ALINE COUTINHO CAVALCANTI
Obtenção de insumo farmacêutico a partir das folhas de
Cissampelos sympodialis Eichl e seu efeito sobre mediadores inflamatórios
relevantes para a asma.
Natal
Obtenção de insumo farmacêutico a partir das folhas de
Cissampelos sympodialis Eichl e seu efeito sobre mediadores inflamatórios
relevantes para a asma.
Orientadores: Prof Dr Eduardo de Jesus Oliveira
Profª Drª Márcia Regina Piuvezam
Prof Dr Túlio Flávio Acioly de Lima e Moura
Natal
2014
Catalogação da Publicação na Fonte
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Cavalcanti, Aline Coutinho.
Obtenção de insumo farmacêutico a partir das folhas de Cissampelos sympodialis Eichl e seu efeito sobre mediadores inflamatórios
relevantes para a asma / Aline Coutinho Cavalcanti. - Natal, 2014. 177f: il.
Coorientadora: Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezam. Coorientador: Prof. Dr. Túlio Flávio Acioly de Lima e Moura. Orientador: Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Medicamento fitoterápico - Tese. 2. Cissampelos sympodialis Eichl - Tese. 3. Ação anti-inflamatória - Tese. 4. Controle de qualidade - Tese. I. Moura, Túlio Flávio Acioly de Lima e. II. Oliveira, Eduardo de Jesus. III. Piuvezam, Márcia Regina. IV. Título.
A Deus, pelo dom da vida e pela possibilidade de vivê-la “bem vivida”
Aos meus pais, pelo incentivo ao saber e pelo exemplo de vida.
Ao Professor Eduardo, pela confiança, incentivo, desafios, conhecimento, orientação e exemplo na rotina multi-tarefa de professor, pesquisador, orientador, amigo e tantas outras.
Ao Prof Túlio Moura (UFRN) e Profª Márcia Piuvezam (UFPB), pela co-orientação, pelos ensinamentos e auxílio na realização desse trabalho.
Aos professores que fazem parte do PPgDITM, pela dedicação e contribuição à minha formação por meio das disciplinas, eventos científicos e atividades diárias, em especial a Prof Cícero Aragão e Profª Fernanda Raffin, também pelas atividades na coordenação geral do PPgDITM e auxílio sempre que necessário.
Ao laboratório de Farmacobotânica, Niara Porto e Profª Fátima Agra, pelo auxílio nas análises histoquímicas.
Ao laboratório de Imunofarmacologia, Hermann Costa e Profª Márcia Piuvezam, pelo auxílio na execução dos ensaios imunológicos.
Ao Prof Fábio Santos de Souza, pela doação de alguns insumos.
Aos técnicos Nonato (CBiotec), Crispim (Biotério) e Gilvandro (CT) pela ajuda nos ensaios de screening fitoquímico, manuseio dos animais de laboratório e obtenção de liofilizados, respectivamente.
Ao colega Severino Antônio Lima Neto e a Prof Marçal Rosas Filho, pela obtenção das imagens através de microscopia eletrônica de varredura.
Aos meus amigos do LAFAM, pela ajuda durante a execução desse trabalho, pelas conversas, risadas e pelo ambiente de trabalho tão leve e cooperativo.
Aos amigos da turma de doutorado, pela convivência, incentivo, ajuda e momentos de descontração, mesmo quando estávamos em meio às tribulações.
À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
DzPor vezes, sentimos que aquilo que fazemos não é, senão, uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.dz
A asma é uma doença crônica caracterizada por dispneia, tosse, espirro intermitente e opressão torácica, sintomas decorrentes de processos fisiológicos como edema, aumento de secreção de muco e contração da musculatura lisa brônquica e também encontra nas plantas medicinais sugestões para seu tratamento. A espécie Cissampelos sympodialis Eichl é uma espécie vegetal bastante estudada, tendo sido avaliadas e comprovadas uma série de ações farmacológicas (anti-anafilática, anti-inflamatória e efeito imunomodulador) que a colocam em posição de destaque para terapia da asma. Esses efeitos farmacológicos são associados à presença de alcaloides, destacando-se a warifteína. O controle de qualidade do material vegetal segundo métodos farmacopeicos foi realizado na busca de especificações de qualidade para as folhas de Cissampelos sympodialis e garantia de uso seguro desse insumo vegetal. A aplicação de técnicas quimiométricas do tipo planejamento experimental foi útil no estabelecimento de condições ótimas de extração para obtenção de extratos hidroalcoólicos das folhas de Cissampelos sympodialis, cuja otimização ocorreu também através de análise univariada relacionada ao tamanho de partícula do material vegetal e método de extração. A monitoração de atividade biológica anti-inflamatória, presumida através de modelos de cultura de células de linfonodos e macrófagos para quantificação de citocinas associadas ao processo inflamatório, foi realizada para os extratos com maior e menor teor de warifteína, decorrentes do planejamento experimental, na forma de suas respectivas frações aquosas. A relação do teor de warifteína com a potência de atividade anti-inflamatória pôde ser sugerida, havendo ainda necessidade de otimização da obtenção da fração aquosa. As condições padronizadas para obtenção do extrato hidroalcoólico envolvem a utilização de material vegetal com partículas de 500 µm, na proporção 1:10 (droga: solvente p/v), com o sistema de solvente extrator sendo etanol : água na proporção 80 : 20 (v/v), através da maceração por 48h, com reposição de solvente após as primeiras 24 h. Foram realizados alguns ensaios de secagem por spray dryer das frações aquosas obtidas, sendo sugerida a utilização de maltodextrina, isolada ou em associação a dióxido de silício coloidal, havendo ainda necessidade de ensaios definitivos. Todo o estudo foi realizado com o intuito de se obter insumo farmacêutico estável e de qualidade para futuro desenvolvimento de formulações e consequente obtenção de medicamento fitoterápico para o tratamento de asma.
Asthma is a chronic disease characterized by dyspnea, cough, sneeze and intermittent chest
tightness, symptoms resulting from physiological processes such as edema, mucus secretion and
contraction of bronchial smooth muscle. There are some evidence that herbal treatments can have
a role in the treatment of asthma. The species Cissampelos sympodialis Eichl has been widely
studied and a number of proven pharmacological actions (anti-anaphylactic, anti- inflammatory
and immunomodulatory effect) put it in a prominent position for asthma therapy. These
pharmacological effects are associated with the presence of alkaloids in the plant's extract,
amongst them warifteine, a bisbenzylisoquinoline-type alkaloid. Pharmacopeal quality control
assays of raw vegetable material were conducted in order to obtain quality specifications for
Cissampelos sympodialis leaves and to ensure safe use as raw material for extract preparation.
The application of chemometric techniques of experimental design was useful in establishing
optimum conditions for extraction in order to obtain the standardized hydroalcoholic extract of the
leaves of Cissampelos sympodialis. Univariate analysis was used for optimization of particle size
and extraction method. Monitoring of anti-inflammatory biological activity was conducted using
cell-based assays with lymphocytes and macrophages to quantify cytokynes associated with
inflammation. These assays were conducted with the aqueous fraction of the ethanolic extracts
with the higher and lower warifteine content, as determined by the optimization of the extraction
conditions. A relationship between warifteine content and the anti-inflammatory potency was
observed. However, the partitioning of the ethanolic extract to obtain the aqueous fraction still
needs to be optimized if higher concentrations of warifteine are to be obtained. The best
conditions for obtaining the hydroalcoholic extract of the leaves involve the use of plant material
with particles of 500 µm; a ratio of 1:10 (drug:solvent w/v), ethanol: water in the ratio 80:20 (v/v)
as the extraction solvent, and maceration for 48 hours with replacement of the solvent after the
first 24 h as extraction method. Spray-drying assays were conducted with the aqueous fractions.
