EXPRESSÃO DE TOPOISOMERASE II
α
E DE CASPASE-3
ATIVADA EM LESÃO INTRA-EPITELIAL CERVICAL ESCAMOSA
DE BAIXO GRAU
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências
EXPRESSÃO DE TOPOISOMERASE II
α
E DE CASPASE-3
ATIVADA EM LESÃO INTRA-EPITELIAL CERVICAL ESCAMOSA
DE BAIXO GRAU
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista
de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Orientadora: Prof. Dra. Julisa Chamorro Lascasas Ribalta
Co-orientador: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Coelho, Raquel Autran
Expressão de topoisomerase IIα e de caspase-3 ativada em lesão intra-epitelial cervical escamosa de baixo grau. / Raquel Autran Coelho -- São Paulo, 2008.
xii, 81f.
Tese (Doutorado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências.
Título em inglês: Expression of topoisomerase II alpha and active caspase-3 in cervical low-grade squamous intraepithelial lesion.
iii
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador da Pós-graduação em Ginecologia:
iv
Ao meu querido esposo, Arnaldo,
pelo amor, apoio e enorme paciência sempre
Aos meus pais,
pelo incentivo na busca dos meus ideais
Ao meu filho, Gustavo,
v
Agradeço a todos aqueles que tornaram possível a realização deste trabalho,
em particular:
Às pacientes, que viabilizaram a execução deste estudo.
À Profa. Dra. Julisa Chamorro Lascasas Ribalta, pelo carinho, competência,
exemplo, e particularmente pela amizade e incentivo à vida acadêmica.
Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim G. da Silva, pela orientação e participação
fundamental na origem deste trabalho, além dos inúmeros incentivos durante
vários momentos desta trajetória.
Ao Prof. Dr. Edmund Chada Baracat e ao Prof. Dr. Manoel Batista Castello
Girão, exemplos de ética e dedicação à vida acadêmica.
Ao Prof. Dr. José Focchi, pelos sábios ensinamentos em Patologia Cervical e
em Medicina.
Ao Prof. Dr. Gustavo Rubino de Azevedo Focchi, pelos ensinamentos na
avaliação histológica e imunohistoquímica, e pelas orientações preciosas na
elaboração desta tese.
À Profa. Dra. Neila Maria de Góis Speck, pela carinhosa acolhida, pelo
incentivo à pesquisa sempre.
Ao Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da
UNIFESP – EPM, em especial à Dra. Naiara Corrêa Nogueira de Souza, que
não mediu esforços para auxiliar na realização da técnica de biologia
molecular.
Às senhoras Sandra de Moraes Fernezlian e Esmeralda Eher, profissionais de
enorme competência e dedicação na tarefa de confeccionar e corar as lâminas
vi
Ao Prof. Dr. João Aragão Ximenes Filho, pelo auxílio na execução da análise
estatística.
Aos pós-graduandos e residentes do ambulatório de Patologia do Trato Genital
Inferior da UNIFESP-EPM, pela amizade sincera e contribuição na realização
de coleta do material junto às pacientes.
Ao Dr. Francisco Edson de Lucena Feitosa que, apesar de distante, sempre
soube transmitir incentivo e positivismo.
Às secretárias do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM, Karim
Martins dos Santos, Valéria Miranda dos Santos Medina, Zélia Maria Gomes
Macedo e Maria Cecília Silva Rocha Santos, pela amizade e apoio constantes.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Ginecologia da
UNIFESP-EPM, pelo auxílio e pela amizade conquistada.
A todos que, direta ou indiretamente, estiveram ao meu lado e suportaram as
minhas constantes ausências para completar os meus objetivos.
vii
Apoio Financeiro
Apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
viii
Felix qui potuit rerum cognoscere causas
“Feliz daquele que pôde conhecer as causas das coisas”
ix
Dedicatória... iv
Agradecimentos... v
Listas... ix
Resumo... xii
1. INTRODUÇÃO... 1
2. PROPOSIÇÃO... 18
3. PACIENTES E MÉTODOS... 20
3.1 Pacientes... 21
3.2 Métodos... 21
3.2.1 Método clínico... 21
3.2.2 Método citopatológico... 23
3.2.3 Método colposcópico... 23
3.2.4 Método histopatológico... 23
3.2.5 Método de biologia molecular... 24
3.2.6 Método imuno-histoquímico... 26
3.2.7 Interpretação da expressão imuno-histoquímica... 28
3.2.8 Método estatístico... 30
4. RESULTADOS... 31
5. DISCUSSÃO... 43
6. CONCLUSÕES... 55
7. ANEXOS... 57
8. REFERÊNCIAS... 63
Abstract
x
Lista de figuras
Figura 1. Fotomicrografia de corte histológico de colo uterino da paciente número 4 mostrando a reação imuno-histoquímica da
topoisomerase IIα (400x)... 29 Figura 2. Fotomicrografia de corte histológico de colo uterino da paciente
número 27 mostrando a reação imuno-histoquímicada caspase-3 ativada (400x)... 29 Figura 3. Distribuição da imunoexpressão de topoisomerase IIα nas
pacientes do grupo de casos e de controles... 32 Figura 4. Curva ROC para imuno-histoquímica de topoisomerase IIα... 34 Figura 5. Fotografia da placa de eletroforese em gel de agarose 2% /
brometo de etídio mostrando os produtos de PCR do Gp5/Gp6... 37 Figura 6. Fotografia da placa de eletroforese em gel de agarose 2% /
xi
Lista de tabelas
Tabela 1. Distribuição das pacientes segundo a expressão imuno-histoquímica
para caspase-3 ativada... 35 Tabela 2. Distribuição das pacientes segundo a expressão imuno-histoquímica
para topoisomerase IIα e para caspase-3 ativada... 35 Tabela 3. Distribuição das pacientes segundo a infecção por DNA-HPV... 36 Tabela 4. Distribuição das pacientes segundo a média de expressão
imuno-histoquímica para topoisomerase IIα e a presença de DNA-HPV... 39 Tabela 5. Distribuição das pacientes segundo a expressão imuno-histoquímica
para caspase-3 ativada e a presença de DNA-HPV... 39 Tabela 6. Distribuição de pacientes infectadas por DNA-HPV nos grupos caso e
controle, de acordo com a expressão de topoisomerase IIα e caspase-3 ativada... 40 Tabela 7. Distribuição de idade, paridade, coitarca, número de parceiros, tabagismo
e contracepção hormonal entre os grupos de pacientes com LBG e sem LBG... 41 Tabela 8. Distribuição de idade, tabagismo, uso de contracepção hormonal, PCR e
imuno-histoquímica para topoisomerase IIα e caspase-3 ativada entre pacientes com regressão e não regressão da lesão em seguimento de
xii DD domínio de morte
DED domínio efetor de morte
DNA ácido desoxirribonucléico
E1,E2,E3,
E4,E5,E6,E7 genes “early” do HPV
EBV Epstein-Barr vírus
Fas “fibroblast associated”
HER-2 receptor de crescimento epidérmico humano 2
HIV vírus da imunodeficiência humana
HPV papilomavírus humano
HSV herpes vírus humano
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IC 95% Intervalo de confiança de 95%
IL interleucina
INCA Instituto Nacional do Câncer
Ki-67 antígeno imuno-histoquímico de proliferação
L1, L1 genes “late” do HPV
LAG lesão de alto grau
LBG lesão de baixo grau
LCR “long control region”
NIC neoplasia intra-epitelial cervical
p53 proteína do gene 53
pRb proteína do gene retinoblastoma
PCNA antígeno nuclear de proliferação celular
PCR reação de polimerase em cadeia
RNA ácido ribonucléico
TH-1 linfócito T helper tipo 1
TH-2 linfócito T helper tipo 2
TNF fator de necrose tumoral
TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling method
xiii
Objetivos: Estudar a expressão imuno-histoquímica de topoisomerase IIα e de caspase-3 ativada, marcadores de proliferação e de apoptose, respectivamente, a
detecção de DNA HPV e a evolução da lesão cervical em mulheres portadoras de
lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LBG). Métodos: Foram avaliadas 40 mulheres portadoras de LBG e 32 sem neoplasia cervical, diagnosticadas por
exame cito-colpo-histopatológico, quanto à imunoexpressão de topoisomerase IIα e
de caspase-3 ativada e quanto à detecção de DNA HPV por PCR consensual
(GP5+/GP6+) em material de esfregaço cérvico-vaginal. Os achados foram
relacionados às variáveis clínicas das pacientes e à evolução clínica das lesões
cervicais em 12 meses. As pacientes assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido. Resultados: A média percentual de células imunomarcadas por topoisomerase foi de 11,71% e 4,13%, no grupo com LBG e controle,
respectivamente, com diferença estatisticamente significante. Observou-se que
houve expressão de caspase-3 em 17 (42,5%) e em 5 (15,63%) pacientes com e
sem LBG, respectivamente, com diferença estatisticamente significante. Foi
detectado HPV DNA em 65% das pacientes com LBG e em 59,4% das pacientes
sem lesão cervical, sem relação com a expressão de topoisomerase IIα ou
caspase-3. Na presença de DNA-HPV, a expressão de topoisomerase IIα no grupo
com LBG foi significativamente maior do que em fragmentos sem lesão. Não foi
observada diferença quanto à evolução da lesão cervical em 12 meses de acordo
com a imunoexpressão de topoisomerase IIα. Com relação à caspase-3 ativada, a
maioria das pacientes com imuno-histoquímica negativa teve regressão da lesão
cervical. Conclusões: A imunoexpressão de topoisomerase IIα e de caspase-3 ativada podem ser considerados marcadores de proliferação e de apoptose em
lesão cervical de baixo grau, sem relação com a presença de DNA-HPV.
