José Ricardo de Figueiredo; Maria Helena Tavares de Matos; Juliana Jales de Hollanda Celestino; Jamily Bezerra Bruno
Faculty of Veterinary Medicine, LAMOFOPA, PPGCV, State University of Ceara, Fortaleza-CE, Brazil *Endereço para correspondência: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Laboratório de Manipulação de Oócitos e
Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi., Fortaleza-CE-Brasil. 60740-000, Tel.:+55.85.3101.9852; Fax:+55.85.3101.9840, jrfig@pesquisador.cnpq.br
Resumo
A biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA), também conhecida como ovário artificial, visa criar in vitro as condições necessárias para que pequenos oócitos inclusos em folículos pré-antrais recuperados dos ovários possam sobreviver, crescer, maturar e posteriormente serem fecundados in vitro, reduzindo-se o processo de atresia que ocorre intensamente nos ovários. Esta revisão destaca a importância e o estado atual da MOIFOPA, além de abordar os principais hormônios e fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais. Palavras chave: MOIFOPA, cultivo in vitro, hormônios, fatores de crescimento.
Introdução
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva dos rebanhos. Neste sentido, especialmente no tocante a ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial (IA), a fecundação in vitro (FIV) e a transferência de embriões (TE) vêm sendo utilizadas com sucesso. Outras biotécnicas estão em fase de desenvolvimento e atualmente são objetos de intensas pesquisas. Nesse grupo, pode-se incluir a clonagem e a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA).
A MOIFOPA visa à recuperação de um grande número de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (FOPA) e o posterior cultivo in vitro destes oócitos até sua completa maturação, evitando a grande morte folicular que ocorre naturalmente in vivo. Tal biotécnica é uma alternativa para o fornecimento de milhares de oócitos normais para as biotécnicas de FIV e clonagem, contribuindo assim para a produção in vitro de embriões em larga escala.
Nesse sentido esta revisão fará uma breve abordagem sobre a importância e o estado atual da MOIFOPA, enfatizando os principais hormônios e fatores de crescimento envolvidos no desenvolvimento in vitro de FOPA.
Etapas da MOIFOPA
A MOIFOPA é uma biotécnica que consiste 1) no isolamento ou resgate de FOPA a partir de ovários, 2) na conservação visando a estocagem por um curto (resfriamento) ou longo (congelação) período e 3) no cultivo folicular tendo como finalidade promover o crescimento, maturação e FIV dos oócitos oriundos de FOPA, proporcionando a produção de embriões em larga escala. Vale ressaltar que as etapas de isolamento e conservação já estão bem estabelecidas (Figueiredo et al., 2008), sendo o cultivo in vitro de FOPA o maior entrave para o desenvolvimento da biotécnica de MOIFOPA.
Importância da MOIFOPA
1- Pesquisa fundamental ou básica, possibilitando o estudo do efeito in vitro de diferentes substâncias sobre os FOPA, visando elucidar os mecanismos envolvidos na regulação da foliculogênese inicial, que ainda é pouco compreendida;
2- Indústria farmacêutica, testando in vitro a ação de fármacos sobre os folículos antes do seu emprego em experimentos envolvendo seres humanos e animais;
3- Formação de bancos genéticos (germoplasma), por meio da conservação de oócitos inclusos em FOPA oriundos de animais de interesse zootécnico ou em via de extinção;
4- Reprodução humana assistida, preservando a fertilidade feminina nos casos de mulheres que se submeterão a tratamentos de radio ou quimioterapias (casos de câncer) e que necessitam ter seus ovários previamente removidos e congelados para posterior autotransplante ou cultivo in vitro;
5- Multiplicação de animais, pois no futuro, possibilitará a produção in vitro de embriões em larga escala a partir de oócitos inclusos em FOPA, recuperados de ovários inteiros ou de fragmentos ovarianos (biopsia);
6- Bem-estar animal, pois a MOIFOPA contribuirá para a redução do estresse em animais, representando uma alternativa aos procedimentos de superovulação e punção de oócitos por ultrassonografia, bem como o uso de animais em experimentos.
Acta Scientiae Veterinariae 36(Supl. 2): s231-s238, 2008.
ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)
Importância de hormônios e fatores de crescimento no desenvolvimento in vitro de FOPA
Diferentes sistemas de cultivo in vitro têm sido desenvolvidos visando estudar os hormônios e fatores de crescimento que controlam a foliculogênese, bem como promover o crescimento folicular e a maturação oocitária associado com a multiplicação e diferenciação das células da granulosa (Hartshorne, 1997). Dentre os hormônios e fatores, podemos destacar: hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), estradiol, fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9), fator de crescimento fibroblástico-2 (FGF-2), fatores de crescimento semelhantes à insulina-1 e 2 (IGFs 1 e 2), fator de crescimento epidermal (EGF), kit ligand (KL), proteínas morfogenéticas ósseas-7 e 15 (BMPs 7 e 15) e fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF).
Dentre as gonadotrofinas, o FSH é conhecido por regular a produção de alguns fatores de crescimento, tais como KL e BMP-15, que desempenham um importante papel na ativação de folículos primordiais e posterior crescimento folicular in vitro (Thomas et al., 2005). Alguns autores mostraram que o FSH estimula a proliferação de CG em suínos (Hirao et al., 1994), mantém a integridade morfológica (Matos et al., 2007a) e promove o crescimento (Silva et al., 2004a) de FOPA caprinos, além de inibir a apoptose de FOPA cultivados in vitro (Mao et al., 2002). Em relação ao LH, muito pouco é conhecido sobre seu efeito no crescimento de FOPA, entretanto, experimentos realizados por Wu et al. (2000) indicaram que, em camundongas, o LH é necessário para o desenvolvimento in vitro de FOPA para o estádio antral. No caso do estradiol, alguns estudos in vitro demonstraram que este hormônio esteróide pode atuar na inibição da apoptose de células foliculares e luteais em suínos (Murdoch, 1998), além de promover o crescimento in vitro de FOPA isolados bovinos (Hulshof et al., 1995).
Com relação aos fatores de crescimento, o GDF-9 é um fator que estimula o crescimento de folículos primários, por meio da proliferação de células da granulosa e da teca, promovendo assim a transição folicular do estádio de primário para secundário (ratas: Nilson & Skinner, 2002, humanos: Hreinsson et al., 2002). Wang e Roy (2004) demonstraram que 10 ng/mL de GDF-9 influencia a expressão de KL e estimula o crescimento de folículos primordiais. Além disso, o GDF-9 em altas concentrações (200 ng/mL) aumenta a proporção de folículos secundários de hamster. Recentemente, Silva et al. (2004b) demonstraram que o GDF-9 e os seus receptores estão expressos em todos os tipos de folículos ovarianos na espécie caprina.
Um dos fatores que está envolvido como sinalizador parácrino no folículo é o FGF-2, que é um potente fator mitogênico, envolvido na diferenciação, migração celular e angiogênese em vários tecidos, incluindo o ovário (Baird et al., 1986; Gospodarowicz et al., 1986). O FGF-2 também se mostrou eficiente na ativação e crescimento de folículos primordiais e primários de ratas (Nilsson et al., 2001). Quando testado em caprinos, na concentração de 50 ng/mL promoveu um aumento significativo dos folículos em desenvolvimento e manutenção da viabilidade folicular durante 5 dias de cultivo (Matos et al., 2007b).
A adição de IGF-1 ao meio de cultivo in vitro de FOPA estimula o crescimento folicular em sinergia com o FSH (camundongos: Liu et al., 1998; humanos: Louhio et al., 2000; bovinos: Gutierrez et al., 2000; ratos: Zhao et al., 2001). Experimentos de Zhou e Zhang (2005) mostraram que o IGF-1, na concentração de 100 mg/L, promove o crescimento e mantém a viabilidade de oócitos inclusos em FOPA caprinos. Em suínos, a utilização de 50 ng/mL de IGF-1 resulta em crescimento folicular, aumento da proliferação de células da granulosa e prevenção de apoptose em FOPA. Além disso, em camundongos, o IGF-1, em diferentes concentrações (10, 50 e 100 ng/mL), aumenta a esteroidogênese de FOPA cultivados in vitro por 12 dias (Demeestere et al., 2004).
