artigo original
Associação Entre Polimorfismo Gln27Glu
do Receptor b
2
-Adrenérgico e Hipertensão
Arterial Sistêmica em Obesos Mórbidos
Sandra M. Villares
Marcio C. Mancini
Sérgio Gomez
Ana M. Charf
Eliana Frazzatto
Alfredo Halpern
Grupo de Obesidade e Doenças
Metabólicas do Serviço de
Endocrinologia e Metabologia do
Hospital das Clínicas e Disciplina de
Endocrinologia e Metabologia da
Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, SP.
RESUMO
Há alguns relatos na literatura sugerindo associação entre polimorfismos
do receptor
b
2-adrenérgico com obesidade e outros com hipertensão
arterial. O objetivo do nosso estudo foi estudar a freqüência de um
polimorfismo do receptor
b
2adrenérgico (Gln27Glu) em pacientes
obe-sos (BMI 48 ± 8,2kg/m
2) e relacioná-lo com hipertensão arterial, e níveis
de triglicérides, colesterol, insulina e glicose no sangue. Encontramos
associação deste polimorfismo em obesos com hipertensão arterial.
(Arq
Bras Endocrinol Metab 2000;44/1: 72-80)
Unitermos:
Obesidade; Hipertensão arterial; Receptor
b
-adrenérgico
ABSTRACT
b
2-adrenergic receptors (
b
2AR) are membrane-bound receptors, which
upon binding the endogenous cathecolamines epinephrine and
nore-pinephrine signal to the interior of cells via stimulatory guanine
nucleotide-binding protein Gs. The sympathetic nervous system activation stimulates
energy mobilization and utilization in the adipose tissue that is a favored
target for high-energy substrate storage, mobilization and utilization.
Adrenergic responsiveness may be altered in obesity and could be an
important factor in the pathogenesis and maintenance of obesity state.
In the hypertensive state there is physiological and biochemical evidence
that b-adrenergic responsiveness is diminished in the face of increased
sympathetic tone. Recently, several different polymorphic forms of the
human
b
2AR have been identified in general population, including
N-ter-minal substitutions of glutamine (Gln) for glutamic acid (Glu) at position
27. The aim of this study was to investigate the potential interaction
between the
b
2AR (Gln27Glu) polymorphism and obesity accumulation
and hypertension in morbidly obese subjects. The Ita I genotypes of
b
2AR
were established using RFLP methods in 135 individuals with BMI 48 ±
8.02kg/m
2. The frequency of Gln/Glu was 31.9% and in the homozygous
Glu/Glu was 12.6%. No association was found between BMI, weight gain
during the past years and the Ita I genotypes and neither was associated
with levels of triglycerides, cholesterol, insulin and glucose. Positive
associ-ation was found between blood pressure (systolic and diastolic) and
pre-sence of polymorphism. The results indicate at the first time that prepre-sence
of polymorphism 27Glu may provide a mechanism for enhanced
vascu-lar reactivity and identify a candidate gene for hypertension in this
obesi-ty group.
(Arq Bras Endocrinol Metab 2000;44/1: 72-80)
Keywords:
Obesity; Arterial hypertension;
b
-Adrenergic receptor
O
BESIDADE É UMA DOENÇA DE PREVALÊNCIA elevada e crescente, tanto
em países desenvolvidos (1-3), como em nosso meio (4).
risco dessa doença, e como a interação entre os fatores
genéticos e os fatores ambientais contribui para o
desenvolvimento da doença. Os fatores genéticos
podem ser atenuados ou exacerbados por fatores não
genéticos, sendo, portanto, o fenótipo obeso, um
traço multifatorial estabelecido por uma somatória
desses efeitos.