Palavras-chave: DNA topoisomerases tipo II, caspase 3, neoplasia
O carcinoma de colo uterino é a segunda neoplasia maligna mais
comum entre mulheres no mundo (Parkin et al., 2005). No Brasil, representa a
terceira neoplasia maligna mais comum entre as mulheres e a quarta causa de
morte por câncer em mulheres, com incidência estimada de 18.680 mulheres em
2006, e risco estimado de 19 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2008). Apesar
da alta incidência e mortalidade, é das neoplasias malignas mais preveníveis, por
meio de detecção precoce da lesão intra-epitelial e da doença microinvasiva.
Em países com boa infra-estrutura de saúde pública e com alta
aderência das mulheres aos programas de rastreamento, a introdução do
exame citopatológico para detecção precoce da neoplasia de colo permitiu
reduzir em dois terços a incidência e a mortalidade por esse câncer
(Monsonego, 2000b; Crum et al., 2003).
A maioria desses tumores parece evoluir em uma seqüência de
lesões displásicas de severidade crescente, as neoplasias intra-epiteliais
cervicais (NIC), que representam os precursores do carcinoma invasor, e são
passíveis de cura (Johnson et al., 1968; Focchi et al., 2000).
Ao longo dessa evolução tem-se a chance de rastrear a doença em
seus diversos níveis, mas falhas na assistência à saúde propiciam o
diagnóstico tardio, principalmente nos países em desenvolvimento.
Baseando-se em registros hospitalares brasileiros, obBaseando-serva-Baseando-se que metade das pacientes
com câncer de colo tem diagnóstico inicial já em estádio avançado (INCA,
2008). Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2005
mostraram cobertura de 68,7% dos casos no exame citopatológico do colo
uterino em mulheres acima de 24 anos de idade, sendo que 20,8% das
mulheres nessa faixa etária nunca tinham sido submetidas ao exame.
O carcinoma cervical escamoso é reconhecido como doença de
transmissão sexual há mais de um século (Villa, 1997). Com o advento
tecnológico de experimentos utilizando DNA recombinante, a associação entre
o papilomavírus humano (HPV) e o câncer cervical uterino pôde ser
confirmada. Esse vínculo é demonstrado em vários estudos, nos quais o vírus
foi encontrado em até 94% das neoplasias intra-epiteliais e em 99,7% dos
carcinomas cervicais (Hildesheim et al., 1990; Walboomers et al., 1999;
Estudo em nosso meio, utilizando reação em cadeia de polimerase
(PCR), encontrou prevalência de 16% de DNA do HPV em mulheres
assintomáticas (Nonnenmacher et al., 2002). Em análise de citologias
falso-negativas colhidas até seis anos antes do desenvolvimento de câncer cervical
uterino, observou-se DNA de HPV em grande parte dos esfregaços,
especialmente os tipos 16 e 18 (Walboomers et al., 1995).
A infecção por HPV, isoladamente, não é suficiente para que haja
carcinogênese genital. Apenas uma pequena fração de mulheres infectadas pelo
DNA-HPV evolui até lesão de alto grau ou câncer (Southern, Herrington, 1998). Há
necessidade da presença de co-fatores essenciais para que a malignização se
instale em mulheres infectadas pelo HPV-DNA, como persistência do HPV
oncogênico, tabagismo, multiparidade, início precoce da vida sexual, infecção por
outras doenças sexualmente transmissíveis, história de múltiplos parceiros e
deficiência imunológica (Schiffman, 1995; Viscidi, 2002; Schiffman, Castle, 2003).
Além da associação marcante com o HPV, o vínculo do carcinoma
cervical com o herpes vírus humano (HSV) foi aventado há pelo menos duas
décadas, ao se comparar sua presença em tecidos normais e neoplásicos (Zur
Hausen, 1989). Santos (2002), avaliando a presença do vírus Epstein-Barr
(EBV) em lesões cervicais, mostrou associação positiva com lesões de alto
grau e invasoras. Em relação à Clamydia trachomatis, nada foi estabelecido,
pois não se confirmaram evidências moleculares de sua relação com o câncer
de colo (Sasagawa et al., 2000).
O HPV é um vírus icosaédrico, não envelopado, com DNA circular de
dupla-fita. O diâmetro do capsídeo é de 55nm. Seu genoma possui cerca de
8000 pares de bases, e seu peso molecular é de 5,2 x 106 Daltons (Brown, Fife, 1990; Chang, 1990). O DNA circular é dividido em regiões precoce, que
contém os genes E1 a E7, e tardia, com os genes L1 e L2. Há também uma
região regulatória LCR, “Long Control Region”, não codificante. Os genes “L”
codificam proteínas do capsídeo viral, enquanto os genes “E” codificam proteínas
com funções reguladoras da atividade celular, atuando na replicação e transcrição
do DNA, além da proliferação e transformação celular (Schoell et al., 1999; Zur
Existem mais de 100 tipos virais de HPV descritos até o momento.
Podem ser classificados em dois grupos: os de alto risco, como 16 e 18, e os
de baixo risco oncogênico, como 6, 11, 42, 43 e 44 (Syrjanen, 1989).
A infecção por HPV é comum em mulheres sexualmente ativas, com
prevalência variando de 20 a 60%, mas a maioria dos episódios é de curta
duração, com média de oito meses (Fairley et al., 1994; Hinchliffe et al., 1995;
Ho et al., 1998; Monk, Wiley, 2004). A persistência da infecção por esse vírus
associa-se ao maior risco de desenvolvimento de lesão intra-epitelial,
sobretudo na presença dos tipos virais 16 e 18 (Schlecht et al., 2001).
Richart (1967) organizou as lesões histológicas displásicas cervicais
em graus crescentes de gravidade, isto é, NIC 1, 2 e 3, enfatizando o potencial
evolutivo dessas lesões. Quanto mais intensa a atipia celular, menor seria a
diferenciação e maior o número de mitoses. Posteriormente, Richart e Wright
(1993) agruparam essas mesmas lesões em NIC de baixo e de alto grau,
aproximando-se do Sistema Bethesda. Lesões de baixo grau (LBG) abrangem a
infecção por HPV e a NIC 1. Já as lesões de alto grau (LAG) compreendem as
NIC 2 e 3, que são parecem ser clinicamente semelhantes.
Em lesões cervicais de baixo grau, há fraca relação entre os
achados citológicos e histológicos. Vários fatores podem contribuir para esta
discordância, como: evolução natural da doença que pode ocorrer entre o
exame citopatológico e posterior avaliação colposcópica e histopatológica; erro
de amostra ou de interpretação; e variabilidade intra e inter-observacional no
diagnóstico cito e histopatológico (Lee et al., 1998). Resultados falso-negativos
são mais comuns em LBG do que em LAG, com relatos de até 30% dos
exames citopatológicos (DeMay, 1996). A citologia em meio líquido melhorou a
qualidade da amostra e aumentou a sensibilidade diagnóstica para LBG e LAG
(Biran, Levy, 2004).
