IATF: DESAFIOS E SOLUÇÕES PARA MAXIMIZAR A EFICIÊNCIA DA TÉCNICA
Marques, M.O.1; Barreiros, T.R.R.2; Max, M.C.3; Silva, K.C.F.3; Gomes, R.G.3; Seneda, M.M.3 1Geraembryo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná. 2 Laboratório de Reprodução Animal – Universidade Estadual do Norte do Paraná. 3Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA-UEL, Londrina, PR
Resumo
Os aspectos práticos e operacionais para a realização de programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) desde o manejo e da estrutura física da propriedade, até os protocolos de sincronização e qualidade de sêmen utilizado são comentados para se obter a maximização da taxa de prenhez. Palavras-chave Bovinos, inseminação artificial, sincronização, IATF.
Introdução
Estima-se que o rebanho bovino brasileiro seja composto por mais de 200 milhões de animais (MAPA, 2006), em sua maioria (80%) por animais descentes ou puros da raça Nelore, constituindo o maior rebanho comercial do mundo. Entretanto, os índices produtivos são muito baixos em virtude da baixa eficiência reprodutiva dos rebanhos. A alta proporção de vacas em anestro, no início da estação de monta, é uma condição comum em vacas de corte Bos taurus indicus e afeta negativamente a eficiência reprodutiva, causando sérios prejuízos na pecuária
brasileira (BARUSELLI et al., 2004). A baixa produção de forragens, coincidente com períodos de alta exigência
nutricional, como o último trimestre da gestação e o início do período pós-parto, são alguns fatores relacionados ao anestro (DODE et al., 1989). Isto dificulta a obtenção de gestações nos primeiros 75 dias pós-parto, inviabilizando
um intervalo entre partos de 12 meses (SHORT et al., 1990).
O objetivo deste trabalho é discutir os principais aspectos práticos relacionados com a implantação e eficiência da IATF em bovinos.
IA convencional
A inseminação artificial (IA) apresenta como uma de suas principais vantagens o melhoramento genético dos rebanhos comerciais, promovendo melhor retorno econômico na pecuária. Entretanto, existem limitações nos programas convencionais de IA que resultam em taxas de serviço de 20 a 30% na primeira metade da estação monta (BARUSELLI et al., 2002). Dentre os fatores relacionados às baixas taxas de serviço e conseqüente redução da
eficiência reprodutiva, destacam-se as falhas de detecção de cio e o anestro pós-parto (BARUSELLI et al., 2004;
MARQUES et al., 2003a). Vários estudos demonstraram que as vacas da raça Nelore manifestaram estro
predominantemente no período noturno (30%) e com duração mais curta (11 horas) em relação a fêmeas Bos taurus
(PINHEIRO et al., 1998; MIZUTA, 2003). Diversas estratégias foram apresentadas na literatura para diminuir os
fatores relacionados ao anestro pós-parto, incluindo a manutenção da condição corporal no período pré-parto, protocolos de sincronização da ovulação e a remoção dos efeitos da amamentação (SHORT et al., 1990; YAVAS e
WALTHON, 2000).
Os protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) visam controlar o crescimento das ondas foliculares, regular a função do corpo lúteo e o momento da ovulação (MACMILLAN e BURKE, 1996). Atualmente no Brasil, empregam-se principalmente hormônios como os progestágenos, as prostaglandinas e seus análogos e o estradiol, além da gonadotrofina coriônica eqüina (eCG).
Organização de propriedades para implantação de programas de sincronização
A organização de propriedades para aplicação de programas de IATF deve atender a alguns requisitos básicos como manejo sanitário e nutricional adequados, infra-estrutura para fácil acesso aos currais e troncos, nitidez na identificação dos animais e principalmente funcionários responsáveis e qualificados para realização dos trabalhos. Foram realizados alguns experimentos com objetivo de analisar as taxas de concepção de acordo com algumas variáveis nas etapas dos protocolos de IATF.
O escore de condição corporal (ECC) é utilizado para mensurar as reservas energéticas de vacas de corte em diferentes fases do ciclo de produção. (SHORT et al., 1990). Os efeitos do escore de condição corporal sobre as taxas
de concepção na IATF de vacas durante no período pós-parto foram amplamente estudas. Baruselli et al., (2004)
obtiveram baixas taxas de concepção (< 50%) em animais com ECC≤3,0. Ainda neste mesmo estudo observou-se aumento da taxa de concepção com uso de eCG em animais com ECC entre 2,5 e 3,0. Recentemente Ayres et al.,
(2007) verificaram as interações do ECC e do período pós-parto sobre as taxas de concepção em 887 fêmeas submetidas a IATF. Estes autores observaram necessidade da aplicação de eCG em vacas com 30 a 59 dias pós-parto, independente da condição corporal (2< ECC >3,5).
ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)
Em um trabalho conduzido no município de Brasilândia-MS, com 2279 vacas Nelore lactantes, foram comparadas as taxas de perdas de dispositivos auriculares impregnados com Norgestomet (Tabela 1). Verificou-se a diferença de 7%, entre 3 técnicos responsáveis pela colocação dos implantes, demonstrando a importância de treinamento e seleção dos recursos humanos envolvidos nos serviços de sincronização para IATF.
A qualidade do sêmen congelado pode interferir sobremaneira na eficiência da taxa de concepção da IATF. Objetivando avaliar o efeito do sêmen nas taxas de concepção a IATF, Marques et al (2004) realizaram um experimento comparando as taxas de concepção de 585 vacas Nelore lactantes submetidas a IATF com três touros (Tabela 2). Observou-se neste estudo que a qualidade do sêmen pode comprometer as taxas de concepção, pois houve diferença de 13 a 25% nas taxas de concepção.
Outro aspecto avaliado foi a taxa de concepção em 434 vacas submetidas IATF de acordo com a partida de congelação do referido sêmen (tabela 3). Portanto, além da avaliação do sêmen prévia à IATF, deve-se contemplar a qualidade do sêmen de diferentes touros e partidas de congelação.
