José Renato Laino Martinelli Cury
EFICIÊNCIA DO PROTOCOLO SUPERESTIMULATÓRIO P36,
ASSOCIADO À ADMINISTRAÇÃO DE eCG OU LH, EM ANIMAIS
DA RAÇA NELORE
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação do Instituto de Biociências de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista -
UNESP, para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas, Área Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Ciro Moraes Barros
Co-Orientador: Dr. Ronaldo Luiz Ereno
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Cury, José Renato Laino Martinelli.
Eficiência do protocolo superestimulatório P36, associado à administração de eCG ou LH em animais da raça Nelore /José Renato Laino Martinelli Cury. – Botucatu : [s.n.], 2012
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu
Orientador: Ciro Moraes Barros Co-orientador: Ronaldo Luiz Ereno Capes: 21001006
1. Zebu - Reprodução. 2. Nelore (Zebu) - Embrião. 3. Transferência de embriões.
AGRADECIMENTOS...5
LISTA DE ABREVIATURAS...9
LISTA DE FIGURAS...11
LISTA DE TABELAS ...12
CAPÍTULO 1 RESUMO...14
ABSTRACT...17
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS...21
REVISÃO DE LITERATURA...24
REFERÊNCIAS...34
CAPÍTULO 2 Resumo...50
1. Introdução ...51
2. Materiais e métodos...53
3. Resultados ...58
4. Discussão...60
Primeiramente a Deus por ter me dado essa grande oportunidade.
Aos meus pais José Carlos e Maria Alice por todo apoio e incentivo dispensados a mim.
Ao meu irmão Luis Fernando por todo incentivo nesta luta.
Aos meus avôs, Flavio, Cida e Diva por toda ajuda e incentivo durante esses anos, a minha tia Fatima e meu primo Gabriel pelos momentos agradáveis e pelo carinho indispensável de sempre.
Aos meus amigos de Piraju, Alexandre, Bruno, Benedito, Matheus, Thiago, Leandro, grandes amigos que já que fazem parte da família.
Ao meu orientador Prof. Dr. Ciro Moraes Barros, pela oportunidade em me acolher em seu laboratório, pela oportunidade de me orientar na execução e pela paciência e dedicação que foram fundamentais para realização deste trabalho de grande importância para minha formação.
Ao meu Co-Orientador Dr. Ronaldo Luiz Ereno que me auxiliou durante a realização do experimento e a dissertação sua participação foi fundamental para realização deste trabalho.
Ao grande amigo Eduardo Lucacin que me auxiliou no experimento e me acolheu em sua fazenda prestando todo auxilio necessário para a realização do experimento.
À Família do Sr Luiz e Sra Eli Lucacin: Davi, Polaca, Natalia, Ana Luiza, Luiz, Simone, Victor, Emanuele, por me receberem em sua casa como um membro da família e também as boas conversas dos almoços de domingo.
Aos novos amigos que me acolheram em Moreira Sales durante o experimento: Sra Dinha, Joelma, Carolina, Paulinho, Jossely, Sr Décio.
Ao amigo Vinicius Gonçalves Pinheiro, um grande irmão, por todo apoio, incentivo e por ser um exemplo de competência e dedicação, sempre me mostrando o caminho correto.
À todos os funcionários da Fazenda e Haras Simone: Sr. Manoel, Leonel, Leopoldo, Alexandre (Gordo), Renato, Sra Teresa, Janete, por auxiliarem de uma forma direta ou indireta no experimento e também pelos bons momentos de trabalho junto.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia (instituto de Biociencias – UNESP- BOTUCATU): Luiz Antonio de Oliveira, Paulo César mioni, Janete Teixeira, Ana Cristina Murcia de Souza. Muito obrigado por toda amizade e os bons momentos juntos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo suporte financeiro, sem o qual não seria possível a realização deste trabalho.
LISTA DE ABREVIATURAS
BE – benzoato de estradiol
CL – corpo lúteo
DIP– dispositivo intravaginal contendo progesterona
eCG – gonadotrofina coriônica equina
EPM - erro padrão da média
FD - folículo dominante
FSH – hormônio folículo estimulante
GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas
IA – inseminação artificial
IATF – inseminação artificial em tempo fixo
IM - via intramuscular
LH – hormônio luteinizante
mg – miligramas
MHz - megahertz
mm - milímetros
PBS - tampão fosfato-salina
pFSH - hormônio folículo estimulante de pituitária suína
PGF2D - prostaglandina F2D
pLH - hormônio luteinizante de pituitária suína
PMSG - gonadotrofina sérica da égua prenhe
P4 - progesterona
TE – transferência de embriões
UI - unidade internacional
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Tratamento superestimulatório utilizado no grupo Controle... 45
Figura 2 - Tratamento superestimulatório utilizado grupo P36... 46
Figura 3 - Tratamento superestimulatório utilizado no grupo P36/eCG... 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Número de folículos (média ± EPM) nos dias 4 (início do tratamento superestimulatório), 6 (aplicação de PGF2D) e 8 (aplicação de LH), em vacas Nelore superestimuladas dos grupos: controle, P36, P36/eCG e P36/FSH+LH... 58
Tabela 2 - Taxa de ovulação (%), número de corpos lúteos, estruturas totais colhidas, embriões viáveis, taxa de viabilidade (%), porcentagem de estruturas totais colhidas em relação ao numero de CL, em vacas Nelore superestimuladas. Os dados
estão representados por média ± EPM... 59
CAPÍTULO 1
Resumo
Abstract
Introdução e Objetivos
Revisão de Literatura
O protocolo denominado P36 tem sido amplamente utilizado para induzir ovulação múltipla e permitir a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) facilitando o manejo de doadoras de embriões. Estudos recentes com o P36 indicam que a substituição das duas últimas doses de FSH por eCG pode melhorar a produção de embriões, possivelmente por sua atividade LH. Objetiva-se com o presente trabalho comparar o protocolo P36 com o tratamento superestimulatório convencional (com observação do estro) e testar, em vacas da raça Nelore, a substituição da eCG pela aplicação simultânea de FSH e LH no último
dia de tratamento superestimulatório. Vacas Nelore (n=16) foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos: superovulação convencional com observação de estro (Controle), P36, P36/eCG e P36/FSH+LH. Os tratamentos foram feitos em modelo cross-over, ou seja todos os animais passaram pelos 4 tratamentos. No grupo Controle, o tratamento superestimulatório iniciou 10 dias após a observação do estro. As aplicações de FSH foram feitas durante 4 dias consecutivos (133mg, IM), duas vezes ao dia em doses decrescentes. Dois dias após o início do tratamento as doadoras receberam uma dose
luteolítica de d-cloprostenol (150µg, IM). As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas
após a detecção do estro. No grupo P36, em dia aleatório do ciclo estral (D0), as doadoras
receberam um dispositivo intravaginal de progesterona (1g) e benzoato de estradiol (3 mg,
IM). O FSH (133mg, IM) foi administrado em doses decrescentes, 2 vezes ao dia durante o
(Proc GLM, SAS). O tratamento P36/ FSH+LH diminuiu o número de embriões viáveis (0,32±0,46) quando comparado aos demais tratamentos: Controle (1,73±0,48), P36 (2,07±0,48) e P36/eCG (1,76±0,46). Conclui-se que o protocolo P36/FSH+LH não é indicado para induzir ovulações múltiplas em vacas da raça Nelore.
