiology Department, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN,}

Brazil.

2_{Pharmacology Departament,}3_{Biosciences Department, Federal University of}

São Paulo, São Paulo, SP, Brazil

Correspondence to: Alessandra M. Ribeiro, Departamento de Biociências,

UNIFESP, Rua Silva Jardim, 136, CEP 11015-020 - Santos, SP, Brasil. Tel.:

+55 13 38783700

(36)

Resumo

Relevância etnofarmacológica: As tocandiras são utilizadas em rituais de passagem para idade adulta na tribo indígena amazônica Sataré-Mawé

Objetivo do estudo: investigar o potencial anticonvulsivante de frações isoladas da peçonha de D. quadríceps em crises convulsivas induzidas pela BIC, bem como uma análise dos efeitos dessas frações no comportamento natural dos camundongos no campo aberto.

Materiais e Métodos: Os animais foram divididos em grupos, os quais receberam injeções (1 mg/ml i.c.v.) de seis frações distintas e tiveram seu comportamento geral observado no campo aberto durante 30 min. No segundo experimento, Os animais receberam as mesmas frações 20 min antes da administração de bicuculina (10 mg/ml). Em seguida, foi analisado o comportamento motor convulsivo desses animais durante 30 minutos no campo aberto.

Resultados: No primeiro experimento, não foram observadas alterações comportamentais. Já no segundo experimento, a administração prévia de DqTx1, DqTx3, DqTx4 e DqTx6 aumentou a latência para o desenvolvimento de crises tônico-clônicas. Além disso, todas as frações, exceto DqTx5, aumentaram a latência para a morte dos animais. Ainda, os melhores resultados foram obtidos com a fração DqTx6, que protegeu 62,5% dos animais testados contra o desenvolvimento de crises tônico-clônicas e 100% dos animais contra a morte.

Conclusões: As frações peptídicas isoladas da peçonha de D. quadríceps possuem um potencial terapêutico para o tratamento de convulsões. Porém, é necessária a determinação da estrutura e mecanismo de ação dos componentes ativos.

(37)

Abstract

Ethnophamacological relevance: The tocandiras ants are used in rituals of passage for adult age in the Sataré-Mawé tribe of Amazonian Indians.

Aim of the study: investigate the anticonvulsant activity of compounds isolated from D. quadriceps venom on seizures induced by BIC, as well as an analysis of its effects on spontaneous behavior in mice

Material and Methods: Animals were divided into groups, which received injections (1 mg/ml; i.c.v.) of six distinct venom fractions and had their general behavior analyzed for 30 min in the open field. In the second experiment, we carried out the same fractions injection protocol 20 min before the administration of bicuculline (10 mg/ml). immediately after, we analyzed

animals’ seizures behavior during 30 min in open field

Results: In the first experiment we did not observe behavioral alterations. Conversely, in the second experiment, previous administration of DqTx1, DqTx3, DqTx4 and DqTx6 increased latency for onset of tonic-clonic seizures. Moreover, all fractions, except DqTx5, increased latency to animals’ death. Yet, we obtained our best result with DqTx6 fraction, which protected 62,5% of tested animals from development of tonic-clonic seizures. Further, this fraction protected all tested animals from seizure episodes followed by death

Conclusions: Peptidic fractions isolated from D. quadriceps venom have an therapeutic potential for seizures treatment. However further work is needed to determine the structure and mechanism of action of the active compounds.

(38)

Introduction

Natural products comprise a immense chemical diversity and

architectural complexity that cannot be matched by synthetic molecules (Clardy

& Walsh, 2004; King, 2011). From this perspective the animals venoms stand

out because of the high specificity and potency of their toxins in relation to their

molecular targets of mammalian biological systems (King, 2011). These

venoms can exert noxious effects on several systems such as cardiovascular,

nervous, respiratory, renal, as well as skin and muscles. As consequence,

poisoning victims may experience pain, swelling, tissue necrosis, vomiting,

paralysis, fever, diarrhea, headaches, blurred sight, dizziness, hypotension,

hemorrhage and even death (Sitprija & Suteparak, 2008; Wong & Belov, 2012).