Em outro trabalho, foi avaliado o efeito do inseminador nas taxas de concepção de 2954 vacas Nelore lactantes, submetidas IATF na região de Brasilândia-MS (Tabela 4).
Considerações finais
A partir dos dados expostos podemos considerar que a assistência profissional, a infra-estrutura e o manejo da propriedade adequados são pontos cruciais para a eficiência dos protocolos de IATF. Assim, apenas com a correta realização de todos os passos, desde a formação dos lotes de vacas paridas até o diagnóstico de gestação, que esta biotécnica pode ser uma alternativa viável para encurtar o intervalo parto-concepção e incrementar a eficiência reprodutiva na propriedade.
References
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improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates. Animal Reproduction Science. v.82, p.479–486, 2004.
BARUSELLI, P.S.; MARQUES, M.O.; CARVALHO, N.A.T.; MADUREIRA, E.H.; CAMPOS FILHO, E.P. Efeito de diferentes protocolos de inseminação artificial em tempo fixo na eficiência reprodutiva de vacas de corte lactantes. Revista Brasileira de Reprodução Animal. v. 26, p. 218-221, 2002.
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MACMILLAN,K.L.; BURKE,C.R. Effects of oestrous control on reproductive efficiency. Animal Reproduction Science. v.42, p.307-320, 1996.
MARQUES, M.O., REIS, E.L., CAMPOS FILHO, E.P., BARUSELLI, P.S. Efeitos da administração de eCG e de benzoato de estradiol para sincronização da ovulação em vacas zebu´1´nas no período pós-parto. In: Anais do 5º Simposio Internacional de Reproducción Animal, Córdoba, Argentina, p. 392, 2003. (resumo).
MIZUTA, K. Estudo comparativo dos aspectos comportamentais do estro e dos teores plasmáticos de LH, FSH, progesterona e estradiol que precedem a ovulação em fêmeas bovinas Nelore (Bos taurus taurus), Angus (Bos taurus taurus) e Nelore (Bos taurus taurus x Bos taurus taurus). 2003. 98f. Tese (Doutorado em Reprodução
Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 2003.
PINHEIRO,O.L.; BARROS, C.M.; FIGUEIREDO, R.A.; VALLE, E.R. DO; ENCARNAÇÃO, R.O.; PADOVANI, C.R. Estrus behavior and the to ovulation interval in Nelore cattle (Bos indicus) with natural estrus or estrus
induced with prostaglandin F2α or norgestomet and estradiol valerate. Theriogenology. v.49, p.667-681, 1998a. SHORT,R.E., BELLOWS,R.A.; STAIGMILLER,R.B., BERARDINELLI,J.G.; CUSTER,E.E. Physiological mechanisms controlling anestrous and infertility in postpartum beef cattle. Journal of Animal Science.v.68, p.799-806, 1990.
WILTBANK,M.C.; GÜMEN,A.; SARTORI,R. Physiological classification of anovulatory conditions in cattle. Theriogenology. v.57. p. 21-52, 2002.
YAVAS,Y.; WALTHON,J.S. Postpartum acyclicity in suckled beef cows: A review. Theriogenology. v.54, p.1-23, 2000a.
TIMED FIXED INSEMINATION: CHALLENGES AND SOLUTIONS TO IMPROVE
THE EFFICIENCY
Marques, M.O.1; Barreiros, T.R.R.2; Max, M.C.3; Silva, K.C.F.3; Gomes, R.G.3; Seneda, M.M.3 1 Geraembryo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná. 2 Laboratório de Reprodução Animal – Universidade Estadual do Norte do Paraná. 3Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA-UEL, Londrina, PR.
Abstract
The aim of this study was to consider practical and operational aspects for the correct implementation of programs of time fixed artificial insemination, emphasizing aspects such as organizational structure in the property and recently described pharmacological resources. Key-words Bovine, artificial insemination, fixed-time
Introduction
The Brazilian cattle herd has more than 200 million animals (MAPA, 2006), mainly (80%) from Nelore or crossed with this breed, being the largest commercial herd in the world. Meanwhile, the rates of production are low because of low results of reproductive efficiency.
The high proportion of cows in anoestrus at the beginning of the breeding season is a common condition in
Bos taurus indicus and it hardly affects the reproductive efficiency, causing serious losses in Brazilian herd
(BARUSELLI et al., 2004). The low production of pasture coincide with periods of high nutritional requirement, as
the last trimester of pregnancy and the beginning of the postpartum period, making conditions to anoestrus (DODE
et al., 1989). This situation does not allow the obtainment of pregnancies in the first 75 days of postpartum, making
impossible an interval of 12 months between births (SHORT et al., 1990).
The purpose of this review is to discuss the main practical aspects related to implementation and efficiency of the TFAI in cattle.
Conventional artificial insemination (AI)
The main advantages of artificial insemination (AI) are the genetic improvement of commercial livestock, promoting better economic results. However, there are limitations in conventional AI programs that result in conception rates from 20 to 30% in the first half of the breeding season (BARUSELLI et al., 2002). Among the factors related
to low conception we should emphasize estrus detection at postpartum (BARUSELLI et al., 2004; MARQUES et al., 2003a). Several studies have shown that Nelore cows expressed estrus predominantly at night (30%) and with
shorter duration (11 hours) regarding females Bos taurus (PINHEIRO et al., 1998; MIZUTA, 2003). Several strategies
have been reported in the literature to reduce factors related to postpartum anoestrus, including the maintenance of body condition in the pre-partum, protocols for synchronization of ovulation and removal of breast feeding effects (SHORT et al., 1990; YAVAS and WALTHON, 2000). Protocols of fixed time artificial insemination tend to control
the growth of follicular waves, regulate the corpus luteum function and the time of ovulation (MACMILLAN and BURKE, 1996). Currently in Brazil, the mainly hormones used are progesterone, prostaglandins and its analogues and estradiol, in addition to the equine chorionic gonadotropin (eCG).