O reconhecimento de lesão de baixo grau cervical à colposcopia é
por vezes difícil, pois há alta variabilidade inter e intra-observador. Os achados
mais comuns são acetobranqueamento discreto e fugaz, pontilhado e mosaico
finos, assim como captação incompleta e irregular de iodo (Monsonego 2000c;
A utilização de técnicas de biologia molecular permite a detecção
direta do DNA de HPV. A escolha do método depende da disponibilidade de
equipamento para diagnóstico, da característica da amostra, da facilidade de
uso laboratorial, da aprovação pelos órgãos controladores de saúde e do custo
(Miranda Pereira et al., 2006). A biologia molecular pode ser empregada em
triagem de alterações citológicas leves, no esclarecimento de resultados
cito-histológicos discordantes, em avaliação de qualidade de laboratório e no
rastreio de infecção persistente por HPV (Monsonego, 2004).
As lesões cervicais por HPV podem regredir, persistir, progredir ou
recidivar. A maioria das infecções é eliminada pelo sistema imunológico dentro
de 12 meses após o contágio, atingindo 92% de regressão em dois anos. O
índice de regressão espontânea aumenta em paralelo à extensão do tempo de
acompanhamento. Já as lesões destinadas à progressão clínica o fazem
rapidamente, não parecendo variar conforme o período de acompanhamento
(Handsfield, 1997).
As lesões NIC 1 regridem espontaneamente em sua maioria.
Aproximadamente 32% delas persistem e 11% evoluem para NIC 3. Somente
1% delas evolui até lesão invasora, diferentemente do que ocorre com 12%
das mulheres com NIC 3 (Ostor, 1993; Syrjanen, 1996). Os fatores que
determinam essa evolução ainda não são bem definidos.
Franco et al. (1999) avaliaram a aquisição e eliminação do HPV em
1.425 mulheres brasileiras. Houve 1,3% de novas infecções pelo vírus por
mês, com duração média de infecção de 13,5 meses para os tipos
oncogênicos, e de 8,2 meses para os não-oncogênicos. Apenas 35% das
mulheres avaliadas permaneceram infectadas após 12 meses.
Os tipos de HPV encontrados nas LBG são: 16 em 30%; 6 e 11 em
20%; e 31,33 e 35 em 25% dos casos. Os outros 25% correspondem, em ordem
decrescente de freqüência, aos tipos 51, 18, 56, 30, 39, 58, 59, 45, 68, 70, 42, 52,
43 e 44 (Nuovo, 1998). Ramael (2003) também observou HPV de alto risco (16,
18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 61, 66, 68) na maioria dos casos (75%) de LBG.
A identificação de um HPV de alto risco nos cânceres de colo não
das lesões pré-invasoras. Trata-se de um marcador sensível para pacientes de
risco para câncer cervical, mas tem valor preditivo positivo relativamente pobre
para identificar mulheres com lesões pré-invasivas (Wang et al., 2004).
Algumas observações clínicas demonstraram a participação da
imunidade celular no controle das infecções por HPV, como o aumento da
prevalência da infecção pelo HPV em pacientes com deficiência imunológica
de células T (De Sanjose, Palefsky, 2002) e a presença de infiltrado de células
T no local de regressão espontânea dos condilomas e verrugas cutâneas
(Coleman et al., 1994).
A defesa contra organismos estranhos é mediada pela imunidade
inata (inespecífica) e pela específica. A primeira compreende a barreira epitelial
da mucosa vaginal, o muco cervical, a presença dos lactobacilos e das células
fagocitárias, o pH ácido, a reação inflamatória, a ação de citocinas e o sistema
complemento. A resposta inespecífica independe do contato com o agente
infeccioso e protege o organismo temporariamente até que se desenvolva a
imunidade específica. Esta engloba as imunidades humoral e celular, sendo
constituída por linfócitos B, T e “natural killers” (Abbas et al., 2000).
Os linfócitos B produzem anticorpos. Diversas imunoglobulinas estão
presentes nas secreções cérvico-vaginais normais, sendo parte importante na
defesa do hospedeiro pelo bloqueio da aderência do agente nas células
epiteliais da mucosa (Tjiong et al., 2001).
Os linfócitos T reconhecem antígenos associados à superfície das
células. Estes são subdivididos em auxiliares (com glicoproteína de membrana
CD4) e citotóxicos (com glicoproteína de membrana CD8). Os linfócitos
“natural killers” não possuem marcadores de membrana e podem lisar células
infectadas por vírus sem evidente estimulação antigênica. A resposta
imunológica específica pode utilizar células T “helper” 1 (TH-1) ou T “helper” 2
(TH-2). No primeiro caso, predomina a resposta celular, com produção de
interferon gama e interleucina-2 (IL-2). No segundo, a resposta humoral, com
produção de IL-4, IL-5 e IL-10 (Abbas et al., 2000).
O HPV, ao infectar as células epiteliais basais, mantém seu DNA no
hospedeiro, driblando o sistema imunológico. Após um período de tempo variável,
macrófagos, monócitos e células dendríticas liberam citocinas, fator de necrose
tumoral e várias interleucinas. Isso permite o reconhecimento e a apresentação
do antígeno HPV a linfócitos T indiferenciados. Segue-se a ativação de células T
citotóxicas HPV-específicas e de linfócitos “natural killers”, que promovem a
destruição das células infectadas por HPV (Konya, Dillner, 2001).
1.1 Apoptose
O processo de destruição celular pode ocorrer por apoptose ou por
necrose. Ambos os eventos interferem na dinâmica histopatológica de lesões
teciduais, tais como regressão, persistência ou evolução.
As primeiras evidências de morte celular programada ocorreram há
cerca de 100 anos. O termo apoptose deriva do grego, designando a queda de
folhas de árvores no outono. Por analogia, foi aplicado para perda celular
programada.
O processo de apoptose foi originalmente descrita por Kerr et al. em
1972. Desde então os critérios de reconhecimento citopatológico de apoptose
são: condensação nuclear e citoplasmática, fragmentação nuclear e formação
de corpos apoptóticos com membrana plasmática intacta.
A necrose celular é forma passiva de morte celular, com perda de
integridade da membrana plasmática, reação inflamatória local e ausência de
fragmentação nuclear (Mcconkey et al., 1998).
A apoptose não envolve perda de conteúdo celular para o espaço
extracelular. As células apoptóticas em geral são reconhecidas por macrófagos e
fagocitadas antes que se desintegrem. Desta forma, não há indução de resposta
inflamatória local ou de dano às células adjacentes (Horta, Young, 1999). Ocorre
em inúmeros eventos fisiológicos, como na embriogênese, na homeostase do
sistema imunológico, na diferenciação e renovação de tecidos normais. É
parece ocorrer, por exemplo, na destruição de neurônios após lesão isquêmica
(Wyllie et al., 1980; Ellis et al., 1991; Raff, 1992; Namura et al., 1998). É
importante mecanismo regulatório da proliferação de células endometrióticas e
de células malignas (Tarkowski et al., 2001).
O controle da imortalização celular depende do equilíbrio entre o
crescimento e a morte celular. A infecção viral estimula a proliferação celular
contínua, enquanto o hospedeiro gera mecanismos de defesa contra a multiplicação
das partículas virais, por ativação de apoptose (Tarkowski et al., 2001).
A indução de apoptose tem sido reconhecida como possível solução
ao dano celular há mais de vinte anos (Wyllie et al., 1980). Os mecanismos
que desencadeiam a apoptose, após dano ao DNA celular, sobrepõem-se
àqueles que iniciam a parada do ciclo celular e o reparo ao DNA. Há muitos
indutores de apoptose, como a supressão de fatores de crescimento (IL-2), a
radiação ionizante, o influxo de íons cálcio, o fator de necrose tumoral (TNF), a
infecção viral e os glicocorticóides (Golstein, 1997).
Em células infectadas por HPV, o genoma viral apresenta-se como DNA
circular extra-cromossomal. Já em células de neoplasias cervicais, o genoma viral
encontra-se integrado ao DNA do hospedeiro. A proteína E2 codificada pelo
DNA-HPV tem efeito importante na integração viral e na defesa do hospedeiro, podendo
gerar sinal pró-apoptótico nos queratinócitos infectados (Webster et al., 2000;
Webster et al., 2001). A proteína E7 também pode induzir a apoptose (Qin et al.,
1994; Field et al., 1996). A expressão da proteína E6, por sua vez, pode bloquear o
sinal apoptótico induzido por E2 e E7, seja por ligação à proteína supressora
tumoral p53 ou por proteólise ubiquitina-dependente (Scheffner et al., 1990;
Werness et al., 1990; Demers et al., 1994; Nair et al., 1999).
