Controle de qualidade do material vegetal

4.5.1. Screening fitoquímico preliminar de Cissampelos sympodialis

4.5.1.1. Preparação dos extratos

Cinquenta gramas do pó das folhas foram extraídos com 100 mL de etanol:água (80:20 v/v) através de maceração por 24 horas. O extrato foi filtrado e este evaporado até a secura sob pressão reduzida a 40°C em rotaevaporador, com adição de porções de etanol para eliminação total da água.

4.5.1.2. Ensaios para metabólicos específicos

3.5.1.2.1. Determinação de presença/ausência de taninos

Cerca de 200 mg do extrato foi diluído com água e adicionado, em três concentrações (25%, 50% e 100%) a solução de cloreto férrico 2%. Taninos resultam em coloração azul ou verde escura na presença de cloreto férrico (MACE e HOWELL, 1974). Esses metabólitos também foram verificados através da adição de cerca de 200 mg do extrato a solução de gelatina 0,5%, nas três concentrações anteriores e sua presença foi confirmada através da formação de precipitado (EVANS, 1989).

4.5.1.2.2. Determinação de presença/ausência de flavonoides

Cerca de 200 mg do extrato foi dissolvido em metanol (50%, 1-2 mL) com aquecimento e em seguida foi adicionada a fita de magnésio e de 5 a 6 gotas de ácido clorídrico concentrado. A solução torna-se vermelha quando há presença de flavonoides. Essa detecção também ocorreu através do método de complexação do ácido bórico, onde 5 gotas de acetona e cristais de ácidos oxálico R e bórico R foram adicionados ao extrato. A solução foi seca e em seguida adicionados 10 mL de éter etílico. A ocorrência de fluorescência foi investigada utilizando lâmpada UV a 365 nm, o que indica a presença de flavonoides (HARBORNE, 2005).

Cerca de 200 mg de extrato foi dissolvida em igual volume de anidrido acético e clorofórmio. A mistura foi transferida para um tubo de ensaio seco ao qual foi adicionado ácido sulfúrico concentrado. A formação de coloração marrom avermelhada na interface entre os dois líquidos indica a presença de esteroides, através da reação de Lieberman-Burchard (RAAMAN, 2006).

4.5.1.2.4. Determinação de presença/ausência de alcaloides

Os alcaloides foram extraídos através de refluxo de 500 mg de extrato com quantidade suficiente de água, durante 2 h. O extrato foi concentrado em rotaevaporador, basificado com 1 mL de hidróxido de sódio 1% e extraído com 6 mL de clorofórmio, três vezes. Uma alíquota de 1 mL da fase clorofórmica foi transferida para quatro tubos de ensaio para reagentes específicos, aos quais foram adicionadas poucas gotas dos reagentes Bouchadart (RAAMAN, 2006), Mayer (EVANS, 1989), Dragendorff (WALDI, 1965) e acido tungístico (RAAMAN, 2006). A formação, respectivamente para cada reagente, de precipitado marrom, branco, laranja ou branco indica que o teste para alcaloides foi positivo.

4.5.1.2.5. Determinação de presença/ausência de saponinas

Cerca de 50 mg de extrato foi dissolvido em 10 mL de água e este sistema foi agitado vigorosamente até FROTH. Após repouso de 10 minutos, a persistência de espuma indica a presença de saponinas (KOKATE, 1999).

4.5.2. Determinação de umidade

Cerca de 3g de material vegetal seco foi pesado e acondicionado em frasco de vidro previamente tarado. A amostra foi seca em estufa a 100-105 °C por 5 horas e até peso constante, quando duas pesagens consecutivas não diferirem em mais de 5 mg. A perda de peso expressa em percentagem de material seco foi calculada e o experimento feito em triplicata para cada lote de folhas (WHO, 1998; BRASIL, 2010a).

4.5.3. Determinação de cinzas totais

Cerca de três gramas do material vegetal, precisamente pesados, foram acondicionados a cadinhos de sílica previamente calcinados e tarados. O material foi distribuído numa fina camada e incinerado com gradual aumento de temperatura, até 500-600 °C (200 °C por 30 minutos; 400 °C por 60 minutos; e 600 °C por 90 minutos), até resultar em resíduo branco, indicativo de ausência de material orgânico. O cadinho foi então resfriado em dessecador por 30 minutos e pesado. O conteúdo de cinzas totais foi calculado em termos de percentagem de massa do material vegetal e o experimento realizado em triplicata (WHO, 1998; BRASIL, 2010a).

4.5.4. Determinação de sólidos extraíveis por etanol

Cerca de 3 g de material vegetal, precisamente pesado, foi acondicionado em erlenmeyer e macerados com 100 mL de etanol, durante 6 horas, com agitação frequente, e por mais 18 h em repouso. O extrato foi filtrado rapidamente para evitar perda de solvente e 25 mL do filtrado foram transferidos para tubos de vidro previamente tarados e evaporado até a secura em banho-maria. Esse resíduo ainda foi seco em estufa de circulação de ar a 105 °C por 6 horas, resfriado em dessecador por 30 minutos e pesado imediatamente. O conteúdo dos sólidos extraíveis foi calculado em mg/mL de extrato líquido e o experimento realizado em triplicada para cada lote avaliado (WHO, 1998; BRASIL, 2010a).

4.5.5. Índice de intumescimento

Cerca de 1 g de material vegetal, precisamente pesado, foi adicionado a uma proveta graduada e agitado repetidamente, a cada 10 minutos, durante 1 hora. O volume do sistema (mL) foi medido após 3 horas. O experimento foi realizado em triplicata para cada lote de folhas avaliado (BRASIL, 2010a).

4.5.6. Distribuição de tamanho de partículas

Cerca de 25 g de folhas secas foi submetido a uma sequência de tamises selecionados (1; 0,850; 0,710; 0,500; 0,425; 0,350; 0,297; 0,250; 0,149; 0,074 mm) e à agitação por 30 minutos. O material vegetal retiro em cada tamis foi pesado e o pó classificado de acordo com a distribuição granulométrica (BRASIL, 2010a).

4.5.7. Teor de warifteína

A concentração de warifteína no extrato hidroalcoólico foi determinada utilizando método através de CLAE descrito e validado em recente estudo (Tabela 4) (MARINHO et al., 2012). As amostras para análise de controle de qualidade dos extratos foram preparadas na concentração de 15 mg/mL de extrato em 0,01% trietilamina : metanol (40:60 v/v). A solução foi filtrada em membrana de nylon 0,45 µm antes da análise através de CLAE, em triplicata.

As curvas de calibração com padrão de warifteína foram preparadas seguindo as concentrações de 2, 3, 5, 10 e 20 µg/mL para quantificação do marcador nas amostras. O teor de warifteína foi calculado em termos de percentagem em relação às folhas secas utilizadas na preparação dos extratos.

Tabela 4 - Condições cromatográficas do método para quantificação de warifteína

Parâmetro Especificação

Fase estacionária C18 250 x 4,6 mm (5 µm) Fase Móvel Trietilamina 0,05% e metanol Modo de eluição Gradiente

0 – 5 min (60% metanol) 5 – 15 min (72% metanol) 15 – 25 min (80% metanol) 25 – 30 min (60% metanol) Tempo de corrida 30 min

Comprimento de onda 278 nm Fluxo de eluição 1 mL/min Volume de injeção 50 µL

Temperatura 40 °C

4.6. Planejamento experimental de triagem 23 para otimização do processo extrativo das