Palavras-chave: FSH, LH, eCG, transferências de embriões, superovulação, Nelore,
The P36 protocol has been widely used to induce multiple ovulation and allow for fixed-time artificial insemination (FTAI) facilitating the management of embryo donors. Recent studies with the P36 protocol indicate that the replacement of the last two doses of FSH by eCG can improve embryo yield, possibly due to its LH activity. The objective of this study was to compare the P36 protocol with conventional superestimulatory treatments (with estrus observation) and to test, in Nelore cows, the replacement of eCG by the simultaneous administration of FSH and LH on the last day
compared to other treatments: control (1.73 ± 0.48), P36 (2.07 ± 0.48) and P36/eCG (1.76 ± 0.46). In conclusion, the protocol P36 / FSH + LH is not indicated to induce multiple ovulation in Nelore cows.
Os animais de raças zebuínas (Bos indicus) constituem a maior parte do rebanho bovino de corte em regiões de clima tropical, devido a maior tolerância ao estresse térmico e resistência aos parasitos, em relação aos animais de raças européias (Bos
taurus). O rebanho de corte brasileiro (cerca de 205 milhões de cabeças, IBGE, 2009) é
composto em sua maior totalidade por animais da raça Nelore (ACBN, 2008), criado principalmente em regime extensivo. O emprego de biotecnologias, tais como a inseminação artificial (IA) e transferência de embriões (TE), ainda é pouco empregado em
animais da raça Nelore, devido a dificuldade de observação do cio (requer mão de obra treinada) aliado curta duração de estro dessas fêmeas e com alta incidência de manifestação noturna (Pinheiro et al., 1998).
A partir do conhecimento detalhado da dinâmica folicular das fêmeas bovinas (Savio et al., 1988; Sirios e Fortune, 1988; Ginther et al., 1989) tornou-se possível o desenvolvimento de protocolos de tratamentos hormonais capazes de regular o crescimento folicular e o momento da ovulação, permitindo que a inseminação artificial seja realizada em tempo fixo (IATF), ou seja sem a observação de cio (Barros et al., 1998; Bó et al., 2003; Ereno et al., 2007).
Segundo o relatório da Sociedade Internacional de Transferência de embriões (IETS, 2009), apesar da crescente produção brasileira de embriões in vitro (256.000), foram produzidos 42.000 embriões in vivo (Stroud e Bó, 2009), o que projeta
aproximadamente 12.000 superovulações por ano realizadas na América do Sul. Esses resultados destacam o Brasil no cenário mundial de produção de embriões.
Dentre os tratamentos superovulatórios utilizados em raças zebuínas, destaca-se o protocolo P36 proposto por Barros & Nogueira (2001) no qual a fonte de progesterona
(CIDR-B£
ou DIB£
) é mantida por até 36 horas após a aplicação de PGF₂D (daí a
denominação P36) e a ovulação é induzida com LH exógeno, administrado 12 horas mais tarde. Graças à administração exógena de LH é possível controlar o momento da ovulação, que ocorre entre 24 e 36 horas após a administração desta gonadotrofina (Nogueira & Barros, 2003). Consequentemente, a IA é realizada em tempo fixo (IATF) 12 e 24 horas após a aplicação de LH, dispensando a detecção do estro das doadoras.
Em fêmeas Bos taurus o P36 não se mostrou tão eficaz quanto em vacas Bos
indicus (Baruselli et al., 2006). Estes dados motivaram ajustes no protocolo P36, onde a administração do indutor de ovulação foi atrasada em 12 horas, tornando-o eficaz também em raças europeias (Martins et al., 2005; Chesta et al., 2007).
Na tentativa de aumentar a produção de embriões, Barcelos et al. (2006) testaram a possibilidade de substituir as duas ultimas doses de FSH por eCG no protocolo P-36. A
eCG, é uma gonadotrofina que possui atividade FSH e LH e portanto poderia estimular a maturação folicular final após a fase de desvio folicular quando ocorre a transição da dependência de FSH para LH. Os resultados positivos obtidos por Barcelos et al. (2007) com o uso de eCG no protocolo P-36 na raça Nelore, foram confirmados na raça Sindi (Mattos et al., 2011) e Brangus (Reano et al., 2009).
FSH+LH, no último dia do tratamento do protocolo superestimulatório P36, na raça Angus (Rosa, 2010).
Objetiva-se com o presente trabalho comparar o protocolo P36 com o tratamento superestimulatório convencional (com observação do estro) e testar, em vacas da raça Nelore, a substituição da eCG pela aplicação simultânea de FSH e LH no último dia de tratamento superestimulatório.
Foliculogênese
Admite-se que o início da foliculogênese em fêmeas mamíferas ocorre na fase fetal, quando as células germinativas primordiais migram do saco vitelino para a gônada em formação, originando as oôgonias. Estas diferenciam-se em oócitos (iniciam o processo de divisão meiótica, o qual é interrompido em prófase da meiose I até o recrutamento folicular), os quais, associados com as células da granulosa,
constituem os folículos primordiais. Esses folículos representam a fonte da qual serão recrutados os folículos para o crescimento durante toda a vida, sendo que os ovários
pareados de um indivíduo contém em torno de 350.000 a 1.100.00 desses folículos no nascimento (humanos: Gougeon, 1996) e de 16.000 a 240.000 em bovinos (Erickson, 1995).