These assays suggest that maltodextrin can be used, alone or in combination with colloidal silicon
dioxide for drying of the aqueous fraction, although the use of other excipients or their
combination are not discarded. The standardized aqueous fraction obtained was able to decrease
the production of pro-inflammatory cytokines and can be considered a suitable raw material for
the development of formulations and the consequent production of a herbal medicine for asthma
treatment.
Keywords: herbal medicine , quality control , standardization of extract, experimental design ,
Figura 1- Mapa sobre a prevalência de asma no mundo, segundo relatório da GINA (Iniciativa
Global para Asma) ... 33
Figura 2 - Quadro representativo com os mediadores envolvidos na asma ... 35
Figura 3 - Esquema das fases do desenvolvimento da asma ... 36
Figura 4 – Fórmula estrutural dos núcleos isoquinolínico (A) e benzilisoquinolínico (B) de onde derivam os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos ... 41
Figura 5- Foto da espécie Cissampelos sympodialis na sua forma adulta (A) e seus frutos (B) ... 42
Figura 6 - Quadro com alcaloides isolados de Cissampelos sympodialis ... 43
Figura 7 – Ilustração com resumo dos alvos terapêuticos de Cissampelos sympodialis ... 49
Figura 8 - Ilustração de métodos tradicionais de extração ... 52
Figura 9 – Ilustração de exemplo de gráfico de pareto em função dos valores de estatística do teste t. ... 58
Figura 10 – Ilustração de exemplo de gráfico de superfície de resposta de modelo quadrático (A) e linear (B) ... 58
Figura 11 - Esquema do equipamento de spray dryer ... 61
Figura 12 - Fases do processo de secagem por spray dryer ... 62
Figura 13 - Secções histoquímicas transversais de folhas de Cissampelos sympodialis. ... 87
Figura 14 - Histoquímica das secções transversais de folhas de Cissampelos sympodialis.. ... 89
Figura 15- Distribuição do tamanho de partículas das folhas de Cissampelos sympodialis .... 93
Figura 16- Gráfico da relação entre teor de warifteína e teor de extraíves por etanol observada nos quatro lotes de folhas de C. sympodialis avaliados ... 95
experimental completo para extração das folhas de Cissampelos sympodialis na avaliação do resíduo sólido como fator resposta. ... 103 Figura 20 - Gráfico de valores previstos x valores observados (A) e histograma de resíduos (B) do planejamento experimental completo para otimização da extração das folhas de
Cissampelos sympodialis Eichl na avaliação do resíduo sólido como fator resposta. ... 104
Figura 21 - Gráfico de pareto para teor de warifteína (%) ... 105 Figura 22 - Gráfico de superfície de resposta (A) e de contorno (B) do planejamento experimental completo para extração das folhas de Cissampelos sympodialis na avaliação do teor de warifteína como fator resposta. ... 106 Figura 23 - Gráfico de valores previstos x valores observados (A) e histograma de resíduos (B) do planejamento experimental completo para otimização da extração das folhas de
Cissampelos sympodialis Eichl na avaliação do resíduo sólido como fator resposta. ... 107
Figura 24 - Rendimento do extrato hidroalcoólico (g) durante comparação univariada de diversos métodos de extração para otimização do processo extrativo das folhas de
Cissampelos sympodialis... 111
Figura 25 - Rendimento do extrato hidroalcoólico (%) em relação à quantidade de folhas utilizadas durante comparação univariada de diversos métodos de extração para otimização do processo extrativo das folhas de Cissampelos sympodialis. ... 111 Figura 26 - Rendimentos extrativos dos extratos hidroalcoólico (g/mL) obtidos durante comparação univariada de diversos métodos de extração para otimização do processo extrativo das folhas de Cissampelos sympodialis. ... 112 Figura 27 - Efeitos in vitro das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de
Cissampelos sympodialis com pior e melhor teor de warifteína, obtidos através de
experimental (Fr Aq P) na apoptose e necrose de linfócitos, visualizados através de densidade óptica (A) e percentagem de sobrevivência de células (B). ... 120 Figura 29 - Efeitos in vitro das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de
Cissampelos sympodialis com pior teor de warifteína, obtidos através de planejamento
experimental (Fr Aq P) na apoptose e necrose de linfócitos, visualizados através de densidade óptica (A) e percentagem de sobrevivência de células (B). ... 121 Figura 30 - Efeitos in vitro das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de
Cissampelos sympodialis com pior teor de warifteína, obtidos através de planejamento
experimental (Fr Aq P) na proliferação e liberação de óxido nítrico de macrófagos ... 124 Figura 31 - Efeitos in vitro das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de Cissampelos sympodialis com pior e melhor teor de warifteína, obtidos através de planejamento experimental (Fr Aq P e Fr Aq M) na liberação de citocinas de linfócitos. .... 127 Figura 32 Efeitos das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de Cissampelos
sympodialis com pior e melhor teor de warifteína, obtidos através de planejamento
experimental (Fr Aq P e Fr Aq M) in vitro na liberação de citocinas de macrófagos. ... 131 Figura 33 - Fração aquosa, Pó “P” e pó “Q”, respectivamente, envolvidos no processo de secagem da fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis ... 137 Figura 34 - Spray dryer durante processo de secagem de fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis em menor (A) e maior (B) escala. ... 139 Figura 35 - Pós “P” (A) e “Q” (B), obtidos a partir da secagem através de spray dryer da
fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis. ... 140 Figura 36 - Acompanhamento de ganho de umidade e escurecimento dos pós “P” (superior) e
“Q” (inferior), após ensaio de umidade (A), após 24 h (B) e após 7 dias (C) do mesmo. ... 140
Figura 37 - Verificação da velocidade de escoamento e ângulo de repouso dos pós “P” (A) e
Figura 39 - Cromatogramas do extrato hidroalcoólico (305 mg/mL) (A), da fração aquosa (10 mg/mL) (B) e do pós seco por spray dryer (25 mg/mL) (C). ... 144 Figura 40 - Fotomicrografias dos pós “N” (A: aumento de 150x; B: aumento de 500x; C:
aumento de 1000x) e “O” (A: aumento de 150x; B: aumento de 500x; C: aumento de 1000x
Tabela 1- Exemplos de estudos envolvendo secagem de extratos vegetais por spray dryer ... 64 Tabela 2 - Equipamentos utilizados ... 66 Tabela 3 - Metodologias utilizadas para a detecção das principais classes de metabólitos nas seções das folhas de Cissampelos sympodialis... 68 Tabela 4 - Condições cromatográficas do método para quantificação de warifteína ... 72 Tabela 5 - Fatores e níveis do planejamento experimental de triagem para otimização da extração das folhas de Cissampelos sympodialis Eichl ... 73 Tabela 6 - Fatores e níveis do planejamento experimental 23 com ponto central para otimização do processo extrativo das folhas de Cissampelos sympodialis ... 74 Tabela 7 - Matriz do planejamento experimental 23 com ponto central para otimização do processo extrativo das folhas de Cissampelos sympodialis ... 75 Tabela 8 - Compostos identificados pelos testes histoquímicos na folha de Cissampelos
sympodialis ... 86
Tabela 9 - Screening fitoquímico dos quatro lotes de folhas de Cissampelos sympodialis ... 90 Tabela 10 - Resultados de ensaios de controle de qualidade das folhas de Cissampelos
sympodialis Eichl (n=3). Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão ... 91
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
PPPM/Ceme: Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos CIPLAN : Comissão Nacional Interministerial de Planejamento e Coordenação
SUS: Sistema único de saúde
RDC: Resolução de Diretoria Colegiada RE: Resolução específica
IN: Instrução normativa
MF: Medicamentos fitoterápicos PTF: produtos tradicionais fitoterápicos LTF: Laboratório de Tecnologia Farmacêutica CBiotec: Centro de Biotecnologia
UFPB: Universidade Federal da Paraíba GINA: Global Initiative for Asthma TNF: fator de necrose tumoral IL: interleucina
LTB: leucotrieno COX: ciclooxigenase LOX: lipooxigenase PDE4: fosfodiesterase 4