As evidências mais convincentes da transmissão
genética da obesidade humana originam-se dos
estu-dos de gêmeos, que distinguem-se pelo fato de o
com-ponente ambiental e doméstico ser controlado desde a
vida intra-uterina. Nos vários estudos publicados, os
quoeficientes de hereditariedade (qh) têm variado de
0,4 a 0,98 (5-12). Os estudos de famílias comparam a
concordância de um fenótipo entre indivíduos
aparentados e não aparentados. Há quatro grandes
estudos nesta categoria (13-16), com um quoeficiente
de correlação com diferentes medidas de adiposidade
corporal entre irmãos de aproximadamente 0,3 e
pouco menor entre pais e filhos (15). Porém,
analisa-dos individualmente, encontramos resultaanalisa-dos bastante
variáveis entre a transmissão genética do índice de
massa corpórea e outras medidas de massa adiposa:
nenhuma transmissão genética no Framingham Heart
Study (13), qh de 0,05 no Canadian Fitness Study
(14), qh de 0,25 no Quebec Family Study (15)
(signi-ficante) e qh de 0,40 no Norwegian Family Study (16)
(significante). Os estudos de adoção comparam a
con-cordância do fenótipo entre o adotado e os pais
biológicos versus entre o adotado e os pais adotivos
(15,17-19), com quoeficiente de hereditariedade
cal-culado significante de 0,34 (20). Estudos de linkage
valem-se de modelos matemáticos para estimar a
trans-missão de uma determinada região gênica ligada à
he-rança de um fenótipo específico, utilizando dados
familiares de várias gerações (21-26). É provável que
vários genes interajam, exercendo em conjunto efeitos
importantes em determinadas famílias. Nos estudos de
associação, a freqüência de um determinado
polimor-fismo do DNA é comparada com o fenótipo estudado.
Existem inúmeros estudos de associação e linkage com
resultados positivos com genes candidatos (por
exem-plo, gene da 3-b hidroxi-esteróide desidrogenase (27),
gene da proteína desacopladora mitocondrial (28)),
revisados recentemente (49).
Entre os modificadores ambientais, destacam-se
os fatores demográficos (como idade (29,30), sexo
(31), etnia (32)), os fatores sócio-culturais (como
nível educacional (33), nível sócio-econômico (32),
estado civil), os fatores biológicos (como paridade
(34), climatério (35,36)) e os fatores comportamentais
(como nutrição (37,38), estado psicológico (39),
tabagismo (40), consumo de álcool (41), atividade
física (42,43)).
A obesidade monogênica humana é bastante
rara (por exemplo, deficiência de leptina (44) e
inati-vação do seu receptor (45), síndromes genéticas com
manifestações dismórficas associadas como síndrome
de Bardet-Biedl (46), síndrome de Prader-Willi (47),
síndrome de Alstrom-Hallgren (48).
Variações genéticas podem potencialmente
favorecer o desenvolvimento da obesidade afetando
possíveis mecanismos homeostáticos (49,50). Dos
genes que regulam a taxa metabólica basal, os genes
envolvidos na modulação da função catecolaminérgica,
e particularmente os genes dos receptores
b-adrenérgi-cos ganharam recentemente considerável atenção, pois
apresentam papel central no gasto energético (56).
Comparando os indivíduos obesos com os de peso
normal, há evidências crescentes que nos obesos estes
mecanismos adaptativos do SNS poderiam estar
alte-rados. Poder-se-ia especular que alterações nos
recep-tores adrenérgicos poderiam diminuir a atividade
sim-pática, e consequentemente alterar a lipólise (56).
As catecolaminas iniciam sua ação pela
ocu-pação do adrenorreceptor na superfície da célula
adi-posa. O adipócito humano possui cinco subtipos de
receptores adrenérgicos identificados:
trêsb-adrenér-gicos (b
1, b
2e b
3) (51,52) e dois a-adrenérgicos (a
1e
a
2) (53). Os receptores b-adrenérgicos estimulam a
lipólise e os a
2-adrenérgicos inibem a lipólise (54-56).
Estes receptores são membros das super-famílias de
receptores com sete domínios transmembranários, três
alças intracelulares, três extracelulares, uma porção
extracelular N-terminal e uma porção intracelular
C-terminal, e são acoplados às proteínas
GTP-depen-dentes (proteínas Gs ou Gi), que estimulam ou inibem
a adenil ciclase. A adenil ciclase controla a
concen-tração de adenosina 3',5' monofosfato cíclico (AMPc)
que, por sua vez, controla a atividade da lipase
hor-mônio sensível (57) e estimula a lipólise. No indivíduo
obeso, qualquer modificação que ocorra na cascata da
lipólise pode resultar em alteração da atividade
lipolíti-ca e diminuição da lipólise (56), e ter como
conse-qüência uma oxidação deficiente dos triglicérides.