O EGF é outro importante fator que regula a fisiologia ovariana (Jewgenow, 1996), incluindo proliferação celular, diferenciação e esteroidogênese (Saha et al., 2000). Estudos in vitro mostraram que o EGF (10 ng/mL) adicionado ao meio de cultivo de FOPA suínos, inibiu a apoptose das células da granulosa e levou a um aumento da formação de antro (Mao et al., 2004). Já quando testado em caprinos, o EGF (50 ng/mL) mostrou um efeito estimulatório na viabilidade oócitária (Zhou & Zhang, 2005) e, na concentração de 100 ng/mL, um efeito benéfico no crescimento de oócitos de folículos primários (Silva et al., 2004a). Em ovinos, o EGF (100 ng/mL) promoveu a ativação de folículos primordiais e a manutenção da viabilidade por até 6 dias de cultivo (Andrade et al., 2005).
O KL, também conhecido como fator stem cell, e o seu receptor c-kit são importantes para a migração, proliferação e sobrevivência de células germinativas primordiais (Zama et al., 2005). Durante o cultivo in vitro, o KL estimula a ativação de folículos primordiais (Parrott & Skinner, 1999), o crescimento e a sobrevivência oocitária (Jin et al., 2005), a proliferação das células da granulosa (Otsuka & Shimasaki, 2002), a manutenção da competência meiótica (Ismail et al., 1997), o recrutamento de células da teca e a regulação da esteroidogênese (Hutt et al., 2006). Estudos in vitro mostraram que a BMP-7 promove a ativação e o crescimento de folículos primordiais, bem como aumenta a expressão de receptores para FSH durante o cultivo de ovários de camundongos (Lee et al., 2004). Já com relação à BMP-15, alguns autores têm demonstrado que este fator de crescimento promove a proliferação das células da granulosa e estimula o desenvolvimento de folículos primordiais e primários em roedores (Vitt et al., 2000; Nilsson et al., 2002; Fortune, 2003).
O VEGF, que é um dos fatores responsáveis pela angiogênese folicular, atua estimulando a mitose de células endoteliais e aumenta a permeabilidade vascular (Redmer & Reynolds, 1996). Shin et al. (2006) demonstraram que a adição de VEGF ao meio de cultivo in vitro, na concentração de 50 ng/ mL, inibe a apoptose em células da granulosa. Já em bovinos, o VEGF (10 ng/mL) estimula a transição de folículos primários para folículos secundários após 10 dias de cultivo (Yang & Fortune, 2007).
Figueiredo J.R., Matos M.H.T., Celestino J.J.H. & Bruno J.B. 2008. Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais...
Estado atual da MOIFOPA
Estudos in vitro têm mostrado resultados bastante satisfatórios com animais de laboratório. Eppig and O’Brien (1996) obtiveram o nascimento de um camundongo a partir de folículos primordiais crescidos, maturados e fecundados in vitro. Mais recentemente, esta mesma equipe aperfeiçoando o protocolo utilizado anteriormente, relatou a produção de embriões e o nascimento de 59 camundongos saudáveis a partir do cultivo in vitro de FOPA, seguido de maturação e FIV (O’Brien et al., 2003). Com relação às espécies domésticas, os resultados mais satisfatórios foram obtidos com suínos (Wu & Tian, 2007) e búfalos (Gupta et al., 2008), em que se alcançou a produção de embriões após cultivo in vitro de folículos secundários. No caso das outras espécies mamíferas, como por exemplo, ovinos, bovinos e caprinos, foi obtida a formação de antro a partir de folículos secundários isolados e cultivados in vitro (Cecconi et al., 1999; Gutierrez et al., 2000; Huamin & Yong, 2000). Nesse sentido, diversas pesquisas têm sido realizadas com essas espécies priorizando o desenvolvimento de meios de cultivo eficientes que promovam a maturação de milhares de oócitos oriundos dos FOPA, o que possibilitaria a produção de embriões em larga escala.
Considerações finais e perspectivas
As fortes evidências do envolvimento de hormônios e fatores de crescimento no controle da foliculogênese inicial em diferentes espécies, demonstradas neste trabalho, abrem novas possibilidades para a realização de vários estudos. Desta forma, sistemas de cultivo in vitro podem ser desenvolvidos visando à otimização do crescimento folicular e posterior produção de oócitos maturos a partir de FOPA, contribuindo assim para a produção in vitro de embriões.
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