Organization of properties to implement synchronization programs
Organization of farms for using FTAI programs needs some basic requirements such as adequate health and nutritional management, appropriate facilities, accuracy on animal identification and, very important, good employees. Some experiments have been conducted with the aim of analyzing the pregnancy rates according to some variables in the steps of the FTAI protocols.
The body condition score (BCS) is used to measure the energy reserves of beef cows in different stages of production (SHORT et al., 1990). The effects of body condition score on the pregnancy rates in FTAI of cows during
the post-partum period were extensively studied. Baruselli et al., (2004) obtained low pregnancy rates (< 50%) in
animals with BCS£3.0. This same study noted an increase in the pregnancy rate using eCG in animals with BCS between 2.5 and 3.0. Recently Ayres et al., (2007) found the interactions of BCS and the post-partum period on
pregnancy rates in 887 cows submitted to IATF. These authors observed that the eCG application is needed in cows with 30 to 59 days post-partum, independent of body condition score (2<ECC>3.5).
In a work conducted in the city of Brasilandia-MS with 2279 lactating Nelore cows, there were compared the rates of losses of ear implant impregnated with Norgestomet (Table 1). There was a difference of 7%, demonstrating the importance of well prepared employees in FTAI services.
The quality of frozen semen may highly interfere with the efficiency of biotechnologies as the FTAI. Aiming to evaluate the effect of semen on the FTAI pregnancy rates, Marques et al (2004) conducted a study comparing the pregnancy rates 585 lactating Nelore cows submitted to FTAI with three bulls (Table 2). It was observed in this study that the quality of semen may compromise the pregnancy rates, because there was a difference of 13 to 25%.
Other evaluated aspects were the conception rates of 434 cows that were submitted to IATF with different sets frozen of semen from the same bull (Table 3). Therefore, besides the previous semen evaluation, the IATF must contemplate the semen quality not only of different bulls, but different sets as well.
In another experiment it was analyzed the effect of the inseminator on the conception rates of 2954 Nellore lactating cows, submitted to FTAI in the region of Brasilândia, Mato Grosso do Sul (Table 4).
:
Final Considerations
With the data exposed above it is necessary to consider the assistance of an expert technician, appropriate facilities and good management requirements for the adoption and effective use of FTAI. This biotechnology is largely presented as a feasible alternative to increase the conception rates in the first half of the breeding season and consequently raise the reproductive efficiency.
References
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induced with prostaglandin F2α or norgestomet and estradiol valerate. Theriogenology. v.49, p.667-681, 1998a. SHORT,R.E., BELLOWS,R.A.; STAIGMILLER,R.B., BERARDINELLI,J.G.; CUSTER,E.E. Physiological mechanisms controlling anestrous and infertility in postpartum beef cattle. Journal of Animal Science.v.68, p.799-806, 1990.
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www.ufrgs.br/favet/revista
“PRINCIPAIS ESTRATÉGIAS PARA O INCREMENTO DA TE EM BOVINOS”
Marques, M.O.1; Silva, K.C.F.2; Max, M.C.2; Gomes, R.G.2; Seneda, M.M.2
1Geraembyo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná; 2Laboratório de Reprodução Animal, DCV-CCA-UEL, Londrina, Paraná
Resumo
A biotecnologia de transferência de embriões é uma importante ferramenta para acelerar o melhoramento genético em rebanhos de alto valor. Entretanto, alguns aspectos devem ser avaliados para que esta biotécnica ofereça seus melhores resultados. Dentre os fatores que podem interferir em um programa de transferência de embriões podemos citar a nutrição e mineralização dos animais, a sanidade do rebanho, o manejo dos animais (prenhes, vazias, em sincronização, transferidas, feto sexado, paridas, descarte), a estrutura e organização da propriedade e a mão de obra envolvida no trabalho. É importante também realizar uma avaliação precisa das doadoras e receptoras, previamente aos programas de sincronização para transferência de embriões, atentando-se para a condição corporal, sanidade, habilidade materna, status ovariano e uterino, além da exclusão de fêmeas com patologias reprodutivas. Palavras-chave Bovinos, embriões, sincronização, tempo fixo
Introdução
Cerca de 110.000 embriões bovinos foram transferidos no Brasil durante o ano de 2002, sendo este número uma quantidade muito superior à realizada em outros países neste mesmo período. Sendo assim este dado demonstra a importância da transferência de embriões no cenário das biotecnologias aplicadas à pecuária nacional. No entanto, inúmeros fatores poderão interferir na transferência de embriões, com destaque especial as receptoras. Desta forma, o incremento das taxas de aproveitamento e de concepção das receptoras é fundamental para maximizar a taxa de prenhez e, com isso, elevar o retorno econômico da transferência de embriões, determinando um maior número de bezerros nascidos e redução dos gastos com fêmeas não gestantes no rebanho.
Estratégias para incremento na eficiência da tecnologia de embriões
Um dos principais aspectos negativos dos programas comerciais de transferência de embriões continua sendo a grande variabilidade de resposta das doadoras de embriões ao tratamento superovulatório com gondotrofinas (Barros & Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006). Devido a isto, a superovulação de doadoras
bovinas tem sido amplamente estudada visando desenvolver protocolos que melhorem a produção de embriões e facilitem o manejo dos animais (Barros & Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006).
A detecção de estro também é um outro fator que pode prejudicar o sucesso dos programas de transferência de embriões em virtude da curta duração do mesmo e sua elevada ocorrência em períodos noturnos no caso dos zebuínos (Bó et al., 2003; Baruselli et al., 2006). Através do controle farmacológico do
ciclo estral é possível manipular o desenvolvimento folicular objetivando-se minimizar os efeitos descritos anteriormente além de melhorar os programas de superovulação e transferência de embriões bovinos. Desta forma ocorrerá uma sincronia da ovulação entre as doadoras permitindo que a inseminação seja realizada em tempo fixo (IATF) sem a necessidade da detecção do estro (Barros & Nogueira, 2001; Nogueira et al., 2002;
Baruselli et al., 2006).