Os receptores adrenérgicos b
1e b
2apresentam
respostas lipolíticas maiores quando comparados com
os receptores b
3-adrenérgicos em adipócitos brancos
humanos (52). Defeitos no gene do receptor b
3-adrenérgico podem levar a resistência a insulina,
dia-betes mellitus, hipertensão arterial, tendência a taxa
metabólica basal baixa e obesidade (58-63). Embora
presença de polimorfismo do gene do receptor b
3alguns autores demonstram influência nas
característi-cas fenotípicaracterísti-cas (58,59,61,62) e outros não (60,63,64).
Além disso, estudos funcionais com cultura de
adipó-citos humanos não demonstraram influência
signifi-cante da presença do polimorfismo (65,66).
Foram descritos nove polimorfismos do gene
do receptor b
2-adrenérgico humano, dos quais dois
são mais freqüentes (67) e localizam-se na porção
N-terminal do receptor (Figura 1) (69): b
2-AR-16, onde
há substituição de arginina (Arg16) por glicina
(Gly16) e b
2-AR-27, onde há substituição de
glutami-na (Gln27) por ácido glutâmico (Glu27), levando a
alteração substancial da função do receptor (68-70).
Polimorfismos do receptor b
2-adrenérgico
humano foram estudados em pacientes asmáticos, uma
vez que poderiam ser determinantes genéticos de
responsividade a tratamento com drogas b
2-agonistas.
Quando comparados com homozigotos para Gly16,
os homozigotos para Arg16 apresentavam
responsivi-dade 5,3 vezes maior e heterozigotos para b
2-AR-16
apresentavam responsividade 2,3 vezes maior a
albuterol, respectivamente. Não foi encontrada
associ-ação entre o polimorfismo b
2-AR-27 e resposta a
albuterol (71). Muito embora nenhuma dessas
mutações fosse mais prevalente em asmáticos em
relação a pacientes controle, a variante Gly16
aparentemente está associada com formas mais graves
de asma (72) e com asma noturna (73).
Recentemente, o grupo de Peter Arner (74)
investigou a freqüência dessas mutações em 58
mu-lheres não obesas e 82 mumu-lheres obesas, usando como
ponto de corte o índice de massa corpórea de
27kg/m
2. O polimorfismo Gln27Glu apresentou uma
forte associação com obesidade (p = 0,003); 24% das
obesas eram portadores da forma homozigota de
Glu27 contra apenas 3% das mulheres não obesas
(risco relativo ~7; odds ratio = 10,4). As mulheres
homozigotas para Glu27 tinham uma massa adiposa
20kg maior que o grupo controle e adipócitos
maiores. Os heterozigotos não apresentaram
associ-ação com obesidade estatisticamente significante,
tam-pouco os portadores do polimorfismo Arg16Gly. Os
achados sugerem que a variabilidade genética do
receptor b
2-adrenérgico pode ser importante para o
desenvolvimento de obesidade em mulheres.
O sistema nervoso simpático exerce influência
sobre o débito cardíaco, o tônus vascular, a reabsorção
renal de sódio e a liberação de renina, podendo estar
implicado na responsividade vascular e
consequente-mente na hipertensão arterial sistêmica (75).
Polimor-fismos genéticos que alterem a resposta agonista de
receptores a-adrenérgicos, levando a vasoconstrição
ou atenuem a vasodilatação mediada pelos receptores
b
2-adrenérgicos, podem levar a aumento da resistência
periférica total e ser um fator importante na
patogê-nese e manutenção da hipertensão arterial. Foi
recen-temente documentada a associação de uma variante do
receptor b
2-adrenérgico com hipertensão em
indivídu-os de origem africana do Caribe (76).
Além disso, genotipagem do locus do receptor
b
2-adrenérgico através de enzimas de restrição
disponíveis comercialmente mostrou associação com
hipertensão essencial (77) e estudos de
linkage
conduzi-dos pelo mesmo grupo sugeriram que a sensibilidade
sistólica e diastólica a sódio e a pressão arterial de base
estão ligadas ao locus do receptor b
2-adrenérgico (78).
O objetivo do estudo foi determinar qual a
influência da presença do polimorfismo Glu27 em
diversos aspectos fenotípicos da obesidade em
pacientes de ambos os sexos portadores de obesidade
mórbida (índice de massa corpórea ³ 40kg/m
2).
