KARINA VIEIRA DE BARROS MUNHOZ
EFEITO DE DIETAS RICAS EM ÓLEO DE PEIXE OU ÓLEO
DE SOJA SOBRE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E DANO
OXIDATIVO DO DNA NA COLITE EXPERIMENTAL
KARINA VIEIRA DE BARROS MUNHOZ
EFEITO DE DIETAS RICAS EM ÓLEO DE PEIXE OU ÓLEO
DE SOJA SOBRE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E DANO
OXIDATIVO DO DNA NA COLITE EXPERIMENTAL
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Vera Lucia Flor Silveira
Barros, KV
Efeito de dietas ricas em óleo de peixe ou soja sobre mediadores inflamatórios e dano oxidativo do DNA na colite experimental. – Karina
Vieira de Barros Munhoz – São Paulo, 2009.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Departamento de Fisiologia da Nutrição. Programa de Pós-graduação em Nutrição.
Este trabalho foi realizado na Disciplina de Fisiologia da Nutrição, Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de
São Paulo, sob a orientação da Profa. Dra. Vera Lúcia Flor Silveira
Apoio Financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
“Ser mestre é um ato de fé.
Fé na possibilidade de mudar o mundo educando, fé no indivíduo, fé na supremacia da riqueza intelectual. Ser mestre é um ato de amor. Porque a entrega de si está implícita na tarefa, porque se dá com as mãos cheias sem
esperar retribuição.
Ser mestre é ser sonhador. Crer, mais além desta época frívola e céptica, no espírito do homem. E crer que algum dia, ao final do caminho, poderemos
transferir esta tocha a um discípulo, outro sonhador”.
Lídia Maria Riba
Dedico este trabalho:
Aos meus pais, minha irmã e meu marido pelo esforço, dedicação e compreensão,
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Vera Lucia Flor Silveira, minha orientadora, pelo apoio, paciência,
credibilidade e compreensão que me proporcionou crescimento pessoal e
profissional. Por suas lições e seus exemplos, meu sincero agradecimento!
Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Real Martinez pela amizade, carinho e dedicação
confiando na minha capacidade e incentivando meu crescimento.
Aos meus amigos e companheiros de trabalho: Gilclay Gomes de Abreu e Roberta
Araújo Navarro Xavier. Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de
outras pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muito obrigada pelo apoio e pela
paciência durante a realização dos experimentos, pelos momentos de alegrias, pelas
risadas e pelas valiosas conversas.
À Profa. Dra. Luciana Pellegrini Pizani e ao Prof. Dr. Andrea Bottoni pela confiança,
incentivo inicial e amizade.
À Profa. Dra. Claudia Oller do Nascimento por disponibilizar auxílio técnico e
científico nos momentos de necessidade.
À minha querida amiga e professora de inglês Ivana Ribeiro Cunha, a quem sou
Alessandra Gambero pela colaboração no desenvolvimento deste trabalho.
Ao amigo André Luis Lacerda Bachi pelos freqüentes auxílios no entendimento da
imunologia. Muito obrigada!
Ao amigo Alexandre Basile, parceiro de todas as horas, que sempre esteve disposto
a me ajudar nos momentos de necessidade. Obrigada Alemão!
Aos amigos do laboratório pela alegre convivência e sugestões, dividindo
conhecimentos e experiências. Ana Barbosa Marcondes de Mattos, Caio Sussumu
de Macedo Motoyama, Carla Rodrigues de Carvalho, Carolina Biz Rodrigues Silva,
Cristiane de Oliveira, Elisabete dos Reis Carneiro, Fábio Santos de Lira, Iracema
Senna de Andrade, Juliane Costa Silva Zemdegs, João Felipe Mota, José Cesar
Rosa Neto, Regina Lúcia Harumi Watanabe, Ricardo Eguchi, Roseli Sandra Silva e
Vinícius José Baccin Martins.
Às professoras Dra. Eliane Beraldi Ribeiro, Dra. Kelse Tibau de Albuquerque, Dra.
Lila Oyama e Dra Mônica Marques Telles pelo agradável convívio no Laboratório de
Fisiologia da Nutrição da UNIFESP.
A todos os funcionários do laboratório de Fisiologia da Nutrição, em especial à Ana
Lúcia Castro Santos e Mauro Cardoso Pereira pela dedicação e responsabilidade
Barros e ao meu pai Pedro Paulo de Barros, meus principais motivos de orgulho,
que não me deram somente a vida, mas principalmente a minha educação e
condições de estudo além de incentivo incondicional na minha formação pessoal e
profissional. A minha irmã Ana Clara Vieira de Barros por sempre torcer por mim e
estar sempre presente.
Ao meu marido Eduardo Della Valle Munhoz, por se orgulhar e acreditar em mim
sempre. Muito obrigada pelo incentivo!
Para sempre ...
“Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis.” Bertolt Brescht
Aprendi ...
Não tenho um caminho novo.
O que tenho de novo é um jeito de caminhar.”
RESUMO
Temos demonstrado, em nosso laboratório, que dietas lipídicas enriquecidas com óleo de peixe ou óleo de soja apresentam efeito antiinflamatório associado a alterações em mediadores inflamatórios, como corticosteróides, bradicinina, calicreína, óxido nítrico e citocinas, em modelo de inflamação aguda. Embora o consumo de dietas enriquecidas com óleo de peixe tem também sido associado à diminuição da inflamação crônica, dietas hiperlipídicas parecem aumentar o risco de desenvolvimento da colite ulcerativa e de câncer de colon.
!!"# $
% & ' ( )
*+ , - )
./0" 1!" 1$" 1!$" - )
20" !" $"
!$"# ! )
) #
-( -0 !! 3) + -( *."#
*-4 !! *54
.* #
) 3 )
) 8$9"
: 6;'* 67 γ 6;'</#
Nos grupos alimentados com dietas hiperlipídicas não foram encontradas diferenças nas concentrações de IL-4 e INF-γ, MPO, corticosterona, índice de
inflamação, comprimento do cólon e IAD. No entanto, a dieta HP aumentou as concentrações de IL-10 em relação à dieta HS e somente a dieta HSP aumentou a razão IL-10/IL-4 (citocina antiinflamatória / proinflamatória) associada à diminuição do dano de DNA. Esses dados demonstram que dietas hiperlipídicas, ricas em óleo de soja ou peixe, não exacerbam a colite experimental em relação ao controle normolipídico (S), e que a mistura desses óleos tem efeito benéfico no equilíbrio das citocinas e na manutenção da integridade do DNA.
Nos grupos alimentados com dietas normolipídicas não foram observadas diferenças nos níveis de corticosterona, IFN-γ e IL-4. Somente a dieta SP diminuiu o
ÍNDICE
1.0 Introdução ... 13
1.1 Justificativa ... 24
2.0 Objetivos ... 26
3.0 Material e Métodos ... 3.1 Animais e tratamento ... 27 27 3.2 Indução da colite experimental ... 28
3.3 Preparações das dietas e armazenamento ... 29
3.4 Consumo alimentar e peso corporal ... 31
3.5 Coleta das amostras ... 31
3.6 Análise histológica ... 32
3.7 Escore do índice de gravidade da doença ... 33
3.8 Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) ... 34
3.9 Concentrações de citocinas no tecido colônico ... 35
3.10 Ensaio cometa ... 36
3.11 Incorporação de ácidos graxos no fígado ... 37
3.12 Determinação de corticosterona plasmática ... 38
3.13 Análise estatística ... 39
4.0 Resultados e Discussão... Artigo I ... 40 41 Artigo II ... 70
1 - INTRODUÇÃO
As doenças inflamatórias intestinais (DII) são afecções crônicas do trato gastrointestinal (TGI), que geralmente se referem a duas condições, retocolite ulcerativa ou colite ulcerativa e doença de Crohn (Galvez et al, 2006). As DIIs caracterizam-se por diarréia crônica, má absorção, disfunção da barreira mucosa e processo inflamatório intestinal, sendo clinicamente incuráveis (Benedetti & Plum, 1996). A colite ulcerativa engloba um espectro de inflamação difusa, contínua e superficial do cólon, que começa no reto e pode se estender até o nível proximal. Já a doença de Crohn caracteriza-se por inflamação transmural assimétrica que afeta qualquer porção do TGI, desde a boca até o ânus (Benedetti & Plum, 1996).