Em razão da interferência do folículo dominante no início do tratamento superovulatório, algumas estratégias foram desenvolvidas, como por exemplo, começar a superovulação com FSH no primeiro dia do ciclo estral (Stock et al., 1996), aspiração do folículo dominante ou todos os folículos acima de 5 mm de
diâmetro antes da superovulação com gonadotrofinas (Bergfelt et al., 1994) e sincronizar o início das ondas
foliculares com a utilização de um implante de progesterona e administração de estrógeno afim de promover a atresia folicular e emergência de uma nova onda (Bó et al., 1995, 2003; Barros et al., 2006).
Dentre as gonadotrofinas que são utilizadas para promover a superovulação nas doadoras, destacam-se a gonadotrofina coriônica eqüina (eCG ou PMSG) administrada isoladamente (Boland et al., 1978) ou ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)
associada a soro anti-PMSG (Alfuraiji et al., 1993) e o hormônio folículo estimulante (FSH) advindo de
extrato de pituitária de suínos, ovinos e equinos (Donaldson, 1989) ou ainda, FSH recombinante bovino (Wilson et al., 1993) e bST (Barros & Nogueira, 2001).
Alguns autores demonstraram que as taxas de aproveitamento são maiores em receptoras submetidas a protocolos de transferência de embriões em tempo fixo (TETF) do que naquelas tratadas com uma ou duas administrações de PGF2α e posterior detecção de cio. As taxas de concepção de tais protocolos são similares, no entanto, o resultado final é o aumento das taxas de prenhez nos programas de transferência de embriões em tempo fixo (TETF), além de proporcionar a vantagem de possibilitar a programação do dia da inovulação e de evitar o trabalho com a detecção de cio (Marques et al., 2004).
A seleção do programa mais adequado dependerá de outros fatores além dos fisiológicos como a eficiência na detecção de cios, destreza do veterinário na palpação retal e ultra-sonografia, disponibilidade financeira para os tratamentos hormonais, custo das doses de sêmen, disponibilidade de mão de obra qualificada, instalações disponíveis e, finalmente os objetivos do programa de melhoramento genético do estabelecimento (Bó et al., 2004).
“STRATEGIC TOOLS FOR IMPROVING EMBRYO TRANSFER IN CATTLE”
Marques, M.O.1; Silva, K.C.F.2; Max, M.C.2; Gomes, R.G.2; Seneda, M.M.2
1Geraembyo Reprodução Bovina, Cornélio Procópio, Paraná; 2Laboratório de Reprodução Animal,
DCV-CCA- UEL, Londrina, Paraná
Abstract
Biotechnology of embryo transfer is an important tool for increasing genetic improvement of livestock with high value. However, some aspects should be evaluated for achieving the best results. Considering factors capable to interfere on the embryo transfer program, we can mention the mineralization and appropriate nutrition of animals, health of herd, management of animals (pregnant, non pregnant, under synchronization, transferred, sexed fetuses, discard), structure and organization of farm, and workers.
It is also important to conduct an assessment of donor and recipient prior to the embryo transfer programs, according to body condition, health, maternal ability (mainly in receiving), uterine and ovarian status and diagnosis of reproductive diseases. Key words Cattle, embryo transfer, synchronization, fixed time
Introduction
About 110,000 cattle embryos were transferred in Brazil during 2002, an expressive amount, which is higher than many other countries in the same period. It is clear the importance of embryo industry on biotechnology scenario of Brazilian livestock. However, many factors may interfere in the embryo transfer program, with special emphasis on the recipients. Thus, increasing rates of conception in recipients is essential to maximize the pregnancy rate and thereby raise the economic return, determining a greater number of calves born and reduction of spending on non-pregnant females in the herd.
Improving the efficiency of embryos transfer technologies
A major negative aspect of commercial embryo transfer programs remains the great variability in superovulatory responses after gonadotropins treatments (Barros and Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006).
Because of that, donor superovulation has been widely studied to develop protocols for improving embryo production, as well as easier ways of animals handling (Barros and Nogueira, 2001; Baruselli et al., 2006).
Estrus detection is another important aspect on the success of embryo transfer programs, especially due to the short duration estrous period and its night occurrence in zebu cattle (Bó et al., 2003; Baruselli et al., 2006).
The estrus cycle control allows the manipulation of follicular development, aiming to minimize the effects described above, plus the improving of superovulation programs and embryo transfer in cattle. Synchronized ovulation will occur between donors submitted to fixed timed artificial insemination (FTAI) without estrus detection (Barros and Nogueira, 2001; Nogueira et al., 2002; Baruselli et al., 2006).
Due to the interference of the dominant follicle at the beginning of superovulatory treatment, some strategies have been developed, for example, beginning superovulation with FSH on the first day of the estrous cycle (Stock et al., 1996), aspiration of dominant follicle or all follicles greater than 5 mm before
superovulation (Bergfelt et al., 1994), and synchronize the beginning of follicular wave by using an implant
of progesterone and administration of estradiol to promote follicular atresia and emergence of a new wave (Bó et al., 1995, 2003; Barros et al., 2006).
Gonadotropins commonly used to promote superovulation are equine chorionic gonadotropin (eCG or PMSG) administered alone (Boland et al., 1978) or associated with serum anti-PMSG (Alfuraiji et al.,
1993), and follicle stimulating hormone (FSH) from pigs, sheep and horses (Donaldson, 1989) or, recombinant bovine FSH (Wilson et al., 1993) and bST (Barros and Nogueira, 2001).
Some authors have shown higher means of embryos per flushing when donors are submitted to protocols of embryo transfer in fixed time if compared with animals treated with one or two administrations of PGF2α
and subsequent detection of estrus. Conception rates of such protocols are similar, however, final result may
be considered better if we included aspects as programming day of embryo transfer and a much better organization of workers. (Marques et al., 2004).