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes
O grupo de estudo foi constituído por 136 pacientes
obesos mórbidos na faixa etária de 15 a 68 anos, em
acompanhamento no Ambulatório do Grupo de
Obesidade e Doenças Metabólicas do Serviço de
Endocrinologia e Metabologia do Hospital das
Clíni-cas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (HC-FMUSP), não aparentados. Os pacientes
foram previamente genotipados e classificados em
por-tadores e não porpor-tadores do polimorfismos.
cir-cunferência do quadril, e calculados o índice de massa
corpórea (IMC, definido como o peso em quilogramas
dividido pelo quadrado da altura em metros) e a
relação entre a circunferência abdominal e a do quadril
(relação cintura-quadril, RCQ). Foi cateterizada veia
antecubital para coleta de sangue venoso para
deter-minações de DNA, glicose, insulina, hemoglobina
gli-cosilada e lípides (colesterol total, HDL, LDL, VLDL
e triglicérides), realizados no laboratório de rotina do
HC-FMUSP. Os pacientes foram informados
deta-lhadamente sobre o estudo.
Avaliação da Pressão Arterial
A pressão arterial (PA) foi aferida pelo mesmo
obser-vador experiente, empregando o método auscultatório
e em esfigmomanômetro de coluna de mercúrio. A
medida foi realizada três vezes após 5 minutos de
repouso na posição sentada. O nível pressórico foi
cal-culado pela média das 3 medidas realizadas. Os casos
que apresentaram valores médios de pressão arterial
sistólica maiores que 140mmHg e diastólica maiores
que 90mmHg, foram classificados como hipertensos.
Avaliação do Peso Corporal
O peso corporal foi aferido em três ocasiões em uma
balança Filizola, com os pacientes trajando roupas
leves e sem sapatos. A média das três medidas foi
con-siderada o peso dos mesmos.
Análise de Polimorfismos (Restriction Fragment
Length Polymorphism - RFLP)
I. Extração do DNA
Para a extração do DNA, o sangue foi coletado em
tubos contendo EDTA (10mL). O DNA total foi
extraído pela técnica de extração sal-clorofórmio a
par-tir de leucócitos de sangue periférico. A quantificação
do DNA foi analisada pelo espectofotômetro (1,0
unidade DO260 = 50mg/ml). As amplificações dos
segmentos do gene do receptor b
2-adrenérgico foram
realizadas pelo termociclador Perkin-Elmes.
//.
Amplificação por PCR
do
segmento de DNA
contendo o codon 27 do receptor b
2-odrenér-gico
Os segmentos amplificados contendo o codon 27 do
receptor b
2-adrenérgico foram realizados em volume
de 26ml contendo 200mg de DNA, 100mM de
deso-xinucleotídeos (DNTP), tampão 10% (100mM
Tris-HC1; 15mM MgCl
2; 500mM KC1; pH 8,3), 10%
DMSO, 20pmol de cada "primer", e 1 unidade de Taq
DNA polimerase.
O primer senso foi
5'-GGCCCATGACCA-GATCAGCA-3' e o primer reverso foi
5'-GAATGAG-GCTTCCAGGCGTC-3'. A PCR foi iniciada com
desnaturação a 94°C por 4 minutos, seguido por 30
ci-clos de desnaturação (94°C, 1 minuto), hibridação
(63°C, 1 minuto), e extensão (72°C, 1 minuto), com
uma extensão final a 72°C por 10 minutos. O produto
de PCR apresentou 353pb. O produto amplificado foi
digerido a 37°C por 1 hora com 0.4 U de FTN4. O
pro-duto de digestão foi visualizado em gel de ultra-puro
agarose a 2% com tampão tris-acetate EDTA (40mM
tris-acetate, 2mM EDTA) e visualizado em
transilumi-nador ultravioleta após coloração com brometo de
etí-dio. Os fragmentos de produtos de digestão dos
tama-nhos: 27, 55, 97, e 174pb nos homozigotos Gln27; 27,
55, 97, 174, e 229pb no heterozigoto Gln27Glu27 e
27, 97,e 229pb no homozigoto Glu27.
O kit de extração de DNA foi adquirido da
Gibco, a enzima Taq DNA polimerase foi adquirida da
Pharmacia-Upjohn (Uppsala, Suécia) e a agarose
ultra-pura da BIO-RAD (Hercules, EUA). As enzimas de
restrição BFTN4 foi adquirida da New England Biolabs
Inc. (Beverly, EUA) e agarose Meta-Phor da FMC
Bio-products (Roekland, EUA).