From another standpoint, these venoms can present benefic effects (de Souza

et al., 2014; Flight et al., 2009; Nunes et al., 2013; Ondetti et al., 1971;

Sheng-ming et al., 2014; T. Wang et al., 2014) or be used as pharmacological tools for

probing biochemical pathways and mechanisms (Mellor & Usherwood, 2004;

Morabito et al., 2014; Wang & Chi, 2004). Despite the remarkable potential of

the venoms their investigation and characterization remains underexplored.

Invertebrates through evolutionary process have incorporated a vast

range of neurotoxins in their venoms, and some compounds show high affinity

to receptors, ionic channels and transporters in the central nervous system

(CNS) (Beleboni et al., 2004; Mellor & Usherwood, 2004; Mortari et al., 2007;

Wang & Chi, 2004). Previous studies have demonstrated anticonvulsant effects

of toxin isolated from invertebrate venoms. Peptide fraction isolated from the

venom of the wasp Polybia paulista protected, at the dose of 350 g/animal,

(39)

pentylenotetrazol (PTZ) (do Couto et al., 2012). Further, the parawixin 2,

isolated from the venom of the spider Parawixia bistriata, when injected in the

right lateral ventricle, protected animals from seizures induced by PTZ,

picrotoxin, pilocarpine and kainic acid (Gelfuso et al., 2007), as well as inhibited

PTZ-induced kindling of rats when chronically administered for 27 days (Gelfuso

et al., 2013).

Seizures are the hallmark of epilepsy, a neurological disorder

characterized by an enduring predisposition to generate transient abnormal

excessive or synchronous neuronal activity, and by the neurobiologic, cognitive,

psychological, and social consequences of this condition (Fisher et al., 2005;

2014). This disorder affects about 65 million people worldwide (Thurman et al.,

2011) and approximately 30% of patients are resistant to pharmacotherapy

(Löscher, 1997; Rosillo-de la Torre, 2014). Furthermore, the patients who use

antiepileptic drugs frequently suffer from collateral effects ranging from gastric

discomfort to hepatic failure and aplastic anemia (Mortari et al., 2007). In this

context, invertebrate venoms appear as a possible source for new

anticonvulsant probes.

Recently, the venom from the giant ant Dinoponera quadriceps has

shown anticonvulsant effects. Lopes et al. (2013) demonstrated that

intraperitoneal administration of the crude venom increased the latency for

onset of seizures induced by PTZ in mice. Additionally, in our lab, after the

injection of the crude venom in the lateral ventricle of mice, we observed

procursive behavior and tonic-clonic seizures. Conversely, the prior

administration of the denatured venom protected the animals against

(40)

bicuculline. Taken together, the findings demonstrated that D. quadriceps

venom might be potential source of new pro- and anticonvulsants molecules. In

this context, the aim of present study was to investigate the anticonvulsant

activity of fractions isolated from D. quadriceps ant venom on seizures induced

by BIC, a GABAA antagonist, as well as an analysis of the effects on

spontaneous behavior in mice.

Material and Methods

Ants collection and fraction obtainment

D. quadriceps were collected in Nísia Floresta (6º5’S, 35º12’W), Rio Grande do Norte state, Brazil. Firstly, to collect the venom the specimens were

frozen at - 20 ºC and venom reservoirs were dissected. Content of two hundred

venom reservoirs were lyophilized and diluted in 0,1%TFA/H2O V/V. This

solution submitted to high performance liquid chromatography (HPLC - Hitachi)

purification using a Phenomenex C18 reverse phase column (2,6 x 25 cm, 12

m, 300 Å). Eluation was carried out with 0,1% TFA/H2O at a 100% gradient for

the first 10 minutes, followed by a linear gradient from 0 to 100% acetonitrile

(ACN) containing 0,1% TFA for 50 minutes. Eluates were monitored at 210 and

280 nm and the main fractions collected were lyophilized and resuspended in

1mL of distilled water. Six major fractions were obtained and named DqTx1,

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Animals

Three-month-old male Swiss mice (30-50 g) were housed with free