Selecting the most appropriate program will depend on other factors like physiological beyond the efficiency in the estrus detection, Veterinarian ability on rectal palpation, financial funds available for hormone treatment, cost of doses of semen, availability of qualified workers, appropriate facilities and, finally, the objectives of the program of genetic improvement of the establishment (Bó et al., 2004).
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ATUALIDADES EM BIOTECNOLOGIA REPRODUTIVA EM CÃES
Lúcia Daniel Machado da Silva1*; Alexandre Rodrigues Silva2; Rita de Cássia Soares Cardoso3 ¹FAVET-UECE, ²FAVET-UFERSA, ³FAVET-UFPI, *autor para correspondência: Av. Paranjana, 1700 –
Campus do Itaperi - 60740-903, Fortaleza-CE, Brasil lucia.daniel.machado@hotmail.com
Resumo
As biotécnicas de reprodução são importantes não somente para preservar a biodiversidade, mas também para a pesquisa básica. Nos últimos anos, tem-se observado um crescente interesse em desenvolver e aplicar rotineiramente essas biotécnicas na criação de cães. Além disso, devido às similaridades filogenéticas existentes entre os canídeos domésticos e os selvagens, os estudos realizados nos primeiros têm servido como base para a aplicação de biotécnicas, visando a conservação de canídeos selvagens ameaçados de extinção. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo apresentar as principais biotécnicas utilizadas na reprodução de cães domésticos. O avanço no desenvolvimento dessas biotécnicas contribuirá não somente para o alavancamento da reprodução de cães, mas também para a aplicação dessas em canídeos selvagens. Palavras-chaves: cão, reprodução, biotécnicas, sêmen, espermatozóide, oócito.
Introdução
As biotécnicas de reprodução são importantes não somente para preservar a biodiversidade, mas também para a pesquisa básica. Apesar dos primeiros estudos acerca do uso de biotécnicas da reprodução terem sido realizados em cães ao final do século XVIII, a reprodução de pequenos animais passou por um grande vazio concernente ao desenvolvimento e à difusão de novas biotécnicas reprodutivas. Apenas nos últimos anos tem-se observado um crescente interesse em desenvolver e aplicar rotineiramente essas biotécnicas na criação de cães. Além disso, devido às similaridades filogenéticas existentes entre os canídeos domésticos e os selvagens, os estudos realizados nos primeiros têm servido como base para a aplicação de biotécnicas, visando a conservação de canídeos selvagens ameaçados de extinção. Nesse sentido, o presente trabalho tem por objetivo apresentar as principais biotécnicas utilizadas na reprodução de cães domésticos.
Tecnologia de sêmen
O sêmen é facilmente colhido de cães. No entanto, a presença de uma cadela em estro melhora a qualidade do ejaculado. Pode-se ainda congelar swabs impregnados de secreções vaginais de cadelas em estro (54) ou impregnados com o feromônio sintético metil-r-benzoato (43).
A eletroejaculação fica reservada à coleta daqueles cães que não permitem ser coletados por manipulação digital. A qualidade do ejaculado não difere da do colhido por manipulação vaginal (36).
O sêmen epididimário pode ser coletado de cães orquiectomizados, seguida de dissecação do epidídimo e da manutenção deste sob refrigeração a 4ºC por até 8 dias (76). Os espermatozóides podem também ser coletados de epidídimos mantidos em temperaturas entre 15 e 25ºC por até 20 h (14). A coleta pode ser realizada por meio da inserção de uma agulha fina no ducto deferente, seguida da injeção de soro fetal bovino, TCM 199 ou tampão Tris (57).
Espermatogônias de cães foram recuperadas por meio de dissociação enzimática e, posteriormente, transplantadas para camundongos severamente imunodeprimidos. A eficiência da técnica foi acompanhada por imunohistoquímica, que detectou a presença de células germinativas caninas em divisão nos camundongos receptores. Apesar das divisões e transformações celulares terem sido observadas, o desenvolvimento das espermatogônias até espermatozóides não foi ainda descrito (10).
A viabilidade do sêmen é prolongada através da refrigeração e da adição de diluentes, como o leite desnatado (9), a glicina-gema (9), o Tris-gema (60) e a água de coco in natura (19) ou na forma de pó (32). O sêmen refrigerado pode ser transportado em diferentes tipos de container e manter-se viável por um a cinco dias, desde que a temperatura seja mantida entre 4 e 5°C (12). A troca do meio diluidor promove a manutenção da viabilidade do sêmen canino por mais de 20 dias, visto que possibilita uma renovação de substrato energético para as células
Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s165-s178, 2008.
espermáticas (23). Além disso, a suplementação do tampão Tris com o açúcar frutose, ao invés da glicose, oferece melhor preservação da motilidade espermática por até 23 dias, sob refrigeração a 5 ºC (42).
Diversos diluentes são utilizados para a congelação do sêmen canino, como a lactose (48), o Tris (1), o Bes-lactose (64), o Triladyl (35), o Tes/Tris (3), Biociphos W482 (53), o Laiciphos 478 (53), o diluente comercializado pelo Cryogenetics Laboratory of New England - CLONE (61), o leite desnatado (46) e um
diluente à base de água de coco in natura (5) ou na forma de pó (4).
A gema de ovo de galinha é adicionada ao diluente, geralmente na proporção de 20% (51). Entretanto, sendo a gema de ovo de origem biológica, esta apresenta a possibilidade de transmissão de doenças. Por isto, foi sugerida a sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados, como os análogos do hidroxitolueno-butilado (15). Tem sido proposta a utilização apenas das lipoproteínas de baixa densidade presentes na gema de ovo, para a conservação do sêmen (69).
Crioprotetores como o glicerol (41), o dimetilsulfóxido (37), o metanol (26), o etileno-glicol (58) e a dimetil-formamida (38) já foram utilizados na congelação do sêmen canino. No entanto, o glicerol permanece como o crioprotetor mais empregado em concentrações que variam entre 2 e 8% (43).