ERO: espécies reativas de oxigênio Ig: imunoglobulina
PGD: prostaglandina TXA: tromboxano A
PFA: fator de ativação plaquetária NO: óxido de nítrico
TGI: trato gastrintestinal
AMPc: monofostafo cíclico de adenosina GMPc: monofosfato cíclico de guanosina BBI: bisbenzilisoquinolínicos
DOE: design de experimentos
HPLC: high peprformance liquid chromatography v/v: volume/volume
CLAE: cromatografia líquida de alta eficiência ANOVA: análise de variância
SBF: soro bovino fetal U: unidades
RPMI: Instituto Roswell Park Memorial ConA: concanavalina A
MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina PI: iodeto de propídio
i.p.: intraperitoneal LPS: lipolisacarídeo IFN: interferon
CTR+: controle positivo Dap: densidade aparente Dc: densidade compactada
CV: coeficiente de variação ou desvio padrão relativo US: ultrassom
Mac: maceração Fr Aq: fração aquosa p/p: peso/peso
2. Objetivos ___________________________________________________________________ 24 3. Referencial Teórico __________________________________________________________ 26 3.1. Plantas Medicinais e fitoterápicos ____________________________________________________ 26
3.2. Asma __________________________________________________________________________ 32
3.3. Cissampelos sympodialis __________________________________________________________ 40
3.4 Extratos vegetais _________________________________________________________________ 50
3.5. Quimiometria ___________________________________________________________________ 56
3.6. Spray dryer _____________________________________________________________________ 59
4. Materiais e métodos __________________________________________________________ 66 4.1. Reagentes e padrões ______________________________________________________________ 66
4.2. Equipamentos ___________________________________________________________________ 66
4.3. Material vegetal _________________________________________________________________ 67
4.4. Análise histoquímica ______________________________________________________________ 68
4.5. Controle de qualidade do material vegetal _____________________________________________ 68
4.5.1. Screening fitoquímico preliminar de Cissampelos sympodialis _________________________ 69
4.5.2. Determinação de umidade ______________________________________________________ 70
4.5.3. Determinação de cinzas totais ___________________________________________________ 71
4.5.4. Determinação de sólidos extraíveis por etanol ______________________________________ 71
4.5.5. Índice de intumescimento ______________________________________________________ 71
4.5.6. Distribuição de tamanho de partículas ____________________________________________ 72
4.5.7. Teor de warifteína ____________________________________________________________ 72
4.6. Planejamento experimental de triagem 23 para otimização do processo extrativo das folhas de
Cissampelos sympodialis ______________________________________________________________ 73
4.7. Planejamento experimental 23 com ponto central para otimização do processo extrativo das folhas de
Cissampelos sympodialis ______________________________________________________________ 73
4.8. Alteração de parâmetros do processo extrativo através de análise univariada __________________ 75
4.9. Aumento de escala da obtenção dos extratos com menor e maior teor de warifteína, segundo condições
otimizadas de extração, e de suas respectivas frações aquosas para quantificação de mediadores envolvidos
na inflamação _______________________________________________________________________ 76
4.9.1. Obtenção dos extratos e frações aquosas __________________________________________ 76
4.9.2. Quantificação de mediadores envolvidos na inflamação ______________________________ 77
4.9.2.1. Animais ________________________________________________________________ 77
4.9.2.2. Cultura de células de linfonodos mesentéricos __________________________________ 78
4.9.2.3. Ensaio de apoptose e necrose _______________________________________________ 78
4.9.2.4. Cultura de macrófagos e dosagem de óxido nítrico ______________________________ 79
extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis _________________________________ 81
5. Resultados e discussão ________________________________________________________ 85 5.1. Análise histoquímica ______________________________________________________________ 85
5.2. Análise fitoquímica _______________________________________________________________ 90
5.3. Determinação de umidade __________________________________________________________ 91
5.4. Determinação de cinzas totais _______________________________________________________ 92
5.5. Substâncias extraíveis por etanol e índice de intumescência _______________________________ 92
5.6. Determinação do tamanho de partículas _______________________________________________ 92
5.7. Teor de warifteína ________________________________________________________________ 93
5.8. Planejamento experimental de triagem 23 para otimização do processo extrativo das folhas de
Cissampelos sympodialis ______________________________________________________________ 97
5.9. Planejamento experimental 23 com ponto central para otimização do processo extrativo das folhas de
Cissampelos sympodialis _____________________________________________________________ 101
5.10. Alteração de parâmetros do processo extrativo através de análise univariada ________________ 109
5.11. Aumento de escala da obtenção dos extratos com menor e maior teor de warifteína, segundo
condições otimizadas de extração, e de suas respectivas frações aquosas para avaliação em modelos de
ação anti-inflamatória _______________________________________________________________ 114
5.11.1. Obtenção dos extratos e frações aquosas ________________________________________ 114
5.11.2. Avaliação de mediadores da inflamação _________________________________________ 116
5.11.2.1. Ensaio de viabilidade celular em cultura de células de linfonodos mesentéricos ______ 117
5.11.2.2. Ensaio de apoptose e necrose _____________________________________________ 119
5.11.2.3. Viabilidade celular em cultura de macrófagos e dosagem de NO __________________ 122
5.11.2.4. Dosagem de citocinas ___________________________________________________ 123
5.11.2.4.1. Dosagem de citocinas de células de linfonodos mesentéricos_________________ 125
5.11.2.4.2. Dosagem de citocinas de macrófagos ___________________________________ 128
5.12. Obtenção do insumo farmacêutico na forma de pó seco por spray dryer a base da fração aquosa do
extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis ________________________________ 135
1. Introdução
As plantas medicinais são uma alternativa para o tratamento de várias doenças, tanto sob orientação da OMS quanto de órgãos nacionais como a ANVISA, que regulamenta a sua utilização através de orientações quanto ao uso de medicamentos fitoterápicos e produtos tradicionais fitoterápicos, e ainda dos insumos originais necessários para a sua elaboração.
Essa opção terapêutica cresceu bastante após o desenvolvimento e alto custo de medicamentos elaborados a partir de insumos farmacêuticos ativos isolados ou em associação, e ainda houve a contribuição da carência de novos tratamentos para doenças crônicas, como a asma. O aumento pela procura e até o uso indiscriminado das plantas medicinais exigiu uma maior regulamentação quanto a sua comercialização, havendo atualmente a necessidade de estudos agronômicos, botânicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos e tecnológicos antes do desenvolvimento de um medicamento fitoterápico.
A espécie Cissampelos sympodialis se destaca pela utilização popular de infusão de suas raízes e folhas no tratamento de doenças inflamatórias, como artrite, incluindo também quadros mais complexos, como a asma, doença para a qual o tratamento atual consiste no alívio dos sintomas e no seu controle, visto que tem caráter crônico, não havendo cura, e necessita de acompanhamento médico específico, com alto investimento em estratégias para adesão dos pacientes.