Recrutamento Folicular
Diferentemente do estágio pré-antral, o desenvolvimento folicular antral é criticamente dependente do suporte de gonadotrofinas. Em várias espécies domésticas, os folículos antrais são recrutados e crescem simultaneamente sob o controle das gonadotrofinas (Fortune et al., 2001; Ginther et al., 2003).
O desenvolvimento folicular de bovinos ocorre em um padrão de ondas. Cada
onda de crescimento folicular é caracterizada por um grupo de pequenos folículos que são recrutados (emergência folicular) e iniciam uma fase de crescimento comum por
cerca de 3 dias (Ginther et al., 2003). Destes, apenas um continua seu desenvolvimento (folículo dominante), enquanto os outros sofrem decréscimo de tamanho (folículos subordinados, Lucy et al., 1992), estabelecendo-se então, o fenômeno denominado de desvio folicular. Neste momento o diâmetro médio do maior folículo é 8,5mm para Bos taurus (Holandês, Ginther et al., 1996) e de 6,0mm para
Bos indicus (Nelore, Sartorelli et al., 2005, Gimenes et al., 2008; Ereno, 2008) Após o
desvio de crescimento folicular, e na presença de altos níveis de progesterona que inibe o pico pré ovulatório de LH o folículo dominante torna-se anovulatório. A partir deste momento começa o processo de atresia e perda da dominância, dando início a uma nova onda de crescimento folicular (Ginther et al., 1989; Webb et al., 2004). Por outro lado, se o folículo dominante estiver presente no momento da regressão luteínica, ocorrerá ovulação do mesmo (Fortune et al., 2004).
A emergência da onda de crescimento folicular, coincide com um aumento nas concentrações plasmáticas de FSH, responsável pelo recrutamento de um grupo de folículos antrais menores que 4 mm de diâmetro (Fortune et al., 2001; Mihm & Austin,
2002), com média de crescimento semelhantes entre si (Gastal et al., 2004) durante aproximadamente 2 a 3 dias (Jaiswall et al., 2004). Aproximadamente 20 a 30 folículos
crescimento e a ovulação de vários folículos através da administração de gonadotrofinas (Adams, 1994). Além da ação das gonadotrofinas, também se tornou evidente que fatores de crescimento produzidos localmente constituem moléculas estimuladoras e reguladoras chave para os folículos antrais, atuando por meio de mecanismos parácrinos e endócrinos (Webb et al., 2003; Fortune et al., 2004).
Existem diferenças na dinâmica folicular entre Bos taurus e Bos indicus. Uma particularidade observada é que em zebuínos há maior incidência de 3 ondas de
crescimento folicular por ciclo estral (Figueiredo et al., 1997; Gambini et al., 1998; Viana et al., 2000; Mollo et al., 2007) enquanto em taurinos ocorre o padrão de 2 ondas (Sávio et al., 1988; Sirois & Fortune, 1988; Ginther et al., 1989; Wolfenson et al., 2004). Em geral, o Bos indicus apresenta maior numero de folículos recrutados durante a onda folicular em relação ao Bos taurus (revisto por Sartori e Barros, 2011).
Tratamentos para induzir múltiplas ovulações
Entre os agentes superestimulatórios testados destacam-se a gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) ou (PMSG) que é produzida pelos cálices endometriais da égua prenhe entre os dias 40° a 120º de gestação (Combarnous, 1992). Quando administrada em outras espécies a eCG pode exercer atividade tanto de FSH como de LH, sua meia vida é longa (40 horas), persiste por até 10 dias na circulação de fêmeas bovinas devido à proporção de ácido siálico (10 a 15%) presente na sua molécula (Dieleman et al., 1993) e também possui alto peso molecular o que dificulta a sua filtração glomerular (revisado por Souza, 2008). Por esse motivo ela pode ser administrada isoladamente (Rowson et al., 1972; Elsden et al., 1976; Boland et al., 1978) ou associada a soro anti-PMSG (Alfuraiji et al., 1993; Gonzalez et al., 1994).
ainda, FSH recombinante bovino (Looney & Bondioli, 1988; Bellows et al., 1991; Wilson et al., 1993). O uso do FSH foi amplamente estudado como agente indutor de superovulação. Essas pesquisas envolviam dose, eficiência de produtos comerciais e as variações nos índices FSH:LH de diferentes produtos comerciais (Donaldson e Ward, 1987; Donaldson, 1990). Estes trabalhos caracterizaram a diferença de potência do FSH (Braileanu et al., 1998) e a variação da relação FSH:LH existente entre diferentes produtos comerciais e dentro de um mesmo produto. Altas concentrações de LH promovem um efeito negativo relacionado à qualidade e produção embrionária bovina, demonstrado por Willmot (1990), Gonzalez et al. (1990) e Mapletoft et al. (2002). A partir desses trabalhos sugeriu-se que o máximo de contaminação de LH no FSH seja de aproximadamente 15 a 20%. Devido ao FSH ter uma meia vida curta (estimada em 5 horas ou menos), há a necessidade de 2 aplicações diárias (Monniaux et al., 1983) durante 4 dias consecutivos para induzir SOV (Barros & Nogueira, 2001 e 2005; Baruselli et al., 2006).
Vários tratamentos para induzir múltiplas ovulações (SOV) foram propostos nos últimos anos (Barros & Nogueira, 2001, Baruselli et al., 2006; Barros et al., 2010). Um dos primeiros protocolos de superovulação utilizava o cio natural como referência. O tratamento superovulatório iniciava-se entre os dias 8 a 12 após a manifestação do estro, coincidindo com o inicio da emergência da segunda onda folicular. (Mapletoft et al., 2002).
(Bergfelt et al., 1994; Bodensteiner et al., 1996; Hill & Kuehner, 1996) e sincronizar o início da emergência das ondas foliculares (Bó et al., 1995, 2003).
Já foi amplamente demonstrado que o uso de uma fonte de progesterona (dispositivos intravaginais e implantes auriculares), associada à administração intramuscular de estrógeno, promove atresia dos folículos e origina uma nova onda folicular, cerca de 4 dias após o início do tratamento (revisto por Bó et al., 1995, 2003). Diante a estes dados e a fim de evitar a presença de um folículo dominante o tratamento superestimulatório com FSH começa justamente no início da onda folicular, ou seja, 4 dias após a colocação do dispositivo intravaginal e administração de estrógeno. Dois dias após a primeira injeção de FSH, é administrada uma dose
luteolítica de PGF2D e 12 horas mais tarde a fonte de P4 é removida. As doadoras são
inseminadas artificialmente 12 e 24 horas após a detecção do cio. Seis a sete dias mais tarde os embriões são colhidos, classificados e congelados ou inovulados. Este protocolo apresenta duas vantagens, pode ser iniciado em qualquer dia do ciclo estral e dispensa a observação do cio base. Porém, a detecção do cio para IA das doadoras
ainda é necessária.