Embora muitos progressos tenham sido feitos no entendimento das DIIs, sua etiologia ainda não está totalmente elucidada, mas acredita-se que haja o envolvimento de fatores imunes, genéticos e ambientais. (Laroux et al, 2001; Cheon et al, 2006; Sainathan et al, 2008). Alguns trabalhos têm sugerido que as DIIs representam uma resposta inapropriada e exagerada do sistema imune da mucosa intestinal à microflora intestinal normal, em indivíduos geneticamente suscetíveis, que pode ser atribuída, em parte, ao desequilíbrio entre as células T efetoras (T ef) e células T reguladoras (T reg). (Ma et al, 2007; Sanchez-Muñoz et al, 2008).
estranhos, como as células infectadas por vírus ou outros microorganismos intracelulares. Já as células T reguladoras são células capazes de bloquear a ativação e a função dos linfócitos T efetores (Abbas & Lichtman, 2005). Alguns estudos indicam que a ação supressora dessas células está ligada à secreção de citocinas imunossupressoras, como Interleucina-10 (IL-10) e o Fator de crescimento transformador beta (TGF-β). O TGF- β inibe a proliferação de células T e B,
enquanto que a IL-10 inibe a ativação de macrófagos e é antagonista do principal fator de ativação de macrófagos, o Interferon gama (IFN-γ) (Sanchez-Muñoz et al,
2008).
Nas DIIs, a resposta imune inata também tem um importante papel. Essa resposta é a linha de defesa inicial do sistema imunológico, onde participam células fagocitárias, células natural killers, proteínas do sangue, incluindo frações do sistema complemento e outros mediadores da inflamação como as citocinas (Abbas & Lichtman,2005).
Citocinas são polipeptídeos produzidos principalmente pelas células imune que facilitam a comunicação entre células, estimulam a proliferação de células efetoras específicas para antígenos e medeiam a inflamação sistêmica e local nas vias endócrinas, parácrinas e autócrinas (Sanchez-Muñoz et al, 2008). As células dendríticas e os macrófagos ativados secretam várias citocinas, que regulam a resposta inflamatória. Uma vez secretadas, essas citocinas promovem a diferenciação de células T, ativando a resposta imune adaptativa (Abbas & Lichtman, 2005).
e, portanto, desempenham funções efetoras distintas. As subpopulações mais bem definidas de células T efetoras são as células T helper do tipo 1 (Th1) e do tipo 2
(Th2) (Fuss et al, 2004; Abbas & Lichtman, 2005). O IFN-γ está associado ao padrão
Th1, enquanto IL-4 e IL-5 associam-se as células Th2. Hoje já está claro que células individuais podem expressar várias misturas de citocinas, e que pode haver muitas subpopulações com padrões heterogêneos de produção de citocinas. Entretanto, as reações imunes crônicas são freqüentemente dominadas por uma das duas populações Th1 ou Th2 (Kampen et al, 2005). Essas subpopulações mostram diferenças na expressão de vários receptores de citocina, e essas diferenças podem refletir o estado de ativação da célula, além de determinar as suas funções efetoras e participar no desenvolvimento e expansão das respectivas subpopulações (Abbas & Lichtman, 2005).
Nas DIIs ocorre um desequilíbrio entre a resposta T reguladoras / Th1, Th2. A falta da regulação apropriada das células T ou a super produção de células T efetoras está relacionada ao desenvolvimento e exacerbação das DIIs (Zhang et al, 2005; Sanchez-Muñoz et al, 2008).
colite observada nesses animais pode se desenvolver como conseqüência da elevada permeabilidade intestinal que propicia aumento dos agentes luminais no sistema imune mucosal (Arrieta et al, 2008).
Alguns estudos têm demonstrado o papel da IL-10 na manutenção da homeostase mucosal gastrointestinal. O mecanismo pelo qual essa citocina regula a inflamação mucosal é provavelmente multifatorial, porém, está associado à diminuição da apresentação de antígeno (McCafferty et al, 2000; Hegazi et al, 2006), aumento da liberação de Interferon gama (IFN-γ) e de IL-12, citocina que inibe a
diferenciação dos linfócitos T em linfócitos Th1 (Rennick & Fort, 2000). Há fortes evidências de que a IL-10 promova a diferenciação e aumento da atividade das células T regulatórias (Hegazi et al, 2006). Estudos in vitro têm demonstrado que a administração de IL-10 diminui a liberação de citocinas pró-inflamatórias de células mononucleares na lâmina própria de pacientes com doença de Crohn. Em adição, altas doses de IL-10, administradas por via intraperitoneal em camundongos com colite induzida por ácido Trinitro benzeno sulfônico (TNBS Trinitrobenzenesulphonic acid), são capazes de restaurar a tolerância de células mononucleares da lâmina própria (Duchmann et al, 1996).
Embora o mecanismo envolvido nessa resposta não esteja completamente elucidado, a ativação de macrófagos teciduais bem como o recrutamento e ativação de leucócitos fagocíticos adicionais (neutrófilos, eosinófilos e monócitos), principalmente neutrófilos (Nieto et al, 1998; Camuesco et al, 2006), tem papel primordial na resposta inflamatória do intestino (Pavlick et al, 2002; Galvez et al , 2006). Este infiltrado inflamatório aumentado é acompanhado por extensiva injúria mucosal e transmural, incluindo aumento da permeabilidade vascular, destruição da matriz extracelular e dano celular epitelial (Nieto et al, 1998).
Um dos principais mecanismos de destruição tecidual é o estresse oxidativo, que ocorre devido à excessiva síntese e liberação de ROS pelos leucócitos (McCord
et al. 2000, Nieto et al. 2002). Embora a formação desses radicais seja essencial para a defesa do hospedeiro contra a infecção bacteriana, sua continua superprodução, durante o processo inflamatório, pode causar extensa destruição tecidual (Roessner et al, 2008).
Pacientes com DIIs parecem ter alteração na função da barreira intestinal. A atividade da doença é associada ao influxo de neutrófilos dentro do epitélio mucosal e, subseqüentemente dentro do lúmen intestinal, resultando nos abscessos de criptas (Arita et al, 2005; Bernstein et al, 2006; McGuckin et al, 2009).
na mucosa intestinal (Burstein & Fearon, 2008). O processo de carcinogênese parece envolver uma seqüência de eventos, onde o epitélio cronicamente inflamado e hiperplásico progride inicialmente para focos de displasia plana, adenoma e finalmente para o adenocarcinoma. A inflamação não controlada é associada ao estresse oxidativo e ao dano celular oxidativo. Durante a proliferação das células, lesões oxidativas de DNA induzem mutações que são comumente observadas na oncogênese e nos genes supressores de tumor como o p53 (Seril et al, 2003; Gommeaux et al, 2007). É provável que as células da mucosa cólica, persistentemente submetidas a agentes oxidantes, sofram dano oxidativo progressivo em seu DNA, o que pode ocasionar mutações em genes supressores de tumor (p53), oncogênese (k-ras) e em genes que codificam as proteínas de reparo (MSH2 e MLH1) (Gommeaux et al, 2007).
A iniciação da carcinogênese é causada por uma alteração irreversível no DNA, como a reação dessa molécula com substâncias carcinogênicas. Assim, mecanismos de detoxicação de carcinógeno, reparo do DNA e eliminação das células que tenham DNA modificado (por apoptose, por exemplo) são importantes para a proteção contra a iniciação do câncer (Brown et al, 1994). Para que a iniciação ocorra, é necessário que haja não só a modificação do DNA, mas também a sua replicação e proliferação celular, de modo que a mutação inicial possa se fixar. A maioria dos cânceres humanos é originária de células epiteliais (carcinoma), pois as mesmas estão expostas aos carcinógenos (presentes no ar ou alimentos) e se proliferam rapidamente (Bartsch et al, 1996).
do DNA, as quais acabam se ligando e levando a formação de adutos (Bartsch et al, 2006). A base do DNA mais suscetível a esse tipo de ataque é a guanina, mas já foram relatados adutos formados em outras bases. Sendo formados no DNA por mecanismos químicos específicos, tais adutos podem levar a mutações em proto-oncogênese ou em genes supressores de tumor e iniciar o processo de carcinogênese (Lehman et al, 1994; Kinzler et al, 1996).