Esta espécie já vem sendo estudada há anos, havendo estudos agronômicos, botânicos, fitoquímicos, analíticos e toxicológicos, além de já ser bem estabelecida sua atividade farmacológica no que diz respeito às ações anti-inflamatória, anti-alérgica e imunomoduladora, imprescindíveis para o tratamento da asma. Há relatos de estudos tecnológicos envolvendo métodos de secagem, e alguns relatos informais sobre tentativas de desenvolvimento de formulações, mas não há ainda estudos relacionados à padronização do método de extração utilizado para obtenção do extrato hidroaloólico a partir das folhas de
Cissampelos sympodialis, bem como da respectiva fração aquosa resultante de partição sua
em água, empregada nos diversos estudos farmacológicos desenvolvidos. A necessidade dessa padronização consiste no fato de que as condições de extração podem influenciar na composição química do extrato e também na sua atividade farmacológica, exigindo-se assim uma reprodutibilidade na obtenção do insumo vegetal e também de seu extrato derivado.
avaliada a resposta imunológica, relacionada à quantificação de citocinas envolvidas no processo inflamatório, como predição de atividade anti-inflamatória e controle de qualidade biológico, a fim de corroborar a qualidade e eficácia do extrato obtido. Além disso, o trabalho propõe a obtenção de insumo farmacêutico ativo na forma de fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis seco por spray dryer, técnica de secagem bastante eficiente, econômica, rápida e versátil. Com a proposta de insumo sólido seco, seria possível sua aplicação em formulações sólidas, líquidas ou semi-sólidas, garantindo sua diversidade e maior segurança, já que as formas sólidas estão associadas a maior estabilidade química e física de insumos e formas farmacêuticas.
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
Otimizar as condições de extração das folhas de Cissampelos sympodialis visando a obtenção de um insumo ativo que possa ser utilizado na obtenção de formas farmacêuticas para o tratamento da asma.
2.2. Objetivos Específicos:
1. Realizar o controle de qualidade ou caracterização físico-química além de avaliação histo e fitoquímica das folhas utilizadas como matéria-prima vegetal;
2. Padronizar a matéria-prima vegetal para obtenção do extrato hidroalcoólico;
3. Padronizar as condições de obtenção do extrato hidroalcoólico, como forma de assegurar a qualidade do insumo ativo a ser utilizado na produção do medicamento; 4. Padronizar as condições de obtenção da fração aquosa das folhas, com base na
quantificação do marcador ativo;
5. Monitorar a atividade farmacológica dos extratos previamente selecionados através da quantificação de citocinas em modelos de linfócitos e macrófagos;
3. Referencial Teórico
3.1. Plantas Medicinais e fitoterápicos
A data precisa do conhecimento adquirido sobre plantas medicinais e outros produtos naturais é incerta, mas contos antigos, mitos, escrituras e literatura histórica refletem o contexto preliminar sobre o uso de plantas com aplicação medicinal (DHAMI, 2013). Sendo assim, as plantas fazem parte da vida humana desde seus primórdios (SIMÕES e SCHENKEL, 2002) e sua utilização para tratamento de doenças no Brasil foi influenciada pela cultura indígena, através da utilização de vegetais em rituais de cura, na caça e nas guerras (CARVALHO, 2004). Ainda houve colaboração da cultura africana, associada a rituais religiosos; bem como da europeia, desde o período de colonização, e das culturas chinesa e japonesa, através da contribuição dos imigrantes no início do século XX (MARTINS et al., 2000).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconhece no conhecimento tradicional sobre produtos da biodiversidade um importante instrumento no desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos para o combate de doenças que assolam as populações dos países em desenvolvimento (FUNARI e FERRO, 2005). O uso da medicina tradicional tem expandido globalmente e ganho popularidade, não sendo utilizada apenas na atenção primária de países em desenvolvimento, mas também tem sido utilizada em países onde a medicina convencional é predominante no sistema de saúde (WHO, 2000).
O uso de fitoterápicos foi reconhecido pela Organização Mundial de Saúde em 1978, na Conferência Internacional de Atenção Primária em Saúde em Alma-Ata (Genebra), e estima-se que 80% das pessoas que vivem em países em desenvolvimento estão utilizando exclusivamente a medicina tradicional para o tratamento de doenças na atenção primária à saúde (CARVALHO et al., 2007; VIEIRA, 2008), o que significa, em média, 3,3 bilhões de pessoas utilizando plantas medicinais regularmente (ARUMUGAM et al., 2012).
fitoterápico substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2010b).
Os medicamentos fitoterápicos são derivados de plantas medicinais e podem ser manipulados ou industrializados, conforme a legislação brasileira. Podem ainda ser destinados ao uso humano ou veterinário, sendo os para uso humano, regulamentados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e os para uso veterinário, pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2013).
Em 1981, a política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos foi citada no Brasil, através da Portaria n°122, do Ministério da Saúde, e ainda em 1982, houve o lançamento do Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos (PPPM/Ceme), para buscar o desenvolvimento de terapêutica alternativa complementar com base científica no desenvolvimento dos fitoterápicos a partir de informações da medicina de uso popular.
Em 1988, a Comissão Nacional Interministerial de Planejamento e Coordenação (CIPLAN) implanta a Fitoterapia como prática oficial da medicina e orienta sua inclusão nos serviços primários de saúde. Esta recomendação condiciona o uso de plantas medicinais a estudos científicos, que incluem a investigação antropológica-botânica junto à medicina popular tradicional; isolamento e caracterização de substâncias ativas; transformação química gerando novos fármacos, ensaios farmacológicos, toxicológicos, pré-clínicos e clínicos (MIGUEL e MIGUEL, 1999).
A política de fitoterápicos vem se desenvolvendo a partir da Política Nacional de Plantas Medicinais (Decreto 5813/2006) e seu programa (Portaria 2960/2008), além da inserção das práticas integrativas e complementares no SUS (Portaria 971/2006). A utilização de plantas medicinais tem recebido incentivos da OMS, que reafirmam a importância das plantas medicinais nos cuidados com a saúde, recomendando entre outros aspectos a criação de programas globais para a identificação, validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais utilizadas na medicina tradicional, bem como assegurar o controle de qualidade dos fitoterápicos (MIGUEL e MIGUEL, 1999). Atualmente, há normas vigentes, segundo a ANVISA, para a pesquisa, registro e comercialização de fitoterápicos (BRASIL, 2013):
i. RDC nº 14/2010: Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos.
iii. RE nº 91/2004: Guia para realização de alterações, inclusões, notificações e cancelamentos pós-registro de fitoterápicos.
iv. IN nº 5/2008: Lista de medicamentos fitoterápicos de registro simplificado.
v. IN nº 5/2010: Lista de referências bibliográficas para avaliação de segurança e eficácia de Fitoterápicos.
vi. RDC no 17/2010: Boas Práticas de Fabricação de medicamentos (aplicada aos medicamentos fitoterápicos em geral)
vii. RDC no. 13/2013: Boas Práticas de Fabricação (BPF) para os produtos tradicionais fitoterápicos
viii. RDC no. 14/2013: Dispõe sobre as Boas práticas de fabricação de insumos farmacêuticos ativos de origem vegetal.
Em maio de 2013 foi lançada uma consulta pública para o registro de medicamentos fitoterápicos (MF) e o registro e notificação de produtos tradicionais fitoterápicos (PTF), na qual ocorre a proposta de criação de uma nova categoria de produto, havendo diferença entre eles. O PTF será o medicamento fitoterápico com comprovação por tradicionalidade de uso e literatura (RDC 14/10 e IN 5/10); ou a droga vegetal notificada (RDC 10/10); ou o medicamento de notificação simplificada de origem vegetal (IN 3/09); ou ainda os medicamentos fitoterápicos de registro simplificado (IN 5/08). A ANVISA atualizará a lista de registro simplificado de medicamentos fitoterápicos incluindo novas espécies vegetais, harmonizando suas especificações, totalizando 39 espécies (ANVISA, 2013).