As pastas Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA) ou Orvus ES (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA) são aditivos comerciais que contêm uma substância detergente, o dodecil-sulfato de sódio (SDS), que possibilita um aumento na resistência aos danos oriundos da congelação. Alguns autores sugerem que a adição isolada do princípio ativo SDS (0.25%) aos diluentes proporciona resultados similares àqueles obtidos com uso das pastas comerciais (40,46).
Para a congelação do sêmen, são utilizadas concentrações que variam de 10 x 106 (3,67) a 8 x 108 de
espermatozóides/mL (39). Já outros pesquisadores utilizam uma diluição fixa, com base no volume de sêmen a ser congelado, variando desde uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (4,5,51) até uma parte de sêmen para quatro partes de diluidor (12).
O método mais usual para a congelação do sêmen canino foi descrito em 1972 (1) O referido método serve como base para inúmeros estudos em que têm sido realizadas pequenas modificações.
A descongelação do sêmen é realizada de 37oC (121) a 75oC (37). A armazenagem do sêmen pode ser
realizada em pastilhas (24,64), tubos de alumínio de 5mL (24) ou, preferencialmente, em palhetas de 0,25mL (4) ou de 0.5mL (64). Existe ainda a possibilidade de manutenção do sêmen congelado/descongelado sob refrigeração a 4ºC por até três dias após a descongelação (70).
Inseminação artificial
Para a IA intra-vaginal (IAIV), pode-se utilizar uma sonda rígida (49) ou a sonda de Osíris® (53). Uma das
possíveis técnicas a serem utilizadas para a IA por via intra-uterina (IAIU) consiste no cateterismo transcervical (1). Para sua execução, são utilizadas bainhas plásticas acopladas ao catéter escandinavo, o qual é transpassado através da cérvice. A endoscopia vaginal é um método utilizado para a sondagem da cérvice na cadela (73). Para sua utilização é utilizado um endoscópio fibro-óptico rígido e um catéter urinário. A IAIU por laparotomia (65) foi desenvolvida no sentido de tentar contornar as dificuldades do cateterismo cervical. (54). A IAIU por laparoscopia, apesar de também ser uma técnica cirúrgica, tem caráter pouco invasivo e é de rápida execução. Os resultados obtidos após IAIU por laparoscopia, tanto com sêmen fresco (56), como com sêmen congelado (55) têm sido satisfatórios.
Inseminações bem sucedidas têm sido realizadas em cadelas, utilizando-se um grande número de espermatozóides, inseminações freqüentes ou ambos. Foi sugerido que 100 x 106 espermatozóides proporcionam
taxas de concepção e tamanho de ninhada aceitáveis (17).
Com relação à eficiência da IA, ambas as vias assemelham-se quando se trata de sêmen fresco, atingindo resultados similares àqueles descritos para a monta natural (50). Com sêmen refrigerado, geralmente têm sido obtidas taxas de concepção superiores a 70% (52). As taxas de concepção observadas após IA com sêmen congelado são inferiores às obtidas com sêmen fresco (28).
Controle do ciclo estral
Dentre os diferentes protocolos utilizados para esse propósito, podem ser citados: administração intravenosa de GnRH(6); FSH ou eCG para indução do desenvolvimento folicular e manifestação do proestro (74); FSH ou eCG seguida de aplicação de LH ou hCG para promover a ovulação dos folículos desenvolvidos (74); administração
Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S. 2008. Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive
de estrógenos (7) ou da gonadotrofina da menopausa humana (hMG - 72) para sensibilizar o eixo hipotalâmico-hipofisário, previamente à administração das drogas já citadas.
O protocolo mais eficiente e que apresenta maior segurança para a vida reprodutiva da cadela consiste na administração de drogas anti-prolactínicas, como a bromocriptina (77), a metergolina (62) e a cabergolina (25), as quais proporcionam um encurtamento no intervalo entre estros.
Estudos vêm sendo conduzidos no intuito de desenvolver protocolos de indução de estro em cadelas por meio da administração de agonistas do GnRH, tais como: a aplicação subcutânea de acetato de busserelina, cujos resultados não têm sido satisfatórios quando comparados àqueles obtidos com a cabergolina (47); e a colocação de implantes subcutâneos para a liberação contínua de lutrelina (8) ou de deslorelina (71), os quais têm proporcionado resultados promissores.
Manipulação de oócitos
Os ovários de cadelas podem ser coletados por ovariosalpingohisterectomia. Os procedimentos adotados para a recuperação dos oócitos, usualmente, são a aspiração, fatiamento do córtex ovariano e dissecação folicular (45). Esses oócitos podem ser imediatamente utilizados em procedimentos de fertilização in vitro (FIV), ou serem
submetidos à congelação a –18ºC (22). Oócitos caninos de boa qualidade apresentam pigmentação escura e citoplasma homogêneo, diâmetro superior a 100 µm, estando completamente circundado por duas ou mais camadas de células do cumullus (31).
Alguns autores sugerem o uso de uma digestão enzimática associada ao isolamento mecânico para a obtenção de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA - 11). Já foi também verificado que após o isolamento enzimático utilizando colagenase e DNAse, os FOPA caninos poderiam ser cultivados in vitro e os oócitos seriam capazes de
reiniciar suas divisões meióticas (2).
Oócitos caninos podem ser transportados por até 4 horas, em solução salina a 4°C, sem que os mesmos tenham sua capacidade de maturação comprometida, podendo chegar ao estágio de metáfase II (63).
