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Contribuição da terapia celular com células tronco em fibrose em ratos

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RENATO GONÇALVES FELIX

Contribuição da terapia celular com células

tronco em fibrose pulmonar em ratos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia Médica da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista para a obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profª Dra. Elenice Deffune

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE

Felix, Renato Gonçalves.

Contribuição da terapia celular com células-tronco em fibrose pulmonar em ratos / Renato Gonçalves Felix. – Botucatu : [s.n], 2013

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu

Orientador: Elenice Deffune

Coorientador: João Tadeu Ribeiro Paes Capes: 90400003

1. Pulmões – Doenças - Tratamento. 2. Células-tronco. 3. . Fibrose pulmonar.

Palavras-chave: Células-tronco mesenquimais; Fibrose pulmonar idiopática; Terapia celular.

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Agradeço a todos aqueles que apoiaram e somaram na realização

de mais este sonho em minha vida, em especial:

A Profª. Drª. Elenice Deffune por ter aceitado o desafio de

orientar meu trabalho e por ter tanto amor e paciência para

transferir seu conhecimento.

À minha mãe, Marlene Gonçalves Felix por todo amor e

carinho.

A Profª Drª Giesela Fleischer Ferrari pela compreensão ,

apoio e amizade.

A Profª Drª Maria Aparecida Custódio Domingues pelo 80

respeito , apoio e carinho para com nosso trabalho.

Ao Dr. Alexandre Fabro pela dedicação, competência e

especial carinho perante nosso trabalho.

A Drª Josy Campanhã Vicentini por todo o conhecimento e

lições transmitidas e, sobretudo, pela impressionante dedicação

demonstrada.

A Drª Michele Janegitz Acorci Valerio pelos ensinamentos

e dedicação marcante.

A Profª.Drª Rosana Rossi pelo respeito e admirável carinho

para comigo.

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A Sra. Ondina Silvia Cotrim por sua amizade, dedicação e

pronto apoio sempre que necessário.

Ao Sr. Cássio Cunha pela amizade, ajuda e companheirismo

durante esta jornada.

Ao Sr. Carlos Roberto Gonçalves Lima e Sr. Ednelson

Henrique Bianchi pela experiência, carinho, dedicação, amizade,

trabalho e paciência comigo.

As Senhoritas Mônica, Daniela e Natalia de Assis-SP

pelo carinho, companheirismo e lealdade demonstrados.

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LISTADEABREVIATURAS... 11 RESUMO... 13 ABSTRACT... 16 1.INTRODUÇÃO... 19 2.REVISÃODELITERATURA... 22 2.1.Patogenia... 23 2.2.Morfologia... 26 2.3.QuadroClínico... 26 2.4.Tratamento... 27 2.4.1.Terapiaantiinflamatória... 27 2.4.2.Terapiaantioxidante... 28 2.4.3.Terapiaantifibrótica... 28 2.4.4.Tratamentopaliativo... 29 2.4.5.OTransplantePulmonar... 29 2.5.Omodeloexperimental... 30 2.5.1.BleomicinaeInduçãodaFPI... 30 2.5.2.Célulastroncoeterapiacelular... 32 3.OBJETIVOS... 35

2.1Geral... 36

2.2Específicos... 36

4.MATERIAISEMÉTODOS... 37

4.1Animais... 38

4.2Induçãoexperimentaldefibrosepulmonar... 38

4.3Obtenção, processamento e caracterização de célulastronco mesenquimaisalogênicas,detecidoadiposo(CTMTA)... 38 5.GRUPOSDEESTUDO... 41 5.1Constituição... 42 5.2ComitêdeÉtica... 42 5.3Paramêtrosanalisados... 43 5.4Análisesmacroscópicasemicroscópicas... 43 6.ANÁLISESESTATÍSTICAS... 45 7.RESULTADOSEDISCUSSÃO... 47 7.1ObtençãodasCTMTAalogênica... 48 7.2VariaçãodePesodosanimais... 52 7.3VariaçãodeSaturação... 54

7.4 AnáliseMacroscópica... 55

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Cols ou et al - Colaboradores

FPI ou IPF - Fibrose Pulmonar Idiopática

CTA- Célula tronco adulta

CTM ou MSC - Célula tronco mesenquimal

TA – Tecido adiposo

DPI- Doença pulmonar intersticial

PINE- Pneumonia intersticial não especifica

PH- Pneumonia de hipersensibilidade

PIU – Pneumonia intersticial usual

TGF-B1- Transforming Growth Factor – Beta

TNF-Alfa- Tumor Necrosis Factor-Alfa

IP- Intraperitoneal

DMEM- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

SFB- Soro fetal bovino

SF- Soro fisiológico

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Felix,RG.Contribuiçãodaterapiacelularcomcélulastroncoemfibrosepulmonarem ratos [dissertação]. Botucatu: Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista;2013.90p.

A FPI é definida como um tipo de doença intersticial fibrosante crônica, de etiologia desconhecida,limitadaaospulmõesequeapresentapadrãohistológicodepneumonia intersticial usual. A prevalência da FPI é estimada em aproximadamente 20/100000 nos homens e 13/100000 nas mulheres, sendo que a média da idade quando do diagnóstico é de 67 anos e a sobrevida média é de 2 a 5 anos. Estimase cerca de 5 milhões de pessoas afetadas em todo o mundo. O tratamento clínico atual está associadoàmelhoraparcialetransitóriacomresultadosduvidososouinsatisfatórios. A abordagem cirúrgicada FPI compreende o transplante de pulmão e é raro em

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diferenciaçãoemtrêslinhagensdeorigemmesodérmica.Apósaexpansão,ocontrole por citometria de fluxo evidenciou 98% das células expressando CD90. Em D14, foi realizadoumpooldestasCTMqueforaminfundidasporviavenosa,emveiacaudalna concentração de 1X106 células/animal em um volume de 200μl de soro fisiológico. Nenhumareaçãoadversaouóbitofoiidentificadonomomentodainfusãoounos14 dias subsequentes. As análises histológicas foram realizadas por dois diferentes especialistasemestudoduplocego.Ainstilaçãointrataquealdebleomicinanadose de 1,5U/Kg de peso determinou FP em 100% dos animais sendo que 57,14% dos animaistiveramFPemgrauIV.Ainstilaçãodebleomicinaintratraquealcomprometeu oíndicedesaturaçãodosanimaiseanáliseshistológicasconfirmamopadrãodeFPI. Os parâmetros de ganho de peso, melhora no índice de saturação, recuperação macroscópica e microscópica do tecido pulmonar foram plenamente alcançados no grupotratadocomCTMTA.Concluímosquedopontodevistaclínicoehistológicoas CTMTA determinaram melhora clínica e histológica comprovadas em animais com fibrose pulmonar de diferentes graus devendo ser considerada como proposta terapêuticainovadora.

Palavraschave: célulastronco mesenquimais; fibrose pulmonar idiopática; terapia celular.

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Felix, RG.Contribution of cell therapy with stem cells in pulmonary fibrosis in rats [dissertation]. Botucatu: Faculty of Medicine, Universidade Estadual Paulista, 2013. 90p.

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within14days.Histologicalanalyzeswereperformedbytwodifferentexpertsdouble blindstudy.Intrataquealinstillationofbleomycinatadoseof1.5U/KgPFdetermined in100%ofanimalswhereasanimalshad57.14%ofPFingradeIV.Theinstillationof intratrachealbleomycincompromisedthesaturationindexofanimalsandhistological analyzes confirm the pattern of IPF. The parameters of weight gain, improved saturation index, recovery macroscopic and microscopic lung tissue were fully achievedinthegrouptreatedwithMSCTA.Itwasconcludedthatfromthestandpoint of clinical and histological MSCTA determined proven clinical and histological improvement in animals with pulmonary fibrosis of different degree and should be regardedasinnovativetherapeuticapproach.

Keywords:mesenchymalstemcells,idiopathicpulmonaryfibrosis,celltherapy.

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As doenças pulmonares intersticiais (DPI) são de difícil abordagem e representamumgrandedesafioparaopneumologista,tendoemvistaavariedadede patologias com quadros clínicos , aspectos radiológicos e apresentação histológica bastante diversificados sendo que para o correto diagnóstico há necessidade de equipemultidisciplinar(Baldi&CastroPereira,2012).