Caso não haja investimento maior nem criação e execução de políticas que incentivem a produção de fitoterápicos, o Brasil corre o risco de, mesmo com a vasta biodiversidade, se tornar importador de matéria-prima vegetal e reprodutor de formulações fitoterápicas, como muitas vezes ocorre com os medicamentos sintéticos (SIMÕES e SCHENKEL, 2002). O objetivo principal de desenvolvimento da política para o setor seria a possibilidade de competição no mercado dos medicamentos fitoterápicos com os fármacos modernos produzidos pela química medicinal clássica, acreditando-se que a sinergia e a associação de mecanismos permitiriam o desenvolvimento de fitoterápicos mais seguros e menos agressivos ao organismo (YUNES et al., 2001).
A população espera que os medicamentos fitoterápicos tenham uma base científica sustentável, além de comprovada segurança e eficácia, o que requer planejamento, gestão, recursos e visão do que é necessário para quebrar os paradigmas e desenvolver estratégias para a promoção dos medicamentos fitoterápicos (CORDELL e COLVARD, 2012).
O mercado mundial de fitoterápicos é da ordem de R$ 21,7 bilhões anuais (CARVALHO et al., 2008), com cerca de R$ 400 milhões no Brasil e taxas de crescimento da ordem de 15%, contra 4% dos medicamentos sintéticos (RODRIGUES, 2005). No Brasil, o valor estimado gasto em fitoterápicos é da ordem de 300 milhões de dólares, relativamente pequeno, representando cerca de 4% do total do mercado farmacêutico, da ordem de 7,4 bilhões de dólares, valores que se referem apenas aos fitoterápicos industrializados (CARVALHO et al., 2007).
A produção de fármacos via síntese química, o crescimento do poder econômico das indústrias farmacêuticas e a ausência de comprovações científicas de eficácia das substâncias de origem vegetal, aliada às dificuldades de controle químico, físico-químico, farmacológico e toxicológico dos extratos vegetais até então utilizados, impulsionaram a substituição destes por fármacos sintéticos, no passado (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006). O mercado de fitoterápicos decaiu com o desenvolvimento dos medicamentos sintéticos no pós-guerra, mas vem apresentando um crescimento marcante nas últimas décadas, como tratamento alternativo aos medicamentos da medicina tradicional (CARVALHO et al., 2007; DHAMI, 2013).
Planta medicinal é uma espécie que contem substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou como precursores de insumos farmacêuticos ativos. Seu uso tradicional é decorrente de anos de experimentação, cuja informação é repassada verbalmente de geração a geração, o que pode ocasionar erros sobre sua forma de utilização e dosagem (KARUNAMOORTHI et al., 2013).
Para grande parte da população o uso de plantas medicinais é visto como uma alternativa histórica à utilização de medicamentos sintéticos, visto que os últimos são considerados mais caros e agressivos ao organismo (CAPASSO et al., 2000). O aumento no consumo de fitoterápicos pode ser associado ao fato de que as populações questionam os perigos do uso irracional dos medicamentos alopáticos associados a seus custos muitas vezes dispendiosos e procuram substituí-los pelo uso de plantas medicinais. A comprovação da ação terapêutica, associada à insatisfação da população perante o sistema de saúde, tem favorecido essa dinâmica (KLEIN et al., 2009).
artesanais que caracterizaram os estágios iniciais de sua utilização (TUROLLA e NASCIMENTO, 2006).
Até março de 2008, a ANVISA abrigava o registro de 512 medicamentos fitoterápicos, sendo 80 associações e 432 simples, onde as principais formas farmacêuticas eram cápsulas e comprimidos, e dentre os quais havia 162 espécies de plantas e 119 empresas detentoras de registros. Do total de espécies vegetais com registro no Brasil, menos de 30% são nativas da América do Sul, indicando a necessidade de investimento e pesquisa envolvendo a avaliação da eficácia e segurança de espécies medicinais brasileiras, bem como no desenvolvimento dos fitoterápicos que as contenham (CARVALHO et al., 2008).
A prática de medicina tradicional e uso de plantas medicinais são igualmente relevantes nas práticas farmacêuticas modernas (DHAMI, 2013) e a opção de conduzir pesquisas a partir da indicação de plantas utilizadas por comunidades encurta o percurso do desenvolvimento de um novo medicamento, já que os pesquisadores dispõem, antes mesmo de iniciarem o estudo científico, de uma indicação de qual atividade biológica esta droga poderia apresentar (FUNARI e FERRO, 2005).
Os fitoterápicos apresentam algumas vantagens que justificam seu uso: potencial efeito sinérgico; associação de mecanismos por classes de substâncias, agindo em alvos moleculares diferentes; menor risco de efeitos colaterais e menor custo de pesquisa (YUNES
et al., 2001). O custo da pesquisa é menor (U$ 3 a 7 milhões) quando comparado ao custo
relativo à pesquisa dos medicamentos sintéticos (U$ 250 a 880 milhões) (RODRIGUES, 2005).
O Brasil é o país com a maior diversidade do mundo, com cerca de 120.000 espécies (CARVALHO, 2004), o que representa um número estimado de mais de 20% do número total de espécies do planeta (CARVALHO et al., 2007). O Brasil não tem apenas um dos mais altos níveis mundiais de biodiversidade, mas também uma enorme diversidade cultural e um ainda não utilizado repertório de plantas com potencial valor econômico que ainda não foram exploradas (ALBUQUERQUE et al., 2007).
Apesar da vasta capacitação técnica em nível acadêmico, os recursos para financiar tais pesquisas não são suficientes em volume e constância, tendo em vista o alto custo do desenvolvimento desses produtos. Além do financiamento insuficiente, um dos principais entraves é a falta de uma política de indução para o setor. Neste sentido, a interação indústria-academia deve contar com uma mentalidade que estabeleça o uso de nossos recursos naturais, propiciando o desenvolvimento socioeconômico, com o indispensável respeito aos ecossistemas e buscando a manutenção das características culturais do país (SIMÕES e SCHENKEL, 2002).
No segmento industrial, é nítido o ressurgimento do interesse em produtos naturais como fonte de modelos para fármacos e como matéria-prima para desenvolvimento de fitoterápicos (SIMÕES e SCHENKEL, 2002). As pesquisas básica e inovadora são igualmente necessárias, no entanto, cada vez menos é possível desenvolver a primeira, devido à crise financeira da universidade pública (RODRIGUES, 2005). A parceria academia-indústria seria estratégica, embora haja discordância por parte de alguns pesquisadores, que a julgam prejudicial quando não há delimitação da função de cada parte, sobretudo no momento em que já há louros para a vitoriosa pesquisa.
O Brasil tem mostrado uma grande evolução ao longo da sua produção científica dos últimos anos, mas atualmente ainda não tem informação suficiente para registro de muitos produtos de origem nacional. Este cenário pode certamente mudar no futuro, no entanto, leva muito tempo para construir isso. A ANVISA e, especialmente, os grupos que lidam com o desenvolvimento e registro de fitoterápicos estão abertos a discussões, ao mesmo tempo que se procura harmonizar o conhecimento e a regulação desse setor, inspirados em legislações internacionais, o que é muito importante (BUFAINO, 2013).
A pesquisa em plantas medicinais é interdisciplinar e que há uma colaboração entre diferentes ciências, incluindo a botânica, agronomia, ecologia, química, bioquímica, farmacognosia, farmacologia, fitoquímica, medicina, toxicologia, biotecnologia e tecnologia farmacêutica (TOLEDO et al., 2003; PHILLIPSON, 2007).
Constatam-se inúmeras plantas cujos estudos fitoquímicos e farmacológicos são potencialmente satisfatórios, contudo a espécie em questão não possui sequer pesquisas agronômicas e ecológicas que se preocupam com reprodução do vegetal ou sequer o extrativismo sustentável (TOLEDO et al., 2003).