A função da proteína p53 em interromper o ciclo celular e permitir o
reparo do DNA já foi bem demonstrada (Ryan et al., 1993; Levine, 1997). A perda
de sua ação foi observada em vários tipos de tumores em humanos. A função
principal da p53 está mais vinculada a apoptose do que à parada do ciclo celular
na fase G1 ou G2, atuando como ativadora da transcrição de genes que codificam
Estudos experimentais mostraram a influência de oncogenes e genes
de supressão tumoral, como Bcl-2, c-myc, APO-1 (Fas) e p53, tanto no processo
apoptótico tumoral quanto na proliferação celular. A perda de função de
reguladores pró-apoptóticos, como a proteína p53, ou a hiperexpressão de
proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2, pode favorecer a sobrevivência de
células tumorais após processos terapêuticos baseados em dano ao DNA (Evan
et al., 1992; Arends et al., 1993; Carson, Ribeiro, 1993; Leithauser et al, 1993;
Ramqvist et al., 1993; Cory, 1994; McGahon et al., 1994).
A apoptose envolve a participação de caspases, proteases
pró-apoptóticas da família das cisteinoproteases, mediadoras centrais da cascata
proteolítica que leva à apoptose (Walker et al., 2005). A primeira descrição foi a da
ICE (“interleukin-1b converting enzyme”), hoje conhecida como caspase 1, sem
papel importante na apoptose. As caspases são semelhantes em estrutura,
seqüência de aminoácidos e especificidade ao substrato. Sua ação é complexa,
caracterizada por destruição de proteínas essenciais, ativação de proteínas tóxicas
ou destruição das que protegem a célula contra a apoptose (Horta, Young, 1999).
As caspases, cisteína-aspartato proteases, agem por meio de
clivagem de proteínas, alterando sua função e ativando outras caspases.
Algumas são iniciadoras, como as caspases-2, 8, 9 e 10, ativadas por sinais de
apoptose. Outras são efetoras, como as caspases-3, 6 e 7, ativadas por outras
caspases em cascata após a ruptura da membrana mitocondrial (El-Mahdy et
al., 2005). Uma vez ativadas, as caspases-3 e 7 atuam permeabilizando a
membrana mitocondrial, em alça amplificadora da cascata de ativação de
caspases, gerando lise de proteínas celulares, como polimerases e receptores
de fator de crescimento epidermal. Exercem função de desarranjo na
organização da cromatina e lise de proteínas reguladoras do citoesqueleto
celular, precipitando a apoptose. Dentre as caspases identificadas em
humanos, a caspase-3 é a que melhor se relaciona com o mecanismo de
apoptose (Thorneberry, Lazebnik, 1998; Liang et al., 2001).
Krajewski et al. (1997) observaram imunoexpressão de caspase-3
inversamente proporcional à de Bcl-2 em tecidos linfóides, com marcação
principalmente citoplasmática, mas também podendo ser localizada no núcleo
O sinal de morte origina-se de dois mecanismos distintos de apoptose:
o tipo I, forma extrínseca, e o tipo II, forma intrínseca. No primeiro, a caspase-8
ativa as caspases-3 e 6 a partir dos receptores de morte. No segundo, a apoptose
ocorre com participação de mitocôndrias, que secretam citocromo c, o qual, por
sua vez, irá ativar as caspases-3, 6 e 9 em cascata (Scaffidi et al., 1999).
A sinalização para sensibilizar a célula para o processo de apoptose
pode começar por diversas proteínas transmembranas, como o elemento Fas
(“fibroblast associated”) e membros de uma grande família de receptores para fator
de necrose tumoral (TNFR). Os receptores de superfície transmitem sinais de
apoptose iniciados por ligantes específicos, permitindo a ativação de caspases em
segundos. O fator de necrose tumoral-α (TNF-α), que se liga ao TNFR, é produzido
principalmente por células do sistema imunológico (Garcia-Velasco et al., 1999). A
dimerização TNFR-TNFα produz alterações em domínios citoplasmáticos de
TNFR, chamados de domínio de morte (DD) e domínio efetor de morte (DED),
que irão disparar a apoptose (Riedl et al., 2004; El-Mahdy et al., 2005).
O segundo mecanismo implica na penetração de moléculas
protéicas, perforinas e granzimas no citoplasma e no núcleo da célula
comprometida (Kondo et al., 2005). Estímulos tóxicos diretos nas mitocôndrias,
como radiação e quimioterápicos, resultam na formação de poros na
membrana externa, o que gera a liberação de citocromo c, que promove
ativação de caspase-9, seguida de ativação de outras caspases efetoras, com
conseqüente fragmentação do DNA (Li et al., 1997).
A mitocôndria atua no evento apoptótico, tanto na indução como na
supressão de sinais pró-apoptóticos, pela ativação de caspases e por
alterações no transporte de elétrons e no potencial celular de
redução-oxidação. Diversas moléculas seqüestradas no espaço intramembranoso da
mitocôndria participam da indução (Bax, Bcl-x, Bak) ou supressão (Bcl-2, BclxL,
Mcl-1) da apoptose. Essas proteínas pertencem à família Bcl-2, que parecem
regular a permeabilidade da membrana mitocondrial. A descoberta do gene
Bcl-2, que provoca resistência à apoptose em linfócitos, foi crucial para o
Os índices de apoptose em células tumorais permitem predizer a evolução clínica em alguns tumores, sendo os mais estudados os de próstata,
cólon e mama. Além disso, muitas drogas podem destruir células tumorais por meio da ativação de apoptose, contrapondo-se à ação de alterações genéticas
inibidoras de apoptose e geradoras de multiresistência a drogas (Clynes et al., 1998). A menor expressão de caspase-3 pode traduzir resistência à químio e à
radioterapia (Yang et al., 2001).
As proteínas E6/E7 do HPV alteram os índices de apoptose, interferindo na atividade da p53, da pRB e agindo diretamente no DNA da
célula hospedeira. O controle de apoptose, entretanto, pode ocorrer de maneira independente do HPV e da proteína p53 em algumas neoplasias
cervicais (Sheets, Yeh, 1997).
1.2 Proliferação celular
A infecção por HPV parece estimular aumento na atividade proliferativa das células epiteliais, podendo definir uma subpopulação celular predisposta à
transformação maligna. Na análise da proliferação celular, os testes imuno-histoquímicos rotineiros avaliam, dentre outros, os anticorpos monoclonais contra
o antígeno Ki-67 e o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).
No ciclo de proliferação celular são reconhecidas: fase G1, de repouso aparente, em que a célula decodifica o RNA mensageiro e sintetiza
proteínas; fase S, de síntese, onde há separação e duplicação das alças de DNA; fase G2, em que ocorre síntese protéica e preparo para a fase de mitose
(M), seguida da fase quiescente G0. Para progredir de G0 a G1, as células necessitam de fatores de crescimento.
O antígeno Ki-67 é uma proteína nuclear expressa durante as fases G1
tardia, S, G2 e M, mas ausente em G0 (Cattoretti et al., 1992). O PCNA, por sua vez, é detectado nas fases G0, G1, S, G2 e M; é um indicador menos acurado
que o Ki-67 (McCormick et al., 1993). O uso do PCNA tem sido recentemente questionado, porque pode ser prontamente destruído em fixação prolongada e
As DNA-topoisomerases são enzimas nucleares presentes em todas
as células, capazes de alterar a morfologia do DNA. Representam 1 a 2% da
proteína total de cromossomos em mitose. Têm estrutura e mecanismo
enzimático bem conhecidos, atuando na condensação, na segregação
cromossômica e na expressão gênica (Hsiang, 1992). São marcadores de
proliferação celular em tecidos normais e neoplásicos (Holden et al., 1995).