RESULTADOS
Entre os 132 pacientes obesos mórbidos estudados, 59
apresentaram polimorfismo do receptor
b-adrenérgi-co, tanto na forma heterozigota (Gln27Gly, n = 42)
como na forma homozigota (Glu27, n = 17) (Figura
2). Embora o peso atual dos pacientes sem
polimorfis-mo seja maior que o dos pacientes portadores do
polimorfismo (130 ± 27kg vs. 121 ±
25kg, p = 0,07),
a altura apresentou-se menor no grupo com
polimor-fismo (158 ±
0,1cm vs. 168 ± 0,1cm, p = 0,003). O
índice de massa corpórea (IMC) não apresentou
dife-rença significante (48 ± 8, 52 ± 8kg/m
2, p = 0,74). A
pressão arterial sistólica apresentou correlação com o
grupo portador de polimorfismo (145 ± 19 e 133 ±
22mmHg, p = 0,007), bem como a pressão diastólica
(92 ± 10 e 86 ± 12mmHg, p = 0,02) (Tabela 1).
Não houve diferença significante quanto à
pre-sença de polimorfismo em relação a raça (p = 0,86). A
presença de polimorfismo foi semelhante em homens e
mulheres (p = 0,105). Houve associação entre o nível
de pressão sistólico e diastólico em pacientes
porta-dores de polimorfismo (Tabela 2).
Há associação de hipertensão e polimorfismo
b
2-AR-27 (p = 0,0001). As pessoas que apresentam
polimorfismo do receptor b
2-adrenérgico possuem um
risco 4,7 vezes (1,2-2,7, p = 0,0019) maior de serem
hipertensos do que os que não apresentam.
DISCUSSÃO
O desenvolvimento de obesidade, assim como de
hipertensão arterial, envolve interações complexas
que sofrem influências ambientais e genéticas,
tor-nando a pesquisa de genes mais difícil. A pesquisa de
genes pode ser facilitada pela investigação de
fenóti-pos relacionados a hipertensão que podem levar à
identificação de uma população relativamente
homogênea genética e patofisiologicamente. Nós
estudamos o genótipo do receptor b
2-adrenérgico
no fenótipo obesidade mórbida.
A associação entre hipertensão e obesidade está
extensamente documentada. Estudos cruzados
sec-cionais demonstram que indivíduos obesos têm um
risco maior de hipertensão arterial que indivíduos
magros (79). Um estudo realizado na população da
cidade de Bergen, na Noruega, demonstrou que 10kg
de aumento no peso corpóreo associa-se com uma
ele-vação de 3 e 2mmHg na pressão sistólica e diastólica,
respectivamente (80), elevação confirmada no estudo
de Tecumseh (81). O Segundo Exame de
Levanta-mento da Saúde Nacional (NHANES II), um estudo
conduzido de 1976 a 1980 em uma amostra
represen-tativa da população norte-americana, documentou que
a prevalência de hipertensão entre adultos com peso
excessivo pode ser 2,9 vezes maior que a de adultos de
peso normal (82). O risco de hipertensão em obesos
na faixa etária de 20 a 44 anos é 5,6 vezes maior que
em pessoas de 45 a 74 anos (83). Nas sociedades
oci-dentais, cerca de um terço dos casos de hipertensão são
causados pela obesidade, e em homens abaixo de 45
anos, cerca de 60% dos casos (84). No estudo
prospec-tive longitudinal de residentes de Framingham,
notou-se associação entre aumento de peso e elevação
da pressão arterial. Em homens, para cada aumento de
10% no peso, houve uma elevação da pressão arterial
de 6,5mmHg. Ganhos de peso da ordem de 15%
causaram 18% de elevação da pressão arterial sistólica.
Elevações do peso em 20% associaram-se a um
aumen-to da incidência de hipertensão 8 vezes maior (85,86).
Os receptores b
2-adrenérgicos são implicados na
hipertensão em estudos que sugerem um relaxamento
vascular deficiente b-mediado (87).
Nossos resultados demonstram associação do
polimorfismo Ghi27Glu a hipertensão arterial em
pacientes com obesidade mórbida, especula-se que a
presença do polimorfismo possa alteram o
relaxamen-to vascular e possa contribuir a para a instalação da
hipertensão em pacientes obesos.
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Endereço para correspondência:
Sandra Mara Ferreira Villares
Rua Pedro Pomponazzi, 487 - apto 91 Chácara Klabim