É preciso uma maior integração e execução do caráter multidisciplinar que envolve a pesquisa e desenvolvimento de um medicamento fitoterápico, de modo a integrar os resultados já obtidos e vislumbrar a obtenção de insumos e formulações que possam auxiliar a população na manutenção da saúde, incluindo o tratamento de diversas patologias, como a asma.
3.2. Asma
O antigo Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da Universidade Federal da Paraíba possui um grupo de pesquisadores envolvidos com o estudo dos aspectos botânicos, químicos e farmacológicos de plantas, principalmente de espécies nativas do Nordeste Brasileiro. Dentre os diversos modelos experimentais e grupos terapêuticos de interesse desse grupo de pesquisa, destaca-se a busca por terapias para o tratamento da asma.
A asma é definida como uma doença inflamatória pulmonar crônica, que apresenta como características principais a obstrução reversível de vias aéreas (espontaneamente ou com tratamento); inflamação e hiper-reatividade das vias aéreas frente a uma variedade de estímulos (PASTORINO et al., 1998; CORRÊA et al., 2008), onde várias células têm importante papel, especialmente os mastócitos, eosinófilos e linfócitos T (MUNIZ et al., 2003). No Brasil, no período de 1975 a 1987, foi detectado um aumento progressivo da incidência de crises de asma, tanto em nível ambulatorial quanto hospitalar (PASTORINO et
al., 1998).
tratamento, sendo uma doença mais comum em crianças, representando mais de 80% de mortes em países de renda baixa/média (VIEIRA, 2008).
Segundo OMS, 300 milhões de pessoas sofrem de asma, e 255 mil morreram decorrentes dela em 2005, sendo considerado um problema de saúde pública, necessitando, de tratamento contínuo, por se tratar de uma doença crônica (JARDIM, 2007; WHO, 2007; CORRÊA et al., 2008).
Adaptado de (MASOLI et al., 2004; GRAHAM-ROWE, 2011)
Caracteriza-se por dispneia, tosse, espirro intermitente e opressão torácica, sintomas decorrentes de processos fisiológicos como edema, aumento de secreção de muco e contração da musculatura lisa brônquica e resulta da interação entre a carga genética, exposição ambiental a alérgenos e irritantes que levam ao desenvolvimento e manutenção dos sintomas (BUSSE e LEMANSKE, 2001).
Na caracterização da doença, algumas mudanças estruturais são esperadas, como a remoção de epitélio e espessamento da membrana reticular basal; hiperplasia das glândulas mucosas; fibrose subepitelial; elastose e fragmentação das fibras elásticas; infiltração de células inflamatórias; hipertrofia e hiperplasia da musculatura lisa brônquica e aumento do número de vasos sanguíneos (angiogênese) em resposta ao aumento de secreção do fator de crescimento endotelial vascular, o que envolve a liberação de diversos mediadores químicos (Figura 2) A inflamação que ocorre na asma é frequentemente descrita como eosinofílica, havendo aumento do número de macrófagos em pulmões de pacientes com asma (VIEIRA, 2008).
Figura 1- Mapa sobre a prevalência de asma no mundo, segundo relatório da GINA (Iniciativa Global
A patologia da asma é dividida em duas fases (Figura 3)
1) Fase imediata ou aguda, que é a resposta inicial aos estímulos irritantes que atuam sobre os receptores de fibras sensoriais presentes no músculo liso das vias aéreas, glândulas produtoras de muco e brônquios. Ocorre a interação do alérgeno com o organismo, sendo tal antígeno reconhecido por células apresentadoras de antígenos, que são macrófagos teciduais ou células dendríticas (BUSSE e LEMANSKE, 2001). Em seguida há ativação de principais citocinas pró-inflamação (TNF-ᵞ e IL-1), que aumentam a permeabilidade vascular provocando a exudação de líquido com outros mediadores inflamatórios (quimiotaxinas, moléculas de adesão – selectinas e integrinas-, bradicinina, fator de transcrição pró-inflamação). Segue-se a chegada de neutrófilos que liberam leucotrieno (LTB4), induzem COX-2 e LOX-5, que estão envolvidas na produção de eicosanóides e leucotrienos. Ocorre então o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), envolvidas na lesão tecidual. São ativados mastócitos, células endoteliais e plaquetas, há interação do antígeno com IgE, o que provoca degranulação de mastócitos e consequente liberação de histamina, PGD2 e LCT4 e LTD4, espasmógenos (CORRÊA et al., 2008). O antígeno se liga a plaquetas e há produção de TXA2 e PAF (fator de ativação plaquetária), que têm ação espasmódica na musculatura lisa brônquica. Células endoteliais aumentam os níveis de NO, o que provoca o relaxamento do músculo liso adjacente e aumenta a permeabilidade celular, caracterizando efeitos citotóxicos. Há aumento de eosinófilos, produção de fibroblastos, aumento de neutrófilos e hiperresponsividade (BOUSQUET et al., 1990; BOUSQUET et al., 2005). As várias citocinas e quimiotaxinas liberadas em resposta ao primeiro estímulo atraem os leucócitos, principalmente eosinófilos e células T, para a área inflamatória. A presença excessiva de eosinófilos e linfócitos promovem a fase tardia da asma, onde células de resposta imunológica específica são envolvidas (CORRÊA et al., 2008).
Decorre daí ainda a lesão tecidual com perda de epitélio e alteração das propriedades mecânicas das vias aéreas (CORRÊA et al., 2008).
Figura 2 - Quadro representativo com os mediadores envolvidos na asma
Mediadores Origem Efeito
Quimiocinas Células epiteliais Recrutamento de células inflamatórias
Leucotrienos Mastócitos
Eosinófilos
Broncoconstricção
Estimula a liberação de outros
mediadores
Citocinas (IL-1β; TNF-α; IL-4; IL-5; IL-13)
LTh2 Amplifica inflamação: ativação de
eosinófilos, ativação de LTh2,
estímulo para secreção de IgE
Histamina Mastócitos Broncoespasmos e inflamação nas vias aéreas
Óxido nítrico Células epiteliais Inflamação das vias aéreas
Prostaglandina Mastócitos Recrutamento de LTh2
Adaptado de (BUSSE e LEMANSKE, 2001; BARNES, 2008)
O impacto negativo da asma é normalmente avaliado pela mortalidade, número de crises e número de hospitalizações. Entretanto, os efeitos causados pela asma podem prejudicar outros aspectos importantes, como a qualidade de vida e o bem-estar físico e emocional do paciente, bem como alterar o desempenho escolar ou laboral (EAGAN et al., 2004; ELLISON-LOSCHMANN et al., 2007).
Figura 3 - Representação das fases do desenvolvimento da asma
Adaptado de (FILHO, 1997)
et al., 2006), acarretando uma sobrecarga no custo da doença para o sistema de saúde, relação
não favorável a farmacoeconomia.
A asma é responsável por 5% das consultas ambulatoriais e até 16% dos atendimentos em pronto-socorro (PASTORINO et al., 1998), sendo de suma importância a implementação de programas de controle de doenças crônicas para melhoria de atenção básica à saúde (CORRÊA et al., 2008).
A valorização dos aspectos epidemiológicos e clínicos dos pacientes asmáticos pode orientar a correta abordagem multidisciplinar, com instituição de medidas profiláticas e o adequado tratamento dos sintomas e doenças associadas (PASTORINO et al., 1998).