Há dois tipos distintos de topoisomerases, I e II, que possuem ação
catalítica em tecidos normais e malignos (McLeod et al., 1994). A atuação de
ambas é necessária para a função celular normal, controlando a configuração
do DNA em eventos de replicação, de recombinação e de transcrição. A
topoisomerase I, de 100-KDa, produz quebras na cadeia simples do DNA e tem
expressão elevada nos tumores de colo uterino e de cólon. A topoisomerase
IIα, de 170-KDa, e a IIβ, de 180-KDa, são enzimas com alta semelhança, mas
codificadas por genes separados. A primeira é codificada por gene próximo ao
do HER 2 no cromossomo 17q12-q21 (Knoop et al., 2005). São de grande
utilidade durante a replicação celular, pois permitem quebras e ligações da
cadeia dupla de DNA.
Ambos os tipos enzimáticos formam pontes transitórias com o DNA,
por meio de ligação covalente, via ponte de fosfodiéster. A topoisomerase IIα
separa os cromossomos no final da mitose. Estudos “in vivo” demonstraram
que sua concentração aumenta rapidamente no final da fase S, na G2 e na M,
diminuindo ao final da mitose em células não neoplásicas. Isso permite melhor
estimativa do número de células em proliferação ativa (Heck et al., 1988;
Hsiang et al., 1988; Berger, 1998; Kaufmann, 1998; Horibe et al., 2000). Entre
as diferentes espécies, essa enzima compartilha uma subunidade que envolve
o domínio de quebra/ligação com o DNA celular, alvo de drogas
anti-cancerígenas, como o etoposide e a doxorrubicina, em organismos eucariontes
(Brustmann, Naudé, 2002).
A proteína topoisomerase IIα também pode atuar como marcador
morfológico útil em diferenciar as duas formas de morte celular: necrose e apoptose.
Em células necróticas, essa proteína concentra-se em nucléolos, estando ausente na
Foi demonstrada a expressão das topoisomerases em vários
tumores sólidos humanos (Holden et al., 1990; Keith et al., 1993; Tanoguchi et
al., 1998). Os estudos mais expressivos trataram de sua atividade nos tumores
ovarianos (Van Der Zee et al., 1991) e nos de cólon (Giovanella et al., 1989),
havendo maior expressão da topoisomerase IIα em tumores com maior
estadiamento clínico. A vantagem de se avaliar a expressão
imuno-histoquímica de topoisomerase IIα é que sua função celular é bem
caracterizada, enquanto a função biológica da proteína Ki-67 permanece pouco
esclarecida (Kuropkat et al., 2003).
A análise da topoisomerase IIα em amostras de carcinoma de mama,
pulmão, colo uterino e cólon mostrou variação significativa inter-tumoral, com
maior expressão em tumores de colo uterino, cólon e pulmão (McLeod et al.,
1994). Estudo retrospectivo identificou alterações de topoisomerase IIα em 84%
de pacientes com câncer de mama com alterações de HER 2 (Knoop et al., 2005).
Comparando-se a análise imuno-histoquímica de topoisomerases I e
IIα, de Ki-67 e de p53 em lesões pré-neoplásicas e carcinoma escamoso oral,
observou-se que a expressão de topoisomerase IIα pode avaliar a atividade
proliferativa, porém, sem mostrar associação com parâmetros clínicos e
patológicos (Hafian et al., 2004). Em neoplasias de adrenal, de mama, de
hipofaringe e em linfoma não-Hodgkin registrou-se valor prognóstico ao se
avaliar a atividade proliferativa por meio de análise imuno-histoquímica de
topoisomerase IIα e de Ki-67 (McGurrin et al., 1987; Hall et al., 1988; Iino et al.,
1997; Kuropkat et al., 2003). Em linfoma não-Hodgkin de células pequenas
clivadas, tipo de linfoma com curso clínico agressivo, o uso de drogas
inibidoras da topoisomerase, como a doxorrubicina e o etoposide, mostrou
maior sobrevida em tumores com menor expressão de topoisomerase IIα,
constituindo-se em fator prognóstico mais importante do que a expressão de
Ki-67, com diferença significante (Schrader et al., 2004).
Os índices de Ki-67 e de topoisomerase IIα devem ter os mesmos
valores em células malignas e em tecidos normais, desde que o ciclo celular
ocorra na mesma velocidade. No entanto, a meia-vida de topoisomerase IIα é
pode refletir na alteração quantitativa e qualitativa da atividade proliferativa
(Yabuki et al., 1996; Horibe et al., 2000). A elevada atividade de topoisomerase I e
II em carcinoma de colo uterino motivou vários estudos com o uso de inibidores
dessas enzimas no tratamento de tumores (Look et al, 1998; McLeod et al., 1994).
Como o valor preditivo positivo do grau de NIC em predizer a
progressão é baixo, 10% para NIC I, evidenciam-se em altos índices de
tratamentos desnecessários. Certos marcadores moleculares, como o Ki-67,
têm valor preditivo positivo de cerca de 30%, que pode ainda ser aumentado
associando-se marcadores adicionais (Baak et al., 2005). A relação entre
expressão de topoisomerase IIα e prognóstico das lesões em colo uterino foi
ainda pouco analisada.
1.3 Equilíbrio entre proliferação e morte celular
O balanço entre proliferação celular e apoptose tem papel importante
no controle de homeostase. Alterações nos genes envolvidos na regulação de
proliferação ou de apoptose são eventos fundamentais para o crescimento
celular neoplásico.
Há evidências de índices de apoptose inalterado e de proliferação
crescente com a progressão de neoplasia oral (Birchall et al., 1996). Em
epitélio mamário, há elevação de ambos os índices com a progressão de
lesões hiperplásicas (Allan et al., 1992; Christov et al., 1996). Em progressão
de lesões mamárias bem diferenciadas, parece ter maior importância o
aumento da proliferação do que a diminuição de apoptose. Em lesões pouco
diferenciadas, a redução de apoptose também parece ser importante na
carcinogênese (Mommers et al., 1999). Em linfoma não-Hodgkin, o índice
apoptótico aumenta com o grau de malignidade e com a atividade proliferativa,
avaliada pela imunoexpressão de ki-67 (Korkolopoulou et al., 1998). Em tecido
endometrial, há aumento tanto nos índices de topoisomerase IIα, como nos de
corpos apoptóticos relacionados à atividade mitótica, porém, com os índices de
porque a apoptose pode ocorrer em qualquer fase do ciclo celular, com pico
em G1; já a topoisomerase IIα expressa-se apenas nas fases S, G2 e M
(Brustmann, 2005).
Na mucosa cervical uterina, estudos sobre o balanço entre proliferação
celular e apoptose foram realizados principalmente por meio de análise de
imunoexpressão do Ki-67 e de método TUNEL (“terminal deoxynucleotidyl
transferase mediated dUTP nick-end labeling method”), respectivamente.
A relação entre infecção por HPV e apoptose é ainda controversa.
Ahmed et al. (2001) revelaram índice apoptótico maior em tumores negativos para
o HPV, o que sugere efeito inibidor desse vírus sobre a apoptose. Alguns autores
observaram aumento de apoptose com a progressão da neoplasia cervical, de
NIC a carcinoma invasor, mas sem associação com infecção por HPV (Isacson et
al., 1996; Shoji et al., 1996; Duttagupta et al., 2001; Lee et al., 2002). Outros
estudos mostraram diminuição de apoptose enquanto progride a atipia cervical
(Sheets et al., 1996; Zanotti et al., 2003).
Sheets et al. (1996) demonstraram a presença de corpos apoptóticos
no terço médio do epitélio escamoso em lesão cervical de baixo grau, e no
terço superior em lesão de alto grau.
Métodos visando identificar pacientes com LBG em colo uterino de
maior risco de progressão para LAG já foram propostos por vários autores
(Vince et al., 2001). A relação entre infecção por HPV, corpos apoptóticos e
Ki-67 foi avaliada em lesões cervicais uterinas por Shoji et al. (1996), que
observaram associação entre o índice apoptótico e a progressão neoplásica,
mas não com a presença de HPV ou com a expressão de Ki-67. Outro estudo
verificou haver associação de expressão de Ki-67 e de apoptose com o aumento
do grau de lesão de colo, mas não com o tipo de HPV (Isacson et al., 1996).