Com grande freqüênciao diagnóstico das DPI ocorre de modo tardio, seja em razãododesconhecimentoporpartedomédico,sejapelasalteraçõesclínicaspouco específicas ou ainda pela limitação de recursos locais, como a falta de aparelho de tomografia ou a impossibilidade de realização de exame de biópsia (Baldi & Castro Pereira,2012).

A semelhança na apresentação clínica entre as várias doenças deste grupo tambémdificultaeretardaodiagnósticoprecisodapatologiatrazendoconsequências quantoaotratamentocomoparasuaevolução(Antó,2001).

A raridade de algumas DPI também dificultam diagnóstico e tratamento até mesmoporpartedoespecialista,entretanto,umpequenonúmerodestaspatologias é mais recorrente , como é o caso da sarcoidose, da pneumonia intersticial não especifica (PINE), da pneumonia de hipersensibilidade (PH) e da fibrose pulmonar idiopática(FPI).(Xaubetetal,2004;Thomeeretal,2001).

A falta de tratamento clínico, cirúrgico ou farmacológico adequado e eficaz também é preocupante e desperta o interesse pelas pesquisas envolvendo DPI. O transplantepulmonar,consideradoaprincipalopçãodetratamento,aindaécercado de problemas de logística. Faltam de equipes capacitadas para a realização dos procedimentoseasobrevidadospacientestransplantadosaindaébaixaerelacionada comadenominadacurvadeaprendizagem(Baldi&CastroPereira,2012).

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terapêutica eficaz das DPI, especialmente da mais prevalente e importante delas: a FPI.

Visando propor uma opção terapêutica adequada para a fibrose pulmonar idiopática,realizouseumarevisãoapartirdeumapesquisaatualizadadosprincipais artigosrelacionadosaestapatologianasbasesdedadosdoPubMed,SciELOeLILACS, associadaarevisãodecapítulosdelivrospertinentesaotemaemliteraturaaceitae recomendada.

O mesmo modelo de revisão foi realizado também sobre a temática da utilizaçãodecélulastroncoeseusbenefíciosnareparaçãoeregeneraçãodetecidos, entre eles o pulmonar. Este trabalho de revisão teve como meta o embasamento teóricoparaserealizarexperimentocomobjetivodeanalisarumaopçãoterapêutica inovadoraquesejaeficaznotratamentodaFPI.

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2.RevisãodeLiteratura

A FPI é definida como um tipo de doença intersticial fibrosante crônica, de etiologia desconhecida limitada aos pulmões e que apresenta padrão histológico de pneumonia intersticial usual (Raghuet al, 2011). Nos países europeus é conhecida mais popularmente como alveolite fibrosante criptogênica (Collard & King, 2003;

AmericanThoracicSociety,2002).

AprevalênciadaFPIéestimadaemaproximadamente20/100000noshomense 13/100000nasmulheres,sendoqueamédiadaidadequandododiagnosticoéde67 anos(PereiraCAetal,2006)easobrevidamédiaéde2a5anos.Taldoençaafeta

cercade5milhõesdepessoasemtodoomundo(Meltzer&Noble,2008).

Existem ainda fatores de risco associados a FPI: refluxo gastro esofágico, diabetesmellitus,agentesinfecciososcomoovírusdahepatiteC,citomegalovíruse vírusEpsteinBarr,alémdeexposiçõesaopódemadeira,poeirademetais,poeirade rochas,areiaesílica(Raghuetal,2011;Taskar&Coultas,2006).

2.1.Patogenia

Apesar da etiologia da Fibrose pulmonar idiopática permanecer desconhecida, os conceitos sobre a patogenia da doença continuam a sofrer mudanças. A visão originalmente apresentada que indicava que a FPI era deflagrada por uma agressão nãoidentificadaquegeravaumprocessoinflamatóriocrônicoqueresultavanoquadro defibrosecaiuemdesusoquandoidentificousequeautilizaçãodeantiinflamatórios potentesnãoinfluenciavamnaevoluçãodadoença(Kumar,2010).

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Em recente revisão publicada na Lancet, King (2011) apresenta como etiopatogenia da doença um processo de ativação epitelial, fibroblasto dependente. Uma resposta anômala e exacerbada das células epiteliais alveolares induzem à secreção de citocinas próinflamatórias pelas célulastronco mesenquimais (CTM), citocinas estas, ativadoras da proliferação fibroblástica, da indução da formação de miofibroblastos,daproliferaçãodasprópriasCTMresidentesedatransformaçãodos fibroblastos em uma grande quantidade de fibrócitos. Este conjunto de células secretorasproduzgrandesquantidadesdeproteínasdamatrizextracelularecolágeno formandoumaresistentecicatriznotecidopulmonarquedeterminaadeformidadeda arquitetura.

Fonte:Kingetal.Lancet2011;378:1949–61

Figura1–MecanismosenvolvidosnapatogênesedaFPI

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A tentativa de reparação anormal do epitélio gera uma proliferação fibroblástica/ miofibroblástica excessiva, tal situação leva a formação de “focos fibroblásticos”, que são indicativos e característicos da Fibrose Pulmonar Idiopática (Kumar,2010).

Não existe, entretanto, uma identificação clara de quais mecanismos desencadeiam este reparo epitelial anormal; porém existem evidencias que alguns produtosdecélulasepiteliaisservemcomoiniciadoresdetodoesteprocesso,comoé o caso do TGFE1. Mais recentemente, fatores epigenéticos, agressões silenciosas

ambientaiscomoocigarro,ainalaçãodemicropartículas,infecçõesviraisderepetição, emespecialporherpesvírussãodeterminantesimportantesdaetiopatogenia.

As células epiteliais alveolares de tipo I quando lesionadas liberam o TGFE1

que é elemento fibrogênico e favorece a formação de miofibroblastos a partir dos fibroblastos, bem como promovem a deposição de várias moléculas, entre elas o colágenosobreamatrizextracelular(Kumar,2010).

ExistemtambémevidenciasdeparticipaçãogenéticanaFPItendoemvistaque a FPI familiar tem sido observada em até 5% dos casos (Steele & Brown, 2007). Esta última é marcada por mutações que encurtam os telômeros; estes são responsáveis pelo controle da replicação celular e com seu encurtamento as células alveolares sofremrápidasenescênciaeentramemapoptose(Tsakirietal,2007;Armaniosetal, 2007).

O TGFE1 também agecausando a redução da telomerase, com isso facilita a apoptose/reparação e, ainda, inibe a caveolina1 que é um inibidor endógeno de fibrose pulmonar mantendo assim o processo de reparo epitelial alveolar que leva a deposição de colágeno e alteração da arquitetura pulmonar pela fibrose (Kumar, 2010).

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2.2.Morfologia

Aanálisemacroscópicadassuperfíciesdapleurapulmonarrevelaumaspecto de “pedra de calçamento” em razão da retração das cicatrizes nos septos interlobulares. Quando da realização de corte superficial no parênquima pulmonar surgem áreas firmes esbranquiçadas de aspecto borrachoso (fibrose) com predominânciadoloboinferioredistribuiçãodiferentenasregiõessubpleurais(Singh

etal,2005;Hubneretal,2008).

Noestudomicroscópicoobservaseumafibroseintersticialirregular,sendoque as lesões mais jovens apresentam proliferação fibroblástica excessiva (focos fibroblásticos).Aslesõesmaistardiassãocolagenosasecommenordensidadecelular. Conformeafibrosesetornamaisdensa,elaproporcionaadestruiçãodaarquitetura alveolareformaçãodeespaçoscísticosrevestidosporpneumócitosdetipoII,células hiperplásicas ou epitélio bronquiolar (fibrose em favo de mel). Ocorre, ainda, inflamação discreta nas áreas fibróticas, com presença de linfócitos, plasmócitos, neutrófilos,eosinófilosemastócitos(Visscher&Myers,2006).

2.3.QuadroClínico

Naapresentaçãoinicialdadoença,amaioriadospacientestemidadede40a 70 anos e apresenta dispnéia gradual e crescente, tosse seca, sendo que frequentementeodiagnósticoédesconhecido(Noth&Martinez,2007).

A gravidade da dispnéia no quadro inicial é inversamente proporcional a sobrevida Ao exame físico encontrase estertores crepitantes em até 90% dos pacientes, sendo que o baqueteamento digital é presenciado em 30 a 40% da casuística . Já em fases mais tardias encontramos hipertensão pulmonar em alguns pacientes(Leyetal,2011).