Observou-se que nem todos os folículos que respondiam aos tratamentos de
SOV ovulavam, possivelmente por não terem se desenvolvido normalmente ou por não possuírem quantidade suficiente de receptores de LH para responderem ao pico pré-ovulatório de LH (Xu et al., 1995; D'Occhio et al., 1997; Liu et al., 1998). Portanto, estratégias que atrasam o pico pré-ovulatório de LH foram utilizadas na tentativa de aumentar o número de embriões (D'Occhio et al., 1997; Van de Leemput et al., 2001) ou ainda para viabilizar a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) após a superovulação (Barros & Nogueira, 2001 e 2005; Baruselli et al., 2006).
o número de embriões viáveis quando comparados a protocolos com detecção do estro (Barros e Nogueira 2001). Porém, estes tratamentos permitiram controlar o momento da ovulação, possibilitando a utilização da IATF. A partir destes experimentos desenvolveu-se um novo protocolo denominado P-36 (Barros & Nogueira, 2001 e 2005), no qual a fonte de P4 (CIDR-B® ou DIB®) é mantida por até
36 horas após a aplicação de PGF2D (daí a denominação P-36) e a ovulação é
induzida com LH exógeno, administrado 12 horas após a remoção da fonte de P4 (ou
seja, 48 horas após a aplicação de PGF2D). Uma vez que a ovulação ocorre entre 24 e
36 horas após a administração de pLH (Nogueira et al., 2003) a IATF é realizada 12 e 24 horas após a aplicação desta gonadotrofina, evitando a inconveniência da detecção do estro.
Alguns estudos foram realizados na tentativa de se obter a dose ideal tanto do LH como de FSH nos tratamento de SOV. Já foi demonstrado que a redução da dose de 25 para 12,5 mg de pLH em vacas Nelore não altera significativamente o número de embriões viáveis (9,8±1,09, e 9,2±0,77, respectivamente) ou a taxa de viabilidade (73,7 e 69,5%, respectivamente; Nogueira et al., 2007). Ree et al. (2009) observaram em animais Bos taurus, diminuição nas taxas de ovulação (32, 58 e 84%) proporcional a dose de LH utilizada (8, 12,5 e 25mg, respectivamente), indicando a necessidade do emprego de doses mais elevadas de pLH nas raças européias (Bos taurus 25mg) em comparação com as preconizadas na raça Nelore (Bos indicus).
Baruselli et al. (2003), avaliaram diferentes doses de Folltropin-V (100, 133 e 200mg). Os resultados indicaram que é possível reduzir a dose de Folltropin-V para 100mg em doadoras Nelore, sem comprometer a resposta superovulatória e a
qualidade embrionária.
nesses animais (Baruselli et al., 2006). A discrepância nesses resultados pode ser atribuída pelas particularidades fisiológicas que diferenciam vacas Bos taurus e Bos
indicus (Sartori et al., 2010).
Sartori et al. (2001) verificaram que fêmeas Bos taurus ovulam à administração
de LH somente quando os folículos atingem diâmetro acima de 10 mm enquanto que
Bos indicus essa resposta é obtida com folículos ao redor de 8mm (Gimenes et al.,
2008; Simões et al., 2012). A capacidade ovulatória e a expressão de LHR nas
células da granulosa estão relacionadas ao aumento do diâmetro folicular (Simões et al., 2012). Considerando esses dados, poderia se esperar que protocolos nos quais, a administração do indutor da ovulação (pLH ou GnRH) fosse atrasada em 12 horas (P36/LH60), seriam mais efetivos em fêmeas taurinas do que o protocolo P36/LH48, possivelmente pelo primeiro tratamento disponibilizar maior tempo para que os folículos atinjam diâmetros condizentes com a capacidade ovulatória (Martins et al., 2005). Com essa hipótese, a outra alteração no protocolo P36 foi proposta. Observou-se que tanto na raça Holandesa (Martins et al., 2005) quanto na Angus (Chesta et al., 2007) o protocolo P36 se mostrou mais eficaz quando o agente indutor da ovulação (LH ou GnRH), foi aplicado 60 horas (P36/LH60), ao invés de 48 horas (P36/LH48), após a administração de PGF₂α. De forma similar, resultados obtidos por Barcelos et
al. (2006), na raça Bonsmara (⅝ Africâner e ⅜ Hereford e Shorthorn) indicam que a
aplicação de pLH 60 h após a PGF₂α, pode ser vantajosa também para esta raça.
Deve se destacar que o atraso no momento da ovulação foi benéfico para raças européias, porém o mesmo não ocorreu com a raça Nelore, onde esta modificação no protocolo P36 promoveu diminuição no numero de embriões viáveis (Baruselli et al., 2006).
concentrações circulantes de estradiol e progesterona em decorrência da alta atividade esteroidogênica das vacas superovuladas (Price et al., 1999). Como se sabe, o LH é imprescindível para o crescimento final dos folículos e para a completa maturação dos oócitos. Xu et al. (1995) caracterizaram a importância da expressão de receptores de LH nas células da granulosa em bovinos como ponto chave para a transição da dependência de FSH para LH. Uma maneira de suprir a deficiência endógena dos pulsos de LH pela administração de FSH exógeno (geralmente extrato de pituitária suína contendo FSH e baixa concentração de LH), seriam administrações freqüentes de GnRH, aumentando, assim, o número de folículos pré-ovulatórios provenientes do tratamento superestimulatório (Price et al., 1999; Melo et al., 2004).
Na raça Brangus, o protocolo P-36/eCG melhorou a quantidade de embriões viáveis (10,9 ± 1,5) quando comparado ao protocolo P36 (7,1 ± 1,4; Reano et al., 2009). Resultados positivos também foram obtidos em trabalhos com a raça Sindi (Bos
indicus), onde os autores verificaram que a adição de eCG no protocolo P36
aumentou o número de embriões viáveis (5,8 ± 1,3 vs 2,6 ± 0,7; p < 0,01, Mattos et al., 2011).