Diversos estudos têm avaliado a relação entre a infecção por HPV e
a expressão da proteína p53 no colo uterino (Ngan et al., 1994; Hachisuga et
al., 1996; Cavuslu et al., 1997), alguns deles considerando o papel de
oncoproteínas codificadas por oncogenes (Bernard et al., 1994; Roland et al.,
1997). Faltam, entretanto, estudos com análise das relações mútuas entre a
expressão de oncoproteínas, a atividade proliferativa das células e a presença
Muitas lesões cervicais de baixo grau são tratadas sem necessidade,
visto que a maioria delas regride espontaneamente. Faz-se necessário,
portanto, um teste laboratorial que possa predizer, com acurácia, o prognóstico
dessas lesões. Frente à paucidade de ensaios nesse sentido e à diversidade
de comportamento das enzimas, interessou-nos avaliar a imunoexpressão da
caspase-3 ativada e da topoisomerase IIα, além da presença e tipagem de
DNA-HPV, em pacientes com lesão intra-epitelial cervical de baixo grau e sem
lesão cervical. Buscar-se-á, por meio destas análises, definir a potencialidade
Propõe-se, em pacientes com lesão intra-epitelial cervical escamosa
de baixo grau e em pacientes sem lesão genital HPV induzida, a avaliar:
1. A imunoexpressão de topoisomerase IIα e de caspase-3 ativada
em material de biópsia;
2. A relação entre o índice de topoisomerase IIα e de caspase-3
ativada e a presença de HPV;
3. Se há relação entre o índice de topoisomerase IIα, o índice de
caspase-3 ativada e o tipo de HPV com a evolução de lesão
intra-epitelial cervical escamosa de baixo grau ao longo de 12 meses;
3.1 Pacientes
Foram selecionadas 72 pacientes atendidas no ambulatório do Setor
de Patologia do Trato Genital Inferior do Núcleo de Prevenção de Doenças
Ginecológicas da Disciplina de Ginecologia Geral do Departamento de
Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina (UNIFESP-EPM), no período de 24 de maio de 2004 a 13 de maio de
2005. Dessas, 40 eram pacientes portadoras de lesão intra-epitelial cervical
escamosa de baixo grau, diagnosticada por exames citopatológico,
colposcópico e anatomopatológico. O grupo controle incluiu 32 pacientes sem
lesão cito-histopatológica HPV induzida.
Foram excluídas pacientes com tratamento prévio para lesão
intra-epitelial de qualquer grau e de carcinoma em trato genital inferior, bem como
aquelas submetidas a cirurgias por via vaginal ou a cauterizações. Pacientes com
antecedentes de imunossupressão, diabéticas, HIV soropositivas, portadoras de
transplante de órgãos, gestantes e lactantes também não foram incluídas.
As pacientes foram adequadamente esclarecidas quanto aos
interesses e desenvolvimento da pesquisa, segundo o termo de consentimento
informado livre e esclarecido assinado (Anexo I). O projeto foi apresentado ao
Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP – Hospital São Paulo, para análise,
tendo sido aprovado sob o protocolo número 193/04 (Anexo II).
3.2 Métodos
3.2.1 Método clínico
O estudo foi constituído de duas fases: uma primeira etapa
transversal, e outra de seguimento das pacientes portadoras de lesão
intra-epitelial cervical de baixo grau durante doze meses.
Na primeira consulta, as pacientes foram submetidas a anamnese, a
cérvico-vaginal e para pesquisa de DNA-HPV. Efetuou-se colposcopia, com biópsia
dirigida de aspectos anormais, caso fossem encontrados, com auxílio de pinça
Gaylor-Medina.
Foram incluídas apenas as mulheres em que havia concordância nos
diagnósticos citopatológico e histopatológico. Desta forma, de 153 pacientes
encaminhadas por LBG a citopatologia, somente 53 com diagnóstico
histopatológico comprovado de LBG foram incluídas. Destas, excluíram-se 13 por
problemas técnicos na marcação imuno-histoquímica. Assim, restaram 40
pacientes. No grupo controle, dentre 43 pacientes referendadas ao serviço sem
lesão cervical cito-histopatológica HPV induzida, apenas 32 foram passíveis de
avaliação pela reação imuno-histoquímica.
Justifica-se o maior número de casos que de controles pela
dificuldade em se obter exames colposcópicos falso-positivos, com lesão
cervical HPV-induzida não confirmada aos exames citopatológico e
histopatológico. Por questões éticas, não se biopsiou pacientes sem evidência
de lesão colposcópica.
Nas 72 pacientes estudadas, a idade variou entre 14 e 57 anos, com
média de 28,2 ± 9,4 anos. Em relação à paridade, apresentaram média de 1,19
partos, variando de 0 a 9 partos. Quanto à coitarca, a média de idade foi de 18
anos e, o número de parceiros, em média 3. Essas taxas foram semelhantes
entre os grupos com e sem lesão cervical (Anexo III).
As pacientes portadoras de lesão intra-epitelial cervical escamosa de
baixo grau foram seguidas trimestralmente por doze meses, com coleta tríplice
para estudo citopatológico e colposcopia, até julho de 2006.
Em caso de não comparecimento as pacientes eram reconcovadas por
telefone ou correio e, na ausência de retorno, eram excluídas da etapa de coorte.
As mulheres que apresentavam progressão da lesão cervical eram
encaminhadas para o devido tratamento, bem como aquelas que
3.2.2 Método citopatológico
Utilizou-se espátula de Ayre e escova endocervical para a coleta de
material dos fórnices vaginais, da ectocérvice e da endocérvice para exame
citopatológico. As amostras foram depositadas em lâminas de vidro
previamente identificadas e fixadas em álcool absoluto, sendo encaminhadas
ao Laboratório de Citopatologia da Disciplina de Ginecologia Geral do
Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM, para coloração pela técnica
de Papanicolaou modificada.
O relato do diagnóstico citopatológico dos esfregaços cervicovaginais
obedeceu aos critérios estabelecidos pelo Sistema de Bethesda modificado, em
que se classificam as lesões intra-epiteliais escamosas em lesões de baixo grau
e de alto grau. Foram ainda identificadas alterações citológicas inflamatórias e
referidas as infecções por bactérias, protozoários e fungos.
3.2.3 Método colposcópico
Foi realizada colposcopia, seguindo técnica de exame preconizada
pela Associação Brasileira de Genitoscopia descrita no Manual de Normas e
Rotinas em Patologia do Trato Genital Inferior e Colposcopia (1998). Durante o
exame, foi feita biópsia dirigida dos achados anormais com pinça de
Gaylor-Medina e os fragmentos encaminhados para procedimento histopatológico.
O laudo colposcópico foi baseado na Nomenclatura Internacional de
Aspectos Colposcópicos estabelecida em Barcelona, em 2002.
3.2.4 Método histopatológico
Os fragmentos obtidos pela biópsia dirigida foram fixados em
solução de formol tamponado a 10% e, posteriormente, desidratados em
concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizados pelo xilol e incluídos
em parafina por processador automático de tecido, conforme rotina
estabelecida no Laboratório do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM.
Os blocos de parafina foram encaminhados para corte em micrótomo
espessura obtidos foram montados em lâminas de vidro e corados pela
hematoxilina-eosina. Após a montagem entre lâmina e lamínula selada com
“Entellan”, os espécimes foram analisados ao microscópio óptico por
patologista experiente. As alterações encontradas foram classificadas de
acordo com Richart e Wright (1993).
A preparação e leitura das lâminas para avaliar a expressão dos
corpos apoptóticos seria, inicialmente, realizada de acordo com Ahmed (2001),
por método de hematoxilina-eosina. Entretanto, a análise de apoptose em
microscopia ótica apresenta problemas devido à fixação, isquemia ou autólise.
Os corpos apoptóticos são difíceis de serem reconhecidos por seu pequeno
tamanho, especialmente em tumores escamosos (Staunton, Gaffney, 1995).
Optou-se, então, pela utilização de método imuno-histoquímico para avaliar a
expressão de apoptose nas amostras selecionadas.
3.2.5 Método de biologia molecular
A detecção biomolecular do HPV foi realizada pela técnica de Reação
em Cadeia de Polimerase (PCR), teste de alta sensibilidade, que consiste na
amplificação do DNA viral e posterior hibridização. Foi executada no Laboratório
de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM.
As amostras de material celular, obtidas por meio de escova
endocervical friccionada contra a mucosa cérvico-vaginal, foram colocadas em
tubo “eppendorf” contendo um mililitro de tampão TE [10 mmol/L Tris-HCl (pH
7.5), 1 mmol/L EDTA], solução conservadora do DNA. As amostras citológicas
assim obtidas foram conservadas em -20°C até posterior extração de DNA
genômico. As coletas para PCR foram realizadas, no máximo, em 30 dias da
coleta do esfregaço citopatológico e da realização da biópsia dirigida.