É bem estabelecido que a inflamação facilita a progressão de células normais para células malignas, pela produção de citocinas pró-inflamatórias como o Fator de necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6, IL-23 e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Bartsch et al, 2006; Roessner et al, 2008). A grande quantidade de citocinas e fatores de crescimento liberados durante a inflamação, pelas células do sistema imune e células não imunes, podem influenciar o processo de carcinogênese (Fantini et al, 2008). Esses mediadores ativam o NF-KB, a óxido nítrico sintase indutível (iNOS) e a ciclooxigenase do tipo 2 (COX-2), que estão associados ao retardo ou supressão da apoptose das células epiteliais intestinais e modulação da angiogênese (Chapkin et al, 2007). A apoptose, morte celular programada, é o mecanismo pelo qual o intestino elimina células com dano de DNA irreparável, e a inibição dessa resposta é uma das características do câncer de cólon (Bancroft et al, 2003).
A integridade do DNA é vital para a divisão celular e alterações oxidantes podem interferir na transcrição, translação e replicação do DNA e podem aumentar as mutações, senescência e morte celular (Miranda et al 2008; Ribeiro et al. 2008).
Devido a sua abundância nas células e suscetibilidade a oxidação, os ácidos graxos poliinsaturados (AGP) são, para os oxidantes, alvos mais prováveis do que o DNA (Wagner et al, 1994; Shimizu et al, 2001). É estimado que aproximadamente 60 moléculas de ácido linoléico e 200 de ácido araquidônico são consumidas por oxidantes que reagem com a bicamada lipídica. Como essa oxidação desencadeia uma cascata autocatalítica que gera numerosas substâncias genotóxicas, tais danos aos lipídeos tem grandes implicações para a integridade do DNA (Wagner et al, 1994).
A peroxidação dos lipídeos de membrana inicia quebras autocatalíticas com conseqüente formação de metabólitos citotóxicos e genotóxicos tais como hidroxinomenal e o malonaldeído. A degradação desses produtos pode interferir na cascata de sinalização intracelular envolvendo replicação e morte das células (Eder
et al. 2008). Lipídeos dietéticos, relacionados ao ataque pró-oxidativo das células epiteliais do cólon, podem ser um importante fator de contribuição para a carcinogênese (Udilova et al, 2003; Nowak et al, 2007).
alternativa para a terapia medicamentosa (Camuesco et al, 2005; Nowak et al, 2007).
As DIIs ocasionam deficiências nutricionais, tais como desnutrição calórica e protéica e deficiência de vitaminas, minerais e oligoelementos, que ressaltam a importância da terapia nutricional em seu tratamento (Pizato et al, 2005; Ferguson et al, 2007; Razack et al, 2007). Desnutrição é comum nestes pacientes, e intervenções, através da terapia nutricional adequada para restabelecer o estado nutricional, tem sido associada à melhora do processo de recuperação com melhora do sistema imunológico nos períodos de crises da doença (Razack et al, 2007). Várias características contribuem para a desnutrição observada nos pacientes: (1) Há uma diminuição da ingestão oral de nutrientes associada à dor abdominal e anorexia; (2) A inflamação mucosal associada à diarréia leva à perda de proteínas, minerais, sangue, eletrólitos e elementos traços. Além disso, ressecções múltiplas ou supercrescimento bacteriano no cólon podem ocasionar efeito nutricional adverso como má absorção de micronutrientes; (3) Terapias medicamentosas podem levar à desnutrição. Por exemplo, a sulfassalazina reduz a absorção de ácido fólico, e corticosteróides diminuem a absorção de cálcio e afetam negativamente o metabolismo protéico (Wild et al, 2007).
resultado em um aumento significativo da razão AGP w-6:w-3 na dieta (Calder, 2008). A incidência de DIIs é alta nas populações ocidentais e tem aumentado muito nos países em desenvolvimento que tem adotado estilo de vida urbano industrializado com mudanças concomitantes nos hábitos dietéticos, como a maior ingestão de fast food com alto conteúdo de gorduras (Wild et al, 2007).
A relação entre resposta inflamatória e dietas enriquecidas com AGP tem sido bastante investigada nos últimos tempos. Muitos estudos têm demonstrado que os AGP podem modificar reações inflamatórias e imunológicas, podendo ser úteis como terapias auxiliares no tratamento de doenças inflamatórias (Kinsella et al, 1990; Serhan et al, 2004).
Os AGP da dieta dos tipos w-6 e w-3 são incorporados aos fosfolipídios das membranas celulares podendo influenciar as respostas imunológicas e inflamatórias, por modificarem a fluidez, os sistemas de defesa antioxidantes, e por darem origem a diferentes precursores da síntese de eicosanóides, importantes mediadores inflamatórios (Kinsella et al, 1990; Simopoulos et al, 2003; Calder, 2008).
Os eicosanóides produzidos a partir do EPA (AGP w-3) são em geral menos ativos no processo inflamatório do que os eicosanóides derivados do AA (AGP w-6) (Calder, 1996; Calder, 1998; Kikuchi et al, 1998).
Estudos clínicos têm mostrado efeitos benéficos da suplementação da dieta com óleo de peixe sobre condições inflamatórias agudas e crônicas (Harbige, 1998; Simopoulos et al, 2002; Innis et al, 2006; MacLean et al, 2005). Tais efeitos têm sido atribuídos à diminuição na geração dos mediadores inflamatórios derivados do AA e produção de mediadores menos potentes derivados do EPA e DHA, após tratamento com dietas enriquecidas com AGP w-3 (Harbige, 1998; James et al, 1998; Zaloga & Marik, 2001).
O papel dos AGP w-3 e w-6 no desenvolvimento do câncer tem sido extensivamente estudado em trabalhos epidemiológicos e experimentais. O contrastante papel, na tumorigênese, dos ácidos graxos AGP w-3 como protetores, e dos AGP w-6 como promotores, tem sido uma questão intrigante no campo da nutrição e câncer (Eder et al, 2008).
uma alternativa segura e efetiva ao uso de drogas antiinflamatórias, particularmente aos inibidores da COX-2, drogas que promovem efeitos colaterais importantes, quando utilizados por períodos prolongados (Zhou et al, 2005; Chapkin et al, 2007).
1.1 Justificativa
Em nosso laboratório observamos que tanto dietas suplementadas com AGP w-3 como AGP w-6 diminuem a resposta inflamatória aguda, induzida por carragenina. Tal efeito foi parcialmente atribuído aos elevados níveis de corticóides encontrados nesses animais (Silveira et al. 1995). Adicionalmente, verificamos que as dietas promoviam, durante o desenvolvimento do edema de carragenina, alterações similares em mediadores inflamatórios. Ambas as dietas diminuíram a liberação de H2O2 e óxido nítrico (NO) por macrófagos estimulados por carragenina, os níveis plasmáticos de kalicreína (KK) e a liberação de bradicinina (BK) e óxido nítrico (NO) do exsudato inflamatório (Wohlers et al. 2005). Verificamos ainda que essas dietas promoveram, durante o desenvolvimento do edema de carragenina, uma diminuição das citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-6 tanto no exsudato quanto no soro, e um aumento da citocina antiinflamatória IL-10 (Wohlers et al, 2007).
desenvolvimento de neoplasias. A confirmação dessa possibilidade, em modelos experimentais, poderá auxiliar no emprego de estratégias dietéticas, como tratamento complementar das DIIs, que possam ser úteis na diminuição de drogas utilizadas no tratamento, aumento do período de remissão da doença e prevenção do câncer colorretal nos enfermos portadores de colite ulcerativa.