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tratamento clinico com medicamentos, sendo o transplante pulmonar a única opção terapêuticadefinitivanomomento,porémnãodeformauniversal(Noth&Martinez, 2007).

2.4.Tratamento

ApesardoavançonoentendimentodaetiopatogeniadaFPIedaimportância dos fatores parácrinos ainda são poucas as opções terapêuticas eficazes. Diante da multiplicidade de células envolvidas no processo de destruição do parênquima pulmonar, a terapia celular tem despontado no capítulo da Medicina Regenerativa/Translacional.

Hámuitasdécadas,aterapiaantiinflamórialideravaasindicaçõesterapêuticas. Posteriormente surgiram as terapias antioxidantes, antifibróticas, além de um conjunto de medidas paliativas até a proposição de transplante pulmonar e mais recentementealgunstrialsenvolvendoaterapiacelular.

2.4.1.Terapiaantiinflamatória

Tendo em vista a hipótese original de que o processo inflamatório era importanteedeterminantenafisiopatologiadaFPI,asdrogasantiinflamatóriasforam usadas em larga escala no início. O follow up dos pacientes, no entanto, não

evidenciaram melhora clínica ou nas taxas de morbidade dos mesmos, sendo assim, tais medicações caíram em desuso, sendo contra indicada sua utilização como única drogaparaospacientescomFPI(Raghuetal,2011).

Alguns imunossupressores como a azatioprina e a ciclofosfamida também foram utilizadas associados aos corticóides, porém sem eficácia comprovada nem diferença na função pulmonar, acabaram por se tornar em conduta proscrita (Raghu

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Autilizaçãodeprednisonaemaltasdosesnãosemostrouviáveltendoemvista osefeitossecundários,taiscomomiopatia,hipertensão,hiperglicemiaeosteoporose (Gross&Hunninghske,2001).

2.4.2.Terapiaantioxidante

Opulmãoéexpostoaumatensãodeoxigêniomaiorqueosdemaistecidos.O estresse oxidativo definido como aumento da exposição aos agentes oxidativos ou a diminuição da capacidade antioxidante tem papel importante na FPI, onde são encontrados grande quantidade de substâncias oxidantes . Os antioxidantes são compostos que protegem os sistemas biológicos contra os efeitos agressores das reaçõesoxidativasdoprocessoinflamatório(Swigris&Brown,2006).

Uma substância antioxidante bastante importante é a glutationa, que tem papel protetor no pulmão de indivíduos normais e que se apresenta reduzido no pacientecomFPI.Essareduçãotemimportânciaamedidaquesabemosqueoestresse oxidativoaceleraoprocessoinflamatórioeaformaçãodefibrosepulmonar(Selman

etal,2001;Harari&Caminati,2010).

Uma hipótese de tratamento com antioxidantes foi levantada pela utilização de Nacetilcisteína que é um precursor da glutationa e tem potente ação anti oxidante (Demedts et al, 2005). Publicações recentes destacam o papel da N

acetilcisteína,utilizadoamplamentecomoagentemucolítico,sendoumprecursorda glutationainterferindonãosomentecomoantioxidante,masatuandodiretamentena modulaçãodaproduçãodascitocinas,pelosmacrófagosalveolares,emespecialTNF

D,TGFE1(Tomioka,2009).

2.4.3.Terapiaantifibrótica

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antifibróticascomoogamainterferon,bosentana,etanercepteeapirfenidona(Baldi &CastroPereira,2012).

O gamainterferon, mesmo com a possibilidade de supressão na produção de fatoresprófibróticos,nãodemonstrounenhumavantagemnasobrevidadospacientes (Kingetal,2009);abosentanaantagonistadaendotelinatambémsemostrouineficaz notratamentodaFibrosePulmonarIdiopática(Kingetal,2008;Kingetal,2011).

Já a função pulmonar foi usada como parâmetro após o uso de etanercepte (antagonistadoTNFD),porémostestesrevelaramnãoterocorridomelhora(Raghu

etal,2008).

A pirferidona apresenta características antioxidantes, antifibróticas e anti inflamatórias sendo que os vários estudos apresentados ainda foram pouco conclusivos(Nobleetal,2011).

2.4.4.Tratamentopaliativo

A alta prevalência do refluxo gastro esofágico em pacientes com Fibrose Pulmonar Idiopática levou a diretriz norte americana a recomendar o tratamento imediatodestadoençaquandodetectada(Raghuetal,2011).

Areabilitaçãopulmonarcomofornecimentodeoxigêniosuplementar(Holland

etal,2008),otratamentodatossecomcorticóide(HopeGilletal,2003)eousode

morfina e oxigênio nos pacientes com dispnéia revelaram apenas uma melhora passageiranoquadroclínico,sementretantomostrareficáciaduradoura(Allenetal, 2005). A oxigenioterapia em pacientes com hipoxemia em repouso é fortemente recomendadanadiretriznorteamericana(Raghuetal,2011).

2.4.5.OTransplantePulmonar

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espera pelo transplante pode chegar a 40%. Tal situação ocorre devido a curta sobrevidadopacienteapósodiagnóstico,normalmentenãopassandode5anoseao encaminhamento tardio dos mesmos (Bjorakeret al, 1998; O’Beirneet al , 2010). Atualmente as diretrizes utilizadas como critérios para a seleção de candidatos ao transplantepulmonarindicamanecessidadedeimediatoencaminhamentoparaalista detransplantepulmonarparaopacienteemquefoidiagnosticadafibrosepulmonar idiopática,independentedograudecomprometimentoeavançodadoença(Orenset al,2006),salvocontraindicaçõescomoobesidade,usodecorticóidesemaltasdoses,

insuficiência renal, infecção por HIV ou outra comorbidade que inviabilize o procedimentocirúrgico(Lynchetal,2006;Kreider&Kotloff,2009).

A sobrevida média de pacientes com fibrose pulmonar idiopática transplantadosnosEstadosUnidosédeaproximadamente4anos(Thabutetal,2009).

O maior problema desta terapêutica no Brasil é o pequeno número de equipes capacitadasparaaexecuçãoalémdalimitaçãonacaptaçãodoórgão.

2.5.Omodeloexperimental

Omodeloanimalidealérelevantenainvestigaçãodedoenças,principalmente as pulmonares. Entretanto, doenças crônicas pulmonares são de difícil reprodução independente do modelo adotado, tendo em vista que muitas vezes sua etiologia é desconhecida,comoéocasodaFPI(Moelleretal,2008).

Diferentesmodelosdeinduçãoafibrosepulmonarforampropostosnasúltimas décadas, sendo que um dos mais comuns e aceitos é a indução experimental de fibrosepulmonaremanimaispelautilizaçãodebleomicina(Moelleretal,2008).

2.5.1.BleomicinaeInduçãodaFPI

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utilizaçãonotratamentoclínicooncológicodediversoslinfomasesarcomas(DaSilva& Prolla,1995).

A utilização experimental da bleomicina reside no fato de que durante o tratamento quimioterápico percebeuse que entre 4 a 10% dos pacientes apresentavam toxicidade pulmonar a droga e isto resultava em processo de fibrose pulmonar(Umerazawaetal,1966).

AinduçãoexperimentaldeFibrosePulmonarfoidescritapelaprimeiravezem 1971emcãeserealizadopor(Fleischmanet al1971).Autilizaçãodebleomicinapor

instilaçãointratraquealemratosfoirealizadademodopioneiroem1979(Thralletal,

1979) e gerou um modelo confiável e utilizado frequentemente, tendo em vista a capacidade de desenvolvimento de fibrose pulmonar de modo rápido e previsível (Ferreira,1996).

Apósainstilaçãointratraquealdedoseúnicadableomicina,podeseperceber3 etapas distintas da evolução: a primeira etapa (estágio agudo da inflamação) corresponde aos primeiros sete dias após a instilação quando ocorre migração de célulasinflamatórias,edemaintersticialedealvéolos,alémdaativaçãodemediadores deinflamação.Nasegundaetapa(estágiosubagudo)quedurado7ºao15ºdiaapósa instilação, percebese um processo inflamatório intenso com aumento de células epiteliais cubóides com objetivo de reparar o epitélio agredido e notase também a presençadefibrosepulmonar.Naterceiraetapa(estágioderesolução)queperdurado 15º ao 30º dia após a instilação, o processo inflamatório diminui e é perceptível a reepitelização alveolar e o depósito de colágeno no tecido de granulação com a formaçãodafibrosenopulmão(Rossari,2004).