O entendimento de quais células imunes estão envolvidas na patologia vem aumentando, podendo levar ao desenvolvimento de novas terapias mais específicas para doenças pulmonares (BARNES, 2008). Até o momento, o tratamento farmacológico mais efetivo para severas reações associadas a eosinófilos é a terapia com glicocorticoides (BEZERRA-SANTOS et al., 2006), que contribuem para a restauração do estado oxidativo normal dos granulócitos do sangue periférico e melhoram a obstrução das vias aéreas em pacientes com asma moderada. Os granulócitos de asmáticos graves não retornam ao seu estado oxidativo normal, embora se estabeleça melhora dos sintomas e aumento do volume expiratório (SARTORELLI et al., 2009).
O principal objetivo no tratamento da asma é alcançar e manter o controle clínico, o que pode ser obtido na maioria dos pacientes (BATEMAN et al., 2004; BATEMAN et al., 2007) com uma intervenção farmacológica planejada e executada em parceria entre o médico, o paciente e sua família (SBPT, 2012).
O tratamento está dividido em duas categorias: medicamentos para aliviar e medicamentos para controlar a doença, sendo essencial o uso da via inalatória de administração (MUNIZ et al., 2003). Em geral, várias classes de fármacos estão envolvidas no tratamento da asma: anti-inflamatórios, broncodilatadores, atuantes na enzima fosfodiesterase, inibidores de receptores de leucotrienos, além da imunoterapia alérgica específica.
- ANTI-INFLAMATÓRIOS
osteoporose, distúrbios metabólicos, alteração de crescimento e comportamento, sendo justificado seu uso em pacientes com asma severa. Uma forma de diminuir os efeitos sistêmicos é a administração via inalatória (MALONE et al., 2005; MUTCH et al., 2007).Sua associação com broncodilatadores constitui a terapia mais eficiente para o tratamento da asma, atuando de forma sinérgica (CORRÊA et al., 2008).
As cromonas também têm ação anti-inflamatória, diminuindo a obstrução crônica, uma vez que estabilizam os mastócitos inibindo a liberação de histamina e leucotrienos, além de reduzir a atividade de eosinófilos. Seu tempo de ação é curto, além de causarem tosse e queimação após administração (BARNES, 2006).
- BRONCODILATADORES
São utilizados os agonistas -2-adrenérgicos, divididos entre os de ação curta (6h), como salbutamol, carbuterol, clenbuterol, fenoterol e terbutalina, onde há o alívio rápido dos sintomas; e os de ação prolongada (12-24h), como o formoterol e salmoterol, cuja monoterapia não é indicada, e sim o uso associado a corticosteroides (VIEIRA, 2008). Esse tipo de broncodilatador tem um maior uso clínico, embora proporcione efeitos adversos indesejáveis, como estímulo cardiovascular, tremores de extremidades e hipocalcemia, por
não serem seletivos aos receptores -2-adrenérgicos da musculatura brônquica, que também podem ser diminuídos através do uso da via inalatória (ZIMMERMAN et al., 2004; WEISS e DORINSKY, 2006).
Há ainda a classe de fármacos antagonistas de receptores muscarínicos, como a escopolamina e a atropina, que estão em desuso devido a propriedades alucinógenas. Há ainda o brometo de ipratrópio e brometo de tiopróprio, que não atravessam a barreira hemato-encefálica, evitando os efeitos alucinógenos. Vale salientar que também não são absorvidos pelo TGI, havendo necessidade de administração via inalatória (CORRÊA et al., 2008).
- ATUANTES NA ENZIMA FOSFODIESTERASE 4 (PDE4)
Essa enzima está amplamente distribuída em tecidos de mamíferos, possuindo papel fundamental na sinalização celular através de hidrólise de AMPc e GMPc, regulando várias funções celulares. Essa ampla distribuição permite que seus inibidores apresentem tanto ação broncodilatadora quanto ação anti-inflamatória. São exemplos desses fármacos ciclomilast, riflumilast, que têm como efeitos colaterais inaceitáveis a ocorrência de náuseas e vômito (CORRÊA et al., 2008).
- INIBIDORES DE RECEPTORES DE LEUCOTRIENOS
Impedem que os leucotrienos se liguem aos receptores. São eficientes inibidores do broncoespasmo devido ao aumento da permeabilidade vascular, produção de muco, quimiotaxia e ativação de leucócitos, uma vez que não permitem o desencadeamento da sinalização celular promovida pelos agentes espasmódicos (LTC4 e LTD4) e quimiotático (LTB4). São exemplos o zafirlukast, montelukast e pranlukast (CORRÊA et al., 2008). Podem ser usados em pacientes com asma persistente em substituição aos beta-agonistas de ação prolongada ou em associação a estes, sendo somado o uso de corticosteróides (BARNES
et al., 2005; CURRIE et al., 2005).
- IMUNOTERAPIA ALÉRGICA ESPECÍFICA
A terapia moderna envolve estudos com inibidores de TNF-ᵞ, de prostaglandinas, além de moduladores de citocinas e anticorpos monoclonais anti-IgE (CORRÊA et al., 2008). A imunoterapia específica consiste na administração de doses progressivamente maiores de alérgenos específicos em pacientes sensibilizados fora da crise aguda, buscando a indução do estado de tolerância (ABRAMSON et al., 1999; CALAMITA et al., 2006).
Há várias espécies relacionadas ao alívio do sintoma da asma: Acanthospermum
hispidum DC (“espinho de cigano”) (ARAÚJO et al., 2008); Mikania glomerata (guaco) (CASTRO et al., 2005; CORRÊA et al., 2008); Ananas comosus L.; Hedera helix L. (HOFMANN et al., 2003); Allium sativum L (alho) (MOYERS, 1996; RIVLIN, 2001); Allium
(capim-santo) (CARBAJAL et al., 1989), e este estudo destaca a Cissampelos sympodialis, pelo seu uso popular e atividades in vitro e in vivo já comprovadas.
3.3. Cissampelos sympodialis
A transformação de uma planta em um medicamento deve visar a preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a sua segurança de utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico (TOLEDO et al., 2003).
No antigo Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF), atual Centro de Biotecnologia (CBiotec), da Universidade Federal da Paraíba, uma das espécies vegetais mais estudadas, tanto do ponto de vista fitoquímico, quanto de suas ações farmacológicas é a
Cissampelos sympodialis Eichl, da família Menispermaceae, que possui uma série de ações
farmacológicas que a colocam em posição de destaque para a terapia da asma.
A família Menispermaceae, composta por cerca de 70 gêneros (BARROSO, 1978) e 420 espécies (PORTO et al., 2008), está representada no Brasil por cerca de 12 gêneros e 106 espécies (BARROSO, 1978; MARINHO, 2008; PORTO et al., 2008). Tal família é caracterizada fitoquimicamente pela presença de alcaloides (FREITAS et al., 1995),havendo relato de isolamento de 1522 destas moléculas entre 1970 e 1997, em 160 espécies diferentes, sendo os bisbenzilisoquinolínicos, os aporfínicos e os protoberberínicos os tipos de alcaloides mais representativos, com, respectivamente, 604, 303 e 275 moléculas isoladas nesse período (MARINHO, 2008).
Na natureza, os alcaloides representam um diverso grupo de compostos relacionados à ocorrência de um ou mais átomos de carbono num anel heterocíclico, que torna esses compostos básicos, tornando possível sua existência nas plantas na forma de sais. Os alcaloides de origem vegetal possuem estrutura complexa, frequentemente são tóxicos e são também amplamente distribuídos, ocorrendo numa estimativa de 12000 moléculas, classificadas segundo seu esqueleto carbônico (AMEH et al., 2010).
sete tipos de esqueletos diferentes (RHODES, 1975; STEVENS, 2001; JACQUES e BERTOLINO, 2008).