2 – OBJETIVOS
2.1 - Geral
Verificar se dietas hiperlipídicas ou normolipídicas, ricas em AGP w-3 ou AGP w-6, alteram o desenvolvimento da resposta inflamatória, a liberação de mediadores inflamatórios e o dano oxidativo do DNA na colite experimental.
2.2 - Específicos
Analisar, em ratos submetidos ao modelo de colite induzida por DSS, se dietas hiperlipídicas ou normolipídicas, ricas em AGP w-3 ou AGP w-6 alteram:
a) o escore de gravidade da doença
b) a incorporação tecidual hepática de ácidos graxos. c) a histopatologia do cólon distal.
d) a atividade da enzima mieloperoxidase expressa nos tecidos colônicos. e) a concentração tecidual das citocinas IFNγ, IL-4 e IL-10.
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Animais e tratamento
O Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP aprovou todos os procedimentos envolvendo animais (Projeto n0 01588/07).
Foram utilizados ratos (rattus norvergicus) da linhagem Wistar, albinos, heterozigotos, procedentes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME), com idade variável entre 28-34 dias e pesando entre 65-70 g para o inicio da alimentação com as dietas experimentais.
Os animais receberam água e alimento ad libitum e foram mantidos em temperatura de 24 ± 1 ºC, sob condições de ciclos de luz alternados, claro/escuro, de 12 horas cada. Os animais foram divididos em seis grupos, tendo, durante 47 dias, livre acesso a diferentes tipos de dietas. A colite foi induzida por 7 dias (do 36o ao 42o dia) pela administração de sulfato de sódio dextran (DSS) na água de beber. No 43º dia o DSS foi descontinuado e no 48º dia os animais foram sacrificados, após jejum alimentar de 24 horas.
Os grupos experimentais foram divididos de acordo com a composição da ração:
2. Grupo Hiper Peixe (HP) – animais alimentados com dieta hiperlipídica (20% de gordura) a base de óleo de peixe;
3. Grupo Hiper Soja-Peixe (HSP) - animais alimentados com dieta hiperlipídica (20% de gordura) com 10% de óleo de soja e 10% de óleo de peixe;
4. Grupo Normo Soja (S) - animais alimentados com dieta normolipídica (5%-8% de lipídeos) à base de óleo de soja, sendo este grupo utilizado como controle tanto para as dietas normolipídicas quanto para as dietas hiperlipídicas;
5. Grupo Normo Peixe (P) - animais alimentados com dieta normolipídica (5%-8% de gordura) à base de óleo de peixe;
6. Grupo Normo Soja-Peixe (SP) – animais alimentados com dieta normolipídica (5% - 8% de gordura) com 2,5 - 4% de óleo de soja e 2,5 – 4% de óleo de peixe.
3.2 - Indução da colite experimental
3.3 - Preparações das dietas e armazenamento
As dietas foram preparadas no laboratório e sua composição definida segundo as recomendações do American Institute of Nutrition (AIN-93) (Reeves et al, 1997). Os animais receberam dieta própria para o crescimento até sessenta dias de idade e dieta para manutenção após esse período. Todos os ingredientes foram pesados e colocados em uma bacia. Água quente foi adicionada gradativamente durante a homogeneização até atingir a consistência adequada para a formação de “pellets”. Os “pellets” foram levados a estufa a 60 ºC por 24 horas. Após o resfriamento à temperatura ambiente, as dietas, devidamente identificadas, foram armazenadas em recipientes plásticos, em temperatura de cerca de 4 ºC e, conforme a demanda dos animais, oferecidas em porções diárias.
Tabela 1. Composição (g/100g) das dietas normolipídicas e hiperlipídicas. Normolipídicas
Ingredientes Soja Peixe Soja/Peixe
Caseína 20,0 (14,0) 20,0 (14,0) 20,00 (14,0)
Amido de milho 62,0 (71,1) 62,0 (71,1) 62,00 (71,1)
Celulose 5,0 (5,0) 5,0 (5,0) 5,0 (5,0)
Mineral mix AIN-93 3,5 (3,5) 3,5 (3,5) 3,5 (3,5) Vitamina mix AIN93 1,0 (1,0) 1,0 (1,0) 1,0 (1,0) Bitartarato de colina 0,25 (0,25) 0,25 (0,25) 0,25 (0,25)
L-cistina 0,3 (0,18) 0,3 (0,18) 0,3 (0,18)
Butilhidroquinona 0,014 (0,007) 0,014 (0,007) 0,014 (0,007)
Óleo de peixe 0 8,0 (5,0) 4,0 (2,5)
Óleo de soja 8,0 (5,0) 0 4,0 (2,5)
Hiperlipídicas
Ingredientes Hiper Soja Hiper Peixe Hiper Soja/Peixe
Caseína 20,0 (14,0) 20,0 (14,0) 20,00 (14,0)
Amido de milho 62,0 (71,1) 62,0 (71,1) 62,00 (71,1)
Celulose 5,0 (5,0) 5,0 (5,0) 5,0 (5,0)
Mineral mix AIN-93 3,5 (3,5) 3,5 (3,5) 3,5 (3,5) Vitamina mix AIN93 1,0 (1,0) 1,0 (1,0) 1,0 (1,0) Bitartarato de colina 0,25 (0,25) 0,25 (0,25) 0,25 (0,25)
L-cistina 0,3 (0,18) 0,3 (0,18) 0,3 (0,18)
Butilhidroquinona 0,014 (0,007) 0,014 (0,007) 0,014 (0,007)
Óleo de peixe 0 20,0 (20,0) 10,0 (10,0)
Óleo de soja 20,0 (20,0) 0 10,0 (10,0)
3.4 - Consumo alimentar e peso corporal
O consumo das rações foi controlado semanalmente e determinado através da diferença entre a quantidade de ração oferecida para a ingestão e a sobra desta que era pesada no dia seguinte.
O peso dos animais foi mensurado semanalmente no mesmo dia e horário, no período antes da indução da colite, e diariamente após o início da indução da colite.
3.5 - Coleta de amostras
Treze dias após o início da indução da colite (48º dia de alimentação), os animais foram anestesiados com ketamina e Xilazina (1:1), na dose de 0.1 mL/100g, tricotomizados na região abdominal, e decapitados para retirada das amostras sanguínea. A seguir realizou-se uma incisão abdominal mediana para a remoção de todo o segmento do cólon e reto, que foi pesado e seu comprimento medido, sob carga constante de 2 g. Esse segmento foi aberto longitudinalmente pela borda mesocólica do ceco até a borda anal, sendo lavado em PBS (phosphate-bufferid saline) e subdividido em 2 segmentos: cólon proximal e cólon distal. O cólon proximal foi desprezado e o cólon distal dividido em quatro fragmentos:
O segundo fragmento (0,5 cm) foi acondicionado em eppendorff contendo protetor de RNAase e conservado em refrigeração à –80 ºC até a realização do “ensaio cometa” para pesquisa de dano oxidativo do DNA.
O terceiro fragmento (0,5 cm) foi acondicionado em um frasco seco, congelado imediatamente após a ressecção em freezer a –80 ºC, até a dosagem da atividade da enzima mieloperoxidase.
O quarto fragmento (5,0 cm) foi homogeneizado em 4,0 ml de PBS gelado, centrifugado a 1200 r.p.m. por 10 minutos a 4 ºC e o sobrenadante aliquotado e congelado a –80 ºC para posterior dosagem das citocinas por ELISA.
O fígado dos animais foi removido inteiro para análise da incorporação tecidual de ácidos graxos.
3.6 - Análise histológica
Os fragmentos do cólon distal, destinados ao estudo histológico e fixados em formalaldeído a 10% foram desidratados em sucessivas concentrações crescentes de álcool. A seguir foram submetidos à clarificação em xileno, incluídos em blocos de parafina e submetidos a quatro cortes longitudinais, com 4µm de espessura para
montagem das lâminas que foram coradas pela técnica da hematoxilina-eosina.