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do modelo de fibrose utilizando a bleomicina foi a técnica escolhida neste experimento,emespecial,pelacolaboraçãodecentrodaUNESPcomexperiênciano uso da mesma. Este Centro, localizado em Assis, é chefiado pelo Prof. João Tadeu RibeiroPaesdaFaculdadedeBiotecnologiaeparceironesteexperimento.

2.5.2.Célulastroncoeterapiacelular

Por definição células tronco oustem cells são aquelas dotadas de auto renovação,comcapacidadedediferenciaçãoempelomenostrêslinhagenscelulares diferentesoriundasdomesmofolhetoembrionário(Bogliolo,2012).

As células tronco embrionárias são células progenitoras pluripotentes, que detêm a capacidade de formar células das 3 camadas germinativas. Estas células dependemdefatoresdetranscriçãoqueregulamumarededegenesquecontrolam suamanutençãoeproliferação(Mitsuietal,2003).Apartirdaidentificaçãodequea

terapia utilizando célulastronco embrionárias gerava sarcomas e teratomas, novos esforçoscientíficosforamestabelecidosnosentidodeinduzircélulastroncoadultasa umcomportamentosemelhanteaosdasembrionárias,massemusarestasúltimas.A utilização de terapia com célulastronco pluripotentes induzidas em pesquisas possui variasvantagenssobreascélulastroncoembrionáriastendoemvistaqueasprimeiras sãoderivadasdoprópriopacienteecomissoapresentammenorrejeiçãoimunológica emrelaçãoaaloenxertosouxenoenxertosdecélulastroncoembrionárias(Kimet al, 2010;BarNuretal,2011).

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Inúmerosestudostêmsidoelaboradoscomointuitodeverificarasegurançaeeficácia da terapêutica com diferentes tipos de célulastronco, entre elas, as célulastronco mesenquimais.

Desdeadécadade50ascélulastroncohematopoiéticastêmsidoutilizadasem terapias experimentais e tratamento de patologias como o mieloma múltiplo e as leucemias (Thomas et al, 1957; Fernand et al, 1995). As célulastronco hematopoiéticas vêm sendo testadas em doenças de depósito lisossômico e metabólicas, como síndrome de Hurler e também aumentaram as taxas de sobrevivência dos pacientes (Wynnet al, 2009). Diversas outras aplicações para as

célulastronco hematopoiéticas têm sido descritas, com uso em cardiologia, dermatologia, vascular, e mais recentemente, um transplante de medula óssea resultounacurabemsucedidadeumpacienteHIVerenovouointeressenabuscade tratamentoeficazparaestaepidemia(Cohen,2011).

A utilização bem sucedida de célulastronco adultas foi primariamente verificadacomascélulastroncomesenquimaisderivadasdemedulaósseaemensaios de terapias regenerativas na obtenção de células ósseas e de cartilagem (Caplan, 1991).Deláparacá,outrasfontesdeobtençãodecélulastroncotêmsidoutilizadas. O uso do tecido adiposo como fonte de células progenitoras tem despontado em medicinaregenerativanosúltimosanoscomsupremacia(Gimbleetal,2010).Ousoda

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Figura2–Representaçãodascaracterísticasdascélulastroncoadultas,mesenquimais edasmesenquimaisorigináriasdotecidoadiposo.

Um fator importante na utilização de célulastronco mesenquimais quando comparadas às célulastronco embrionárias e mesmo as induzidas é que a utilização dasprimeirasnãolevaaformaçãodeteratomas(Knoepfler,2009).

Célulastronco mesenquimais também podem ser obtidas a partir de tecido adiposo,sinovial,sangueperiférico,tecidomusculareapartirdematerialdocordão umbilical (Zhang et al, 2012). O tecido adiposo constitui rica fonte de células mesenquimaisquejáforamusadasnaregeneraçãodosossosetecidoscartilaginosos em humanos (Pak,2011). A utilização de células mesenquimais de tecido adiposo se mostra bastante viável tendo em vista a fácil extração por lipoaspiração, sendo processominimamenteinvasivo(Schremletal,2009).Alémdopapelderegeneração

de ossos e cartilagem, outros estudos vêm sendo realizados quanto a segurança e o graudeeficáciaterapêuticaemesclerosemúltipla,diabetesetransplanterenalentre outros(Siatskasetal,2010).

O uso da terapia celular em pulmão tem como marco histórico o artigo publicado em 2001 por Krauseet al (2001) que evidenciam que a infusão de CT

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3.1Geral

x Avaliar a contribuição da terapia celular em modelo animal de fibrose pulmonar

3.2Específicos

x Estabelecer modelo animal de fibrose pulmonar em ratos albinos da

linhagemWistar.

x Expandirecaracterizarcélulastroncomesenquimaisalogênicasapartir

detecidoadiposo(CTMTA).

x Infundir CTTA por via intravenosa (veia caudal) e monitorar a recuperaçãodotecidopulmonar.

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(38)

4.1Animais

Foramutilizados60ratosmachosalbinosdalinhagemWistar(pesomédiode 250300g; 8 semanas de idade) procedentes do Biotério Central da Faculdade de MedicinadeBotucatuUNESP.Osanimaisforammantidosemcaixasdepolipropileno revestidascomserragem,emsalascomtemperaturaeluminosidadecontroladas(22°C e12h–luze12h–escuro,respectivamente).Duranteoperíododoexperimento,os ratosreceberamdietasólidaeáguasuplementadacomvitamina,adlibitum.

4.2Induçãoexperimentaldefibrosepulmonar

Parainduçãodafibrosepulmonaremratos,utilizouseomodeloexperimental propostoporPunithavathietal.,2000.

Os animais foram sedados com a utilização de Xilazina (0,5ml/kg) e Ketamina (1ml/kg) , em seguida foi realizada a antissepsia e tricotomia dos pêlos do pescoço , produzida abertura de 23cm da pele para visualização e exposição da traquéia , seguida de canulação da mesma comangiocath 22 BD® ( 0,9x25mm) por onde foi

instiladaableomicinanadosede1,5U(0,3mg/kg)+0,2mldeSorofisiológicoouSoro fisiológicopuro,dependendodogrupoexperimental.

Após a instilação, o catéter foi retirado. Foi procedida a sutura da pele dos animais com fio reabsorvível. Os mesmos foram recolocados nas gaiolas onde receberamanalgésicosedemaiscuidadosnecessários.

4.3 Obtenção, processamento e caracterização de célulastronco

mesenquimaisalogênicas,detecidoadiposo(CTMTA)

(39)

capacidade imunomoduladora, optouse neste experimento pelo uso das CTMTA. O tecidoadiposo(TA)despontanosúltimos5anoscomofontepromissoradeCTMpara terapia celular. O sítio de coleta do TA foi definido em função de resultados preliminares do laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu que demonstra que as CT obtidas de TA de abdômen apresentam curva de crescimento superioraoTAobtidodeoutraspartesdocorpodoanimal(Campos,2011).

Paraaobtençãodotecidoadiposo(TA)abdominalforamutilizados4animais dalinhagemWistar,comomesmopesoeidade,porémnãopertencentesanenhum dosquatrogruposdetrabalho.Apósanestesiadosanimaiscom30mg/Kgdetiopental sódico a 2,5%, via intraperitonial (IP), os mesmos foram colocados em fluxo laminar com filtro Hepa para se proceder a retirada do fragmento de TA. Foi realizada a antissepsia do pêlo, abertura de 23 cm da pele, identificação do TA e remoção de fragmentocompesomédiode3,35gporanimal.

OfragmentodeTAfoilavadoabundantementecomsorofisiológico0,9%(100 200mL)edepoiscolocadoemtubocônicoestérilcontendomeiodetransporteHEPES comantibióticos.

O material foi acondicionado em caixa de isopor e transportado para LaboratóriodeEngenhariaCelulardoHemocentrodeBotucatu.Aoreceberomaterial, o tecido foi pesado passando por lavagem em tampão PBS sofrendo posterior incubação com colagenase tipo I Invitrogen®por 12 horas em repouso, em estufa a 37oC. A ação enzimática foi bloqueda com a adição de soro fetal bovino (SFB) por 5 minutos. O conjunto foi transferido para tubo Falcon de 15mL. Centrifugouse o materialpor10minutos,aspirouseosobrenadante,dissolveuseopelletnovamente em PBS e centrifugouse a 1200 rpm durante 10 min para retirada completa da enzima.