Considerando os resultados satisfatórios obtidos pela adição da eCG ao P36,
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CAPÍTULO 2
EFICIÊNCIA DO PROTOCOLO SUPERESTIMULATÓRIO P36,
ASSOCIADO À ADMINISTRAÇÃO DE eCG OU LH EM ANIMAIS
DA RAÇA NELORE
Este artigo científico está de acordo com as normas para publicação na
Eficiência do protocolo superestimulatório P36, associado à administração de eCG ou LH, em animais da raça Nelore
Running title:
Protocolo P36 associado à aplicação de eCG ou LH.
José R. L. M. Cury, Eduardo Lucacin, Barbara Loureiro, Ronaldo L. Ereno, Ciro M. Barrosa
Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista (UNESP), São Paulo, Brasil
a
Resumo 1
2
O protocolo denominado P36 tem sido amplamente utilizado para induzir ovulação múltipla 3
e permitir a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) facilitando o manejo de doadoras 4
de embriões. Estudos recentes com o P36 indicam que a substituição das duas últimas 5
doses de FSH por eCG pode melhorar a produção de embriões, possivelmente por sua 6
atividade LH. Objetiva-se com o presente trabalho comparar o protocolo P36 com o 7
tratamento superestimulatório convencional (com observação do estro) e testar, em vacas 8
da raça Nelore, a substituição da eCG pela aplicação simultânea de FSH e LH no último 9
dia de tratamento superestimulatório. Vacas Nelore (n=16) foram distribuídas 10
aleatoriamente em 4 grupos: superovulação convencional com observação de estro 11
(Controle), P36, P36/eCG e P36/FSH+LH. Os tratamentos foram feitos em modelo cross-12
over, ou seja todos os animais passaram pelos 4 tratamentos. No grupo Controle, o 13
tratamento superestimulatório iniciou 10 dias após a observação do estro. As aplicações de 14
FSH foram feitas durante 4 dias consecutivos (133mg, IM), duas vezes ao dia em doses 15
decrescentes. Dois dias após o início do tratamento as doadoras receberam uma dose
16
luteolítica de d-cloprostenol (150µg, IM). As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas
17
após a detecção do estro. No grupo P36, em dia aleatório do ciclo estral (D0), as doadoras
18
receberam um dispositivo intravaginal de progesterona (1g) e benzoato de estradiol (3 mg,
19
IM). O FSH (133mg, IM) foi administrado em doses decrescentes, 2 vezes ao dia durante o
20
D4 ao D7. No D6, foi aplicado d-cloprostenol (150µg, IM) e o dispositivo intravaginal foi 21
removido 36h mais tarde. No dia 8, a ovulação foi induzida com 12,5mg de pLH e os 22
animais foram inseminados artificialmente em tempo pré-determinado, sem a observação 23
de estro, 12 e 24 horas após a aplicação de pLH. As vacas do grupo P36/eCG foram 24
tratadas de forma semelhante ao P36, exceto que as duas últimas doses de FSH foram 25
substituídas por duas doses de 200UI de eCG (totalizando 400UI, IM). O protocolo do 26
de pFSH, os animais também receberam duas doses de 1,0mg de pLH (2mg, via IM). A 28
coleta de embriões foi realizada 7 dias após a IA. Os dados foram analisados por ANOVA 29
(Proc GLM, SAS). O tratamento P36/ FSH+LH diminuiu o número de embriões viáveis 30
(0,32±0,46) quando comparado aos demais tratamentos: Controle (1,73±0,48), P36 31
(2,07±0,48) e P36/eCG (1,76±0,46). Conclui-se que o protocolo P36/FSH+LH não é 32
indicado para induzir ovulações múltiplas em vacas da raça Nelore. 33
Palavras-chave: FSH, LH, eCG, transferências de embriões, superovulação, Nelore,
34
Bos indicus.
35 36
1. Introdução
37 38
Os animais de raças zebuínas (Bos indicus) constituem a maior parte do rebanho 39
bovino de corte em regiões de clima tropical, devido a maior tolerância ao estresse 40
térmico e resistência aos parasitos, em relação aos animais de raças européias (Bos 41
taurus). O rebanho de corte brasileiro (cerca de 205 milhões de cabeças, [1]) é composto
42
em sua maior totalidade por animais da raça Nelore [2], criado principalmente em regime 43
extensivo. O emprego de biotecnologias, tais como a inseminação artificial (IA) e 44
transferência de embriões (TE), ainda é pouco empregado em animais da raça Nelore, 45
devido a dificuldade de observação do cio (requer mão de obra treinada) aliado curta 46
duração de estro dessas fêmeas e com alta incidência de manifestação noturna [3]. 47
A partir do conhecimento detalhado da dinâmica folicular das fêmeas bovinas [4-6] 48
tornou-se possível o desenvolvimento de protocolos de tratamentos hormonais capazes 49
de regular o crescimento folicular e o momento da ovulação, permitindo que a 50
inseminação artificial seja realizada em tempo fixo (IATF), ou seja sem a observação de 51
cio [7-9]. 52
Segundo o relatório da Sociedade Internacional de Transferência de embriões 53
foram produzidos 42.000 embriões in vivo [10], o que projeta aproximadamente 12.000 55
superovulações por ano realizadas na América do Sul. Esses resultados destacam o 56
Brasil no cenário mundial de produção de embriões. 57
Entretanto, os resultados obtidos nos tratamentos superestimulatórios continuam 58
sendo variáveis e imprevisíveis, devido a inconstância na resposta supervolatória, na taxa 59
de fertilização e desenvolvimento dos embriões [11-15]. Esta variação individual a SOV 60
foi relata tanto em vacas Nelore (Bos indicus, [16]) quanto em vacas Holandesas (Bos 61
taurus, [17]).