A intensidade do processo inflamatório foi classificada em ausente (-), leve (+), moderado (++) e intenso (+++) baseando-se nos seguintes critérios:
0(-) = Normal
1(+) = Leve
Polimorfos nucleares na lâmina própria.
Criptite ocasional.
Mínima destruição glandular e ulceração.
2(++) = Moderada
Moderado número de polimorfonucleares na lâmina própria com criptite e abscessos.
Alguma destruição glandular.
3(+++)= Intenso
Numerosos polimorfonucleares com abundante criptite.
Abscesso crípticos.
Destruição celular intensa.
Ulceração proeminente da mucosa.
fezes e a consistência das fezes. Esses parâmetros foram classificados de acordo com o Escore proposto por Cooper et al (1993) (Tabela 2), utilizado para calcular a média diária do Índice de Atividade da Doença (IAD) para cada animal.
Tabela 2. Escore do Índice de Atividade da Doença (IAD)
IAD Perda de peso Consistência das
fezes
Sangramento retal %
0 0 Normal Normal
1 1 – 5
2 5 – 10 Perda de consistência
3 10 – 20
4 >20 Diarréia Sangramento
O IAD representa índices combinados de perda de peso, consistência das fezes e perda de consistência das fezes, adaptado por Cooper et al. (1993)
3.8 – Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)
A determinação desta enzima foi realizada homogeneizando-se, por 15 a 20 segundos, 50 mg do cólon e 1 ml de uma solução de Brometo de Hexadecil trimetilamônio (HTAB hexadecyltrimethylammonium bromide) (5 g de HTAB para 1 litro de tampão Fosfato de Potássio), em gelo. A seguir, a amostra foi centrifugada por 10 minutos, a 4 ºC, e o sobrenadante separado e colocado em placa de 96
sobrenadante e 200 µl de o-dianisidine, sendo a placa imediatamente lida em 460 nm, de 30 em 30 segundos, por 3 minutos.
3.9 Concentrações de citocinas no tecido colônico
As concentrações das citocinas IFNγ, IL-4 e IL-10 foram determinadas por
ELISA nos fragmentos de cólon homogeneizados, utilizando-se kits de citocinas para ratos R&D System (Minneapolis, USA) Os protocolos dos kits foram seguidos. Primeiramente, placas para ELISA (Nunc-Maxisorb) foram adsorvidas com anticorpos de captura anti-rato em um tampão de adsorção e incubadas a temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte as placas foram lavadas cinco vezes com cerca de 300 ml/well de Tampão Fosfato-Salina (0,01 M), pH 7,3 e 0,05% de Tween 20 (PBS-T).
As placas foram incubadas com 300 µl de tampão de bloqueio [PBS (0,01 M,
temperatura ambiente, em local escuro. A reação foi interrompida pela adição de 50ml de H2SO4 (1M) e a intensidade da cor amarela (densidade óptica) determinada em leitor de microplaca (Labsystems Multiskam, MS) a 405 nm. Elaborou-se uma curva padrão de concentrações conhecidas de citocinas e com base nesta curva os
resultados foram calculados e expressos em ρg de citocinas por ml de homogeneizado.
3.10 - ENSAIO COMETA
O ensaio do Cometa foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Unidade de Farmacologia e Gastroenterologia (UNIFAG) da Universidade São Francisco, Bragança Paulista.
overnight. Subseqüentemente, expostas a um tampão alcalino (1 mM EDTA e 300 mM NaOH, pH~13,4) por 40 min a 4 ºC. A eletroforese foi realizada neste tampão a 4 ºC por 30 min a 25V e 300 mA. Após a corrida, as lâminas foram neutralizadas (0,4 M Tris, pH 7,5), coradas com SYBR Safeä (Invitrogen) e analisadas com um microscópio de fluorescência. Duzentas células foram aleatoriamente selecionadas (100 de cada réplica) e analisadas usando o software Komet 5,5 (Kinetic Imaging, USA). As amostras foram avaliadas e a média do Olive Tail Moment DNA foi determinada. Uma maior porcentagem de DNA na cauda significa altos níveis de danos ao DNA.
3.11 - Composição de ácidos graxos das dietas e incorporação no fígado
Para a extração total de lipídeos, as amostras de tecidos congeladas ou de dieta, foram homogeneizadas em clorofórmio e metanol (2:1 v/v) seguida de adição de solução aquosa de KCL (Folch et al. 1957). O clorofórmio foi seco em camadas sob N2 e a extração total foi convertida dentro de ésteres metil de ácidos graxos usando BF3 metanol, de acordo com o método sugerido pelo the American Oil Chemist's Society (1993). Os ésteres metal foram diluídos em hexane e analisados por cromatografia gasosa usando cromatográfico CHROMPACK® chromatographer (model CP 9001) com o detector de ionização e a coluna capilar CP-Sil 88 (Chrompak, WCOT Fused Silica 59 m x 0.25 mm). O detector de temperatura foi 280 oC e o injector 250oC. A temperatura inicial foi 180 ºC por 2 minutos, programado
com um autêntico padrão de ésteres de ácidos graxos injetados sob as mesmas condições. A composição dos ésteres de ácidos graxos, como porcentagem do peso total de ácidos de graxos, foi calculada usando contagem da área do cromatógrafo.
3.12 – Determinação de Corticosterona Plasmática
A concentração plasmática de corticosterona foi determinada pelo método fluorimétrico de Guilhemim et al (1959) baseado na fluorescência dos glicocorticóides em ácido sulfúrico.
Uma quantidade de 500 µl de plasma era misturada a 6 ml de diclorometano. Após agitação, formava-se um sobrenadante turvo que era aspirado, usando-se uma pipeta Pauster conectada à bomba de vácuo (Bomba de vácuo e compressor rotativo Primar – Mod. 141, tipo 2 VC). Em seguida, a amostra era submetida à agitação e aspiração após ser acrescida de 0,5 ml de água destilada. Então, 1 ml de uma solução formada por etanol e ácido sulfúrico (7:3) foi adicionada, e a amostra, após agitação, era deixada em repouso até que a solução etanol-sulfúrico, contendo o material fluorescente, precipitasse completamente no fundo do tubo (20 a 30 minutos). Essa solução era cuidadosamente retirada e colocada em cubetas para leitura em espectrofotoflurímetro (Perkin-Elmer LS 5B).
3.13 – Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa PRISMA 4.0 para Windows. Calculou-se o coeficiente de variabilidade (CV) das amostras para a escolha da análise estatística Paramétrica (CV < 0,20), ou Não Paramétrica (CV > 0,20). Como alguns grupos apresentaram um CV maior do que 0,20 (20%), utilizamos estatística Não Paramétrica.
Para as comparações feitas entre os grupos utilizou-se a Análise de Variância de Bonferroni. Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m) e o nível mínimo de significância foi fixado em 5% (p<0,05).
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e a discussão estão apresentados no formato de 2 artigos científicos:
- Artigo 1: Soybean and Fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis
Artigo 1: Soybean and Fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis
Karina Vieira de Barros, MD,1 Roberta Araujo Navarro Xavier, MD,1 Gilclay Gomes de Abreu1 Carlos Augusto Real Martinez, PhD,2 Marcelo Lima Ribeiro, PhD,3 Alessandra Gambero, PhD,3 Patrícia de Oliveira Carvalho, PhD,2 Claudia Maria Oller do Nascimento, PhD,1 Vera Lúcia Flor Silveira, PhD,4.
1Department of Physiology, Federal University of São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP, Brazil; 2Multidisciplinary Research Unit, São Francisco University Medical School, Bragança Paulista, SP, Brazil;3 Clinical Pharmacology and Gastroenterology Unit, São Francisco University Medical School, Bragança Paulista, SP, Brazil; 4Department of Biological Sciences, Federal University of São Paulo, Diadema, SP, Brazil.