(40)

células foram plaqueadas em frascos T de 25cm2 mantendoas em meio seletivo MesencultInvitrogen“eobservaçãomicroscópicacomusodomicroscópioinvertido Axiovert200,Zeiss“.Aculturafoimantidaemcondiçõesespecíficasdeincubadorade CO2, com jaqueta de água à 37ºC,Thermo“. Após 4 dias aproximadamente

(estabelecimentodascolôniasdecélulasfibroblastóidesaderentes)trocouseomeio de cultura DMEM Knockout Invitrogen® (5mL) a cada dois dias. Após observarse a confluência celular, as células foram novamente submetidas ao processamento enzimáticoparadescolamentodaplacadeculturaenovaalíquotafoiprocessadapor citometria de fluxo utilizando os marcadores citados. A análise foi realizada no citômetro de fluxo FACS Calibur da BD“ através da leitura em Software Cell Quest

Pro“. Importante salientar que as CTMTA plaqueadas foram amplificadas até a 8ª

passagemparaseobteronúmeroadequadodecélulasparaoexperimento,sendoas mesmasarmazenadascongeladasemnitrogêniolíquido.

Nomomentodousofoiprocedidoodescongelamentoearealizaçãodopool

dasCTMTAparaposteriorinfusãoporviaintravenosa(veiacaudal)nosanimais.

(41)

(42)

5.1Constituição

Osanimaisforamdivididosem4gruposde15 animais,mantidossob estrito controledebioteristaemédicoveterinárioduranteos28diasdeobservaçãoapartir da data de instilação traqueal da bleomicina ou soro fisiológico. Os 4 grupos foram assimconstituídos

9 Grupo1Bleosoro=controledefibrose:Animaisinstiladoscomsoluçãode bleomicinae“tratados”comsorofisiológicos,quadro1.

9 Grupo 2 Sorosoro= animais controle:Animais instilados com solução fisiológicaetratadoscomSF.

9 Grupo 3 BleoCTM= grupo estudo:Animais instilados com solução de bleomicinaetratadoscomcélulastroncoobtidasdotecidoadiposo.

9 Grupo 4 SoroCTM = controle da ação das CT:Animais instilados com soluçãofisiológicaetratadoscomcélulastroncoobtidasdotecidoadiposo.

Grupo Dia

instilação

Solução instilada

Dia infusão

Solução infundida

Dia sacrifício

G1BleoSoro 0 Bleomicina 14º SF 28º

G2SoroSoro 0 Soro 14º SF 28º

G3BleoCTM 0 Bleomicina 14º CTMTA 28º

G4SoroCTM 0 Soro 14º CTMTA 28º

*SF=sorofisiológico

Quadro1–Constituiçãodos4gruposdeestudo,instilaçãodableomicina,infusãodas CTMTAouSFesacrifício.

Todos os animais foram submetidos ao mesmo grau de estresse de manipulaçãoereceberamno14ºoprocedimentodeinfusãodeCTMTA,ousoro.

5.2ComitêdeÉtica

(43)

5.3Paramêtrosanalisados

Osanimaisforamacompanhadosquantoaoganho/perdadepesoequantoaos valores de saturação em 3 momentos diferentes (D0, D14 e D28) do experimento. A figura abaixo representa as ações realizadas dentro do protocolo estabelecido, vide figura2.

Figura 2– Protocolo de indução da fibrose pulmonar, abordagem terapêutica e sacrifíciodosanimais.

5.4Análisesmacroscópicasemicroscópicas

Uma vez sacrificados os animais em D+28, após a determinação da saturometria e pesagem dos mesmos, os pulmões eram transportados em frascos devidamenteidentificadosporordemnuméricasequencialaoServiçodePatologiada FMBUNESP.Omaterialfoianalisadopordoisdiferentespatologistasemestudoduplo cego.Apósprocessamentodospulmões,tendosidoprocessadosempreomesmolobo pulmonar, a saber, lobo médio direito, o restante foi mantido preservado para eventuais análises. O material emblocado foi submetido a cortes em criótomo e procedidoascoloraçõesdehematoxilinaeosinaePicrossírius.Paraaavaliaçãopelos patologistas foi estabelecida a classificação semiquantitaviva de Singh (2005) para inflamaçãoperivascular.

Escore Descrição 0 Seminflamação

1 Umaouduasfilasdecélulasinflamatóriasconcêntricas 2 Trêsoumaisfilasdecélulasinflamatóriasconcêntricas 3 acúmulodecélulasinflamatóriasentrevasosebronquíolos

Quadro1–ClassificaçãosemiquantitativadeSingh

Instilaçãoda Bleomicina

InfusãovenosadaCTM TAousoro

Sacrifício

(44)

AquantificaçãodafibrosepulmonarvaleusedaescaladeAshcroftmodificada porHübner(2008),quadro2. Graude fibrose EscalaModificada Septoalveolar–semfibroseoupoucasfibrasemparedesalveolares 0 Arquiteturapulmonarnormal Septoalveolar–alteraçõesfibróticasdiscretas;septo3Xespessaqueo normal 1 Arquiteturapulmonar–alvéolosalargadoserarefeitos,semmassas fibróticas

Septoalveolar–alteraçõesfibróticasevidentes(septo3Xmaisespesso queonormal)comformaçãodenóssemconexõesentreeles.

2

Arquiteturapulmonaralvéolosalargadoserarefeitos,semmassas fibróticas

Septoalveolar–paredefibróticascontínuassepto3Xmaisespessoqueo normal)predominandoemtodoocampomicroscópico.

3

Arquiteturapulmonaralvéolosalargadoserarefeitos,semmassas fibróticas

SeptoalveolarVariável

4 Arquiteturapulmonar–massasfibróticasisoladas(10%docampo

microscópico) SeptoalveolarVariável 5 Arquiteturapulmonar–massasfibróticasconfluentes(entre10e50%do campomicroscópico).Estruturapulmonargravementealterada,porém, aindapreservada. Septoalveolar–Variávelmaiorianãoexistente.

6 ArquiteturapulmonarGrandemassasfibróticascontíguas(>50%do

campomicroscópico).Amaioriadaarquiteturapulmonarnãopreservada.

Septoalveolar–nãoexistente

7 Arquiteturapulmonaralvéolosquaseobliteradoscommassasfibrosas, masaindaatécincobolhasdear

Septoalveolarnãoexistente

8 Arquiteturapulmonar–Camposmicroscópicoscomobliteração

completapormassasfibróticas

Quadro2–EscalaquantitativadefibrosepulmonarpropostaporAshcroft,modificada porHübner(2008).

(45)

(46)

Asanálisesestatísticasforamrealizadascomauxíliodosoftware Stat.Paraas variáveis, saturação, peso e graus de fibrose os cálculos foram realizados pelo teste KruskalWallis, de dados não paramétricos (método ANOVA), com pósteste de múltiplascomparaçõespelométododeDunn.

(47)

(48)

7.1ObtençãodasCTMTAalogênica

As células tronco mesenquimais foram obtidas a partir de tecido adiposo abdominalde4animaismachosdelinhagemWistarpesandoentre250e300gecom 8 semanas de vida, que não faziam parte dos 60 animais que foram divididos nos 4 gruposexperimentais,tabela1.

Tabela1–Descriçãodosanimaisedopeso,emgramas,deTAretirado

Animal PesoemgramasdeTAretirado

1 1,7

2 2,0

3 4,7

4 5,0

Média 3,35

Amédiadetecidoadiposoretiradofoide3,35gsendoqueapósadissociação com o uso de colagenase tipo I, a contagem celular média (LMN) foi de 5,3 x 104 células/gdetecidoadiposo,valoresteconsideradosuficienteparaasnecessidadesdo experimento, tendo em vista as etapas subseqüentes de amplificação em cultura.As células plaquedas foram expandidas até a 8ª passagem em meio Knockout DMEM, mantidasemcondiçõesdecultivoestéril.

ParacomprovaropadrãodasCTMTAobtidasdotecidoadiposofoiseguidoa orientaçãodaInternational Society for Stem Cell Research(ISSCR)

.