62
Dentre os tratamentos superovulatórios utilizados em raças zebuínas, destaca-se 63
o protocolo P36 proposto por Barros & Nogueira [14] no qual a fonte de progesterona 64
(CIDR-B£ ou DIB£) é mantida por até 36 horas após a aplicação de PGF₂D (daí a 65
denominação P36) e a ovulação é induzida com LH exógeno, administrado 12 horas mais 66
tarde. Graças à administração exógena de LH é possível controlar o momento da 67
ovulação, que ocorre entre 24 e 36 horas após a administração desta gonadotrofina [18]. 68
Consequentemente, a IA é realizada em tempo fixo (IATF) 12 e 24 horas após a 69
aplicação de LH, dispensando a detecção do estro das doadoras. 70
Em fêmeas Bos taurus o P36 não se mostrou tão eficaz quanto em vacas Bos 71
indicus [15]. Estes dados motivaram ajustes no protocolo P36, onde a administração do 72
indutor de ovulação foi atrasada em 12 horas, tornando-o eficaz também em raças 73
europeias [17,19]. 74
Na tentativa de aumentar a produção de embriões, Barcelos et al. [20] testaram a 75
possibilidade de substituir as duas ultimas doses de FSH por eCG no protocolo P-36. A 76
eCG, é uma gonadotrofina que possui atividade FSH e LH e portanto poderia estimular a 77
maturação folicular final após a fase de desvio folicular quando ocorre a transição da 78
dependência de FSH para LH. Os resultados positivos obtidos por Barcelos et al. [21] 79
com o uso de eCG no protocolo P-36 na raça Nelore, foram confirmados na raça Sindi 80
Dando continuidade ao trabalho de Barcelos, Rosa ([24], na raça Angus) e 82
Oliveira ([25], na raça Nelore) testaram a substituição da eCG por LH, no último dia do 83
tratamento superestimulatório. Observaram que a aplicação de apenas LH no último dia 84
do tratamento superestimulatório, diminuía [24] ou não promovia alteração [25] na 85
produção de embriões. No entanto, quando o LH foi administrado juntamente com as 86
duas ultimas doses de FSH em vacas Angus, (P36/FSH+LH), a produção de embriões 87
viáveis foi comparável ao observado em doadoras tratadas com o protocolo P36/eCG. 88
Estes resultados indicam que é possível substituir a eCG por FSH+LH, no último dia do 89
tratamento do protocolo superestimulatório P36, na raça Angus [24]. 90
Objetiva-se com o presente trabalho comparar o protocolo P36 com o tratamento 91
superestimulatório convencional (com observação do estro) e testar, em vacas da raça 92
Nelore, a substituição da eCG pela aplicação simultânea de FSH e LH no último dia de 93
tratamento superestimulatório. 94
A hipótese a ser testada é que a aplicação de LH e FSH no último dia do 95
tratamento superestimulatório, aumenta a taxa de ovulação, a qualidade e a quantidade 96
de embriões viáveis produzidos. 97
98
2. Materiais e Métodos
99 100
O experimento foi realizado na Fazenda e Haras Simone, município de Moreira 101
Sales (Latitude 24.012982 S e longitude 53.037180W) , estado do Paraná, Brasil, durante 102
o período de fevereiro de 2011 a fevereiro de 2012. Foram utilizadas vacas Nelore 103
multíparas, puras de origem (PO; Bos Indicus, n=16), com faixa etária entre 4 a 9 anos, 104
escore de condição corporal 3,0 a 4,5 (escala de 1 a 5; [26]) mantidas em regime de 105
pasto Brachiaria brizantha e Cynodon sp com acesso irrestrito á água e sal 106
Antes de se iniciar os tratamentos, as vacas foram previamente avaliadas por exame 108
ultrassonográfico (Tringa Linear Esaote Pie Medical transdutor transretal 3,5 a 15 MHz) 109
para a confirmação de ciclicidade e ausência de quaisquer patologias reprodutivas. As 110
doadoras foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos: Controle, P36, P36/eCG e 111
P36/FSH+LH. O experimento foi delineado em modelo cross-over, ou seja, todas as 112
vacas receberam os quatro tratamentos. As inseminações foram feitas por apenas um 113
inseminador, utilizando sêmen de um único touro e de uma mesma partida. Para facilitar 114
o manejo dos animais, com relação à aplicação dos hormônios e avaliações 115
ultrassonográficas durante os tratamentos, as vacas foram numeradas de 1-4 (os 116
números correspondiam aos grupos que pertenciam no momento em que eram tratadas, 117
n=4 em cada grupo). 118
Nas vacas do grupo controle o tratamento superestimulatório teve como referência 119
o dia da manifestação do estro (D0). Dez dias após (D10) administrou-se, FSH (133mg, 120
IM, Folltropin-V®, Bioniche, Ontário, Canadá), 2 vezes ao dia, em doses decrescentes 121
(40, 30, 20 e 10% da dose total, respectivamente) durante 4 dias consecutivos. No (D12) 122
às 7:00 h, foi administrada uma dose de um análogo da PGF2D (150µg, d-cloprostenol,
123
IM, Prolise, Tecnopec, São Paulo, Brasil). Após o término da SOV (D13) iniciou-se a 124
observação do estro e 12 e 24 h após a manifestação do mesmo, realizou-se a 125
inseminação artificial. A coleta dos embriões foi realizada 7 dias após a primeira IA. 126
127
Figura 1: Tratamento superestimulatório utilizado no Grupo Controle. US = ultrassom; IA =
128
130
As vacas do grupo P36, receberam em dia aleatório do ciclo estral (D0), um 131
dispositivo intravaginal liberador de progesterona (DIP, 1g, PRIMER®, Tecnopec, São 132
Paulo, Brasil) juntamente com a aplicação de 3 ml de benzoato de estradiol (BE, 3mg, 133
IM, RIC-BE£
, Syntex, Buenos Aires, Argentina ). Quatro dias mais tarde (D4) foi iniciado o 134
tratamento superestimulatório com pFSH (133mg, Folltropin-V®, IM), 2 vezes ao dia, 135
durante 4 dias consecutivos, em doses semelhantes as utilizadas no grupo controle. No 136
D6 pela manhã foi administrada uma dose de um análogo da PGF2D (150µg, de
d-137
cloprostenol, IM, Prolise£). Trinta e seis horas após (D7, às 19 h), o DIP foi removido. No 138
D8 (manhã), a ovulação foi induzida pela aplicação de uma dose de LH (Lutropin®, 139
12,5mg, IM, Bioniche Animal Health, Ontário, Canadá) e a IATF foi realizada 12 e 24 140
horas após. 141
142
Figura 2: Tratamento superestimulatório utilizado no grupo P36. +P4 = inserção do
143
dispositivo intravaginal; -P4 = retirada do dispositivo intravaginal; BE = 144
benzoato de estradiol; US = ultrassom; IATF = inseminação artificial em 145
tempo fixo; PGF₂α = prostaglandina F₂α.