Cultivo e maturação in vitro de oócitos
A maturação e fertilização oocitária na espécie canina são únicas entre todos os mamíferos. A cadela ovula naturalmente um oócito imaturo em estágio de vesícula germinativa, necessitando de cerca de 48 horas para concluir sua maturação (52). O tempo de cultivo reportado para a MIV de oócitos caninos varia enormemente (acima de 120 h), mas os resultados de completa maturação são ainda controversos e insatisfatórios. Assim, a avaliação da retomada da meiose assume grande importância para avaliar a progressão da maturação nuclear ao longo de todo o tempo de cultivo (30). Meios suplementados com estradiol, progesterona, FSH, LH, eCG, L-cisteína e ácido araquidônico já foram utilizados, porém nenhum desses mostrou um efeito positivo significativo sobre as taxas maturação de oócitos caninos quando comparados aos grupos controles (18). Por outro lado, foi demonstrado que o uso de FSH recombinante melhora significativamente as taxas de MIV (18). O meio TCM-199 adicionado de BSA e somatotrofina humana possibilita a retomada da meiose em oócitos caninos até o estágio de metáfase II (78).
Alguns fatores como a idade da doadora, o tamanho do oócito e a morfologia nuclear e das células do cumulus influenciam as taxas de sucesso na MIV (21). O tamanho do folículo do qual o oócito foi recuperado pode também influenciar diretamente a MIV (59). Por outro lado, a MIV de oócitos caninos não sofre influência do status reprodutivo in vivo da fêmea (45). Já foi também demonstrado que o uso de células do oviduto, ou ainda
de um ambiente sintético de composição similar ao do fluido produzido por estas células, com altas concentrações de proteínas, poderia melhorar as taxas de MIV (10). A superovulação tem sido estudada em cadelas no sentido de optimizar a recuperação oocitária. Entretanto, tanto os protocolos de MIV, quanto os de superovulação têm sido pouco eficientes (18).
Produção in vitro de embriões
A produção in vitro de embriões (PIV) e transferência de embriões (TE) são as mais poderosas ferramentas
atualmente disponíveis para estudar a fertilização e preservar o material genético de espécies raras, bem como valiosas (29).
Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S. 2008. Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive
Oócitos caninos podem retomar a meiose espontaneamente in vitro, utilizando-se adaptações das técnicas
de maturação in vitro (MIV) para bovinos e suínos, embora em uma taxa e eficiência mais baixa do que outras
espécies (30). Dessa forma, o uso da FIV na espécie canina ainda não foi de grande sucesso (16).
Para a FIV, após a obtenção dos oócitos, os mesmos são cultivados, objetivando a MIV, por um período que varia de 24 a 72 horas. Paralelamente, os espermatozóides são diluídos em um meio de capacitação, geralmente o meio de capacitação canina (CCM). É realizada então a incubação de espermatozóides e oócitos por aproximadamente 12h em estufa de CO2 e, posteriormente, os complexos cúmulos-oócitos (COCs) são transferidos para um meio fresco, avaliados e somente os de boa qualidade são transferidos para as receptoras (13).
O primeiro sucesso na FIV na espécie canina foi relatado em 1991 (44), em que foi observado o desenvolvimento até mórula. Embriões de oito células 72 horas após a inseminação foram obtidos, embora ainda em uma taxa de 4,8% (75). Posteriormente, foi conseguido desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto. Da mesma forma que o trabalho anterior, ainda em uma baixa eficiência (0,5%).
O resultado mais surpreendente foi o obtido em 2001, em que os autores conseguiram uma gestação após FIV de oócitos caninos (13). Em ultra-sonografia realizada aos 20 dias após a TE, foram observados três conceptos. Entretanto, dois dias após, os mesmos não foram mais observados, tendo sofrido reabsorção.
Injeção intracitoplasmática de espermatozóide
A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) consiste na injeção de um espermatozóide dentro do citoplasma de um oócito maduro. A fertilização terá sucesso quando o DNA espermático estiver intacto e em uma forma condensada e estável. Este procedimento é útil não só em casos de espermatozóides imóveis, mas também para espermatozóides epididimários de animais que tenham que ser submetidos a uma orquiectomia e sejam de raro valor (21).
Em um experimento de ICSI na espécie canina foram utilizados 82 oócitos, os quais foram submetidos à injeção de espermatozóides caninos refrigerados. Dentre os oócitos, apenas seis (7,8%) atingiram a formação dos pró-núcleos, o que foi considerado como um indicativo do sucesso na fertilização. Entretanto, nenhuma gestação foi obtida (20).
Transferência de embriões
Em 1989, foi realizada a transferência de embriões caninos produzidos in vivo no estágio de mórula para
uma cadela receptora, resultando no nascimento de dois filhotes (66). Em 2001, esses mesmos autores demonstraram que podem ser alcançadas gestações em cadelas, a partir da TE produzidos in vivo, desde o estágio de oito células
até blastocisto, coletados por ovariohisterectomia ou por lavagem uterina (68). Em adição, conforme citado no tópico referente à FIV, já foi descrito na espécie canina a ocorrência de gestação a partir da transferência de embriões produzidos in vitro, a qual, no entanto, não resultou em nascimento (13).
Xenotransplante
Os protocolos de xenotransplante envolvem a coleta do córtex ovariano de um indivíduo seguido de um posterior transplante para um indivíduo de uma espécie totalmente diferente (18).
O transplante de tecido ovariano canino para a cápsula renal de camundongos inférteis severamente imunodeprimidos já foi realizado. Tais camundongos foram submetidos à necropsia após 56 dias, quando se confirmou que estava acontecendo o desenvolvimento folicular, porém não foi visualizada a formação de antro (33).
Clonagem
Em 2005, foi descrito o primeiro sucesso na clonagem de cães (27). Segundo os autores, foram utilizados como carioplastos, os fibroblastos oriundos da orelha de um cão macho da raça Afghanhound. Além disso, foi realizada a coleta de oócitos maturados in vivo, no estágio de metáfase II, 72h após a ovulação, através da técnica
de lavagem dos ovidutos. Esses oócitos foram enucleados e, em seguida, fundidos e ativados com os núcleos
Silva L.D.M., Silva A.R. & Cardoso R.C.S. 2008. Atualidades em biotecnologia reprodutiva em cães. Update in reproductive
oriundos dos fibroblastos. Um total de 1.093 embriões reconstituídos foram transferidos para 123 cadelas receptoras. A partir desse procedimento, três gestações foram confirmadas por ultra-sonografia, entretanto apenas dois fetos vieram a termo. Um dos filhotes faleceu aos 22 dias após o nascimento, devido a problemas respiratórios. O segundo filhote nasceu por cesariana aos 60 dias de gestação e foi submetido à análise de DNA que confirmou que o mesmo consistia no primeiro clone canino da história.