Corresponding author Prof. Dr. Vera L. F. Silveira
Departamento de Ciências Biológicas
Universidade Federal de São Paulo - Campus Diadema
Rua Prof. Artur Riedel, 275, Bairro Eldorado – Diadema – SP – Brasil, CEP: 09972-270, Tel./fax: 55-(11)-5576-4527
E-mail: vera.flor@unifesp.br / veraflorsilveira@gmail.com
ABSTRACT
Background: Ulcerative colitis (UC) is characterized by recurrent episodes of colonic inflammation with an imbalance in the synthesis and release of cytokines. Chronic colonic inflammation has been associated with DNA damage and colorectal cancer. Dietary polyunsaturated fatty acids (PUFA), can modulate immune function, inflammation and carcinogenesis. Therefore, we investigated whether PUFA could influence colonic injury, plasma corticosterone and tissue myeloperoxidase activity (MPO), DNA damage and cytokines in colitic rats.
Methods: Male weaning Wistar rats were fed for 47 days with an AIN-93 diet with control (C), fish (F) or a mixture of fish and soybean oil (SF). UC was induced from day 36 until day 42 by 3% DSS in drinking water. On day 48, the rats were anesthetized and, blood samples were collected for corticosterone determination. The distal colon was excised for histological analysis and to quantify the cytokine (IL-4, IL-10 and INF-γ), MPO and DNA damage. The disease activity index (DAI) was recorded daily during colitis induction.
Results: DAI, MPO, histological analyses showed decreases (p<0.05) only in the SF group compared with the C group. IL-10 was increased and DNA damage was reduced in the groups F and SF, and an inverse correlation between these variables (r=0.77) was found. There were no differences in corticosterone, IFN-γ and IL-4 levels.
Conclusions: Soybean and fish oil mixture may be effective in improving colonic injury and DNA damage, and it could be an important complementary therapy in UC to reduce the use of anti-inflammatory drugs and prevent colorectal cancer.
Running head: PUFA and colonic inflammation
INTRODUCTION
Ulcerative colitis (UC) is an inflammatory bowel disease (IBD) characterized by recurrent episodes of colonic inflammation and tissue regeneration1. Although the pathogenesis of UC has not been entirely elucidated, the chronic relapsing inflammation has a multifactorial etiology. UC can be caused by an exaggerated immune response to the intestinal flora in the context of genetic predisposition2,3 that can be attributed, at least in part, to an imbalance between effector T cells (Teff) and regulatory T cells (Treg)4.
In IBD, there is increased synthesis and release of pro-inflammatory mediators, such as eicosanoids, platelet activating factor, reactive oxygen species (ROS), nitrogen metabolites, chemokines and mainly cytokines5 that have been associated with disease severity, activity and remission2.
Active episodes of UC are characterized by mucosal injury, increased vascular permeability, infiltration of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes, disruption of extracellular matrix and epithelial cell damage where neutrophils can mediate cell and tissues injury by the synthesis and release of ROS6.
the deoxy-ribose-molecule9,10. Chronic inflammation in the colonic mucosa caused by increased and continuous exposure of ROS promotes oxidative DNA damage of the epithelial cells, triggering the appearance of genetic mutations and initiating colorectal carcinogenesis10,11.
Disturbances of fatty acid status are related to IBD12, and nutrition and dietary factors, mainly fatty acids, can modulate immune function. Dietary fatty acids such as omega 3 (w-3) polyunsaturated fatty acids (PUFA) can exert an anti-inflammatory effect reducing pro-inflammatory cytokines production4.
The main purpose of this study was to examine the effect of diets enriched with fish oil, soybean oil and fish plus soybean oil mixture on markers of colonic injury, cytokines (IL-4, IL-10 and IFN), MPO activity, corticosterone levels and DNA damage in colon of rats with experimental UC induced by dextran sulfate sodium (DSS). Colitis induced by DSS is widely used due to the advantages of simplicity, degree of lesion uniformity, and leukocytes infiltration13. DSS is also an experimental model for oxidative stress11,14.
MATERIALS AND METHODS
Animals and diet treatments:
(n=6 per group) and received, for 47 days, one of three diets: control (C group), fish (F group) or soybean-fish (SF group) diet. All of the experiments reported were previously reviewed and approved by Institutional Ethics Committee for Experimental Research.
The diets were prepared according to the recommendations of the American Institute of Nutrition. The standard AIN-9315 G (8% fat until 2 month) and M (5% fat after 2 month) diets contained the same amount of protein, carbohydrates and lipids. The only difference between the diets was the source of lipids: 100% of soybean oil (source of w-6 PUFA) in the C group, 100% of fish oil (source of w-3 PUFA) in the F group and a mixture of 50% of soybean oil and 50% of fish oil in the SF group. We obtained soybean oil and fish oil from Brazilian producers. The detailed compositions of the diets are presented in Table 1, and the fatty acid profile of each diet is presented in Table 2.
Induction of colitis, samples collection and procedures
Colitis was induced in all animals from day 36 to day 42 with 3% DSS (wt/v, prepared daily, mol wt 5.000-Fluka BioChemika) put in the drinking water.
Animal body weight, presence of gross blood in the feces and stool consistency were recorded daily for each rat from day 35 to day 47. These parameters were each assigned a score according to the criteria proposed by Cooper et al.16, which was used to calculate a daily mean disease activity index (DAI). Food and water consumption was also recorded daily during this period.
corticosterone determination (trisodium citrate, as anticoagulant). The distal colon was immediately excised, rinsed with phosphate buffered saline (PBS), weighed, and its length was measured under a constant load (2 g). The distal colon was longitudinally opened and subsequently divided into four segments: 2 cm to histological analysis (immediately fixed in 10% formaldehyde), 0.5 cm to DNA damage detection (maintained in a fixative solution described below), 0.5 cm to myeloperoxidase (MPO) activity determination, 0.5 cm to fatty acids composition and 6.0 cm to cytokines (IL-4, IL-10 and INF-γ) measurements. All samples were stored
at -80 °C, except the histological analysis samples .
Histological analysis
Fatty acids composition of diets
For total lipid extraction, diets samples were homogenized in chloroform and methanol (2:1 v/v) followed by the addition of an aqueous solution of KCL17. The chloroform layer was dried under N2, and the total extract was converted into methyl esters of fatty acids using BF3 methanol, according to the method suggested by the American Oil Chemist's Society18. The methyl esters were diluted in hexane and analyzed by gas chromatography using a CHROMPACK® chromatographer (model CP 9001) with a flame ionization detector and a CP-Sil 88 capillary column (Chrompak, WCOT Fused Silica 59 mm x 0.25 mm). The detector temperature was 280 oC, and the injector temperature was 250 oC. The initial temperature was 180 oC for 2 minutes (min), programmed to increase 10 oC per min up to 210 oC and held for 30 min. The carrier gas used was hydrogen at a flow rate of 2.0 mL.min-1. The identification of the fatty acids was done comparing the retention times of the sample components with authentic standards of fatty acid esters injected under the same conditions. Fatty acid composition, as a percent of total acid weight, was calculated using area counts of the chromatogram.
Measurement of colon cytokine and plasma concentration
Tissue samples were homogenized in 3.5 mL PBS solution and centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes. Supernatants were transferred into clean Eppendorf tubes and stored at –80 ºC. The concentration of INF-γ, IL-4 and IL-10 were measured by
Myeloperoxidase Activity in the Colon
Tissues colon samples (0.5 cm) obtained from the distal colon were homogenized in 0.5% (w/v) hexadecyltrimethylammonium bromide in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0. For the myeloperoxidase (MPO) assay, 50 µL of each sample were added to 200 µL of dianisidine solution (0.167 mg/mL o-dianisidine dihydrochloride, 0.0005% hydrogen peroxide in 50 mM phosphate buffer, pH 6.0) immediately prior to reading the change in absorbance at 460 nm over 5 minutes using a microplate reader (Multiscan MS, Labsystems, Helsinki, Finland).
Comet Assay
Cell Viability:
The Comet assay should be performed only on samples having a cell viability of more than 75%. Therefore, cell viability was determined using the fluorescein-diacetate (FDA)/ethidium bromide (EtBr; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) assay. Briefly, a fresh staining solution was prepared containing 30 mL FDA in acetone (5 mg/mL), 200 mL EtBr in PBS (200 mg/mL), and 4.8 mL PBS (Invitrogen). The single cell suspension (25 mL) was then mixed with 25 mL of the staining solution, spread onto a slide and covered with a coverslip. Viable cells appeared fluorescent-green, whereas red-stained nuclei indicated dead cells. At least 200 cells were counted per sample.