A análise da quantidade de DNA obtida nas extrações foi feita pela
espectrofotometria com comprimento de onda de 260nm (espectrofotômetro
Spectronic modelo Genesys 5).
As seqüências iniciadoras genéricas Gp5 e Gp6 detectam região L1
3.2.5.1 Reação de cadeia polimerase para Gp5/Gp6
Nas reações foram usados 200ng do DNA genômico em um volume
final de 25µl de reação contendo: 10pmol/µl de cada “primer” Gp5 (5’-TTT GTT
ACT GTG GTA GAT ACT AC-3’) e Gp6 (5’-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT
ATT-3’), 11µl de mix Promega (50UN/ml de Taq DNA polimerase com “buffer” de
reação – pH8,5, 400µM de dATP, 400µM de dCTP, 400µM de dGTP, 400µM de
dTTP e 3mM de MgCl2; Promega Coorporation, Madison, WI, USA) e 11µl H2O
de “nuclease-free” Promega, que foram submetidos ao termociclador (GeneAmp
PCR System 9700, Applied Biosystems) por 40 ciclos, onde a primeira etapa de
desnaturação foi de 94ºC por um minuto, anelamento à 55ºC por um minuto e
polimerização à 72ºC por um minuto. A eletroforese foi em gel de agarose 2% /
brometo de etídio e o padrão obtido nesta reação foi de 150pb.
3.2.5.2 Reação de cadeia polimerase para HPV 16 e HPV 18
As amostras positivas para HPV, detectadas pelo “primer” Gp5/Gp6,
foram testadas para os “primers” específicos HPV 16 e HPV 18.
Nas reações para o HPV 16, foram usados 200ng do DNA genômico
em um volume final de 25µl de reação contendo: 10pmol/µl de cada “primer
sense” (5’-ATT TAC TGC AAC ATT GGG TAG-3’) e “anti sense” (5’-AAT GCT
AGT GCT TAT GCA GC-3)”, 11µl de mix Promega (Promega Coorporation,
Madison, WI, USA) e 11µl H2O de “nuclease-free” Promega, que foram
submetidos ao termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied
Biosystems) por 40 ciclos, onde a primeira etapa de denaturação foi de 94ºC
por 1 minuto, anelamento à 55ºC por 1 minuto e polimerização à 72ºC por 1
minuto. A eletroforese foi em gel de agarose 2% / brometo de etídio e o padrão
obtido nesta reação foi de 152pb.
Já nas reações para HPV 18, também foram usados 200ng do DNA
genômico em um volume final de 25µl de reação. Os “primers” estavam na
concentração de 10pmol/µl de cada, sendo o: “sense” (5’-AAC GAT GAA ATA GAT
GGA GT-3’) e “anti sense” (5’-CTG GCT TCA CAC TTA CAA CAC-3)”, adicionados
“nuclease-free” Promega. As condições para o PCR no termociclador foram as
mesmas utilizadas para o HPV 16. A eletroforese foi em gel de agarose 2% /
brometo de etídio e o padrão obtido nesta reação foi de 101 pb.
3.2.6 Método imuno-histoquímico
As reações imuno-histoquímicas foram efetuadas no Laboratório de
Imuno-histoquímica do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo.
Foram preparados cortes histológicos com 3µm de espessura, a partir de
material blocado em parafina, em lâminas tratadas com 3-aminopropiltrietoxisilano
(APTS) e deixadas por 24 horas em estufa a 60ºC para melhor adesão do tecido
à lâmina.
Para verificar a eficácia do anticorpo primário, fez-se a contraprova
utilizando-se espécimes teciduais de tonsilas palatinas, com imunorreação em
estudo-piloto.
As reações imuno-histoquímicas utilizadas para a pesquisa do
anticorpo topoisomerase IIα e do anticorpo caspase-3 ativada foram realizadas
pelo método biotina-estreptavidina peroxidase. Os cortes histológicos a 3 µm
de espessura foram feitos em lâminas silanizadas (3-aminopropil-trietoxi-silano
da marca Sigma) e seguiu-se o protocolo descrito abaixo, para cada reação:
3.2.6.1 Topoisomerase IIα a) Hidratação e Bloqueio
As lâminas foram desparafinizadas com xilol quente por 30 minutos
e à temperatura ambiente por 15 minutos. Foram hidratadas em álcool etílico
em concentrações decrescentes de 100, 95, 80 e 70%, por 30 segundos cada,
e lavadas em água corrente.
Seguiu-se o bloqueio da peroxidase endógena com água oxigenada
(H2O2) 10V a 3% vol/vol com Metanol, por sete vezes de cinco minutos cada.
b) Recuperação antigênica
A recuperação antigênica foi obtida por meio de calor irradiado em
forno microondas, na potência de 700 watts, com imersão das lâminas em
tampão citrato de sódio 10mM, a pH 6,0, por 50 minutos. Após este período, as
lâminas foram resfriadas à temperatura ambiente por 30 minutos e lavadas em
PBS. Em seguida, fez-se nova lavagem em água corrente e imersão em
solução salina tamponada com fosfatos (PBS 10 Mm pH 7,4), com a finalidade
de bloquear reações não-específicas.
c) Incubação com o anticorpo primário
Após os bloqueios, o anticorpo monoclonal anti-humano
topoisomerase II alfa, marca Dako Cytomation S/A Denamrck, código M7186,
título 1:50, diluído em BSA, foi aplicado sobre os cortes e controle positivo de
tecido, e as lâminas incubadas “overnight ” à temperatura de 2 a 8ºC.
As lâminas foram lavadas em PBS e incubadas pelo Kit System-HRP
(Dako Cytomation K0690). Houve então revelação pelo cromógeno 3,3
Diaminobenzidine (DAB) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EUA), lavagem
em água corrente e contra-coloração com hematoxilina de Harris (Merck,
Darmstadt, Alemanha). Seguiu-se nova lavagem em água corrente,
desidratação, diafanização e montagem com resina para microscopia Entellan
(Merck, Darmstadt, Alemanha).
3.2.6.2 Caspase-3 ativada a) Hidratação e Bloqueio
As lâminas foram desparafinadas, hidratadas e seguiu-se o bloqueio
da peroxidase endógena com água oxigenada (H2O2)10V a 3% vol/vol com
Metanol, por sete vezes de 5 minutos cada. Após isso, fez-se lavagem com
água e PBS.
b) Recuperação antigênica
A recuperação antigênica foi obtida por meio de calor irradiado em
forno microondas, na potência de 700 watts, com tampão Tris-EDTA, pH 9,9,
durante 50 minutos. Após este período, as lâminas foram resfriadas por 20
c) Incubação com o anticorpo primário
Após os bloqueios, o anticorpo policlonal de coelho anti-caspase-3
ativada (“Rabbit anti-active Caspase-3 polyclonal antibody”), da marca
Chemicon International Inc., a título 1:25, diluído em BSA, foi aplicado sobre os
cortes e controles positivos de tecido, e as lâminas incubadas “overnight”.
As lâminas foram lavadas em PBS e incubadas pelo Kit System-HRP,
da Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, Vectastain ABC Elite Kit, cód.
PK-6101, Rabbit IgG. Houve então revelação pelo cromógeno 3,3 Diaminobenzidine
(DAB) (Dako Cytomation, Liquid DAB Chromogen System, Carpinteria CA,
USA, cód. K3468), lavagem em água corrente e contra-coloração com
hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha). Seguiu-se nova
lavagem em água corrente, desidratação, diafanização e montagem com resina
para microscopia Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).
3.2.7 Interpretação da expressão imuno-histoquímica
A imunoexpressão da topoisomerase IIα e da caspase-3 ativada
foram analisadas no Laboratório de Imunopatologia e Técnicas Especiais do
Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM.
A leitura foi realizada com microscópio óptico da marca Nikon, modelo
Eclipse E 400, com aumento de 400 vezes. As imagens foram capturadas por
sistema computadorizado, que consiste em videocâmara colorida (Samsung
modelo SCS 131), acoplada a computador Pentium 64 MB de memória RAM, e
foram graficamente analisadas por programa Image Pro Plus.
Na análise da cada caso, selecionaram-se dez campos microscópicos
consecutivos de epitélio e dez campos consecutivos do estroma adjacente,
padronizados nas áreas de maior concentração de células imunomarcadas. A
contagem foi realizada manualmente.