Alcaloides bisbenzilisoquinolínicos (BBI) são biossintetizados a partir do aminoácido tirosina, vindo da via metabólica do chiquimato, derivados do núcleo isoquinolínico (Figura 4) e formados por dímeros dos núcleos benzilisoquinolínicos (BRUNETON, 1991; YUNES e
CECHINEL-FILHO, 2009) e estão relacionados a diversas atividades farmacológicas, como inibição da acetilcolinesterase (INGKANINAN et al., 2006; COMETA et al., 2012); atividade antibacteriana, antifúngica e citotóxica (LOHOMBO-EKOMBA et al., 2004);antinociceptiva, anti-artrite (AMRESH et al., 2007);e anti-helmíntica (AYERS et al., 2007).
A espécie Cissampelos sympodialis Eichl é uma trepadeira (Figura 5) encontrada nas regiões nordeste e sudeste do país, do Ceará a Minas Gerais (MARINHO, 2008), sendo predominantemente tropical (PORTO et al., 2008).É popularmente conhecida no Brasil como
“jarrinha”, “orelha-de-onça”, “abuteira” e “milona” (CORREA, 1984; PORTO et al., 2008). A germinação das sementes ocorre em 18 a 25 dias e a floração após cerca de 150 dias do plantio, havendo maturação dos frutos após os próximos 26 dias (FONSECA e FIGUEIRÊDO, 1999).
O uso popular do gênero Cissampelos remete ao tratamento de doenças cardíacas, genitais, urinárias, diarreia, resfriados e asma. Há relato de que a infusão das raízes e folhas de Cissampelos sympodialis é utilizada no nordeste para o tratamento de asma, bronquite,
A
B
Figura 4 – Fórmula estrutural dos núcleos isoquinolínico (A) e benzilisoquinolínico (B) de onde
resfriado, reumatismo e outras doenças inflamatórias (CORREA, 1984; BARBOSA-FILHO
et al., 1997; ALEXANDRE-MOREIRA, PIUVEZAM, et al., 2003; BEZERRA-SANTOS et al., 2006; CORRÊA et al., 2008).
Figura 5- Foto da espécie Cissampelos sympodialis na sua forma adulta (A) e seus frutos (B)
Essa espécie proporcionou o isolamento dos seguintes alcaloides (Figura 6): warifteína (CORTES et al., 1995), metillwarifteina (BARBOSA-FILHO et al., 1997), laurifolina, simpodialina (ALENCAR, 1994), milonina (FREITAS et al., 1995), roraimina, liriodenina (LIRA et al., 2002), e desmetilroraimina (MARINHO, 2011).
Figura 6 - Quadro com alcaloides isolados de Cissampelos sympodialis
Estrutura/Composto Atividade farmacológica Parte da planta
Laurifolina
Inibição da transcriptase reversa do vírus da mieloblastose
aviária, sendo potente antiviral (JUCÁ, 1998).
Folhas de Cissampelos sympodialis, tendo sido isolada também de Hypserpa nitida, Menispermaceae (CHENG et al., 2007).
Simpodialina
Não relacionada Raízes de Cissampelos sympodialis (ALENCAR, 1994).
Milonina
Efeito hipotensor e vasorrelaxante em ratos normotensos
(CAVALCANTE et al., 2011);
Ação espasmolítica (FREITAS et al., 1996; MELO et al.,
2003);
Efeito citotóxico em culturas de hepatócitos e fibroblastos
(MELO et al., 2003);
Contribui com o efeito anti-alérgico de Cissampelos
sympodialis (BEZERRA-SANTOS et al., 2012).
Folhas de Cissampelos sympodialis, tendo sido isolada também
Metilwarifteína
Atividade inibitória contra cultura de células de carcinoma
humano (KUPCHAN et al., 1965).
Raízes e folhas de Cissampelos sympodialis, tendo sido isolada
de C. ovalifolia (BORKAKOTI e PALMER, 1978); Aristolochia
ridicula, Aristolochiaceae (MACHADO e LOPES, 2010).
Warifteína
Atividade espasmolítica (CORTES et al., 1995; FREITAS et
al., 1996; MELO et al., 2003);
Citotoxicidade em linhas celulares de fibroblastos (V79);
inibição da degranulação de mastócitos e de liberação de
histamina (MELO et al., 2003);
Ação antialérgica (BEZERRA-SANTOS et al., 2006);
Inibe a atividade da fosfodiesterase AMPc (THOMAS,
BURNES, et al., 1997);
Atividade relaxante em músculo liso (FREITAS, 1994;
CORTES et al., 1995);
Ação anti-inflamatória, anti-alérgica e imunomoduladora
(PIUVEZAM et al., 1999; ALEXANDRE-MOREIRA,
PIUVEZAM, et al., 2003; BARBOSA-FILHO et al., 2006;
BEZERRA-SANTOS et al., 2006).
Raízes e folhas de Cissampelos sympodialis, tendo sido isolada
também de C. ovalifolia (BORKAKOTI e PALMER, 1978).
Liriodenina
Atividade antitumoral, antibacteriana, antifúngica e
tripanomicida (LIU et al., 2011);
Atividade larvicida contra Aedes aegypti (FEITOSA, 2009).
Folhas de Cissampelos sympodialis, tendo sido isolada também
de Annona crassiflora, Annonaceae (GONÇALVES et al.,
Roraimina
Contribui com a ação antialérgica de Cissampelos
sympodialis (BEZERRA-SANTOS et al., 2012).
Raízes de Cissampelos sympodialis ((LIRA et al., 2002).
Desmetilroraimina
Não relacionada Raízes de Cissampelos sympodialis (MARINHO, 2011)
Há poucos estudos toxicológicos, mas todos indicam que é segura a utilização da fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas (AFL) de Cissampelos sympodialis, forma utilizada nos ensaios biológicos dessa espécie. Estudos de toxicidade aguda em camundongos, ratos e cães demonstraram a inocuidade da utilização do extrato hidroalcoólico das folhas de
Cissampelos sympodialis, mesmo que os resultados devam ser confirmados através de análise
histopatológica (DINIZ, 2000; DINIZ et al., 2002). Baseado em informações sobre o uso popular, um estudo avaliou e sugeriu que a dose terapêutica humana de preparações com essa planta é de 9 mg/kg/dia (MAIOR et al., 2003). Os alcaloides isolados, warifteína e milonina, também tiveram sua toxicidade avaliada em cultura de hepatócitos de ratos, sendo a milonina menos tóxica do que a warifteina (MELO et al., 2003). No entanto, tais efeitos tóxicos não foram verificados na administração de AFL, e ainda há o fato de que a concentração desses alcaloides nesse extrato é bem inferior às concentrações avaliadas nos estudos de toxicidade avaliados.
Foi também estabelecida a dose letal média (DL50) para a administração
intraperitonial do extrato hidroalcóolico de folhas de C. sympodiallis como sendo de 1818 mg/kg, sendo verificado também que, para administração por via oral, a dose letal média foi de 5 g/kg, aparentemente atóxica para camundongos, ratos e cães, embora demonstrando alterações hepáticas transitórias (VIEIRA, 2008). Outro estudo toxicológico envolvendo ratas prenhas, monitorou 3 grupos de doses: 9 mg/kg (uso popular); 45 mg/kg (5X uso popular) e 225 mg/kg (25x uso popular), confirmando-se a segurança, em doses terapêuticas por via oral, durante período gestacional de ratas, havendo necessidade de estudos mais específicos de embrio e fetotoxicidade (MAIOR et al., 2003).
Os metabólitos secundários das plantas, por possuírem uma enorme diversidade química, atuam em diferentes fases do processo asmático, desde a produção de eicosanoides e leucotrienos até fatores envolvidos na produção e ativação de citocinas e células inflamatórias (CORRÊA et al., 2008).