AISSCRdestaca4

(49)

sediferenciaremtrêsdiferentestecidosdelinhagemmesodérmicatalforamutilizados meios específicos de cultura, condicionados para diferenciação condrogênica, osteogênica e adipogênica, seguindo os Procedimentos Operacionais Padrão do LaboratóriodeEngenhariaCelulardoHemocentrodeBotucatu.

O critério de comprovação para célulastronco baseado na aderência ao plástico e na presença de unidades formadoras de colônias fibroblastóides foi conseguidocomsucesso,conformefotomicrografiasobtidaspormicroscopiainvertida decontrastedefase.

A = Aspecto da cultura após 4 dias do plaqueamento (aumento de 5x); B = Presença de unidades formadoras de colônia fibroblastóides15diasapósoiníciodacultura(aumentode10x)eC=Presençadeunidadesformadorasdecolôniafibroblastóides 15diasapósoiníciodacultura(aumentode20x)

Figura 3 – Microscopia Investida por Contraste de Fase do primeiro critério de comprovaçãodasCTMTA:aderênciaaoplástico.

OsegundocritérioutilizadofoiaanálisedoperfildascélulasporCitometriade Fluxo, que utiliza marcadores de superfície específicos. As melhores análises são aquelasqueocorremnafaixaentre5.000e10.000eventos(células).Foramcalculadas as médias das 4 amostras analisadas . Os marcadores CD45 e CD90, específicos para rato, foram executados em dois momentos: logo após a dissociação, antes do plaqueamento, quando as células eram consideradas linfomononucleares, e após o cultivo. O número mínimo de eventos (células) analisadas neste experimento foi de 8.436 e máximo de 10.000 células. O número máximo é determinado pelo próprio equipamento.Atabelaabaixomostraosresultadosnuméricosdasanálisesefetuadas.

(50)

Tabela 2 – Resultado do perfil fenotípico das CTMTA pelo método de citometria de fluxofrenteaosmarcadoresCD34,CD44,CD45eCD90.

Marcador Controle

Negativo CD34 CD44 CD45 CD90

Númeromédiodeeventos

(células)analisadas 9013 8857 10.000 8436 10.000

MédiadeIntensidadede

fluorescência(%) 1,83 1,70 18,59

53,38* 1,72**

17,35* 98,97**

*=apósadissociaçãoenzimática,antesdoplaqueamento;**após21diasdeculturacommeiodeculturaespecíficoparaCTM.

Na figura 4 estão representados em A: distribuição das células linfomononucleares após a dissociação enzimática em gráfico de dispersão por tamanho e granulosidade das mesmas. EmB, a população de células, sem marcador específico, considerado como controle negativo. A barra com a denominação M1 delimita a área correspondente ao pico das células que expressam marcadores positivosparaCTM.EmC,oresultadodaexpressãodeCD34ondefoiobservadauma reatividadede1,70%emmédia,resultadoesteesperadoparaestaamostragem.

(51)

A=gráficodedispersãodasLMN;B=controlenegativo;C=CD34;D=CD45préplaqueamento;E=CD44e emF=CD90pósamplificaçãoemcultura

Figura4–GráficosdasanálisesporcitometriadeFluxocommarcadoresfluorescentes.

(52)

Figura 5 –Aspecto da coloração por citoquímica comAlizarin Red de CTM com diferenciaçãoosteogênica

7.2VariaçãodePesodosanimais

A literatura indica a perda de peso dos animais submetidos a instilação com bleomicinaintratraqueal(Rossari,2004).Paraverificarestedado,osanimais,mantidos em condições idênticas, foram pesados em 3 momentos: D0, D14 e D28. A hipótese destetrabalhoeradequeafibrosepulmonarinduzidaporbleomicinadiminuiriaode peso dos animais, que poderia ser reestabelecido com a terapêutica com CTM. A análise estatística evidenciou diferenças significantes, p<0,0001 em D0, visto não houve a decisão de parear os animais por peso. Quando comparados o peso dos animais dos grupos G1Bleosoro G2 sorosoro, não houve diferença estatística, p> 0,05,omesmoocorrendoentreG3bleoCTMeG4soroCTM.Ascomparaçõesentreos diferentesgruposemD+28tambémnãoidentificoudiferençaestatísticasignificante, gráfico1(dadosoriginais,apêndice1).

(53)

Gráfico1–Análiseestatísticadopesodosanimais(emgramas)em3momentos,nos diferentesgruposanalisados.

Martinez(2008)publicaqueousoisoladodableomicinaestáassociadoaperda significativa do peso corporal total e a uma alta taxa de mortalidade (40%) em comparaçãoaosgruposcontroles.Osdadosdopresenteestudonão corroboramos resultadosdaqueleautor,poisataxademortalidadenopresenteestudo,foibaixae nãohouvediferençaestatísticasignificantecomrelaçãoaopeso.Duranteos28diasde monitoramentoregistraramseduasperdasemdiferentesgrupos(2/60ou3,33%),no momentodainstilaçãodableomicina,podendoestarrelacionadoscomoprocessode anestesia ou ao quimioterápico propriamente dito. Não foi registrado nenhum óbito entre os animais nos dias subsequentes à instilação de bleomicina, nem processo infecciososistêmico.

(54)

7.3VariaçãodeSaturação

ParamonitoraraFibroseinduzidautilizouseasaturometria,comequipamento pediátricoBCI3.300hand–heldpulseoximeter®fixandoosensornaporçãoproximal dacauda.Ahipóteseformuladaeradequea mesmadiminuiriacomainstalaçãodo processodefibrose,equeocorreriaarecuperaçãodosíndicesdesaturaçãocomuso daCTMTA.Estefatoseriaumindicadordemelhoraclínicaeanátomopatológica.Os dados obtidos confirmam a queda do índice de saturação em animais em que foi instilada a bleomicina (G1Bleosoro e G3 BleoCTM). Em D0, não foram registradas diferenças estatisticamente significativa entre os grupos, como esperado (p=0.6313). As análises estatísticas da saturometria em D14 entre os grupos G2/ G3 e G2/G4 mostram diferenças significantes com p<0,05. Em D+28 p <0,049, muito significante (apêndice2,planilhadedadosprimáriosdasaturometriadosanimais).

Gráfico2MédiadoíndicedeSaturaçãonosdiferentesgruposemD14eD28.

(55)

modelo de fibrose pulmonar com uso da bleomicina é a potencial recuperação espontânea, no entanto, tratase do modelo mais utilizado. A decisão, neste experimento,desacrifícioem28dias,sedeubasicamenteporestefato.Ouseja,para intervenção com as CTM antes do início da regressão espontânea. Na realidade, muitos outros autores fazem a crítica aos modelos animais de FP, que não retratam comfidelidadeointrincadomecanismoqueocorreemsereshumanos.

7.4 AnáliseMacroscópica

Aanálisemacroscópicadopulmãolevouemcontaasseguintescaracterísticas: aarquitetura,proporção,coloraçãoesuperfícieeconfirmouasalteraçõesesperadase descritaspelaliteratura(Singhetal2005;Hubneretal,2008).

(56)

Figura 6 Classificação dos graus de fibrose segundo a análise macroscópica dos pulmões dos animais do grupo G1(Belosoro) em D28. A= grau I(leve); B= grau moderado (intermediário); C= grau III avançado e D = grau avançado com complicações

(57)

Foiidentificadoapenas1animal/14(7,14%)queapresentavapoucasplacasem superfície e mantinha as demais características macroscópicas de um pulmão saudável,figura6A.

Dois animais apresentaram grau II moderado ou intermediário (N = 2/14) correspondendo a 14,28% do grupo, com placas por toda a superfície, alteração de coloração,porémmantinhamaproporcionalidadeearquiteturapulmonar.Aotoqueo tecidopulmonarsemostravafriável,figura6B.

Na classificação grau III ou avançado (N = 3/14, ou 21,42%) os pulmões apresentavamplacasportodaasuperfície,evidentealteraçãodecor,observandose perda de proporção e da arquitetura pulmonar, além do tecido ser bastante friável, figura6C.

Amaiorpartedosanimais(57,14%)desenvolveuumafibrosegrauIV,avançada comcomplicações(8/14).Observaramseplacasportodaasuperfície,comalteração de coloração, ocorrendo perda de proporção e arquitetura, tecido bastante friável sendoqueem6animaisforamdetectadosváriospontosdenecrose,figura6D.