Determination of DNA Damage:
M Tris, pH 7.5), stained with 40 mL EtBr (20 mg/mL) and analyzed with a fluorescence microscope (Eclipse E400; Nikon, Melville, NY, USA), using an image analysis system (Komet 5.5; Kinetic Imaging, Nottingham, UK). Two hundred randomly selected cells (100 from each of two replicate slides) were evaluated from each sample, and the mean of the Olive tail moment DNA was determined. Tail moment (TM) is defined as the product of DNA in the tail, and the mean distance of migration in the tail is calculated by multiplying tail intensity/sum comet intensity by the center of gravity of the tail – peak position. A higher percentage of tail DNA signifies a higher level of DNA damage.
Statistical analysis
Data were expressed as means ± standard error of the mean (SEM). Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Bonferroni’s post hoc test for multiple comparisons. Significance level was set at p< 0.05. To verify the correlation between two variables, Pearson’s correlation coefficients (r) were used.
RESULTS
Fatty acids composition of diets
excess of SAFA like there was in the Fish diet. In relation to PUFA, the F group had a lower amount compared with the C and SF groups; however, the main difference among the diets was the w-6:w-3 PUFA ratio. The C group showed a w6:w3 ratio that was similar to western diets (10:1) while the F group had a ratio (1:6) with an excess of w-3 PUFA. In the SF group, a balanced ratio (2:1) was observed.
Body weight before and after colitis induction, disease activity index (DAI), colon length, inflammation score (IS) and corticosterone.
Animals were monitored from weaning, and their weight was evaluated once a week before induction and daily after colitis induction. Up to day 36, there was no difference in weight among the groups; however, after colitis induction, groups SF and F presented with body weight increases compared with the C group (Table 3).
The induction of colitis resulted in significant changes in body weight, stool consistence, fecal blood, food intake and a worsened general status. The three groups presented a progressive DAI from the 3rd day with DSS (day 38) until the 7th day (day 42) (Figure 1). During colitis induction, the F group tended to be similar to the SF group in stool consistency and weight loss; however, rectal bleeding was more intense (data not shown).
SF group presented a significantly decreased DAI on days 41, 42 and 43 when compared with the C group. The F group had an intermediate DAI, which was between those for the C and SF groups (Figure 1).
Colon length, an inflammation indirect marker, was higher in the SF and F groups in relation to the C group (Table 4). In addition, IS revealed typical inflammatory changes in the colonic architecture (ulceration, crypt dilation, mixed cell infiltration and granulocytes) in all groups, but only the SF group presented with lower tissue damage when compared with C (Figure 2), probably associated with a decreased incidence of diarrhea, blood in feces and smaller weight loss in this group.
Regarding plasma corticosterone levels, there were no differences among the groups.
Cytokines, MPO activity and DNA damage
MPO activity was significantly lower in the SF group than in the C group, suggesting a reduced neutrophil infiltration in colon tissues, and again, the F group had an intermediate result (Table 5). Interestingly, no difference was observed in the IL-4 and INF-γ cytokine tissue concentrations. However, in relation to IL-10, an
important cytokine in maintaining gastrointestinal mucosal homeostasis, increased values were found in the F and SF groups when compared with the C group (Table 5).
DISCUSSION
The results showed that the colon inflammation induced by DSS was significantly less severe in group SF, showing that the mixture of fish oil and soybean oil balanced the w6:w3 PUFA ratio (2:1) and improved colonic inflammation. The diet enriched with fish oil (F group) presented intermediate effects, probably because of the imbalance in the w-6:w-3 PUFA ratio (1:6). Several studies demonstrated the importance of modulating the w-6: w-3 ratio to obtain beneficial effects rather than simply reducing w-6 PUFA levels21. The imbalance in the w-6:w-3 ratio, as is observed in western diets (10:1), may be related to an increased production of proinflammatory cytokines and eicosanoids in autoimmune diseases and IBDs22. Fish oil contains large amounts of SAFA, which has been associated with chronic diseases23,24. Several studies indicate that the optimal w-6:w-3 ratio may vary according to the disease; however, the ratio between 5-2:1 has been associated with decreased inflammation in patients with IBD, rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases and with reduced rectal cell proliferation in patients with colorectal cancer25.
It has been suggested that patients with IBD show changes in the metabolism of long chain polyunsaturated fatty acids. These alterations may be relevant in maintaining the chronic inflammatory activity in the colon26. Fish oil supplementation may be able to down-regulate the expressions of some genes, which have been involved in inflammatory process12,27.
more difficult to observe. The protocol was started using DSS 5% in drinking water for 7 days, and later, it was decreased to 2% for 10 days, when the animals were sacrificed21. However, the mortality in this experimental model was 80%, and so we decided to decrease the DSS to 3% for 7 days and water for 5 days. This high mortality could be associated with different molecular weight of DSS and/or the animals’ gender. The mol wt of 36,000 – 50,000 for DSS and Wistar female rats were not used in this paper.
Intense rectal bleeding observed in the F group during colitis induction could be associated with a decreased production of thromboxanes A2, a potent platelet aggregator, as it has been demonstrated with fish oil rich-diets23,25,28. The DAI evaluation showed lower values in the SF group suggesting that the balance of fish and soybean oils exerts protective effects in decreasing disease activity and protecting against weight loss. These are important factors considering that the nutritional status of patients with IBD is negatively affected during the disease activity and that dietary interventions could be beneficial and improve clinical and nutritional status29.
No difference was found in INF-y and IL-4 cytokines. Evaluating cytokine release in experimental colitis, Dieleman et al.32 also found no increase in IL-4 and INF-γ in the acute phase of UC. These authors observed these elevated cytokines
only in later phases (14 days after DSS stopping).
An increase in the colonic MPO activity, a specific marker of polymorphonuclear neutrophils activity, was used as a measure of the inflammatory
status33. The present study showed that the MPO activity decreased only in the SF
group in relation to the C group, which matched the lower inflammation based on the
inflammatory score and decreased DNA damage. Once more, the balanced w6:w3
ratio used in the SF group shows a beneficial effect on UC. In fact, neutrophils may
mediate a mucosal injury by the synthesis and release of ROS6, and it has been
known that oxidative stress is a pathogenic factor correlated with DNA damage9.
There was a clear correlation between increased IL-10 levels and decreased DNA damage, and to the best of our knowledge, this is the first demonstration of a causal association between these variables associated with IBD. It is likely that the anti-inflammatory effects from IL-10 attenuating mucosal inflammation are associated with putative protection in DNA.
Considering that inflammation can accelerate tumorigenesis in the colon, and anti-inflammatory drugs have been used to prevent this event, a dietary intervention with a mixture of fish and soybean oil may be an effective complementary therapy to prevent cancer. Also, it could be an alternative to the use of anti-inflammatory drugs and their associated side effects.
different w-3 PUFA doses used28. Here, the mixture of fish and soybean oil in the diet was demonstrated to be better than the use of fish oil as an exclusive source of fat.
The experimental conditions of this study could represent a stressful situation for the rats, and they could modify their corticosterone levels. It has been reported that plasma corticosterone levels are significantly increased when animals undergo a single stress session, compared with chronic stressful conditions38. Furthermore, it has been shown that chronic stress does not modify either catecholamine or corticoids plasma levels, indicating an adaptation of the neuroendocrine circuit39. Here, we show that plasma corticosterone levels did not differ in the three experimental groups. This strongly suggests that the animals had adapted at the time of the experiment and that the anti-inflammatory effects obtained by dietary treatment using fish or soybean/fish diet could not be attributed to the action of this hormone.
In conclusion, the main beneficial effects exerted by the balance between fish and soybean oil were in reduced disease activity, improved histological score, increased IL-10 cytokine, decreased MPO and protection against DNA damage. The inverse correlation between IL-10 levels and DNA damage also demonstrated that the w-6:w-3 ratio (2:1) was important in reducing disease activity and colon cancer prevention associated with colitis.