146
147
O tratamento dos animais do grupo P36/eCG foi semelhante aos do grupo P36, 148
exceto que as duas últimas doses de FSH foram substituídas por duas doses (200UI, 149
cada) de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG, totalizando 400UI, IM, Novormon£, Sintex, 150
152
Figura 3: Tratamento superestimulatório utilizado no Grupo P36/eCG. US = ultrassom; BE
153
= benzoato de estradiol; IATF = inseminação artificial em tempo fixo; PGF₂α = 154
prostaglandina F₂α; eCG = gonadotrofina coriônica equina. 155
156
No grupo P36/FSH+LH, o tratamento foi semelhante ao P36, porém, juntamente 157
com as duas últimas doses de FSH, aplicou-se também 2 doses de 1mg cada, de LH 158
(Lutropin®, 2mg, IM, Bioniche Animal Health, Ontário, Canadá). 159
160
Figura 4: Tratamento superestimulatório utilizado no Grupo P36/FSH+LH. US = ultrassom;
161
BE = benzoato de estradiol; IATF = inseminação artificial em tempo fixo; PGF₂α 162
= prostaglandina F₂α. 163
164
A escolha da dose 1mg de LH, administrada simultaneamente com as doses de 165
FSH no ultimo dia do tratamento superestimulatório, foi determinada pelos resultados de 166
um experimento preliminar, em vacas Nelore, onde as doses de 12,5; 6,25; 3,12mg de LH 167
induziram ovulação em 80% dos animais, ao passo que as vacas que receberam 1,56 mg 168
170
2.1. Ultrassonográfia 171
172
As avaliações ultrassonográfica foram realizadas nos dias indicados nas figuras, 173
para acompanhar a dinâmica folicular (ausência de folículo dominante no início do 174
tratamento superestimulatório para o grupo controle), eficácia dos tratamentos 175
superestimulatórios (número total de folículos no D4, D6 e D8), taxa de ovulação e 176
contagem de corpos lúteos (D16). 177
178
2.2. Coleta de embriões 179
180
A coleta de embriões foi feita por um mesmo veterinário, pelo método não 181
cirúrgico, 7 dias após as inseminações, através de lavagem uterina utilizando tampão 182
fosfato-salina (PBS). Os embriões foram avaliados e classificados como viáveis, 183
degenerados e estruturas não fertilizadas. A classificação da viabilidade dos embriões 184
obedeceu as normas da Manual da Sociedade internacional de Transferencia de 185
Embriões, onde grau 1 (GI, excelente ou bom), grau 2 (GII, regular), grau 3 (GIII, pobre) 186
e grau 4 (GIV, degenerado, [28]). Os embriões recuperados (grau I e II) foram 187
criopreservados com etilenoglicol (Solução de Congelamento Etileno Glycol Freeze, 188
Embriolife®). 189
190
2.3. Analise Estatística. 191
192
O quadrado mínimo das médias (LSMeans ± o erro padrão da média) da 193
quantidade de folículos nos dias 4, 6 e 8, corpos lúteos, estruturas totais colhidas, 194
embriões viáveis e a porcentagem de ovulação, viabilidade dos embriões, corpos 195
degenerados foram analisados por analise de variância (ANOVA), utilizando PROC GLM 197
do programa SAS (SAS for Windows, Version 9.2 Cary, NC). Os dados de porcentagem 198
foram transformados para arcoseno antes das analises. O efeito dos tratamentos 199
superestimulatórios foi considerado fixo, enquanto o efeito de rodada foi considerado 200
aleatório. Diferenças individuais entre os tratamentos foram comparadas por 201
probabilidades de diferenças individuais (PDIFF; SAS 9.2). As diferenças foram 202
consideradas significativas quando o valor de p<0,05. 203
204
3. Resultados 205
206
Não houve diferença entre os grupos com relação ao número total de folículos nos 207
dias 4 e 6 (p>0,05; tabela 1). Porém, o grupo Controle apresentou maior quantidade de 208
folículos no D8, quando comparado aos animais do P36FSH+LH e não diferiu dos grupos 209
P36 e P36/eCG (p<0,05). 210
211
Tabela 1. Número de folículos (média ± EPM) nos dias 4 (início do tratamento
212
superestimulatório), 6 (aplicação da PGF2α) e 8 (aplicação do LH). em vacas
213
Nelore superestimuladas dos grupos: Controle, P36, P36/eCG, P36/FSH+LH. 214
Grupos Experimentais (n=16)
Controle P36 P36/eCG P36/FSH+LH
Folículos no D4 25,69±2,59 A 27,8±2,5 A 22,76±2,4 A 22,86±2,38 A
Folículos no D6 16,33±1,62 A 15,21±1,56 A 15,03±1,5 A 12,88±1,49 A
Folículos no D8 20,35±1,72A 16,93±1,65 A B 18,28±1,59 A B 15,57±1,58 B A, B Letras diferentes, na mesma linha, indicam diferença significativa entre os tratamentos 215
(p<0,05) 216
A taxa de ovulação do grupo Controle foi inferior ao do grupo P36 (Tabela 2). No 217
grupo P36/FSH+LH o numero de estruturas totais colhidas foi inferior aos grupos Controle 218
apresentou o menor valor em relação aos demais, conseqüentemente, a taxa de 220
viabilidade dos embriões também foi menor no grupo P36/FSH+LH quando comparado 221
aos demais (p<0,05; tabela 2). 222
223
Tabela 2. Taxa de ovulação (%), número de corpos lúteos, estruturas totais colhidas, embriões
224
viáveis, taxa de viabilidade (%) e porcentagem de estruturas totais colhidas em 225
relação ao numero de CL, em vacas Nelore superestimuladas. Os dados estão 226
representados por média ± EPM. 227
Grupos Experimentais (n=16)
Controle P36 P36/eCG P36/FSH+LH
Taxa de Ovulação (%) 30±5,95 A 48,8±5,74 B 36,6±5,51AB 39,34±5,47 AB
Nº de Corpos lúteos 5,8±1,01 A 7,59±1,02 A 6,82±0,98 A 6,03±0,97 A
Estruturas totais 2,51±0,71 A B 3,76±0,71 A 2,51±0,68 A B 1,35±0,68 B
Embriões viáveis 1,73±0,48 A 2,07±0,48 A 1,76±0,46 A 0,32±0,46 B
Taxa de viabilidade (%) 74,72±12,3 A 68,75±10,8 A 63,38±10,8 A 23,20±12,45 B
Estruturas totais/CL (%) 45,36±8,78 A 43,43±7,9 A 41±7,81 A 26,17±8,42 A
A, B Letras diferentes, na mesma linha, indicam diferença significativa entre os tratamentos 228
(p<0,05) 229
230
A proporção de embriões GII foi maior no grupo Controle em relação ao grupo 231
P36/FSH+LH (p<0,05) e não diferiu dos grupos P36 e P36/eCG ( p>0,05; tabela 3). 232
Nenhuma diferença foi observada quanto à proporção de embriões GI e GIII entre os 233
