Dosagem de citocinas de células de linfonodos mesentéricos

Os linfócitos contribuem para a imunopatologia da asma, sobretudo através das células Th2, que sintetizam citocinas que participam do processo de elaboração de IgE, maturação e ativação de mastócitos e basófilos, assim como pela infiltração eosinofílica mediada pela IL- 5, determinando dano epitelial e hiper-reatividade brônquica. Os linfócitos apresentam uma participação muito importante na asma e representam 20-40% das células brancas sanguíneas circulantes, e 99% das células na linfa (FILHO, 1997).

O perfil de citocinas aqui avaliado envolve as citocinas do perfil de ativação de linfócitos Th2 (IL-10 e IL-13), além de IFN- (perfil Th1) e IL-17.

A produção de IFN- induzida por Con-A permite avaliar a capacidade geral de produção desta citocina, pois se liga às glicoproteínas da superfície dos linfócitos T, ativando- os de forma policlonal (PELIZON et al., 2007).

A IL-10 é produzida principalmente por células CD4+ ativadas. Células Th0, Th1, Th2 ativadas, linfócitos B, mastócitos e monócitos ativados por LPS também podem produzir IL-10, sendo fontes menos importantes. Sua síntese é inibida por IL-4 e pela própria IL-10 (BENJAMIN et al., 1992). O efeito principal da IL-10 é inibir a síntese de outras citocinas, como o IFN- , IL-2, IL-12, TNF- . IL-10 atua como um co-estimulador para a proliferação de mastócitos e seus progenitores e é ainda co-estimulador no crescimento dos timócitos imaturos, agindo como fator de diferenciação para as células T citotóxicas, sendo esta ação a menos significativa (THOMPSON-SNIPES et al., 1991).

A IL-13 é produzida por células Th0, Th1, Th2 e CD8+, mas não se expressa no coração, pulmão, cérebro, placenta, fígado ou músculo esquelético. A IL-13 inibe a atividade quimiotática e fagocitária de monócitos/macrófagos (AMAM, 1996); reduz expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12) e quimiocinas; aumenta a produção de IL-1. Desta forma IL-13 atua diminuindo a resposta inflamatória dependente de neutrófilos e macrófagos, e ainda regula a produção de IgE (BARNES, 2001).

A IL-17 é produzida principalmente por células T CD4+, mas células epiteliais, fibroblastos e células endoteliais também a produzem (KENNEDY et al., 1996). Estimula a secreção de IL-6, IL-8, PGE2 por estas células, aumentando assim os níveis de citocinas pró- inflamatórias, mantendo a maturação preferencial em neutrófilos (FOSSIEZ, 1996).

Os experimentos in vitro com células do linfonodo mesentérico de animais sensibilizados, demonstraram que as citocinas INF- , IL-10, IL-13, IL-17 não foram alterados pelas Fr Aq isoladas em comparação ao meio, em quaisquer concentrações, sem diferença estatística. Células co-estimuladas com Con-A também não demonstraram, em nenhuma das concentrações, de nenhuma das Fr Aq, nenhuma alteração significativa estatisticamente nos níveis de nenhuma das citocinas avaliadas (Figura 31).

IL-13 foi avaliada, pois estudos a apontam como principal mediador de hiper- reatividade das vias aéreas (YANG et al., 2005). Foi verificada diminuição de IL-13 em animais tratados com AFL, em relação ao tratamento padrão (BEZERRA-SANTOS et al., 2012). Em cultura de células do baço induzidas por Con-A foi demonstrado que AFL induz aumento de IFN- de maneira dose-dependente, além de haver aumento de IL-10, exceto na concentraçaõ de 50 ug/mL, que provocou inibição dessa citocina (PIUVEZAM et al., 1999).

A IL-10 é uma importante citocina cujo aumento está relacionado à inibição da resposta das células T (PIUVEZAM et al., 1999), o que sugere a ação anti-alérgica e imunomoduladora (PIUVEZAM et al., 1999; ALEXANDRE-MOREIRA, PIUVEZAM, et

al., 2003; BEZERRA-SANTOS et al., 2006; CERQUEIRA-LIMA et al., 2010; VIEIRA et al., 2013). A atividade anti-inflamatória de AFL também foi comprovada em modelo de alergia alimentar, sem alteração dos níveis de IL-13 e INF- , mas demonstração de ação imunomoduladora com o aumento de células T reg (COSTA et al., 2013). Pode ser sugerido que o aumento de IFN- pode interferir na diferenciação de células Th2, na diminuição de IgE e também na reação alérgica (BEZERRA-SANTOS et al., 2004). AFL ainda aumenta a produção de IL-10 e IFN- e inibe a proliferação de células T como resposta proliferativa de células do baço tratadas com Con-A (PIUVEZAM et al., 1999; BEZERRA-SANTOS et al., 2004; BEZERRA-SANTOS et al., 2005; CERQUEIRA-LIMA et al., 2010).

Figura 31 - Efeitos in vitro das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de Cissampelos sympodialis com pior e melhor teor de warifteína, obtidos através de planejamento experimental (Fr Aq P e Fr Aq M) na liberação de citocinas de linfócitos.

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados através do Software Graphpad Prism através de ANOVA e pós-teste de Tukey, onde p < 0,001 (***) foi significativo.

O aumento da produção de IL-10 é um importante mecanismo para inibição do desenvolvimento da asma, devido ao controle da inflamação excessiva causada pelo influxo de eosinófilos e reação de hiperresponsividade dependente de IgE, que envolve a degranulação de mastócitos e contribui para a patogênese da asma. O aumento de IL-10 durante a resposta alérgica pode auxiliar o controle da inflamação tecidual, que se caracteriza pela infiltração de leucócitos (BEZERRA-SANTOS et al., 2004).

Concentrações de 100 µ g/mL de AFL foram associadas, em modelo de cultura de células de macrófago infectados por T. cruzi, ao aumento de níveis de IL-10 e diminuição de NO, podendo o primeiro evento estar associado ao aumento de AMPc já relatado como decorrente da ação de AFL (THOMAS et al., 1999). É possível também que o aumento de IL- 10 possa estar relacionado à redução de eosinófilos em decorrência da diminuição de IL-5 em lavado bronco-alveolar de animais tratados com AFL (CERQUEIRA-LIMA et al., 2010). O mecanismo através do qual AFL aumenta os níveis de IL-10 permanece desconhecido, mas a imunorregulação exercida nas citocinas Th2 pode ser explicada, ao menos em parte, pela inibição de fatores transcricionais (CERQUEIRA-LIMA et al., 2010).

A atividade anti-intlamatória de AFL nas doses de 50 e 100 mg/mL por via intraperitoneal) foi comprovada pela inibição de edemas de orelha e de pata, além de inibir a migração de neutrófilos induzida por carragenina (BATISTA-LIMA et al., 2001). Esta ação pode estar relacionada à diminuição de MIP-2, já que se sabe que AFL aumenta IL-10 e esta diminui MIP-2, o que explica a diminuição na migração de neutrófilos (BATISTA-LIMA et

al., 2001).

Mesmo com indicativos de que AFL poderia induzir INF- e IL-10, não foi verificado esse comportamento através desse estudo, o que pode ser justificado pelo fato de que o estímulo inferido através da adição de Con-A não foi suficiente nem específico para esse tipo de cultura de células, significando que o protocolo não foi significativo para discriminar a ação anti-inflamatória das Fr Aq avaliadas.