A clonagem por transferência nuclear interespécies surge como uma alternativa para aquelas espécies onde os sistemas de produção embrionária in vitro são ainda deficiente, como nos cães. Assim, foi demonstrado ser
possível o desenvolvimendo de embriões reconstituídos a partir de oócitos bovinos enucleados fundidos com material genético oriundo de células do cumulus de cadelas, até a fase de blastocisto, mas a ocorrência de gestação através desse procedimento não foi ainda descrita (34).
Considerações finais
Após a revisão de diversas biotécnicas existentes para auxílio à reprodução de cães, observa-se que há uma discrepância entre os graus de evolução de umas comparadas a outras. As biotécnicas de tecnologia de sêmen e IA estão mais avançadas do que as demais. O que se espera é que à medida que o interesse na reprodução de cães aumente, o desenvolvimento e aperfeiçoamento das diferentes biotécnicas cresçam junto. O avanço no desenvolvimento dessas biotécnicas contribuirá não somente para o alavancamento da reprodução de cães, mas também para a aplicação dessas biotécnicas reprodutivas para canídeos selvagens.
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UPDATE IN REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY IN DOG
Lúcia Daniel Machado da Silva1*; Alexandre Rodrigues Silva2; Rita de Cássia Soares Cardoso3 ¹FAVET-UECE, ²FAVET-UFERSA, ³FAVET-UFPI, *autor para correspondência: Av. Paranjana, 1700 –
Campus do Itaperi - 60740-903, Fortaleza-CE, Brasil lucia.daniel.machado@hotmail.com
Abstract
Reproductive biotechniques are important for biodiversity preservation and for basic research. The interest for development and application of such biotechniques in dog breeding is steadily increasing and filogenetic similarities enable extrapolation of studies in domestic canidae to wild canidae at risk of extinction, for conservation purposes. This work provides an overview of the main biotechniques employed in domestic dog reproduction. The advances in the development of such biotechniques will contribute to improve dog reproduction and for their application in wild canidae. Keywords: dogs, reproduction, biotechniques, semen, sperm cell, oocyte.
Introduction
Reproduction biotechniques are important for biodiversity preservation and for basic research. Although the first studies on the use of these biotechniques in dogs date from the late XVIIIth century, small animal reproduction has not seen much development since. Only in recent years has the development and routine application of such biotechniques in dog breeding gained attention. Filogenetic similarities enable extrapolation of studies in domestic canidae to wild canidae at risk of extinction, for conservation purposes. This work provides an overview of the main biotechniques employed in domestic dog reproduction.
Semen technology
Semen collection is easily performed in dogs, but the presence of a female in estrus can improve the quality of the ejaculate. Frozen swabs impregnated with vaginal secretion from estrus females (54) or the synthetic pherhormone methyl-r-benzoate (43) can also be used.
Electroejaculation is restricted to collection of dogs that will not allow digital manipulation and has been compared to the employment of artificial vagina, with no differences concerning the quality of the ejaculate (36).
Epididymal sperm can be retrieved from dogs submitted to orchiectomy and dissection of the epididymus and stored at 4ºC for up to 8 days (76). Sperm cells can also be retrieved from epididymus and kept between 15 and 25ºC for up to 20h (14). Epididymal semen collection can be performed inserting a thin needle in the vas deferens and injecting fetal bovine serum, TCM 199 or Tris buffer for lavage of the epididymus tail and retrieval of sperm cells (57).
Spermatogoniae have been retrieved from dogs by enzymatic dissociation and transplanted into severely immunodrepressed mice. The efficacy of the technique was monitored immunohistochemically and the presence of canine germinative cell division was observed in the receptor mice. Despite observation of cell division and transformation, the development of espermatogoniae into sperm cells has not been described to date (10).
When semen is collected for posterior use, sperm viability can be improved by cooling and adding extenders such as skimmed milk (9), egg yolk glycine (9), egg yolk Tris (60) and coconut water, both in natura (19) and in powder (32). Cooled semen can be transported in different types of containers and is viable for one to five days, as long as temperature is kept between 4 and 5°C (12). Changing the extender promotes viability of canine semen for another 20 days, once the energetic substrate available for the sperm cells is renewed (23). Also, supplementation of the Tris buffer with fructose instead of glucose improves preservation of sperm cell motility for up to 23 days under 5 ºC (42).
Several extenders can be used for canine semen freezing, such as lactose (48), Tris (1), Bes-lactose (64), Triladyl (35), Tes/Tris (3), Biociphos W482 (53), Laiciphos 478 (53), the Cryogenetics Laboratory of New England extender- CLONE (61), skimmed milk (46) and a coconut water extender, in natura (5) or in powder (4). However, the Tris buffer remains the most commonly used extender by most research groups, with excellent in vitro and in vivo results (120).
Egg yolk is added to the extender usually at 20% (51) but is at risk of disease transmission because of its biological origin. Thus, replacement by other synthetic and purified lipids like the hydroxytoluene butilate analogues (15) has been suggested. The use only of the low density lipoproteins in the egg yolk for semen conservation has been proposed (69).
Cryoprotectors such as glycerol (41), dimethylsulfoxide (37), methanol (26), ethyleneglycol (58) and dimethylformamide (38) have been employed in canine semen freezing procedures, but glycerol still is the most commonly used, in concentrations between 2 and 8%.
The Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA - 93) and the Orvus ES (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA - 67) pastes are commercial additives containing a detergent substance (sodium
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