grupos (p>0,05; tabela 3). 234
Tabela 3. Porcentagem de embriões (média ± EPM) classificados como GI, GII, GIII e
236
embriões degenerados, de acordo com suas características morfológicas. 237
Grupos Experimentais (n=16)
Controle P36 P36/eCG P36/FSH+LH
GI 43,25±13,41 A 45,85±11,83 A 38,88±11,87 A 23,83±13,58 A
GII 31,33±10,81 A 22,27±9,54 A B 18,02±9,57 A B 0±10,94 B
GIII 0±2,86 A 0±2,52 A 6,4±2,53 A 0±2,9 A
Degenerados 21,77±12,29 A 31,02±10,85 A 33,48±10,88 A 76,62±12,44 B
A, B238 Letras diferentes, na mesma linha, indicam diferença significativa entre os tratamentos (p<0,05) 239 240 4. Discussão 241 242
No protocolo P36/FSH+LH a resposta ao tratamento superestimulatório e a taxa 243
de ovulação foram semelhantes às dos grupos Controle, P36 e P36/eCG. Entretanto, 244
contrariando a hipótese inicial deste trabalho, a produção de embriões viáveis foi inferior 245
aos demais grupos experimentais. 246
Este resultado surpreendente difere dos obtidos por Oliveira [25] que, ao utilizar 247
somente LH (2 ou 4mg) em substituição as duas ultimas doses de FSH, não observou 248
diferença na produção de embriões viáveis em relação aos protocolos P36 e P36/eCG. 249
Por outro lado, Rosa [24] relata que houve declínio na quantidade de embriões viáveis ao 250
tratar vacas da raça Angus com o protocolo P36/LH. No entanto, quando associou FSH 251
com LH no último dia do tratamento superestimulatório (protocolo P36/FSH+LH), 252
observou aumento na produção de embriões viáveis, em relação ao grupo P36/LH e 253
Os dados reportados por Rosa ([24], protocolo P36/FSH+LH), aliados aos 255
resultados obtidos com o uso de eCG (possui atividade FSH e LH) no último dia do 256
tratamento superestimulatório P36, em animais da raça Nelore [21], Sindi [22] e Brangus 257
[23], indicam que talvez haja necessidade de FSH no último dia de tratamento 258
superestimulatório, visto que os tratamentos que apresentaram aumento no número de 259
embriões viáveis incluíam hormônio com atividade FSH (eCG ou FSH+LH). 260
É possível que estas aplicações de FSH, no último dia do tratamento 261
superestimulatório, além de estimularem o crescimento de folículos pequenos que ainda 262
não ultrapassaram a fase de desvio folicular, induzam a expressão de receptores de LH 263
nas células da granulosa [29,30]. Desta forma, ao final do tratamento superestimulatório, 264
a maioria dos folículos estariam aptos a ovular no momento da administração do agente 265
indutor da ovulação (usualmente, LH ou GnRH). 266
A combinação de FSH com LH, no último dia do tratamento superestimulatório, se 267
baseia no trabalho de Price et al. [31], que relataram diminuição progressiva nos pulsos 268
de LH a partir do início de tratamento superestimulatório com FSH, devido possivelmente 269
ao aumento nas concentrações circulantes de estradiol e progesterona, provenientes da 270
maior atividade esteroidogênica das vacas superovuladas. Portanto, a reposição de LH 271
no último dia do tratamento superestimulatório, justifica-se tendo em vista que o aumento 272
da pulsatilidade do LH durante o ciclo estral é importante para o crescimento final e 273
maturação do folículo e do oócito [32, 33, 31]. Além disso, Greve et al. [34] observaram 274
que em animais superestimulados pode haver atraso na maturação citoplasmática do 275
oócito, prejudicando a fertilização e, conseqüentemente, diminuindo as taxas de 276
prenhes. 277
Embora o tratamento superestimulatório promova a diminuição nos pulsos de LH 278
[31], outros estudos mostram que a administração do FSH sem a contaminação de LH 279
promove melhora nos resultados [35,36]. Talvez esses dados possam justificar a 280
Mapletof et al. [37] o grau de contaminação do FSH com LH pode ser prejudicial quando 282
administrado durante os protocolos de superestimulação possivelmente por induzir uma 283
ativação precoce da meiose durante esses tratamentos [38]. No entanto, o mesmo não se 284
observou quando somente o LH (2 ou 4mg) foi administrado no ultimo dia de tratamento 285
da superestimulatório em vacas Nelore [25]. Esta autora observou que no protocolo onde 286
o FSH foi totalmente substituído por LH não houve diferença no número de embriões 287
viáveis recuperados (LH2mg, 3,7±0,8 e LH4mg, 4,2±1,0) quando comparado ao grupo 288
P36/eCG (4,5±0,5). 289
Uma possível ação deletéria do LH poderia ser esperada também nos 290
tratamentos superovulatórios onde a eCG foi utilizada, porém, isto não foi observado em 291
vários trabalhos [21,24,25]. Para o protocolo P36/FSH+LH, uma possibilidade a ser 292
considerada, é que as doses de FSH utilizadas no ultimo dia do tratamento 293
superestimulatório (13,3mg) possuem um total de aproximadamente 2,1mg de LH 294
contaminante, o que juntamente com a administração exógena do LH (2mg), poderia ter 295
fornecido uma dose alta desta gonadotrofina para os animais deste experimento. No 296
entanto, na raça Angus, quando se administrou a dose de 2mg de LH juntamente com as 297
duas ultimas aplicações de FSH, houve tendência de aumento na quantidade de 298
embriões viáveis [24]. Dentre as possíveis explicações para estes resultados conflitantes 299
estão as particularidades fisiológicas que diferenciam fêmeas Bos taurus [32] de Bos 300
indicus [39,40], principalmente em relação a taxa de crescimento folicular e tamanho em
301
que o folículo atinge capacidade ovulatória [41,27]. 302
Conclui-se que o protocolo P36/FSH+LH, contrariamente a hipótese inicial deste 303
trabalho, diminui a produção de embriões viáveis e, portanto, não deve ser indicado como 304
tratamento superestimulatório para vacas Nelore, até que experimentos adicionais 305
confirmem ou contestem os resultados do presente trabalho. 306
307