(58)

Figura7–AspectodaanálisemacroscópicadepulmãodeanimalintegrantedoGrupo G1(sorosoro).Controlenormal.

O grupo experimental, G3 (bleoCTM), cujos animais sofreram a FP induzida pela instilação traqueal da bleomicina, tiveram em D+14 a infusão de 1X106 CTMTA infundidasporveiacaudal.Estegrupoteveaperdade1animalemD0,1minutoapós ainstilaçãodableomicina,fatoestesemelhanteaoocorridoemG1.

(59)

Figura8AnálisemacroscópicadospulmõesdosanimaisdogrupoG3(BleoCTMTA) em D28 com arquitetura, proporção e coloração preservadas. A e B representam diferentes animais. Em B observamse pontos de necrose com tecido recuperado circunjacente.

(60)

Figura8–AnálisemacroscópicadospulmõesdosanimaisdogrupoG4(soroCTMTA) comtecidonormal,arquitetura,proporçãoecoloraçãonormais.

7.5. AnáliseHistológicaPulmonar

7.5.1.ColoraçãoporHematoxilinaeosina

Esta análise foi realizada em estudo duplo cego através da interpretação de dois patologistas especializados em histopatologia pulmonar. As análises envolveram coloraçãoclássicadehematoxilinaeosinaecitoquímicadePicrossírius.Aavaliaçãoda inflamação perivascular utilizou o sistema semiquantitativo de avaliação histopatológicaparainflamaçãoperivasculardescritoporSinghconformedescritono de materiais e métodos, enquanto que a quantificação da fibrose pulmonar valeuse daescaladeAshcroftmodificadaporHübner.Aplanilhaindividualdosanimaisdecada grupoencontrasenoapêndice3.

(61)

Figura 9 – Padrão de fibrose pulmonar Aspecto histológico, com coloração em HE, representativadogrupoG1(bleosoro).EmA=Espessamentoseptaldifusosemformação de massas fibróticas. Em B = Espessamento septal difuso acometendo mais região subpleural(seta).EmC=Padrãoderemodelamentoparenquimatososacular(elipses).Em D = Ausência de inflamação de vaso peribronquiolar (seta) e inflamação perivascular periférica intensa (cabeça de seta). Aumento 10x. Em E = Vaso em maior aumento, acometidodeinflamação(40X).EmF=Bronquitecrônicaintensacomdestruiçãoepitelial edacamadamuscular(seta).40x

C

D

A

B

(62)

Na análise histomorfológica do grupo G2 (sorosoro), observase uma fibrose mais densa com acometimento difuso, mas com mais foco peribrônquico e bronquiolar, além do subpleural. O remodelamento parenquimatoso acomete quase todososseptoseobservasenafronteiraentreasáreasdemassafibróticaseseptos levemente espessados estruturas fibróticas semelhantes a focos fibroblásticos, nos quais ocorre a ativação miofibroblástica e progressão da fibrogênese pulmonar. A inflamaçãoé leve amoderada eeventualmente acompanha os vasos, os quais estão muitas vezes com hipertrofia da média. Percebese franca bronquite e bronquiolite comdestruiçãoepitelialintensa(figuras10e11).

Figura10Aspectohistológico,comcoloraçãoemHE,representativadogrupoG2(soro

soro).A=Grandeáreafibróticacontínuacom completaperdadaarquiteturapulmonar. 10x; B = Interface entre áreas fibróticas e parênquima pulmonar com espessamento septal. 10x; C= Maior acometimento fibrótico peribronquiolar, com septos alveolares anormalmente espessados. 10x; D = Estrutura matricial com miofibroblastos ativos, provávelfocofibroplásticodaFibrosePulmonarIdiopática(seta).40x

A

B

(63)

Figura11Aspectohistológico,comcoloraçãoemHE,representativadogrupoG2(soro soro). E = Região com a estrutura matricial fibrótica, miofibroblastos em paralelo a hiperplasia de pneumócitos tipo II. Aumento 40x. F = Hipertrofia da camada média dos vasosperiféricos.Aumento40x;G=Bronquitecrônicaativacomdestruiçãodoepitélioe camada. Aumento 10x e H = Acúmulo eventual focal de macrófagos alveolares em área poucoacometida.Aumento20x.

A observação histomorfológica do grupo G3(bleoCTM) identifica notável redução da fibrose, porém na maioria dos casos notamse ainda massas fibróticas isoladas. Os septos ora se apresentam com estrutural habitual fina e delicada, ora mostram diferentes graus de espessamento até formarem verdadeiras massas fibróticasdensas.Nãoseobservamseptosalveolaresanômalosouarquiteturaseptal anormal nas áreas preservadas. Notamse macrófagos com citoplasma finamente granular azulado de entremeio a algumas regiões fibróticas e perivascular, podendo representar algum pigmento exógeno e/ou bactérias ou outros. A inflamação é centrada no eixo brônquiobronquiolo vascular caracterizada por células

E

F

(64)

mononucleareseepitéliotropismo.Broncopneumoniafoiidentificadaemalgunscasos por infiltrado inflamatório neutrofílico intrabronquial, abscesso intraepitelial e sua consequente pneumonia organizante. Notase hipertrofia da camada média das arteríolas e artérias pulmonares, talvez em menor grau que os outros grupos. Interessantemente houve uma “hiperplasia” de suas células endoteliais, as quais se mostram muito bem definidas e “saudáveis”. Houve hiperplasia mesotelial focal, geralmenteassociadaaáreasfibróticas.

(65)

Figura 12 – Histomorfologia grupo G3(bleoCTM) com coloração de Hematoxilina eosina

A=massafibróticaúnicacompostapor(mio)fibroblastos,matrizextracelularevasos. Vasocommoderadahipertrofiadamédiaecélulasendoteliaispreservadas(cabeçade seta). Macrófagos microvacuolizados basofílicos estão distribuídos pela massa (seta). Aumento 20x. B = Estruturas semelhantes a focos fibroblásticos estão presentes em algumas massas fibróticas. Aumento 20x. C= Septos alveolares de aspecto habitual com áreas contiguas de espessamento discreto adjacente a áreas de septos com moderado espessamento. Aumento 10x. D= Eixo bronquíolovascular preservado em discreto espessamentoseptal adjacente. Hipertrofia da camada média do vaso e seu endotélio hiperplásico. Aumento 20x. E= Hiperplasia mesotelial adjacente a área fibrótica. Aumento 20x. F = Area de Bronquiolite intensa com preenchimento da luz por proliferação miofibroblástica (pneumonia organizante). Aumento 10x. G = Abscessointraepitelialbronquiolar.Aumento40x.

A B C

D E F

(66)

Figura 13 – Histomorfologia grupo G3(bleoCTM) com coloração de Hematoxilina eosina

A=Pneumoniaorganizanteclássica.Aumento40x;B=Interfaceentreáreaseptalmais preservada e área com nítido espessamento. Aumento 20x; C= Área septal com alterações matriciais mínimas. Aumento 40x; D= Espessamento septal contínuo. Aumento 40x; E= Área focal de espessamento septal contínuo e áreas nodulares adjacentes. Aumento10x; F= Eixo brônquio vascular preservado. Discreto espessamentoseptalfocal.Aumento20x;G=Áreaseptalpreservada.Mínimasáreas comespessamentofocal.Aumento10x

O grupo controle G4 (soroCTM) apresentou aspectos histomorfológicos onde percebese uma atenuação importante da fibrose, sem a formação de massas fibróticas, exceto para o pulmão de um dos animais (animal 11). A maior parte dos septosapresentaseuaspectodelicadohabitualoucomalteraçõesmínimas.Jáoutras áreas há um espessamento maior e eventualmente com a presença de pequenos nódulosfibróticos.Ainflamaçãoémoderadacomacometimentoperivascularvariável. Notase intensa bronquite e bronquiolite crônica em atividade, denotando estimulo antigênicoimportante.Observamsesinaisdehipertensãopulmonar,masparecemem menorgrau.