Acknowledgments
Table 1 - Composition of the experimental diets according AIN-9315 Diet (g/100 g)
Ingredient Control Fish Soybean/Fish
Casein+ 20.0 (14.0) 20.0 (14.0) 20.00 (14.0)
Corn starch* 62.0 (71.1) 62.0 (71.1) 62.00 (71.1)
Cellulose* 5.0 (5.0) 5.0 (5.0) 5.0 (5.0)
Mineral mix AIN-93@ 3.5 (3.5) 3.5 (3.5) 3.5 (3.5) Vitamin mix AIN 93@ 1.0 (1.0) 1.0 (1.0) 1.0 (1.0) Choline bitartrate* 0.25 (0.25) 0.25 (0.25) 0.25 (0.25)
L-cystina* 0.3 (0.18) 0.3 (0.18) 0.3 (0.18)
Butylhydroquinone* 0014 (0.007) 0.014 (0.007) 0.014 (0.007)
Fish oil# 0 8.0 (5.0) 4.0 (2.5)
Soybean oil& 8.0 (5.0) 0 4.0 (2.5)
Table 2: Fatty acids composition of the experimental diets
Percentage of total fatty acids
Fatty acids (%) Control Fish Soybean/Fish
14:0 0.6 8.9 2.3
16:0 10.2 20.8 12.9
18:0 3.2 5.5 3.9
16:1 (w-7) 1.6 8.4 4.3
18:1 (w-9) 20.5 9.8 15.2
18:2 (w-6) 49.4 4.8 35.6
18:3 (w-3) 4.9 0.8 2.4
20:4 (w-6) Nd Nd Nd
20:5 (w-3) Nd 16.2 8.2
22:6 (w-3) Nd 14.9 6.4
Ni 9.6 9.9 8.8
Total SAFA 14.0 35.2 19.1
Total MUFA 22.1 18.2 19.5
Total PUFA 54.3 36.7 52.6
w-6 PUFA 49.4 4.8 35.6
w-3 PUFA 4.9 31.9 17.0
w-6:w-3 PUFA 10:1 1:6 2:1
Table 3: Values indicate body weight (g) before and after induction of colitis by DSS
Days
Before induction of colitis After induction of
colitis #
Groups 7 14 21 28 35 42 47
Control 129.83
± 3.13 167.49 ± 2.19 209.41 ± 3.50 244.96 ± 3.26 286.25 ± 2.58 265.82 ± 5.88 278.39 ± 7.81
Fish 140.70
± 5.05 172.33 ± 5.29 224.53 ± 8.07 264.47 ± 10.74 301.98 ± 4.14 290.36
± 9.04
*
311.69
± 5.84
*
Soybean/ Fish 129.57 ± 4.08 168.79 ± 3.84 210.01 ± 4.00 250.23 ± 4.57 289.88 ± 5.28 301.58
± 2.06
*
314.86
± 6.60
*
Table 4: Colon length (cm), inflammation score and corticosterone concentration (µg/100mL) in DSS-induced colitis rats fed control, fish or
soybean/fish diet.
Groups
Colon length Inflammation
Score Corticosterone
Control 14.26 ± 0.24 2.33 ± 0.33 14.57 ± 1.40
Fish 16.85 ± 0.30
*
1.83 ± 0.30 14.63 ± 1.11Soybean-Fish 17.21 ± 0.28
*
1.16 ± 0.16*
16.17 ± 0.89Table 5: IL-4, IL-10 and INF-y concentrations (ρg/mL), MPO activity (U/mg) in the
colon and DNA damage levels (tail moment/100 cells isolated from colon) of DSS-induced colitis rats fed Control, Fish or Soybean/Fish diet.
Groups IL-4 IL-10 INF-y MPO
DNA damage
Control ± 47.30 209.36 ± 33.36 310.01 ± 37.27 206.08 ± 0.23 0.84 ± 0.16 4.66
Fish ± 37.25 255.66 ± 57.14539.79
*
± 21.04 234.81 ± 0.09 0.60 ± 0.113.46*
Soybean-Fish ± 44.22 272.64
653.50 ± 61.69
*
285.15
± 43.35 ± 0.06* 0.21
2.94 ± 0.19
*
Figure 2: Histology (hematoxylin-eosin, magnification, x 200) of colonic samples taken from Wistar rats receiving 3% DSS for 7 days and water for 5 days. (A) Control group, fed control diet, showed ulceration of epithelial superficies (black arrow), intense inflammatory cellular infiltration (white arrow) and destruction of colonic architecture; (B) Fish group, fed fish diet, showed basal lamina edema and moderate cellular infiltrate (arrow); (C) Soybean/Fish group, fed soybean/fish diet showed light cellular infiltrate (arrow). The soybean/fish diet was more efficient than the fish diet in attenuating morphologic damage and preserving colonic architecture.
REFERENCES
1. Reed KL, Fruin AB, Gower AC, Gonzales KD, Stucchi AF, Andry CD, O’ Brien M, Becker JM. NF-КB activation precedes increases in mRNA encoding
neurokinin-1 receptor, proinflammatory cytokines, and adhesion molecules in dextran sulfate sodium-induced colitis in rats. Dig Dis Sci. 2005;50:2366-2378.
2. Sanchez-Muñoz F, Dominguez-Lopes A, Yamamoto-Furusho JK. Role of cytokines in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2008;14:4280-4288.
3. McGuckin MA, Eri R, Simms LA, Florin THJ, Radford-Smith G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflamm bowel Dis. 2009;15:100-113.
4. Ma X, Torbenson M, Hamad ARA, Soloski MJ, Li Z. High-fat diet modulates non-CD1d-restricted natural killer T cells and regulatory T cells in mouse colon and exacerbates experimental colitis. Clinical and Experimental Immunology. 2007;151:130-138.
5. Innis SM, Pinsk V, Jacobson K. Dietary lipids and intestinal inflammatory disease.
J Pediatr. 2006;149:S89-S96.
7. Hegazi RAF, Saad RS, Mady H, Matarese LE, O’ Keefe S, Kandil HM. Dietary fatty acids modulate chronic colitis, colitis-associated colon neoplasia and COX-2 expression in IL-10 Knockout mice. Nutrition. 2006; 22: 275-282.
8. Chapkin RS, Davidson LA, Weeks BR, Lupton JR, McMurray DN. Immunomodulatory effects of (n-3) fatty acids: Putative link to inflammation and colon cancer. J Nutr. 2007;137:200S-204S.
9. Roessner A, Kuester D, Malfertheiner P, Schneider-Stock. Oxidative stress in ulcerative colitis-associated carcinogenesis. Pathology - Research and Practices. 2008;204:511-524.
10. Ribeiro ML, Priolli DG, Miranda DC, Arçari DP, Pedrazzoli J, Martinez CAR. Analysis of oxidative DNA damage in patients with colorectal cancer. Clinical Colorectal Cancer. 2008;7:267-272.
11. Bancroft LK, Lupton JR, Davidson LA et al. Dietary fish oil reduces oxidative DNA damage in rat colonocytes. Free Rad Biol & Med. 2003;35:149-159.
12. Figler M, Gasztonyi B, Cseh J, Horváth G, Kisbenedek AG, Bokor S, Decsi. Association of n-3 and n-6 long-chain polyunsaturated fatty acids in plasma lipid classes with inflammatory bowel diseases. Brit J Nutr. 2007;97:1154-1161.
13. Hudert CA, Weylandt KH, Lu Y, Wang J, Hong S, Dignass A, Serhan CN, Kang JX. Transgenic mice rich in endogenous omega-3 fatty acids are protected from colitis. Proc Natl Acad Sci. 2006;103:11276-11281.
14. Tardieu D, Jaeg JP, Cadet J, Embvani E, Corpet, DE, Petit C. Dextran sulfate enhances the levels of na oxidative DNA damage biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2-deoxyguanosine, in rat colonic mucosa. Cancer Lett. 1998;134:1-5.