As contagens nucleares, representando a percentagem de células
com imunorreação nuclear, foram avaliadas por dois observadores
independentes, contando-se um número mínimo próximo de 200 células,
A expressão de topoisomerase IIα foi considerada positiva nas
células cuja coloração nuclear apresentou-se acastanhada, e negativa na sua
ausência ou naquelas fracamente coradas (FIGURA 1). Quanto à caspase-3
ativada, haveria da mesma forma, expressão nuclear e citoplasmática com
coloração acastanhada (FIGURA 2).
FIGURA 1 – Fotomicrografia de corte histológico de colo uterino da paciente nº 4 mostrando a reação imuno-histoquímica da topoisomerase IIα (400x).
3.2.8 Método estatístico
As variáveis qualitativas foram descritas por meio de tabelas e, as
variáveis quantitativas, por figuras e tabelas com medidas de tendência central,
variabilidade e separatrizes. O teste de normalidade da distribuição das
variáveis quantitativas foi feito pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.
O teste exato de Fisher e o teste de qui-quadrado foram utilizados
para análise de homogeneidade e de associação em tabelas de contingência.
Estimativas de razão de chances, “odds ratio” (OR), e de seus respectivos
intervalos de confiança (IC) também foram realizadas nos casos em que
ocorreu diferença significativa na distribuição de dados das variáveis.
O teste de comparação entre duas populações independentes em
relação à média de variáveis cuja distribuição é normal foi realizada pelo
teste t de Student.
A Curva de ROC foi utilizada a fim de determinar um ponto de corte
para diagnosticar LBG em função da Topoisomerase (%), onde o teste deverá
satisfazer uma sensibilidade mínima de 80% e especificidade de 70%.
O nível de rejeição para a hipótese de nulidade foi fixado sempre em
Foram avaliadas, por imuno-histoquímica, 72 pacientes, sendo 40
destas com lesão cervical de baixo grau e 32 do grupo controle. Não houve
diferença estatisticamente significante quanto à idade de pacientes com LBG
(casos) e sem LBG (controle), com média de 26,3 anos no primeiro grupo e de
30,6 anos no grupo controle (p=0,051).
A avaliação por imuno-histoquímica para topoisomerase IIα
comparou contagens de células marcadas entre os grupos de pacientes com
LBG e sem LBG (QUADRO 1). A média de células imuno-marcadas no grupo
de casos foi de 11,71% (desvio padrão ± 7,38), enquanto no grupo controle foi
de 4,13% (desvio padrão ± 3,48).
O teste t de Student aplicado a esses resultados revelou
significância estatística (p<0,001) (FIGURA 3). Houve predomínio da coloração
nuclear com distribuição epitelial, especialmente nas camadas basal e
parabasal.
FIGURA 3 – Distribuição da imunoexpressão de topoisomerase IIα (porcentagem de células coradas) nas pacientes do grupo de casos e de controles.
caso controle
0 5 10 15 20 25
Legenda:
┬ - desvio padrão ─ - Média
Teste t de Student (p < 0,001)
T
opoi
som
e
ra
s
e
II
α
(%
QUADRO 1 – Distribuição das 40 pacientes com LBG e das 32 pacientes sem LBG (controle) segundo número de ordem, idade, imunoexpressão de
topoisomerase IIα e de caspase-3 ativada e pesquisa de DNA-HPV
No idade topo II% CAS-3 PCR No idade topo II% CAS-3 PCR
1 40 16,88 + - C1 36 0 - -
2 21 16,43 - - C2 16 1,47 - +
3 40 3,65 - + C3 30 0 - -
4 22 23,33 + + C4 30 1,80 - +
5 36 19,37 - + C5 24 2,01 + +
6 16 14,06 - + C6 46 2,06 - +
7 26 14,49 - + C7 30 0 - +
8 24 15,31 + + C8 31 10,85 - -
9 19 1,44 - + C9 22 13,15 - +
10 16 9,62 + + a C10 30 0 - -
11 21 10,20 + + C11 45 7,5 - +
12 18 0,99 - + C12 43 4,83 - +
13 26 19,69 + - C13 24 3,15 - +
14 37 8,59 - - C14 22 4,65 - +
15 18 27,03 - + C15 28 5,52 + +
16 32 8,89 - + C16 23 3,53 - -
17 25 5,76 - - C17 56 5,66 - +
18 23 5,71 + + a C18 42 10 - -
19 57 14,29 + + a C19 44 7,65 + -
20 32 18,43 - + C20 26 8,11 - +
21 27 25,93 + + C21 43 0,9 - -
22 27 11,66 - + C22 22 5,96 + +
23 21 23,08 + + a C23 26 8,33 - +
24 16 11,43 - + C24 27 1,07 - +
25 40 28,21 + - C25 30 3,96 - -
26 26 10,45 - + C26 30 6,10 - +
27 17 13,82 + - C27 36 4,19 - -
28 19 15,51 - + C28 23 3,27 + -
29 27 9,80 - - C29 17 0,5 - +
30 33 8,65 - + C30 33 0 - +
31 25 1,06 + - C31 16 3,35 - -
32 39 12,05 + - C32 28 2,56 - -
33 19 7,06 + -
34 14 6,53 - +
35 19 0 - +
36 31 4,05 - +
37 23 4,10 - -
38 29 6,23 - -
39 27 8,08 + -
40 22 6,34 + +
M 26,25 11,71 M 30,59 4,13
Legenda: + = positivo; - = negativo
PCR = Técnica utilizada para detecção de HPV-DNA C = número do controle
a
= pesquisa positiva para HPV 18 M = média
Usando a curva ROC (“receiver operating characteristic”), observou-se
que a percentagem de células coradas por imuno-histoquímica para
topoisomerase IIα é bom parâmetro para diagnóstico de LBG. Sendo a área sob a
curva de ROC = 0,829 (±0,048), p< 0,001, verifica-se ser o ponto de corte igual a
5,7% que permite sensibilidade de 82,5% e especificidade de 71,9%, usando
como padrão-ouro o grupo caso-controle. Desta forma, valores maiores ou iguais
a 5,7% implicam em chance maior para ocorrência de LBG (FIGURA 4).
FIGURA 4 – Curva ROC para imuno-histoquímica de topoisomerase IIα.
A acurácia de topoisomerase IIα ≥ 5,7% foi estimada em 72,94%.
Estima-se que 2,63% dos resultados topoisomerase IIα < 5,7% (diagnóstico
positivo) sejam falso-negativos, com valor preditivo negativo de 97,37%, e que
75,42% dos resultados topoisomerase IIα ≥ 5,7% sejam falso-positivos, com
valor preditivo positivo de 24,58%.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
área sob a curva = 0,829 (+/-0,048) ; p< 0,001
S e n s ib ili d a d e (% )
Quanto à avaliação imuno-histoquímica para caspase-3 ativada,
observou-se marcação nuclear e principalmente citoplasmática de coloração
acastanhada mal delimitada, mais evidente nas camadas epiteliais próximas da
basal. Devido à dificuldade em se quantificar essa marcação, optou-se por
analisar apenas a presença ou não de expressão de caspase-3 ativada nas
amostras. A expressão do marcador ocorreu em 17 pacientes com LBG
(42,5%) e, em cinco, sem LBG (15,63%) (QUADRO 1). Houve significância
estatística na diferença entre os dois grupos (p=0,014), pelo teste qui
quadrado, com razão de chances de 3,99 (IC 95%: 1,27-12,5) (TABELA 1).
TABELA 1 – Distribuição das pacientes segundo a expressão imuno-histoquímica para caspase-3 ativada
Caspase-3 ativada (N) Grupo
positiva negativa total
p
caso 17 23 40 0,014
controle 5 27 32
total 22 50 72
Legenda: N = número de pacientes; p= nível de significância
Teste Qui-Quadrado
A média de imunoexpressão de topoisomerase IIα entre as pacientes
com pesquisa de caspase-3 positiva e negativa mostrou diferença
estatisticamente significante (p= 0,0024), pelo teste t de Student (TABELA 2).
TABELA 2 – Distribuição das pacientes segundo a expressão imuno-histoquímica para topoisomerase IIα e para caspase-3 ativada
Caspase-3 Topoisomerase IIα (%) p
N Média DP
Positivo 22 12,05 7,94 0,0024
negativo 50 6,71 5,99
Legenda: N = número de pacientes; DP = desvio padrão; p= nível de significância