A B C

D E F

(67)

Figura 14 – Histomorfologia grupo G4(soroCTM) com coloração de Hematoxilina eosina. A=Septosalveolaresdeaspectodelicadofinohabitualoucomalteraçõesmínimasno componenteintersticial.Intensoinfiltradoinflamatórioperivascular(setas).Aumento 10x;B=Bronquíoloterminalebronquíolorespiratóriodeaspectohabitual.Aumento 10x;C=Intensabronquitecrônicaematividade.Destruiçãodacamadamuscular(seta) einfiltraçãointraepitelial(cabeçadeseta).Aumento10x;D=Interfaceentreáreasde aspecto habitual com áreas de espessamento continuo do septo alveolar. Eixo bronquíolo vascular não está acometido por processo inflamatório (setas). Aumento 10x; E = Arteríola com hipertrofia da camada média e intenso processo inflamatório perivascular.Poucoespessamentonosseptosaoredor.Aumento40x

A

B

C

D

(68)

7.5.2.ColoraçãoTricrômicodePicrosírius

OmétododecoloraçãoporTricrômicodePicrosíriusconsistenacoloraçãoem vermelho pelo Sirius Red da proteína colágeno, presente nas fibras colágenas, reticulares, cartilagens e nas membranas basais. Quando associada à microscopia de polarização, possibilita a visualização de colágeno pela organização paralela das moléculas de tropocolágeno. As fibras de colágeno tipo I apresentam coloração que variadovermelhoaoamarelobrilhantecomintensabirrefringência.OcolágenotipoII apresentabirrefringênciamenosintensaecoloraçãoamarelopálida.Ocolágenotipo IIIaparececomofibrasdelicadasdecoloraçãoesverdeada(Junqueiraetal,1979).

(69)

AanálisedogrupoG1(Bleosoro)evidenciaemnafigura15Amassafibrótica com espessamento e distorção septal intensa evidenciados pela coloração de Picrosírius sob luz polarizada. Note o remodelamento parênquimatoso determinado peladeposiçãodefibrascolágenasespessascomoocolágenoI(vermelhoeamarelo)e finacomoocolágenoIII(verde),noaumentode200 vezes.Namesmafigura,emB, massa fibrótica confluente e extensa, emC remodelamento parênquimatoso intenso por abundante deposição de colágeno, espessamento septal e distorção do eixo bronquíoloalveoloar.EmDremodelamentoparenquimatosoeespessamentopleural adjacente. Na figura15 E, aspecto de espessamento septal envolvendo pequeno bronquíoloedistorcendoaarquiteturapulmonarhabitual.EmF,interfaceentremassa fibróticaconfluenteeestruturasseptaisdistorcidas(linhatracejada).

Figura 15 – Histomorfologia grupo G1(bleosoro) com coloração tricrômica de Picrosírius.Aumentode200X,barrade50μm.

A B C

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No grupo G2(sorosoro) apesar da análise clássica por hematoxilinaeosina evidenciar estrutura matricial fibrótica, miofibroblastos em paralelo a hiperplasia de pneumócitostipoIIequadrodebronquitecrônicaativacomdestruiçãodoepitélioe camada, a coloração tricrômica evidencia na figura 16AParenquima pulmonar de aspecto habitual. Pontual deposição de matriz extracelular remetendo os achados iniciais às condições de biotério convencional em que os animais foram mantidos. Estas condições podem ter determinado quadros de bronquites, bronquiolites e até pneumonias em função da instilação intratraqueal utilizada, que neste grupo, correspondeu ao soro fisiológico. A provável contaminação vem do ambiente de manipulação. EmB, parênquima e pleura de aspecto habitual. Focal deposição de colágeno.Notecomoapleuramostrasedelicadaeseconectaaosseptosdemaneira harmônicaeemCeixobronquíoloalveolardeaspectohabitual.Os bronquíolossão envolvidos por um esperado arcabouço de fibras colágenas. Os septos ancoram os bronquíolossemcausardistorçãodaarquitetura.

Figura 16 – Histomorfologia grupo G2(sorosoro) com coloração tricrômica de Picrosírius.Aumentode200X,barrade50μm.

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NogrupoestudodenominadoG3(bleoCTM),ondeanálisesporhematoxilina eosinaevidenciavamaregressãodoquadrodefibrosecomapermanênciademassas fibróticas isoladas, não se observando anomalias de septos, a coloração específica, tricrômicadePicrosíriusmostraestruturaalveolardeaspectopreservado,entretanto commoderadadeposiçãodefibrascolágenas(figura17A),comoesperado,umavez que a infusão de CTMTA foi realizada com objetivo de analisar a contribuição, sem efetivoajustededose,comoaconcentraçãodecélulas,queforaminjetadasporveia caudal. Como muitos trabalhos mostram, a efetividade do uso das CTM é dose (número) dependente. Provável aumento da concentração de células mesenquimais injetadaspudesse,nomesmotempo,trazerumbenefíciomaior.Observasenafigura

17Bbronquíolodeaspectohabitual.Notequeosalvéolosadjacentesmostramalgum grau de espessamento septal com deposição de fibras colágenas. EmCPleura de aspecto habitual com sua arquitetura delicada de deposição de matriz extracelular. Contudo o parênquima pulmonarperiférico apresenta espessamento septal devido a presençadefibrascolágenas.EmDpequenobronquíolocomdiscretoespessamento peribronquiolar, mas sem distorção da arquitetura. Septos com leve espessamento. EmEparenquimapulmonarperiféricomostraarquiteturapreservada.Adeposiçãode fibrascolágenasnasparedesseptaisémarcante.

Figura 17 – Histomorfologia grupo G3(bleoCTM) com coloração tricrômica de Picrosírius.Aumentode200X,barrade50μm.

A B C

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NogrupoG4(soroCTM),ondenamacroscopiaseobservouaspectonormaldo pulmãoenaanáliseporhematoxilinaeosinaalteraçõesmínimas,entreelasinfiltrado inflamatório justificável pelos motivos acima descritos que se referem ao tipo de ambiente da manipulação, do biotério, e das condições de instilação intratraqueal, estesachadosforamconfirmadospelacoloraçãodepicrosírius,sendoquenafigura18 A observase leve espessamento septal margeado por deposição “em dot” de fibras colágenas.EmB,leveamoderadoespessamentoseptalmargeadopordeposição“em dot”defibrascolágenas,emC,eixobronquíoloalveolarpreservado(seta).Osseptos espessadoscomfibrascolágenasnassuasbordassemantémeemDpleuradeaspecto habitual.Osseptosespessadoscomfibrascolágenasnassuasbordassemantém.

Figura 18 – Histomorfologia grupo G4 (soroCTM) com coloração tricrômica de Picrosírius.Aumentode200X,barrade50μm.

A

B

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A partir do exposto, e com base nos objetivos propostos para este trabalho, concluímos:

1. A terapia celular com célulatronco mesenquimal de tecido adiposo interfere positivamente no controle do processo da fibrose pulmonar, em modeloanimal,induzidapelableomicina.

2. A instilação intrataqueal de bleomicina na dose de 1,5U/Kg de peso determinou fibrose pulmonar em 100% de ratos albinos, da linhagem Wistar,sendoqueem57,14%dosanimaisograudefibrosepulmonarfoi IV.

3. Foi obtido, expandido em cultura e caracterizado com sucesso as CTMTA deratos,apartirdeumamédia3,35gdegorduradaparedeabdominaldos animais. Este fragmento digerido por colagenase tipo I obteve em média 5,3X104célulaslinfomonucleares.AsLMNexpandidasemculturasatéa8ª passagemaderiramaoplásticodeterminandooaparecimentodeunidades formadoras de colônias fibroblastóides e se diferenciaram, em meios de cultura condicionados, específicos, em adipócitos, condrócitos e osteoblastos/osteócitos.OPerfilfenotípicodasCTMTAfoiconfirmadopor citometriadefluxocomaexpressãode98,97%deCD90e1,70%deCD34, alémdeoutrosmarcadores.

4. A instilação de bleomicina intratraqueal comprometeu o índice de saturaçãodosanimais.

5. A infusão de CTM alogênicas por via caudal não determinou óbito em nenhumanimal.

6. Análiseshistológicasconfirmaramopadrãodefibrosepulmonar.

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A partir dos promissores resultados obtidos neste estudo, acreditamos que a CTMTA mereça ser considerada em futuros estudos abordando o tratamento de fibrosepulmonar,nãosóporseusefeitosdiretosnaremodelaçãodotecido,enquanto unidade funcional propriamente dita (célula), mas em especial por seus efeitos parácrinos, como a produção de citocinas, quimiocinas, inibidores e moduladores do danotecidual.

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